CN116640689B - 一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64及其应用。该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64于2023年3月14日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63205，命名为：高丽魏斯氏菌(weissella koreensiskk)。该菌具有良好的耐酸耐胆盐特性，可以保证有足够生物量通过消化道环境的胁迫；该菌具有表面疏水特性和自动集聚能力；该菌发酵后的胞外代谢产物具有清除DPPH自由基和羟自由基的能力；该菌可以产纤维素酶和β‑半乳糖苷酶等饲料酶制剂；该菌对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的抑制效果和共聚集能力。此外，动物饲喂实验表明该高丽魏斯氏菌kk64作为益生菌饲料添加剂在提高饲料价值、改善动物肠道健康、增强机体免疫力、提高动物产肉率等方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌开发利用技术领域，具体涉及一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64及其应用。
背景技术
目前，抗生素仍是畜禽养殖过程中治疗细菌感染的重要手段，但抗生素的反复使用、过度使用或滥用会导致药物副作用；另外，抗生素在杀死致病菌的同时，也可能会对肠道微生物组产生不良影响，进而引起肠易激综合症(IBS)及各种免疫性疾病。更为重要的是，抗生素过度使用及滥用会导致抗生素抗性菌株的产生及传播，对畜禽养殖业造成严重威胁。在此背景下，益生菌发酵饲料为生产安全、优质、绿色、健康的动物产品开辟了一条新途径。益生菌发酵饲料作为一种新型的生态环保饲料，其在缓解饲料资源紧缺、改善营养结构、降低饲料成本、保护环境等方面的优势日益凸显，可广泛应用于家禽、猪、反刍及水产动物养殖，对于我国畜禽养殖业的健康可持续发展具有重要的意义。
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类革兰氏阳性菌，通过代谢活动可直接为宿主提供必需的氨基酸和各种维生素(维生素B族和维生素K等)，发酵生成的有机酸可以促进动物对钙、铁、磷和维生素D的吸收，并促进胃肠蠕动，产生的纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等多种消化酶可以调节消化道对营养物质的吸收利用，有利于动物的生长发育。此外，乳酸菌还通过竞争黏附位点、修复肠道屏障功能、降低肠腔pH、分泌具有抗菌活性的细菌素来抑制有害细菌的生长，从而维持肠道菌群的平衡；并通过刺激宿主免疫系统，增强先天和适应性免疫反应，来发挥免疫调节作用。除此之外，经乳酸菌发酵的饲料一方面含有大量乳酸菌和乳酸，能够抑制腐败菌生长，延长饲料的贮存期；另一方面还富含有机酸和多种糖类、醇类、酯类等风味物质，可改善饲料的适口性，增加动物的采食量。乳酸菌还能增强动物的抗氧化能力，干预脂肪酸代谢过程，显著改善肉产品的亮度和嫩度。目前，使用的乳酸菌菌种大多为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、粪肠球菌和屎肠球菌。其中，魏斯氏菌(Weissella)不仅能产生细菌素、有机酸等抗菌物质，还能产生胞外多糖，因而在医药、食品等行业的关注度较高。目前，对魏斯氏菌益生作用的研究和应用相对较少，但现有研究表明魏斯氏菌是一种潜在的益生菌，存在很大的研究空间。因此，筛选出一株能高效增强饲料的发酵品质、维持畜禽肠道菌群平衡、提高动物产肉率的魏斯氏菌，对当下畜禽养殖业绿色发展具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64及其应用，研究发现该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64具有良好的耐酸耐胆盐特性、黏附能力、抗氧化能力，并且该菌可以产纤维素酶和β-半乳糖苷酶等饲料酶制剂，以及对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的抑制效果和共聚集能力，这些益生功能使其具备作为动物用饲料添加剂的应用前景，本发明还通过动物饲喂实验很好地证实其作为饲料添加剂的功用。
本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64，于2023年3月14日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63205，命名为：高丽魏斯氏菌(weissella koreensiskk)。
进一步地，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64具有耐酸耐胆盐特性，在肠液、pH1.5-2时胃液以及0.3％水平胆盐中的存活率为100％；并且可以产纤维素酶和β-半乳糖苷酶；主要代谢产物包括胞外多糖和γ-氨基丁酸等；该菌发酵后的胞外代谢产物的DPPH自由基清除率为41.66％，羟基自由基清除率为55.81％，因而具有良好抗氧化能力；并且无溶血性，是安全的共生菌，不会产生机会性毒力。因此，本发明第二方面提供所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在制备益生菌制剂上的应用。
进一步地，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64具有表面疏水特性和较弱自动集聚能力，表面疏水特性为2.33％，自动聚集能力为7.135。并且，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌具有良好的抑菌效果，对于SL1344鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1、印第安那沙门菌S17137都有良好的抑制效果。因此，本发明第三方面提供所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在制备疏水抗菌涂层上的应用。
进一步地，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64对于SL1344鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1、印第安那沙门菌S17137都有良好的抑制效果。因此，本发明第四方面提供所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在制备抑菌抗菌药物或者抑菌抗菌保健品上的应用。
进一步地，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌与大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1都有共聚集能力，可一定程度防止上述病原菌在肠道致病性粘附和肠道定植。因此，本发明第五方面提供所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在制备维持肠道菌群平衡药物上的应用。
第六方面，本发明提供一种益生菌制剂，包括所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64。
优选地，所述益生菌制剂还包括益生芽孢杆菌、双歧杆菌、酪酸梭菌、乳酸菌、酵母菌、丁酸梭菌中的至少一种。
进一步地，本发明第七方面提供所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者所述益生菌制剂在制备饲料添加剂上的应用。
第八方面，本发明提供一种饲料添加剂，包括所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者所述益生菌制剂。
第九方面，本发明提供一种饲料，包括所述饲料添加剂。
第十方面，本发明提供一种疏水抗菌涂层，所述涂层添加有所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64。
第十一方面，本发明提供一种抑菌抗菌药物，所述药物包括所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64和药学上必不可少的辅料。
第十二方面，本发明提供一种保健品，所述保健品添加所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者由包含所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64的菌剂发酵获得。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明提供了一株高丽魏斯氏菌kk64(Weissella koreensis kk64)，该菌具有良好的耐酸耐胆盐特性，可以保证有足够生物量通过消化道环境的胁迫，进入宿主肠道发挥益生功效；该菌具有表面疏水特性和自动集聚能力，其黏附能力较高；该菌发酵后的胞外代谢产物具有清除DPPH自由基和羟自由基的能力，因而抗氧化能力较强；该菌可以产纤维素酶和β-半乳糖苷酶等饲料酶制剂，可以提高畜禽对饲料的消化、利用；该菌对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的抑制效果和共聚集能力。此外，动物饲喂实验表明该高丽魏斯氏菌kk64作为益生菌饲料添加剂在提高饲料价值、改善动物肠道健康、增强机体免疫力、提高提高肉兔产肉率等方面具有良好的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例1分离得到的高丽魏斯氏菌kk64的划线图片；
图2是实施例10中高丽魏斯氏菌kk64对病原菌的抑制能力。第一行依次为SL1344鼠伤寒沙门菌标准菌株、大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922，第二行依次为鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1、印第安那沙门菌S17137，第三行依次为鸡白痢沙门菌、铜绿假单胞菌ATCC27853；
图3-1是实施例12中kk64组肉兔肠道样本染色显微成像照片，图中从左到右依次为kk64组肉兔的空肠、回肠和盲肠500μm染色图；
图3-2是实施例12中KY组肉兔肠道样本染色显微成像照片，图中从左到右依次为KY组肉兔的空肠、回肠和盲肠500μm染色图；
图3-3是实施例12中CK组肉兔肠道样本染色显微成像照片，图中从左到右依次为CK组肉兔的空肠、回肠和盲肠500μm染色图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64的分离鉴定及活化
1、大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64的分离鉴定
大熊猫粪便样品来源于中国大熊猫保护研究中心，用PBS将采集的大熊猫粪便样品梯度稀释，并涂布于MRS固体培养基，置于恒温培养箱于37℃培养18h。挑取有透明圈的单菌落进行再次分离纯化。挑取单个菌落于MRS液体培养基富集培养18h(37℃)。按照百泰克细菌DNA提取试剂盒上的步骤提取DNA，以细菌DNA为模板，27F和1492R为引物扩增16S rRNA基因，进行16S rRNA标记基因测序鉴定，鉴定结果为Weissella koreensis。将该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64于2023年3月14日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：63205，命名为：高丽魏斯氏菌(weissella koreensiskk)。
2、菌株的活化与培养
从-80℃冰箱中取出保菌管，使用1μL接种环蘸取细菌冻存管中的菌液，在含MRS培养基的培养皿中进行三区划线，倒置于37℃培养箱中厌氧培养24h。之后使用1μL接种环挑取平板上第三区明显的单菌落，继续在固体平板上进行三区划线培养24h，进行高丽魏斯氏菌的传代及复壮，以供后续试验使用。如图1所示，该菌在MRS琼脂培养基上，形成光滑不透明的小菌落，呈微隆起圆状轮廓。
实施例2
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64溶血性实验和耐酸耐胆盐能力的测定
1、高丽魏斯氏菌kk64溶血性实验
取血琼脂培养基，采用点种法，中心以金黄色葡萄球菌为对照，外围取实验乳酸菌kk64点种3次。37℃培养48h，观察实验菌与对照菌溶血情况。
2、高丽魏斯氏菌kk64耐酸耐胆盐能力实验
将胃蛋白酶重悬于经灭菌的0.5％(W/V)生理盐水中使其浓度达到3g/L，将pH调至1.5～2.0得到模拟胃液。将胰酶重悬于经灭菌的0.5％(W/V)生理盐水中使其浓度达到1g/L，加入0.3％胆盐并将pH调至8.0得到模拟肠液。取3份1mL大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64菌液，离心洗涤，分别重悬于1mL0.5％(W/V)无菌盐水、1mL模拟胃液、1mL模拟肠液、1mL pH2.0的MRS肉汤和1mL0.3％胆盐的MRS肉汤中混匀，置于37℃恒温培养箱中培养。1mL模拟胃液，在2h时取出100μL菌液进行活菌计数，计算存活率，确定耐胃液特性。1mL模拟肠液，在2h时取出100μL菌液进行活菌计数，计算存活率，确定耐肠液特性。1mL0.3％胆盐MRS肉汤，在24h时取出100μL菌液进行活菌计数，计算存活率确定耐酸耐胆盐特性。
其中存活率(％)＝P1/P0×100，P1为胁迫处理后活菌数，P0为胁迫处理前活菌数。
该菌不溶血，是安全的共生菌，不会产生机会性毒力。该菌在2h时在胃液中的存活率为100％；在2h时菌株在肠液中的存活率为100％；在24h时在0.3％胆盐MRS肉汤中存活率为100％。高丽魏斯氏菌kk64拥有相对较好的耐酸耐胆盐特性，具有成为益生菌的潜力。
实施例3
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64自聚集能力的测定
在装有10mL MRS肉汤的15mL离心管中接种乳杆菌kk64，于37℃恒温培养箱中培养24h。将培养后的菌液使用PBS洗涤，调整洗涤后菌液的浓度至OD600值为0.800，记为A0＝0.800，检测时使用PBS将OD600值调零。取4mL调节浓度后的菌悬液充分混匀，室温孵育5h。以PBS缓冲液的OD600值作为对照，吸取室温孵育5h后的1mL菌悬液，将其OD600值记为At。试验重复三次并计算，自凝集(％)＝1-At/A0*100％(注：孵育5h后取菌悬液时应取表面菌液，禁止吹打，保持菌液静止。)
益生高丽魏斯氏菌需具备在宿主肠道有效定殖并能阻止病原菌在肠道定殖的能力。细菌的自凝集能力是体外评估评估其黏附肠道细胞能力的重要指标。Angmo等(AngmoK，Kumari A，Savitri，et al.Probiotic characterization of lactic acid bacteriaisolated from fermented foods and beverage of Ladakh[J].LWT-Food Science andTechnology，2016，66：428-435.)表明自凝集能力一般分为以下三类：弱(16％～35％)、中等(35％～50％)和强(高于50％)。我们测定了高丽魏斯氏菌kk64的自凝集能力，结果表明高丽魏斯氏菌kk64的自凝集能力较弱，约为7.135％。
实施例4
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64菌体表面疏水性的测定
高丽魏斯氏菌活化后，8000r/min离心5min，收集菌体。菌体经无菌水洗涤、重悬后，调整菌液OD595mm值约为0.5，记为A0。取3mL细胞悬液，分别加入1.0mL的二甲苯和三氯甲烷，30℃孵育10min后，涡流振荡混合60s，常温静置15min。待有机相完全与水相分层后，取200μL水相，测定OD595nm值，记为A1，按下列公式计算疏水率：
疏水率(％)＝(A0-A1)/A0*100％
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64的疏水性为2.33％。
实施例3、实施例4和实施例10的结果表明，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64具有表面疏水特性和较弱自动集聚能力，表面疏水特性为2.33％，自动聚集能力为7.135。并且，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌具有良好的抑菌效果，对于SL1344鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1、印第安那沙门菌S17137都有良好的抑制效果。因此，该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64有望在开发具有疏水抗菌效果的细菌涂层上提供应用基础。
实施例5
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64胞外代谢产物抗氧化能力的测定
将保存于甘油保菌管(-80℃冻存)的高丽魏斯氏菌以体积分数为2％的比例接种到MRS液体培养基，37℃培养18h，连续活化2次。取活化2次的高丽魏斯氏菌培养液，6000r/min离心4min，去除上清之后用PBS洗涤2次，用PBS调整高丽魏斯氏菌菌悬液浓度为1×109CFU/mL，备用。
1、高丽魏斯氏菌kk64DPPH自由基清除能力的测定
取0.5mL菌悬液与0.5mL DPPH(0.2mmol/L，无水乙醇配制)，充分混匀后，室温避光反应30min，然后经过6000r/min离心10min。取上清液，517nm处测定OD值。用等体积的PBS溶液代替样品溶液作为对照组，并以等体积的PBS溶液和无水乙醇的混合液作为空白调零。实验重复3次。DPPH自由基的清除率计算如下：
DPPH自由基的清除率＝(1-A517(样品)/A517(对照))*100％
式中：A517(样品)和A517(对照)分别为样品组和对照组在517nm处的吸光值。
2、高丽魏斯氏菌kk64羟自由基清除能力的测定
分别取0.5mL高丽魏斯氏菌菌悬液，0.5mL2.5mmo1/L的1，10-菲罗啉，0.5mL PBS(pH7.4)，0.5mL2.5mmol/L的FeSO4，混匀后加入0.5mL20mmol/L H2O2，37℃中水浴90min，在536nm处测定其OD值。将0.5mL高丽魏斯氏菌菌悬液换成0.5mL PBS为空白组；将0.5mL的H2O2换成0.5mL的蒸馏水为对照组。实验重复3次。清除羟自由基的能力计算如下：
羟自由基清除率＝(A536(样品)-A536(空白))/(A536(对照)-A536(空白))*100％
式中：A536(样品)、A536(对照)及A536(空白)分别为样品组、对照组及空白组在536nm处测得的吸光值。
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64 DPPH自由基的清除率和羟自由基的清除率分别为41.66％和55.81％，有较强的抗氧化能力。
实施例6
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64主要代谢产物的测定
1、胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)
将菌株按3％(v/v)的接种量接种于MRS培养基中，37℃培养24h，连续活化3次后，以4℃、10000r/min离心10min除去发酵液中的菌体和杂质，离心后取上清液，添加80％三氯乙酸溶液，使溶液中三氯乙酸的终浓度为4％(m/v)，在4℃冰箱中放置6-8h后，以4℃、10000r/min离心15min除出蛋白质沉淀，取上清液，然后加入3倍体积的95％乙醇，在4℃冰箱中放置12-15h后，再以4℃、10000r/min离心15min，取沉淀，加去离子水溶解后，移至透析袋中，用流动的纯净水透析2d，每隔8h更换一次水，收集透析液后进行真空冷冻干燥，即得到粗多糖。
通过苯酚-硫酸法测定EPS含量，并制作葡萄糖标准曲线。取适量分析纯葡萄糖置于110℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温后，准确称取100mg葡萄糖于1L容量瓶中，加蒸馏水至刻度。分别吸取上述的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL，补蒸馏水至2.0mL，加入1.0mL6％苯酚和5.0mL浓硫酸，摇匀，冷却至室温，放置30min，以蒸馏水为空白对照，于490nm测定吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值A490nm为纵坐标制得标准曲线。
2、γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)
将菌株接入MRS液体培养基中37℃活化培养，然后按照2％(v/v)的接种量接入含谷氨酸1％的TYG液体培养基中进行发酵。
根据比色法定量测定产GABA菌株发酵液中的GABA含量。利用Berthelot反应，即苯酚、次氯酸钠与游离氨的反应呈蓝色来测定体系中的微量氨，通常GABA浓度越高，反应后溶液呈现的蓝色越深。
GABA标准曲线的绘制：准确配制浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL的GABA标准溶液，分别取1mL标准液依次加入1mL浓度为0.01mol/L的四硼酸钠缓冲液、1mL浓度为6g/100mL的苯酚溶液以及2.5mL的7.5g/100mL次氯酸钠溶液充分混匀后沸水浴10min，再冰浴5min，待溶液呈蓝绿色加入2mL60％乙醇溶液，630nm处测OD值，以吸光度(y)为纵坐标，各标准液质量浓度为横坐标(x，mg/mL)作图得标准曲线，并建立回归方程。
样品中GABA含量的测定：取5mL产GABA菌株的发酵液于5000r/min离心20min，取1mL上清液，按照前面的方法进行处理，630nm处测OD值，取等量无菌水为空白对照，根据标准曲线方程求得相应GABA含量。
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64的碱溶性EPS和水溶性EPS的产量分别为30.94mg/L和29.15mg/L，GABA的产量为0.35g/L。
实施例7
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64胆盐水解酶(Bile salt hydrolase，BSH)活力的测定
BSH是一类由肠道微生物合成的胞内酶，能水解结合型胆盐从而增强菌体对胆盐毒性的抵御能力，延长菌体在肠道中的生存时间。BSH特异性识别底物甘胆酸钠，将其水解生成甘氨酸，试验中以测定甘氨酸的生成量为判定BSH水解活性的指标。甘氨酸与茚三酮作用生成蓝紫色物质，记录其在570nm处的吸光值。
将培养24h的发酵液、空白组加入体积分数15％三氯乙酸，添加量为体积分数为30％，混匀静置15min，8000r/min离心10min，吸取1mL上清液，加入0.5mL茚三酮显色液，旋涡振荡，密封沸水浴15min，迅速冰浴3min，再加入0.5mL体积分数95％的乙醇，混匀静置5min后测定在570nm处的吸光度。
上述培养24h的发酵液是将kk64菌株按3％体积分数接种于MRS液体培养基内，37℃培养24h得到(实施例8同)。
上述空白组为没有接种kk64菌株的空白MRS液体培养基。
配制1mmol/L甘氨酸标准溶液，准确吸取上述溶液0、200、400、600、800、1000μL至离心管中，用蒸馏水补足体积为1mL，再分别加入0.5mL显色液，旋涡振荡后密封沸水浴15min，迅速冰浴冷却3min，加入0.5mL体积分数95％的乙醇混匀，静置5min，在570nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，甘氨酸标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64的BSH酶活为15.18μg/mL。
实施例8
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64纤维素酶活力的测定
葡萄糖标准曲线绘制：称取100mg葡萄糖并加入等量的蒸馏水获得葡萄糖标准溶液。将溶液按照0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL至于带刻度试管中，并用蒸馏水定容至2.0mL。做好标记后在每一个试管中都加入2mL的3，5-二硝基水杨酸并煮沸5min，取出后迅速冷却至室温，后用蒸馏水定容至20mL。其中的0号管作空白对照。通过吸收光谱确定最适波长为480nm，并在此波长下用酶标仪进行比色。以吸光值为纵坐标，葡萄糖含糖为横坐标绘制标准曲线。
取发酵液4℃、4500r/min离心10min，上清即为粗酶液，在试管中依次加1.2mL的羧甲基纤维素钠溶液以及0.4mL的样品并封口，50℃水浴30min，取出后迅速加入2.4mL DNS试剂，煮沸5min后冷却至室温，最后加入蒸馏水定容到20.0mL。将试管内溶液混匀后在480nm处测定吸光值。
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64的纤维素酶活为11.15μmol/mL。
实施例9
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64β-半乳糖苷酶活力的测定
将培养16h后处于稳定期的高丽魏斯氏菌kk64利用PBS离心洗涤两次(12000g，6min，5℃)，再次用PBS溶解菌泥得到菌悬液，取菌悬液接种到MRS-lac培养基或Elliker-lac中(体积分数1％)，于适宜温度培养24h，离心洗涤两次，并用PBS再次溶解菌泥，获得纯净菌悬液。在波长560nm处将菌悬液吸光度值调至1.0左右。取调整吸光度值后菌悬液1mL，加入50μL甲苯/丙酮溶液(1：9，体积比)，在涡旋混匀器上震荡7min。取震荡后菌悬液100μL，加入900μL的PBS，在波长560nm处测定吸光度，记为A1560。之后加入200μL邻硝基半乳糖苷溶液(ONPG，质量浓度4g/L)，混匀后在适宜温度水浴加热15min，立即加入0.5mL浓度为1mol/L的Na2CO3溶液终止反应。分别在波长420nm和560nm处测定反应后混合物吸光度。
结果表明，高丽魏斯氏菌kk64的β-半乳糖苷酶活为1.7U/mL。
实施例2、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8和实施例9的结果表明，所述大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64具有耐酸耐胆盐特性，在肠液、pH1.5-2时胃液以及0.3％水平胆盐中的存活率为100％；并且可以产纤维素酶和β-半乳糖苷酶；主要代谢产物包括胞外多糖和γ-氨基丁酸等；该菌发酵后的胞外代谢产物的DPPH自由基清除率为41.66％，羟基自由基清除率为55.81％，因而具有良好抗氧化能力；并且无溶血性，是安全的共生菌，不会产生机会性毒力。因此，该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64可以开发成益生菌制剂。进一步地，该菌还可以直接作为饲料添加剂或者将该菌开发成益生菌制剂作为饲料添加剂。
现有用作益生菌制剂的菌株包括益生芽孢杆菌、双歧杆菌、酪酸梭菌、乳酸菌、酵母菌、丁酸梭菌，kk64或将和前述菌株复配形成复合菌株作为益生菌制剂。
实施例10
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64对重要病原菌生长抑制能力的测定
试验所用的重要病原菌为：SL1344鼠伤寒沙门菌标准菌株、大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1、印第安那沙门菌S17137以及鸡白痢沙门菌。
采用琼脂扩散法。平板中倒入15mL融化的素琼脂(2％)，待其充分冷却凝固后，放入已灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排列整齐。将指示菌稀释至1×108cfu/mL浓度菌悬液，取该菌悬液1mL与15mL经融化后保持在45℃左右的MRS培养基迅速混合均匀，冷却后用无菌镊子取出牛津杯，即形成若干孔洞。分别向孔洞里加入等量待检菌kk64的离心上清液，37℃培养12h，游标卡尺测量抑菌圈直径D，打孔直径记为d，抑菌比＝D/d，结果如表1和图2所示，表明该菌对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鸡白痢沙门菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的抑制效果，尤其是对大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌ATCC25922、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923抑制作用强，因此，有望进一步开发成抑菌抗菌药物或者抑菌抗菌保健品。
表1高丽魏斯氏菌kk64抑菌试验结果
实施例11
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64与细菌共聚集能力的测定
将病原菌(大肠杆菌G1-7(ETEC)、大肠杆菌M143(EPEC)、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鸡白痢沙门菌527、金色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯S45-1)在LB液体培养基中37℃培养18h。将培养了18h的菌液以3000g的速度离心十分钟，弃去上清液。加入等量灭菌后的PBS缓冲液，重悬混匀，3000g离心10min，重复此步骤2-3次。加入少量PBS缓冲液并重悬混匀。以一定比例将菌液与PBS缓冲液混合，使混合溶液在600nm的波长下OD值在0.8左右，记为A0。
将高丽魏斯氏菌kk64悬浮液和病原菌悬浮液等体积(2mL)混合，在室温下静置孵育5h。在相同生长条件下培养含4mL单菌悬液的对照组，在600nm下测定OD值。实验重复三次并计算：Co-aggregation(％)＝[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/(Ax+Ay)×100％；(Ax和Ay代表两个细菌悬液的吸光度，A(x+y)意味着混合细菌悬液的吸光度。)，结果如表2，表明该菌对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌(较弱情况下)、鸡白痢沙门菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的共聚集能力，可一定程度防止上述病原菌在肠道致病性粘附和肠道定植。因此，该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64有望进一步开发成维持肠道菌群平衡药物。
表2高丽魏斯氏菌与细菌共聚集试验结果
实施例12
大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在肉兔饲喂实验
kk64的单菌液离心后，去除培养基，用15％甘油重新悬浮，经过平板计数终浓度在1×1010CFU/mL左右，用10mL离心管分装，冻存于-20℃冰箱。
试验的起始日期为2021年8月10号，结束日期为同一年的9月6号。试验期间供试动物的管理采用单笼饲养，即1个笼子饲养1只兔子。每天早上11：30、晚上7：30共两次投喂饲料，各组肉兔自由采食、饮水。
挑选33只体重相近、日龄相近的生长期肉兔，用空白饲料进行一周左右的饲喂，此举是为避免肉兔在开展饲喂试验前食用其他饲料对试验结果的影响。将33只肉兔平均分为kk64组、KY组和CK组，试验各组分组详情见表3。空白饲料配方为：玉米24％、小麦麸12％、豆粕11％、首蓿草粉29％、次粉8％、油菜秸秆5％、玉米酒精糟及可溶物9％、试验0.4％、粘合剂0.6％、预混料1％(预混料主要提供矿物质元素、维生素、赖氨酸以及蛋氨酸等，常规市售产品)。在正式实验开始前进行称重，之后每隔一周左右进行称重，记录数据。预先解冻的kk64菌剂用一次性注射器吸取，每只兔子一天0.5mL，一天饲喂一次实验组兔子。在饲喂菌剂结束后立即给兔子饲喂日粮100g/只，一天饲喂2次，上午一次，晚上一次，两次饲喂之间保证一定的时间间隔，试验27天。
表3肉兔饲喂试验分组详情
12.1肉兔存活率
从表4中可以看出，kk64组存活数量为10只、KY组存活数量为10只、CK组存活数量为6只。结果表明，饲喂高丽魏斯氏菌kk64的实验组肉兔存活率与饲喂添加抗生素饲料的存活率相同，并且大于未饲喂菌剂的空白饲料组。
表4肉兔饲喂实验存活率结果
表3表明，在饲喂27天后，kk64组和KY组兔子存活率相同，均高于CK组。
12.2肉兔平均增重
从表5中可以看出，kk64组平均增重484.2g、KY组平均增重472.2g、CK组平均增重403.8g。结果表明，饲喂高丽魏斯氏菌kk64的实验组肉兔的体重要略大于饲喂添加抗生素饲料和饲喂空白饲料的对照组。
表5肉兔饲喂实验平均增重结果
注：表5中第一行的X/Y表示称重日期。
12.3肉兔肠道固定样本组织学检测
在饲喂期结束后，分别选择各个组的肉兔进行解剖，分别取空肠、回肠、盲肠肠道组织样品。
检测步骤：(1)包埋：4％多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗30min，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中进行脱水(75％乙醇6h，85％乙醇10h，95％乙醇4h，无水乙醇I2h，无水乙醇II 2h)，透明(二甲苯I 20min，二甲苯II 15min)，浸蜡3h，包埋组织块于石蜡中。(2)切片：采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm厚的薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上，60℃烘烤切片至少2h。(3)染色：切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，用苏木素染色30min，流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。(4)显微成像系统对组织样品拍照，采用Image Pro Plus6.0对组织中10个完整绒毛高度及相对应的10个隐窝深度进行测量，并计算出绒隐比；对组织测量10次肌层厚度并计算平均值。每个样品均在4倍物镜，5.5倍目镜下拍照，对图片中10个完整肠绒毛高度与10个对应隐窝深度进行测量，结果如表6、表7和图3-1、图3-2、图3-3所示。
空肠样品中，kk64组的绒毛高734.15±6.10μm要显著高于KY组绒毛高602.87±28.73μm(P＝0.000)和CK组绒毛596.06±23.96μm(P＝0.017)；kk64组的隐窝深143.11±18.48μm和绒隐比5.20±0.62μm均与KY组、CK组无显著差异。
回肠样品中，kk64组的绒毛高为715.55±36.87μm要显著高于KY组绒毛高554.28±15.60μm(P＝0.011)，与CK组无明显差异(P＝0.575)；kk64组的隐窝深为147.75±10.93μm显著小于CK组隐窝深218.49±30.10μm(P＝0.046)，与KY组无显著差异(P＝0.216)；kk64组绒隐比为4.85±0.22μm要显著大于CK组绒隐比为1.30±0.25μm(P＝0.001)，与KY组无明显差异(P＝0.194)。
盲肠样品中，kk64组的平均肌层厚度为298.38±16.72μm要显著小于KY组和CK组的平均肌层厚度。
这些结果表明，高丽魏斯氏菌kk64被肉兔摄入后有很大可能增强了肉兔肠道吸收营养物质的能力。
表6肉兔空肠和回肠的平均绒毛高、隐窝深、绒隐比
表7肉兔盲肠的平均肌层厚度
实施例12的结果表明，该大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64可以作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中，提高饲料价值、改善动物肠道健康、增强机体免疫力、提高动物产肉率等方面具有良好的应用前景，或者将kk64开发成益生菌制剂作用饲料添加剂应用在饲料中。
综上所述，本发明提供了一株高丽魏斯氏菌kk64(Weissella koreensis kk64)，该菌具有良好的耐酸耐胆盐特性，可以保证有足够生物量通过消化道环境的胁迫，进入宿主肠道发挥益生功效；该菌具有表面疏水特性和自动集聚能力，其黏附能力较高；该菌具有清除DPPH自由基和羟自由基的能力，因而具有较强的抗氧化能力，其发酵后的胞外代谢产物：胞外多糖和γ-氨基丁酸等，也具有较强的抗氧化能力；该菌可以产纤维素酶和β-半乳糖苷酶等饲料酶制剂，可以提高畜禽对饲料的消化、利用；该菌对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有良好的抑制效果和共聚集能力。此外，动物饲喂实验表明该高丽魏斯氏菌kk64作为益生菌饲料添加剂在提高饲料价值、改善动物肠道健康、增强机体免疫力、提高动物产肉率等方面具有良好的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一株大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64，其特征在于，于2023年3月14日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.63205，命名为：高丽魏斯氏菌（Weissella koreensis）。
2.权利要求1所述的大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64在制备抑菌抗菌药物上的应用，所述抑菌抗菌药物能抑制鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
3.一种抑制病原菌的益生菌制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64；所述病原菌为鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求3所述的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂还包括益生芽孢杆菌、酪酸梭菌、乳酸菌、酵母菌中的至少一种。
5.权利要求1所述的大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者权利要求3所述的益生菌制剂在制备饲料添加剂上的应用。
6.一种饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1所述的大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者权利要求3或4所述的益生菌制剂。
7.一种饲料，其特征在于，包括权利要求1所述的大熊猫源高丽魏斯氏菌kk64或者权利要求3或4所述的益生菌制剂或者权利要求6所述的饲料添加剂。
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