CN110964658A

CN110964658A - 一种具有免疫调节功能的副干酪乳杆菌et-22

Info

Publication number: CN110964658A
Application number: CN201811164616.7A
Authority: CN
Inventors: 洪维鍊; 刘伟贤; 赵雯; 孙婷; 司徒文佑
Original assignee: Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN110964658B

Abstract

本发明涉及一种具有免疫调节功能的副干酪乳杆菌ET‑22。本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET‑22菌株用于增强受试者免疫力的用途。本发明还提供一种用于增强受试者免疫力的方法，所述方法包括副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET‑22菌株施用给所述受试者以增强其免疫力。本发明还提供制备含有所述菌株的用于增强受试者免疫力的组合物的方法。本发明的菌株具有提高受试者体液免疫和细胞免疫能力，从而增强受试者的免疫力的功效。

Description

一种具有免疫调节功能的副干酪乳杆菌ET-22

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种能显著促进体液免疫和NK细胞杀伤活性的副干酪乳杆菌。

背景技术

免疫是人体的一种重要的生理功能，涉及非特异性免疫和特异性免疫，非特异性免疫不需要预先接触抗原，一旦病原体进入了机体，则会快速清除病原体。吞噬细胞和自然杀伤细胞都具有清除和杀伤作用，是非特异性免疫系统中的重要成员。特异性免疫具有特异地识别外来异物并具有免疫记忆能力的免疫细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)。免疫系统之间最首要的信息传导子就是细胞因子，每种细胞因子对不同的细胞类型具有不同的刺激功能，它们通过结合细胞表面的特异性受体而诱导细胞的生长发育和功能活性。人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康，抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所不希望的生物的侵入。

现存问题

增强人体免疫力是儿童、青少年、成年人与老年人多年龄群体及各个社会阶层共同的需求。研究同时指出，多种人体疾病如感冒、肠炎、关节炎症等均与免疫能力低下相关。益生菌具有多种功能，如调节肠道菌群失调、增强肠道免疫功能，抑制过敏反应。其中对益生菌免疫调节作用的研究表明益生菌可以同时促进特异性和非特异性免疫，对人体健康起到促进作用。因此是否能筛选得到具有提高免疫力特性的益生菌是本发明希望解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种副干酪乳杆菌及其用途。本菌株单菌即具有显著增强体液免疫，激活NK细胞活性，以便改善由于饮食不规律和工作压力增加而引发的免疫能力低下等问题。

在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)。

在一些实施方案中，本发明提供一种培养物，其包所述的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株。在一些实施方案中，所述培养物还可以包括适当的乳酸菌培养基，包括固体培养基和液体培养基，例如MRS培养基。在一些实施方案中，所述培养物包括副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株的冷冻干燥培养物。

在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于增强受试者免疫力的用途。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于增强受试者免疫力的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株施用给所述受试者以增强其免疫力。在一些实施方案中，本发明提供一种提高受试者抗体生产细胞数、提高半数溶血值HC₅₀和/或提高NK细胞活性的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)ET-22菌株施用给所述受试者。在一些实施方案中，所述菌株为具有活性的菌株。在一些实施方案中，所述菌株可以通过胃肠道途径施用给所述受试者。在一些实施方案中，所述菌株可以通过口服施用给所述受试者。在一些实施方案中，所述菌株通过其它适合肠道吸收的方式施用给受试者，例如通过不经过口腔、咽喉和食道的方式如饲管施用给受试者。

在一些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人、猴、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪等。

在一些实施方案中，通过本发明的方法，所述受试者的体液免疫和/或细胞免疫得到增强。

在一些实施方案中，所述方法提高受试者的抗体生成细胞数。

在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备受试者免疫调节的组合物的用途。在一些实施方案中，所述组合物包括适合受试者肠道吸收的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包括食品组合物。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株可以和其它适当的增强免疫的物质联合使用。在一些实施方案中，所述副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株可以制成适当的食品组合物，包括保健食品、营养补充食品、功能食品等。在一些实施方案中，所述组合物中可以包括例如缓冲剂、赋形剂、稀释剂、载体、稳定剂和/或防腐剂。在一些实施方案中，所述食品可以包括饮品如粮食制品、油、肉制品、乳制品、水产品、罐头、含糖食品、冷食、酒品、宠物食品等。在一些实施方案中，所述食品可以包括饮品如乳制饮品、茶、咖啡、口香糖及洁牙糖、宠物用肉干或以上的组合。在一些实施方案中，本发明的菌株可以制备成食品组合物，例如乳制饮品、茶、咖啡，其中乳制饮品可包含发酵乳、酸奶、奶酪或乳粉。在组合物中，所述菌株可以以有效量存在。例如在食品组合物或医药组合物中，乳酸菌菌株的数量为10⁶CFU以上，例如10⁷CFU以上，10⁸CFU以上，10⁹CFU以上，10¹⁰CFU以上；较佳者，乳酸菌菌株的数量为10¹⁰CFU以上。

在本文中，益生菌可以指使用活的微生物，其能够添加到组合物如食品等中，保持活性并且对摄取含有所述益生菌的组合物的对象发挥其生理学作用。益生元可以指这样的物质，所述物质被添加到组合物如食品等中，其对微生物群的组分发挥作用，有利于建立对健康有利的细菌和/或阻碍致病细菌建立。在一些实施方案中，本发明的菌株可以制备成益生菌或益生元组合物。

在一些实施方案中，已经令人吃惊的发现副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比具有优异的免疫调节作用。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比具备提高受试者体液和/或细胞免疫力的作用。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比能够提高受试者体液和/或细胞免疫力(例如提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍)。在一些实施方案中，提高受试者体液和/或细胞免疫力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过抗体生成细胞实验和/或半数溶血值HC₅₀测定，以及NK细胞活性实验等测定。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株可以制备用于增强受试者免疫力的组合物和/或试剂盒。在一些实施方案中，所述增强受试者免疫力的组合物和/或试剂盒还可以包括其它适当的增强免疫力的物质。

在一些实施方案中，本发明提供一种生产用于制备增强受试者免疫力的组合物的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株加入到组合物中。

本发明提供的菌株可以用于增强机体的免疫反应，具体包括：

(1)提高抗体生成细胞数

(2)半数溶血值HC₅₀

(3)激活NK细胞活性。

附图说明

图1.L.paracasei ET-22模拟肠道环境耐受性，胃酸、胆盐环境耐受能力。

图2.L.paracasei ET-22细胞黏附能力。

图3.L.paracasei ET-22激活抗体生成细胞数。

图4.L.paracasei ET-22血清溶血素半数溶血值(HC₅₀)。

图5.L.paracasei ET-22激活NK杀伤细胞活力。

【生物材料保藏】

本发明的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株保藏于：

中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年12月18日、保藏编号CGMCC No.15077；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)K56菌株保藏于：

中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年12月29日、保藏编号CGMCC No.15139；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义

本发明所述的乳酸菌菌株的冷冻干燥培养物已保藏于中国典型培养物保藏中心以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏的详细资料如下表所示：

乳酸菌菌株的保藏资料

菌株名	分类	保藏编号	保藏日期
				ET-22	副干酪乳酸杆菌	CGMCC 15077	2017年12月18日

乳酸菌菌株的形态学以及一般性质

根据16S rDNA序列分析以及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。上述菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于下表：

乳酸菌菌株的形态学及一般性质特征

本菌株的发酵条件为：

MRS液体培养基：蛋白胨，10.0g；牛肉膏，10.0g；酵母浸粉，5.0g；葡萄糖，20.0g；磷酸氢二钾，5.0g；柠檬酸氢二铵，2.0g；乙酸钠，5.0g；七水合硫酸镁，0.5g；四水合硫酸锰，0.2g；吐温80，1.0g；琼脂15.0g；蒸馏水1000mL。调整pH至6.2～6.4之间，121℃灭菌15分钟。

L.paracasei ET-22为微好氧菌，兼性厌氧环境生长较佳，产乳酸，具有耐酸性，可耐受pH值2.5的酸性环境及耐0.4％的胆盐环境4小时，嗜中温菌，生长温度范围在15～45℃，最适生长温度在37℃左右。

实施例1.人工胃液、肠液耐受性、人工胆汁耐受性

L.paracasei ET-22活化三次后分装8支，取一支进行菌落计数，计算初始活菌数。其余七只，以4000rpm离心10min，除去上清液后置于pH 2.5培养基中培养，37℃，培养1～3小时，每小时取一管混合液，以4000rpm离心10min，除上清液后，用5mL RO water清洗两次后计算活菌数。另外4支3小时后以4000rpm离心10min，去除上清液(pH 2.5MRS broth)后，以含1.5％牛胆汁MRS broth将4管充分混匀，在平均分配至4管，37℃培养1～4小时。每小时取1管混合液，以4000rpm离心10min，去除上清液后，用5mL RO Water清洗两次后计算存活菌数。统计不同时间测得活菌数的变化，进行比较分析，菌株的存活率见图1.

结果显示，总菌数经由酸性培养基及胆盐环境连续处理，L.paracasei ET-22经模拟消化环境连续7小时之胃酸、胆碱处理仍维持5次方菌数，证明L.paracasei ET-22是可以通过人体消化系统环境的严格考验。

实施例2.肠道细胞吸附效果

将载玻片以镊子夹取盖玻片，酒精灯杀菌后，放入6孔盘中备用。将Caco-2细胞从保藏冻管取出，调整细胞后，移至6孔盘中培养，待满盘后，再进行实验。试验时，移除盘中液体，以PBS缓冲液清洗两次后，每孔加入1.5mL菌液(1×10⁹CFU/mL)及1.5mL细胞培养液(含有10％PBS及1％penicilin-streptomycin)混匀，于恒温培养箱中培养(37℃，5％CO₂)4小时后，无菌PBS清洗两次，甲醇固定细胞，革兰氏染色，显微镜下计算活菌数。

通过黏附实验对菌株对Caco-2细胞的黏附性进行检测，结果如图2，L.paracaseiET-22对Caco-2细胞具有较强的黏附性。

实施例3：免疫调节活性分析

3.1体液免疫实验

3.1.1抗体生成细胞检测实验

经过绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑，溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。

使用PBS悬浮于每日动物灌胃前依据不同灌胃量分别调整活菌样品浓度(用量为约10⁷-10⁹CFU/天)，动物连续给样28天后，经腹腔对每只小鼠注射SRBC 0.2mL进行免疫。将SRBC免疫4天后的小鼠处死，取脾，制成5×10⁶个细胞/mL的细胞悬液。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加20％(V/V，用生理盐水配置)压积SRBC 50μL，脾细胞悬液200μL，迅速混匀，倾倒至已刷琼脂糖薄层的六孔板上，带琼脂凝固后，放入二氧化碳培养箱中继续孵育1h，然后加入SA缓冲液稀释的补体(1∶10)，继续孵育2h，计数溶血空斑数。

抗体生成细胞数结果如图3所示，样品组与对照组相比，L.paracasei ET-22、L.paracasei K56(CGMCC 15139)促进抗体生成细胞数与对照组具有显著差异(p＜0.05)。

3.1.2血清溶血素半数溶血值(HC₅₀)的测定

动物连续给样28天后，经腹腔对每只小鼠注射SRBC 0.2mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于1.5mL离心管内，4℃放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min收集血清。取血清用SA缓冲液稀释100倍。将稀释后的血清加入96孔板，每孔100μL，再依次加入10％(v/v)SRBC 50μL，补体100μL(用SA溶液按1∶8稀释)，置37℃恒温水浴中保温30min，1500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50μL，加入另一个96孔培养板内，加文奇氏试剂150μL，同时设半数溶血孔，加入10％(v/v)SRBC 12.5μL，再加文奇氏试剂至200μL，用震荡期充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。

溶血素的量以半数溶血值(HC₅₀)表示，按以下公式计算：

从图4可以看出，与对照组相比，L.paracasei ET-22组半数溶血值HC₅₀具有显著性差异(p＜0.05)，且高于L.paracasei K56。

3.2NK细胞活性试验

动物连续给样28天，开始实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，用前以Hank’s液洗2次，用含10％小牛血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为1×10⁵个/mL(靶细胞)。小鼠颈椎脱臼猝死，无菌取脾，制成皮细胞悬液，用Hank’s液洗2次，1000rpm离心10min，再用2mL含10％含小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬，用台盼蓝活细胞染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL(效应细胞)，使效靶比为100：1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL，上述均设三个平行孔。37℃，5％CO₂培养箱中培养4h，将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，然后每孔加入1mol/L的HCL溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK活性按下式计算：

由图5.可知，L.paracasei ET-22激活NK细胞活性的能力高于L.paracasei K56，且与对照组相比具有显著差异(p＜0.05)。

由实验结果可知，L.paracasei ET-22抗体生成细胞实验和半数溶血值HC₅₀结果阳性，则判定样品L.paracasei ET-22体液免疫阳性；NK细胞活性实验结果阳性，可判定样品L.paracasei ET-22的NK细胞活性实验阳性。综上，可认为L.paracasei ET-22具有增强免疫力的功效。

实施例4：肠道菌群调节效果(测序结果)

本实施例意图证实本发明的副干酪乳杆菌在肠道调节方面的效果，其原理和步骤参见“保健食品检验与评价技术规范-调节肠道菌群功能判定标准”。本实验采用16S rDNA测序结果。

实验样品：菌粉样品(活菌数见包装规格)由内蒙古乳业技术研究院有限责任公司提供。

实验材料：6周龄健康成年BABL/c小鼠182只，体重约18-20g。

实验步骤1.样品准备

活菌样品(ET-22)：依据样品规格，各称取1g活菌样品，分别使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x10⁹CFU/ml。

高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为10⁹CFU/20g。

中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小鼠灌胃剂量为10⁸CFU/20g。

低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为10⁷CFU/20g。

2.调节肠道菌群实验

(1)6周龄BABL/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿度10-60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。

(2)适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只，分组情况见表1。

表1调节肠道菌群实验分组

(3)开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。

(4))实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1-14天给予PBS，实验组分别依据表1灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每周称重一次，根据体重调整灌胃量。

(5)14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。

3小鼠肠道微生物多样性变化

微生物多样性是基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库进行测序。通过对Reads拼接过滤，OTUs(Operational TaxonomicUnits)聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成；将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在菌属水平上的群落结构。

通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了各样品在97％相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数，绘制了样品稀释曲线及等级丰度曲线；进一步进行α多样性分析(Alpha Diversity)、β多样性分析(Beta Diversity)和显著物种差异分析等等，可以挖掘样品之间的差异。肠道菌群α多样性指数比较：Chao1和ACE指衡量物种丰度即物种数量的多少；Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。相同物种丰度情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高。在属的水平与对照组相比，ET-22干预后可显著增加小鼠肠道中的相对丰度。其中低剂量组的OTU、ACE、Chao1指数显著上升，显示ET-22低剂量最能够明显增加肠道微生物多样性。

黄色(下划线)标示：与对照组相比有统计上显著差异(p＜0.05)。

在致病菌属的水平，控制组相比，ET-22低剂量与中剂量两组小鼠肠道中的脱硫弧菌(Desulfovibrio)均显著下降；中剂量与高剂量两组的幽门螺杆菌(Helicobacter)数量显著下降；低剂量与中剂量三组的高埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)均显著下降。BL-99可显著增加小鼠肠道中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度，且BL-99低剂量组对乳酸杆菌(Lactobacillus)的增加程度最为显著。

因此，补充不同剂量的ET-22可以调节肠道菌群平衡，抑制有害菌甚至是致病菌数量，起到潜在的健康之功效。

除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。所附权利要求书意图涵盖这类等同物。

本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过所附权利要求书示出，说明书和实施例仅是示例性的。

Claims

1.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于增强受试者免疫力的用途。

2.一种用于增强受试者免疫力的方法，所述方法包括副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)ET-22菌株施用给所述受试者以增强其免疫力。

3.权利要求2所述的方法，其中所述菌株为具有活性的菌株。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述菌株通过胃肠道途径施用给所述受试者。

5.权利要求2或3所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

6.权利要求2或3所述的方法，其中增强所述受试者的体液免疫和/或细胞免疫。

7.权利要求2或3所述的方法，其中所述方法提高抗体生成细胞数、提高半数溶血值HC₅₀和/或提高NK细胞活性。

8.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备增强受试者免疫力的组合物的用途。

9.权利要求8所述的用途，其中所述组合物包括食品组合物。

10.一种制备用于增强受试者免疫力的组合物的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株加入到组合物中。