CN114480229A - 一种动物双歧杆菌乳亚种菌株wkb148及其产品与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148及其产品与应用”属于微生物技术领域。所述动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的保藏编号为CCTCC NO:M 2022189。本发明还提供基于所述菌株WKB148的调节病原菌或有益菌制品和调节短链脂肪酸含量的制品。动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148能增加小鼠肠道中二代益生菌Akkermansia spp.的相对丰度，并能有效抑制福氏志贺氏菌等病原菌，增加小鼠肠道中保护性菌Allobaculum spp.的相对丰度。可以增加小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，在调节肠道菌群结构方面具有非常广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148及其产品与应用。
背景技术
乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）一般指动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis），是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一。在微生态学上属于菌群。1899年法国巴斯德研究院的蒂瑟尔（Tissier)首次从母乳喂养的婴儿大便中分离到了该菌，并指出它对乳儿的营养和预防肠道疾病具有重要作用。该菌是人和动物肠道中重要的生理性细菌。参与免疫、营养、消化和保护等一系列的生理过程，发挥着重要的功能。
阿克曼氏菌属（Akkermansia spp.）目前主要包括Akk菌和A.glycaniphila两种，Akk菌能够以黏蛋白作为唯一碳源和氮源，产生短链脂肪酸来为宿主提供能量。Akk菌作为益生菌中具有巨大潜力的二代益生菌，在益生菌研究领域中具有独一无二的地位。Akk 菌被广泛认为是改善炎症性肠病、肠易激综合征、糖尿病、肥胖症、酒精肝和阿尔兹海默症等疾病的一种新的潜在候选菌。
Allobaculum菌属（Allobaculum spp.）是人体肠道中重要的短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸作为肠道微生物的最终代谢产物，能通过降低肠道中的pH值，抑制病原菌生长，促进有益菌的增殖，从而起到平衡肠道微生态环境；短链脂肪酸为肠粘膜细胞提供能量来源，促进肠上皮细胞增殖，有利于维护肠道屏障，抵抗炎症发生。因此，Allobaculum spp.对维护肠屏障的完整性和肠道免疫系统的构建有重要作用，是肠道中的保护性菌群，肠道中Allobaculum spp.数量的减少与便秘、结肠炎、过度肥胖、重金属中毒等很多疾病紧密相关。
目前尚未见动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株可调节Akkermansia spp.、Allobaculum spp.、福氏志贺氏菌或单增李斯特氏菌的报道。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述空白，本发明的目的在于提供一种可调节肠道阿克曼氏菌属Akkermansia spp.和Allobaculum菌属的动物双歧杆菌乳亚种WKB148及其应用。该菌株分离于母乳，具有较强的耐酸耐肠液性能，具有抑制常见病原菌的能力，具有较强的黏附能力，黏附于肠道上皮细胞，发挥益生作用。本发明目的还在于提供一种调节肠道阿克曼氏菌属和Allobaculum菌属的功能性菌剂、食品、功能食品和或药品。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022189。
保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在制备调节病原菌或有益菌制品和/或调节短链脂肪酸制品方面的用途。
所述调节病原菌或有益菌指：抑制病原菌或提高有益菌的相对丰度；
优选地，所述调节短链脂肪酸指增加肠道中短链脂肪酸的含量。
所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
优选地，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属；
优选地，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
一种调节病原菌或有益菌制品，包括活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
优选地，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属。
所述的一种调节病原菌或有益菌制品还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自药物或食品。
一种调节短链脂肪酸制品，包括活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
所述的一种调节短链脂肪酸制品还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自药物或食品。
在一些国家或地区专利法允许的情况下，本发明还请求保护保藏编号为CCTCCNO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在调节病原菌或有益菌和/或调节短链脂肪酸方面的用途。
本发明提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148，其分类命名：动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis），保藏编号：CCTCC NO: M 2022189；保藏时间：2022年03月04日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
所述的动物双歧杆菌乳亚种菌株具有以下特征：
（1）菌落形态：在含0.05%L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上形成圆形、灰白色、不透明、边缘整齐、表面凸起、光滑且湿润菌落；
（2）菌体形态：显微镜下观察为革兰氏阳性细菌，直杆或弯曲短杆，单个或成对排列，V型或弯曲状；
（3）菌种鉴定：进行16S rRNA基因测序，测得序列用BLAST与NCBI GenBanK数据库中的基因序列进行相似性分析，确定该菌株是动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）。
（4）模拟胃肠液具有较强的耐受能力，在pH3的人工胃液中处理3h时活菌存活率为106.4%，在pH8的人工肠液处理3h活菌存活率为112.88%。
（5）具有抑制常见肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长能力。
（6）具有较强的黏附Caco-2结肠癌上皮细胞的能力，其黏附能力是明星菌株LGG的2倍多。能与肠道上皮细胞发生黏附，发挥其益生作用。
（7）具有上调Akkermansia spp.含量和Allobaculum spp.含量的作用，增加小鼠肠道中短链脂肪酸含量。
本发明提供所述动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在制备微生态制剂中的应用。所述微生态制剂包括固体制剂或液体制剂。
所述微生物制剂的制备方法是将上述动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在含有L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中活化培养2代，将活化的菌种以2％的接种量接种至培养基中，在37℃、转速100rpm的条件下发酵16h后，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2-3次后，得到微生态制剂；或者将收集得到的上述菌体用保护剂重悬，经冷冻干燥得到动物双歧杆菌乳亚种菌株微生态制剂。
本发明提供上述动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在制备食品、保健品或药品中的应用。
所述食品、保健食品或药品用于调节Akkermansia spp.和Allobaculum spp.数量，和或增加肠道中的短链脂肪酸含量。
所述食品包括保健食品、含活性乳酸菌的食品或发酵食品；所述的保健食品包括但不限于发酵食品或微生态制剂。所述发酵食品包括发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料等。所述发酵乳制品包括常温酸奶、低温酸奶、搅拌型酸奶、凝固型酸奶、饮用性酸奶、乳酪、乳酸菌饮料。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148，对模拟胃肠液有很强的耐受能力，对常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有显著的拮抗作用，此外，还具有较强的黏附能力，能与肠道上皮细胞发生黏附，发挥其益生作用。动物实验研究发现，动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148能增加小鼠肠道中二代益生菌Akkermansia spp.的相对丰度，增加小鼠肠道中保护性菌Allobaculum spp.的相对丰度。可以增加小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，在调节肠道菌群结构方面具有非常广阔的应用前景。
本发明WKB148菌株的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO: M 2022189；
分类命名：Bifidobacterium animalis subsp. lactis；
保藏日期：2022年03月04日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在平板上的菌落形态图。
图2为动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148经革兰氏染色后的菌体形态图。
图3为动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和实验例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实验例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
下列实验例中的培养基成分如下：
MRS培养基（1 L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉 10 g，酵母浸粉 5 g，葡萄糖 20 g，柠檬酸二铵 2 g，无水乙酸钠 5 g，磷酸氢二钾 2 g，硫酸镁 0.2 g，一水硫酸锰 0.19 g，吐温-80 1 g，配置固体培养基时加入2%琼脂粉，115℃灭菌20 min。
第1组实施例、本发明的菌株WKB148
本组实施例提供一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022189。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为CCTCCNO: M 2022189的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148的行为均落入本发明的保护范围。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂；还可制成食品，例如，发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料等。所述发酵乳制品包括常温酸奶、低温酸奶、搅拌型酸奶、凝固型酸奶、饮用性酸奶、乳酪、乳酸菌饮料等。
第2组实施例、本发明菌株WKB148的制品用途
本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在制备调节病原菌或有益菌制品和/或调节短链脂肪酸制品方面的用途。
在一些实施例中，所述调节病原菌或有益菌指：抑制病原菌或提高有益菌的相对丰度；
优选地，所述调节短链脂肪酸指增加肠道中短链脂肪酸的含量。
在另一些实施例中，所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
优选地，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属；
优选地，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
优选地，所述制品选自药物或食品。
本文中的阿克曼氏菌属（Akkermansia spp.）、Allobaculum菌属（Allobaculumspp.）具有本领域技术人员通常理解的技术含义，Allobaculum菌属（Allobaculum spp.）目前尚无通用的中文名称。阿克曼氏菌属（Akkermansia spp.）、Allobaculum菌属（Allobaculum spp.）可以是“Aged citrus peel (chenpi) extract causes dynamicalteration of colonic microbiota in high-fat diet induced obese mice”一文记载的Akkermansia spp.和Allobaculum spp.。
第3组实施例、本发明的调节病原菌/有益菌制品
本组实施例提供一种调节病原菌或有益菌制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述调节病原菌或有益菌制品包括活性成分；所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
在一些实施例中，所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
优选地，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属。
在进一步的实施例中，所述一种调节病原菌或有益菌制品还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自药物或食品。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CCTCC NO: M 2022189的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
第4组实施例、本发明的调节短链脂肪酸制品
本组实施例提供一种调节短链脂肪酸制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述调节短链脂肪酸制品包括活性成分，所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
在一些实施例中，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
在进一步的实施例中，所述一种调节短链脂肪酸制品还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自药物或食品。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CCTCC NO: M 2022189的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
第5组实施例、本发明菌株WKB148的适应症用途
本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在调节病原菌或有益菌和/或调节短链脂肪酸方面的用途。
在一些实施例中，所述调节病原菌或有益菌指：抑制病原菌或提高有益菌的相对丰度；
优选地，所述调节短链脂肪酸指增加肠道中短链脂肪酸的含量。
在另一些实施例中，所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
优选地，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属；
优选地，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
实验例1、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的分离筛选与鉴定
（1）菌株的分离筛选
采集健康母乳样品，取健康母乳样品1g至9mL无菌生理盐水中，充分振荡分散均匀，无菌生理盐水稀释至合适梯度，取100μL均匀涂布于添加有5%（V/V）的莫匹罗星锂盐、且含有0.05%的L-半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板上，37℃厌氧条件下培养48～72h后，挑选不透明乳白色、圆形有光泽、边缘整齐、表面凸起且湿润的单克隆菌落，在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，经过细胞形态和个体形态观察，获得双歧杆菌菌株。
（2）菌株的形态学和16S rDNA分子生物学鉴定
形态学鉴定包括菌株在平板培养基上的菌落形态以及革兰氏染色后显微镜下的菌体形态。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的菌落、菌体形态和电镜见图1、图2和图3。在含0.05%L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上形成圆形、灰白色、不透明、边缘整齐、表面凸起、光滑且湿润菌落；显微镜下观察为革兰氏阳性的细菌，菌体呈直短杆或弯曲短杆状，单个或成对排列， V型或弯曲状。
动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148菌株经液体培养后，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ ID No.2）和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID No.3）扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。将获得的目的片段进行测序分析，测序结果在NCBI数据库中进行比对分析，鉴定所得菌株为乳双歧杆菌，其分类命名为动物双歧杆菌乳亚种，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。将该菌株命名为WKB148，并送保藏。
WKB148菌株的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO: M 2022189；
分类命名：Bifidobacterium animalis subsp. lactis；
保藏日期：2022年03月04日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
实验例2、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对人工胃肠液耐受性
模拟人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
模拟人工肠液：配制PBS溶液，加入0.1%胰蛋白酶和0.3%的牛胆粉，用0.1mol/LNaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在厌氧条件下活化培养2代。活化后的动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148菌液离心，弃上清，收集菌体，制备菌悬液调整活菌数为108CFU/mL。取1mL菌悬液离心后，去掉上清液，收集菌体后，分别接入1mL配制耐受溶液，并充分混匀，37℃条件下孵育，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见下表。其中，菌株存活率计算公式为：N1/N0×100%，式中N0表示菌株0h的活菌数（CFU/mL），N1表示菌株3h的活菌数（CFU/mL）。
动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148在模拟人工胃液和人工肠液中的耐受结果见表1。由表1可知，该菌株在pH3模拟胃液活菌存活率为100.5%，在pH8.0模拟肠液中处理3h后活菌存活率为100.2%。实验结果表明，该动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148具有较强的耐受胃肠液的能力，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效，所述特性是作为益生菌的基础。
表1. 动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148耐受模拟胃肠道存活率
注：活菌数单位为 log CFU/mL。
上表1中处理3h的活菌数比0h活菌数有略微升高，属于正常的检测误差范围，这说明菌株处理3h后没有变化，pH3.0和pH8.0的环境对菌株存活无任何不利影响。
实验例3、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB对病原菌的抑制能力
取拮抗菌株按2%（V/V）接种至含有0.05%的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液浓度为108CFU/mL。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μL拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
表2. 动物双歧杆菌乳亚种菌株发酵液对病原菌的抑制作用
由表2可得，动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌、福氏志贺氏菌及单增李斯特氏菌的生长均有非常强的抑制作用。
实验例4、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的黏附能力测试
菌种活化：动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148按2%接种量接种于含有0.05%的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。
CaCo-2细胞培养：从液氮罐中取出Caco-2细胞，将冻存管迅速置于37℃水浴1-2min复苏细胞，700 rpm/min离心3 min后小心收集细胞，在细胞培养瓶中，加入 4mL DMEM完全培养液（含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺添加剂、1%青霉素-链霉素溶液和1%非必须氨基酸溶液），于5% CO2恒温培养箱中37℃孵育，每天换1次培养液，细胞生长良好且到达70%-80%聚合时，用0.2%消化液（胰酶-EDTA）进行消化传代。
黏附性试验：将 消 化 的CaCo-2细 胞 调 整 浓 度 到105cell/mL，接种到 12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5%CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层后进行实验。实验时，弃去培养板中培养基后，用无菌PBS洗涤细胞2次。使用DMEM培养基将菌液调节为108CFU/mL，在细胞培养板中每孔加入1 mL调节好的菌液，并于5% CO2培养箱中37℃孵育2 h。孵育完成后小心移去上清，用无菌PBS缓冲液轻柔洗涤5次后，每孔加入0.2 mL 胰酶-EDTA缓冲液消化细胞5 min，消化完成后每孔加入0.8 mL无菌 PBS缓冲液，吹打均匀并进行稀释涂板计数，同时用血球计数器对孔中的细胞进行计数。每个实验做3个平行，鼠李糖乳杆菌LGG是行业内公认的黏附性较好的商业菌株，通过黏附实验对菌株对Caco-2细胞的黏附性进行检测，最终结果按照下列公式计算： 黏附能力=(黏附细菌数（CFU/孔）)⁄(细胞数（个/孔）)。
黏附率=(黏附细菌数（CFU/孔）)⁄(细菌数（CFU/孔）)。
实验结果如表3。
表3. 动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148黏附特性测试结果
由表3结果可知，本发明的动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148菌株黏附性能有明显优势。动物双歧杆菌乳亚种WKB148对CaCo-2的黏附能力是8.23CFU/cell，而LGG对CaCo-2的黏附能力是4.09CFU/cell，动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对CaCo-2的黏附能力是明星菌株LGG的黏附能力的2倍多。
实验例5、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对Akkermansia spp.和Allobaculumspp.的调节能力
动物实验：SPF级（无特定病原体级）C57BL/6雄性健康小鼠24只，体重20±2g。动物饲养室温温度 23±2℃，湿度 50%±10%，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养5天后随机分组，每组12只，分为2组，包括对照组、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148组（WKB148组）。对照组每天灌胃无菌生理盐水，每天一次，每次0.2μl，WKB148组每天灌胃含2.0×109CFU/mL动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148菌悬液，灌胃体积均为0.2mL，连续14天。
第14天收集小鼠粪便后，应用16S rDNA测序技术对小鼠粪便中的Akkermansiaspp.和Allobaculum spp.进行分析。
表4. 各组小鼠粪便中Akkermansia spp.和Allobaculum spp.的相对丰度（%）
结果如表4所示，相较于对照组，小鼠灌胃动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148后，小鼠肠道中Akkermansia菌的相对丰度提高了16.3倍，Allobaculum菌的相对丰度提高了3.3倍。说明动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148能增加小鼠肠道中二代益生菌Akkermansia spp.和肠道保护性菌Allobaculum spp.的相对丰度。
实验例6、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对Akkermansia muciniphila的调节作用
根据实验例5，通过灌胃动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148后，小鼠肠道中Akkermansia菌的相对丰度显著提高。通过定量PCR(qPCR)对来自小鼠盲肠内容物的微生物区的特定细菌Akkermansia muciniphila进行分析，实验见表5：
表5. 各组小鼠粪便中Akkermansia muciniphila的相对丰度（%）
由表5中结果可知，小鼠肠道中阿克曼氏菌属（Akkermansia spp.）主要菌种是Akk菌（Akkermansia muciniphila），动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的存在主要增加了Akkermansia muciniphila的相对丰度。说明动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148的存在对小鼠肠道中的（Akkermansia muciniphila）的丰度增加具有显著促进作用。
实验例7、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对小鼠肠道中短链脂肪酸含量的影响
动物实验处理方法同实验例4，第14天收集不同组小鼠粪便，利用GC-MS测定小鼠粪便中短链脂肪酸含量。实验结果如表6所示。
表6. 小鼠肠道中短链脂肪酸含量（mg/g）
《Rhizoma coptidis alkaloids alleviate hyperlipidemia in B6 mice bymodulating gut microbiota and bile acid pathways》一文报道 A. muciniphila 可以产生短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸等），可以与肠道中产丁酸盐细菌协同合作促进丁酸盐的产生，从而激活GPR41和GPR43受体，并能改善宿主糖脂代谢异常。Allobaculum spp.是重要的短链脂肪酸产生菌，可以维护肠道屏障的完整性和调节肠道免疫系统。实验结果表明，与对照组相比，动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148组小鼠粪便中短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的含量均高于对照组。说明动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148摄入后，可以显著增加粪便中短链脂肪酸含量。
实验例8、动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对小鼠肠道短链脂肪酸产生的作用
动物实验：SPF级（无特定病原体级）C57BL/6雄性健康小鼠24只，体重20±2g。动物饲养室温温度 23±2℃，湿度 50%±10%，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养5天后随机分组，每组12只，分为2组，包括HFD组（脂肪含60%kcal）、HFD-动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148组（HFD-WKB148组）。
实验程序：每周连续持续5天，每只小鼠经口给予：HFD组给予无菌PBS缓冲液，HFD-WKB148组给予动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148菌悬液为109CFU/mL（动物双歧杆菌乳亚种菌株培养得到的菌体，用无菌PBS重悬得到菌悬液）。在治疗一周之后，HFD组、HFD-WKB148组经口给予HFD饮食。试验结束后，收集小鼠盲肠内容物评估短链脂肪酸运输的基因GPR41和GPR43的表达水平（相对改变）。
表7. 动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148对小鼠肠道GPR41和GPR43表达的影响
实验结果表明：在HFD饮食下经动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148治疗的小鼠中GPR41和GPR43的表达水平显著增加。
上述实施例和实验例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实验例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 微康益生菌(苏州)股份有限公司
<120> 一种动物双歧杆菌乳亚种菌株WKB148及其产品与应用
<130> P220397/WKY
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148
16S rDNA序列
<400> 1
gtcgaacggg atccctggca gcttgctgtc ggggtgagag tggcgaacgg gtgagtaatg 60
cgtgaccaac ctgccctgtg caccggaata gctcctggaa acgggtggta ataccggatg 120
ctccgctcca tcgcatggtg gggtgggaaa tgcttttgcg gcatgggatg gggtcgcgtc 180
ctatcagctt gttggcgggg tgatggccca ccaaggcgtt gacgggtagc cggcctgaga 240
gggtgaccgg ccacattggg actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgcggg atggaggcct 360
tcgggttgta aaccgctttt gttcaagggc aaggcacggt ttcggccgtg ttgagtggat 420
tgttcgaata agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag 480
cgttatccgg atttattggg cgtaaagggc tcgtaggcgg ttcgtcgcgt ccggtgtgaa 540
agtccatcgc ctaacggtgg atctgcgccg ggtacgggcg ggctggagtg cggtagggga 600
gactggaatt cccggtgtaa cggtggaatg tgtagatatc gggaagaaca ccaatggcga 660
aggcaggtct ctgggccgtc actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat 720
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtggatgctg gatgtggggc cctttccacg 780
ggtcccgtgt cggagccaac gcgttaagca tcccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta 840
aaactcaaag aaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgcggat taattcgatg 900
caacgcgaag aaccttacct gggcttgaca tgtgccggat cgccgtggag acacggtttc 960
ccttcggggc cggttcacag gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ccgcatgttg ccagcgggtg atgccgggaa 1080
ctcatgtggg accgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca gatcatcatg 1140
ccccttacgt ccagggcttc acgcatgcta caatggccgg tacaacgcgg tgcgacacgg 1200
tgacgtgggg cggatcgctg aaaaccggtc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact 1260
gcgtgaaggc ggagtcgcta gtaatcgcgg atcagcaacg ccgcggtgaa tgcgttcccg 1320
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gaccct 1386
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 通用引物27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 通用引物1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (10)
1.一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022189。
2.保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在制备调节病原菌或有益菌制品和/或调节短链脂肪酸制品方面的用途。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在制备调节病原菌或有益菌制品和/或调节短链脂肪酸制品方面的用途，其特征在于，所述调节病原菌或有益菌指：抑制病原菌或提高有益菌的相对丰度；
和/或，所述调节短链脂肪酸指增加肠道中短链脂肪酸的含量。
4.根据权利要求2或3所述的保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148在制备调节病原菌或有益菌制品和/或调节短链脂肪酸制品方面的用途，其特征在于，所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
和/或，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属；
和/或，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
5.一种调节病原菌或有益菌制品，包括活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
6.根据权利要求5所述的一种调节病原菌或有益菌制品，其特征在于，所述病原菌选自：福氏志贺氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的一种或一种以上；
和/或，所述有益菌选自阿克曼氏菌属和/或Allobaculum菌属。
7.根据权利要求5或6所述的一种调节病原菌或有益菌制品，其特征在于，还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
和/或，所述制品选自药物或保健食品。
8.一种调节短链脂肪酸制品，包括活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO: M 2022189的一种动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）菌株WKB148。
9.根据权利要求8所述的一种调节短链脂肪酸制品，其特征在于，所述短链脂肪酸选自乙酸、丙酸、丁酸。
10.根据权利要求8或9所述的一种调节短链脂肪酸制品，其特征在于，还包括：辅料；所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
和/或，所述制品选自药物或保健食品。
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