WO2015007941A1 - Nueva cepa de bifidobacterium animalis subsp. lactis cect 8145 y su uso para el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y obesidad y enfermedades asociadas - Google Patents

Nueva cepa de bifidobacterium animalis subsp. lactis cect 8145 y su uso para el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y obesidad y enfermedades asociadas Download PDF

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bif
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obesity
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Patricia Martorell Guerola
Mª Empar CHENOLL CUADROS
Daniel RAMÓN VIDAL
Pepa ORTIZ SERRANO
Silvia Llopis Pla
Núria GONZALEZ MARTÍNEZ
Salvador GENOVÉS MARTÍNEZ
Beatriz Casinos Ramo
Ángela SILVA ANGULO
Amaya ALEIXANDRE
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention is part of the food and pharmaceutical industry. It refers specifically to a new strain of the species Bifidobacter ⁇ um animalis subsp. lactis CECT 8145, its supernatants and / or culture, as well as extracts and / or bioactive compounds released by the strain, which, incorporated into food and / or pharmaceutical formulations, induce satiety, reduce appetite, body fat and cardiovascular risk, they cause weight loss, have antioxidant and anti-inflammatory activity and, consequently, have application in the treatment and / or prevention of overweight and / or obesity and / or their associated diseases.
  • Obesity and overweight are a metabolic and nutritional disorder with serious health consequences, being overweight a degree of obesity.
  • obesity has increased significantly in industrialized and developing countries.
  • the high risk of obesity in the incidence of several chronic diseases is recognized: arterial hypertension, coronary ischemic disease, cerebrovascular accidents, type 2 diabetes and certain forms of cancer, which are a major cause of morbidity and mortality in the countries of the Western Hemisphere.
  • ingredients can be added to act by inhibiting the accumulation of energy in the form of fat, either by decreasing the absorption or fat formation, either by stimulating the mobilization of fat with an increased lipolysis or by improving its lipid oxidation rates.
  • Another aspect that positively affects the prevention or treatment of overweight and obesity is to control and / or reduce appetite through the induction of a satiating effect on the individual by activating the metabolic regulation of appetite.
  • some studies suggest that obesity is accompanied by a state of chronic oxidative stress, which has been proposed as the link between obesity and some associated comorbidities such as insulin resistance and cardiovascular pathologies. (Molnar D, Decsi T, Koletzko B. "Reduced antioxidant status in obese children with multimetabolic syndrome.” Int J Obes Relat Metab Disord 2004; 28: 1197-202). Therefore, in recent years, different investigations are also being carried out on the possible role of supplementation with different dietary antioxidants in the improvement and prevention of overweight and obesity.
  • the intestinal microbiota and probiotics produce a positive health effect by regulating the immunological functions of the individual and protecting them from infections and chronic inflammation processes.
  • the intestinal microbiota As a new factor that could be involved in the regulation of body weight and diseases associated with obesity. Therefore, the intentional manipulation of the intestinal microbiota through the diet is proposed as a possible new tool to prevent or modify the risk of obesity and, in particular, the metabolic diseases associated with it.
  • US Patent US20120107291 describes the strain Bifidobacterium animalis subsp. B420 lactis with activity against diabetes, metabolic syndrome, obesity, tissue inflammation, etc.
  • strain B420 acts by positively influencing the immune system through the lymphoid tissue associated with the intestine and shows the ability to induce an improvement in glucose tolerance, the reduction of adipose tissue. mesenteric, reduction in inflammation rates, etc.
  • this strain there is no mention in the information available regarding this strain regarding a possible ability to induce a reduction in appetite or an increase in satiating effect as well as antioxidant capacity of the strain.
  • US Patent US2008267933 describes the strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 with activity against weight control and obesity through inducing satiating effect, improving energy metabolism, improving insulin sensitivity, metabolic syndrome, etc.
  • the effects produced by this strain may be the result of overexpression of certain genes related to energy metabolism - fat, sugar and insulin in addition to satiety - such as Scd1, Acrp30, Adn, Thrsp, Car3 and Apoa-4.
  • Scd1, Acrp30, Adn, Thrsp, Car3 and Apoa-4 a possible antioxidant capacity of the strain. Therefore, the technical problem of the present invention relates to the provision of new microorganisms capable of being used as ingredients in pharmaceutical and food formulations with better therapeutic and / or preventive activity against overweight and obesity as well as their associated diseases .
  • the strain of the present invention as well as the food and pharmaceutical compositions containing them, in addition to reducing body fat, have the capacity to induce satiety and reduce appetite and increase the capacity of resistance to oxidative stress in mammals after their intake. Additionally, the strain of the present invention, as well as the food and pharmaceutical compositions containing them, reduce the concentration of total cholesterol and triglycerides in the blood, in addition to reducing the concentration of glucose and some inflammation markers.
  • the present invention relates to a new strain of the species Bifidobacterium animalis subsp. lactis, deposited on 05/14/12 with access number: CECT8145 in the Spanish Type Crops Collection (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, c / Professor Agust ⁇ n Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, Spain, according to the provisions of the Budapest Treaty, the bioactive compounds released by this strain, supernatants and cultures of the strain, extracts containing biaoactive compounds, supernatants and / or cultures, and the formulation of any of them in food and pharmaceutical compositions.
  • CECT Spanish Type Crops Collection
  • the strain of the invention act by modulating the differentiated expression of certain genes that positively affect the reduction of body fat, which makes the strain of the present invention in the treatment and / or prevention of overweight and / or obesity as well as associated diseases, such as: metabolic syndrome, hypertension, glycemia, inflammation, type II diabetes, cardiovascular diseases, hypercholesterolemia, hormonal alterations, infertility, etc.
  • associated diseases such as: metabolic syndrome, hypertension, glycemia, inflammation, type II diabetes, cardiovascular diseases, hypercholesterolemia, hormonal alterations, infertility, etc.
  • the strain of the present invention acts by reducing body fat, weight, total triglyceride level, total cholesterol, glucose, TNFa factor and increasing adiponectin.
  • the transcriptomic study of the strain of the present invention shows that the ingestion of the strain induces an increase in metabolic pathways and processes related to carbohydrate metabolism (among others, oxidative phosphorylation and ATP synthesis), glutathione metabolism (reduction of oxidative stress levels), biosynthesis of cofactors and vitamins, lipid metabolism, nucleotide metabolism, glycosylation and membrane metabolism.
  • the object of the present invention is a microorganism as well as the food and pharmaceutical compositions that contain it, with utility in the treatment and prevention in mammals of overweight and obesity as well as their related diseases.
  • Said microorganism refers, in particular, to a new strain of the species Bifidobacterium animalis subsp. lactis, deposited on 05/14/12 with access number: CECT8145 in the Spanish Type Crops Collection (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, Professor Agust ⁇ n Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, Spain, according to the provisions of the Budapest Treaty.
  • the strain of the invention Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 will also be referred to as BIF-1.
  • the terms "related or associated diseases” and “diseases caused by overweight and / or obesity” include: metabolic syndrome, hypertension, blood glucose, inflammation, type II diabetes, cardiovascular diseases, hypercholesterolemia, alterations hormonal, infertility, etc.
  • bioactive products are understood to be obtained from the strain of the present invention, both its cellular components, compounds and molecules that are part of the strain, as well as the metabolites and molecules secreted therein, such as: intracellular components (eg, DNA, peptides, fatty acids, etc.) as components of the cell wall (proteins, peptides, fatty acids, etc.) that confer the desired preventive or therapeutic activity.
  • intracellular components eg, DNA, peptides, fatty acids, etc.
  • proteins proteins, peptides, fatty acids, etc.
  • compositions are understood as those which incorporate the strain of the present invention, the bioactive products derived therefrom, the supernatant and / or the extract and / or its cultivation thereof together with, at least one pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients to be used in the present invention are known in the state of the art to one skilled in the art.
  • the inventors of the present invention have managed to identify a new strain CECT8145 of the species Bifidobacterium animalis subsp. lactis that has novel biological activities against other strains of the same species belonging to the state of the art, which make it especially effective in the treatment and / or prevention of overweight and / or obesity as well as diseases caused by and / or related with overweight and / or obesity.
  • One of the novel biological activities in the strain of the present invention is its antioxidant activity and, ultimately, the ability to increase resistance to oxidative stress.
  • Oxidative stress is caused by an imbalance between the production of free radicals and the antioxidant defenses of the organism responsible for the detoxification of these radicals.
  • oxidative stress is not generated by a single mechanism, but by the confluence of several factors that, in short, can be summarized as a decrease in antioxidant agents in parallel to an increase in pro-oxidant elements.
  • Several studies support the existence of a Direct relationship between obesity and a reduction in the activity of the main antioxidant enzymes.
  • Malondialdehyde is a marker indicative of the degree of oxidation at the body level; the higher the level of oxidation, the level of this marker is increased and less protection against oxidative stress occurs; and vice versa.
  • Figure 5 shows, through survival in Caenorhabditis elegans, an increase in protection against oxidative stress.
  • Another of the novel biological activities of the strain of the present invention is the ability to induce an increase in satiety after ingestion, decreasing ghrelin levels (Figure 17).
  • ghrelin is the only circulating hormone with the potential to increase or stimulate appetite and, consequently, acts as a regulator of hunger and body weight. It is a gastrointestinal neuropeptide (endogenous ligand of the GH secretagogue receptor) recently isolated from the oxidative mucosa produced mainly in the stomach. Its blood concentration depends on diet, hyperglycemia and adiposity and leptin. It is secreted 1-2 hours before the meal and its concentration decreases dramatically after eating. It acts in the lateral hypothalamus and, theoretically, inhibits the secretion of proinflammatory cytokines and antagonizes leptin. Ghrelin, physiologically, increases gastric acid secretion and has other hormonal and cardiovascular functions.
  • the strain of the present invention is capable of lowering ghrelin levels, inducing an increase in satiety.
  • the strain of the present invention acts by reducing the level of total triglycerides, cholesterol, glucose, TNFa factor, and increasing the levels of adiponectin ( Figures 12, 9, 13, 14 and 15, respectively).
  • the levels of body fat reduction achieved by the strain of the present invention are surprisingly higher than the levels reached through other strains of the genus Bifidobacterium and, especially, with respect to the commercial strain belonging to the same species called Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 (figure 2).
  • the results illustrated in example 1 of the present report confirm that the ingestion of the strain of the present invention causes a reduction in body fat in the nematode Caenorhabditis elegans by at least 40% with respect to standard feeding conditions. Comparatively to the reduction of body fat produced by other strains of the same species known from the state of the art and, in particular, from strain Bb12, the strain of the present invention is capable of producing a reducing effect of body fat greater than 28 , 5% with respect to this strain Bb12; which demonstrates a greater effectiveness of the BIF-1 strain of the present invention against strains of the same species.
  • the strain of the present invention when incorporated into a food product, such as yogurt, fermented soybeans or juice, its effect on reducing body fat is greater than 11%, compared to the effect produced by a conventional food, be it yogurt, fermented soybeans or juice (figures 20, 21 and 22).
  • the transcriptomic study shows that the ingestion of the strain of the present invention induces an increase in metabolic pathways and processes related to carbohydrate metabolism (among others, oxidative phosphorylation and ATP synthesis), glutathione metabolism (reduction of oxidative stress levels), cofactor and vitamin biosynthesis, lipid metabolism, nucleotide metabolism, glycosylation and membrane metabolism.
  • differentially expressed genes have been identified as the following: Acox-1, Acs-5, Daf-22, Fat-7, Daf-16, Sod-4, Trxr-2, Asg-2 and Tph-1.
  • the Acox-1, Acs-5 and Daf-22 genes code for enzymes of the beta oxidation of fatty acids in peroxisome; Fat-7 and Daf-16 genes code for enzymes that act in the process of desaturation of fatty acids; the Sod-4, Trxr-2 and Asg-2 genes code for enzymes involved in maintaining redox cell balance and eliminating reactive oxygen species; the Asg-2 gene, by itself, codes for an enzyme involved in oxidative phosphorylation processes; and the Tph-1 gene codes for an enzyme involved in tryptophan metabolism and, therefore, in the synthesis of serotonin.
  • the strain of the present invention and the bioactive products secreted by it, as well as the supernatants, cultures and / or extracts of the strain, can be formulated and incorporated, individually or in combination with other microorganisms and / or functional ingredients. , to food compositions as well as pharmaceutical compositions, to be used in accordance with the present invention.
  • the strain of the present invention When the strain of the present invention is incorporated in combination with other microorganisms, they preferably belong to the genera Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Saccharomyces and / or Kluyveromyces, as per example: L. rhamnosus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. kefir, L. parakefir, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. paracasei, L. acidophilus, L paraplantarum, L. reuteri, Yes thermophilus, B. longum, B. Brief, B. bifidum, B. catenulatum, B.
  • the present invention also relates to a composition incorporating the bioactive compounds obtained from the strain of the present invention, the supernatants and / or the cultures of the strain, as well as the extracts obtained from the culture of the strain of the strain. invention.
  • compositions of the present invention which incorporate the strain of the present invention and / or the bioactive products secreted by it and / or the supernatants and / or the cultures and / or extracts, may be food or pharmaceutical compositions.
  • Said food or pharmaceutical compositions may be presented in liquid or solid form, including but not limited to, capsules and / or tablets.
  • the food and / or pharmaceutical compositions of the present invention incorporate the strain of the present invention in an amount between 10 5 cfu and 10 12 cfu per gram or milliliter of the composition and, preferably, between 10 7 and 10 11 cfu / go cfu / ml.
  • compositions of the present invention incorporate the bioactive compounds derived from the strain of the present invention, such as supernatants, extracts, peptides, etc., these are incorporated into the composition in a proportion of between 0.01 - 99% by weight over the total composition and, preferably, in a proportion of between 0.01-40%.
  • the food compositions incorporating the strain of the present invention, as well as the bioactive compounds derived therefrom, the supernatants, the extracts of their culture and / or the cultivation can be selected from the group comprising: fruit juices or vegetables, ice cream, infant formulations, milk, yogurt, cheese, fermented milk, powdered milk, cereals, confectionery products, products based on milk and / or cereals, nutritional supplements, soft drinks and / or dietary supplements, etc.
  • the dairy food products referred to in the present invention such as fermented milk, fresh cheeses or yogurts or their equivalents, dried or lyophilized, preferably represent suitable delivery systems incorporating the strain of the present invention and / or bioactive compounds derived therefrom and / or supernatants and / or extracts and / or culture.
  • the strain of the present invention and / or the bioactive compounds derived therefrom and / or the supernatants and / or extracts and / or culture of the strain may, where appropriate, be packaged in cellulose or gelatin capsules, capsules gel or tablets, among others, for food and pharmaceutical purposes.
  • the strain of the invention as well as the compositions containing it, are especially intended for use in mammals, that is, animals and humans, for the treatment of overweight and obesity and related diseases.
  • Objects of the present invention are therefore the strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, food and pharmaceutical compositions that comprise it, in active and inactive form, and optionally in combination with other microorganisms as well as a method for the treatment and / or prevention in mammals of overweight and / or obesity as well as associated diseases, such as: metabolic syndrome, hypertension, glycemia, inflammation, type II diabetes, cardiovascular diseases, hypercholesterolemia, hormonal alterations and infertility, characterized by understanding the administration of an effective amount of the strain of the invention Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 as well as food and pharmaceutical compositions containing it in accordance with the present invention
  • a method for the reduction of weight, total cholesterol, triglycerides and blood glucose, levels of TNFa factor, malondialdehyde and ghrelin, as well as an increase in adiponectin in mammals characterized by understanding the administration of an effective amount of the strain of the invention Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, as well as food and pharmaceutical compositions containing it in accordance with the present invention.
  • the present invention contemplates the use of the strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145, both in its viable and non-viable cell form ( Figure 4).
  • the non-viable cells of the invention inactivated by different methods (freezing, heat, radiation, etc.), can be used according to the present invention and form part of the present invention, since the desired effects are exerted, at least in part. , by structural components (such as DNA, cell wall components, etc.).
  • structural components such as DNA, cell wall components, etc.
  • an inactivated culture of the strain of the present invention reduces body fat in the animal model C. elegans; This could lead one to think that the functional effect is not only due to the metabolism of the strain, but also to the presence of certain compounds in the cell wall.
  • Figure 1 Screening of 23 strains of the genus Lactobacillus on the reduction of body fat in C. elegans.
  • Figure 2 Screening of 15 strains of the genus Bifidobacterium on the reduction of body fat in C. elegans.
  • Figure 3 Quantification of triglycerides in C. elegans N2 fed with strain CECT8145 (BIF-1) or subjected to a standard diet (NG medium).
  • Figure 4 Effect on fat reduction in C. elegans of a culture of the strain CECT8145 (BIF-1) inactivated at 70 ° C overnight.
  • Figure 5 Antioxidant activity of strain CECT8145 (BI F-1) estimated after applying oxidative stress with hydrogen peroxide to C. elegans (N2).
  • Figure 6 Reduction of body fat compared to C. elegans (N2; wild strain) and mutants.
  • Figure 7 Determination of body weight in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day ( ⁇ ) of strain CECT8145 (BIF-1) during the 17 weeks of the trial. A control group of obese Zücker rats ( ⁇ ) and the group of thin Zücker rats (O) are included.
  • Figure 8 Solid intake observed in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day ( ⁇ ) of strain CECT8145 (BIF-1). A control group of obese Zücker rats ( ⁇ ) and the group of thin Zücker rats (O) are included.
  • Figure 9 Total cholesterol determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of the CECT strain (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 10 HDL cholesterol determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 11 Total Cholesterol / HDL Cholesterol (Cardiovascular Risk Index) ratio determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), compared to Zücker control rats (black bar) . Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • FIG. 12 Triglyceride concentration determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 13 Concentration of glucose determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), with respect to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 14 Levels of TNFa (inflammation marker) determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 15 Adiponectin levels determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • FIG 16 Malondialdehyde concentration (oxidation marker) determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • FIG 17 Ghrelin levels (appetite marker) determined in obese Zücker rats treated with 10 10 CFU / day of strain CECT8145 (BIF-1) (gray bar), relative to Zücker control rats (black bar). Control of thin Zücker rats (white bar) is included.
  • Figure 18 Resistance of strain BIF-1 at acidic pHs.
  • Figure 19 Resistance of strain BIF-1 to bile salts.
  • Figure 20 Yogurt fermented with strain BIF-1 produces greater reduction of body fat in C. elegans (11, 4%) than commercial conventional yogurt.
  • Figure 21 Fat-reducing effect in C. elegans of soy milk fermented with strain BIF-1.
  • the trials consisted of feeding C. elegans with the different microorganisms from the egg phase to the young adult phase (3 days).
  • the standard feeding of the nematode has been the NG medium, which contained a lawn of the Escherichia coli bacteria.
  • the staining of the fat drops has been carried out by direct addition of the Nile Red dye to the NG medium plates. Nematodes were incubated at 20 ° C under different conditions for the duration of the test, and after the intake period, samples were taken from each condition and the fluorescence emitted in each case was quantified.
  • the control feeding condition (NG + Escherichia coli medium) has been taken as a reference to quantify the fluorescence in all other conditions.
  • Figure 1 shows the results obtained with the Lactobacillus strains in the reduction of body fat of C. elegans (expressed as a percentage of quantified fluorescence reduction in worms stained with the Nile Red dye). The highest percentage of fat reduction was provided by strain LAC-1 (32.4% compared to standard feeding conditions).
  • Figure 2 shows the screening of strains of the genus Bifidobacterium.
  • the most effective strain in reducing body fat was BIF-1 (40.5% compared to standard feeding conditions) Based on the results obtained with the 38 strains analyzed, the Bifidobacterium BIF-1 strain was selected as the most effective against fat reduction, so it was proceeded to a greater functional and technological characterization of it.
  • the unequivocal identification of the BIF-1 strain was made at the genus and species level by sequencing the 16S ribosomal DNA (rDNA).
  • the sequence obtained allowed its identification by comparing the sequence of the BIF-1 strain with the total gene sequences deposited in the public databases using the BLAST online tool (http: //blast.ncbi.nlm.nih .gov / Blast.cgi), obtaining the highest homology (99%) with the public sequences belonging to the species B. animalis subsp. lactis
  • Triglyceride determination was made from synchronized populations of C. elegans in the young adult phase. The nematodes of each condition were washed in PBS buffer and sonicated for lysing. The lysed samples were used to determine Total triglycerides by a commercial kit based on a fluorimetric determination. All samples were normalized in terms of protein concentration.
  • Figure 3 shows the quantification of triglycerides in nematodes with standard feed (NG medium) or fed with strain BIF-1. A reduction in total triglycerides was observed in nematodes fed with bifidobacteria BIF-1.
  • the functional effect on fat reduction in C. elegans was analyzed after inactivating strain BIF-1 by heat treatment of 70 ° C for 18 hours.
  • the trials consisted of feeding C. elegans with the BIF-1 strain activated and inactivated from the egg phase to the young adult phase (3 days).
  • the standard feeding of the nematode was carried out in NG medium, which contained a lawn of Escherichia col i bacteria.
  • nematodes fed strain BI F-1 had a different gene expression profile than nematodes with control feeding. Thus, they presented 296 overexpressed genes and 26 repressed genes with respect to the control nematodes (Table 1).
  • Table 3 List of over-expressed metabolic pathways in C. elegans after treatment with BIF-1 regarding control feeding. ID: identification according to KEGG database. KEGG ID Over-expressed metabolic pathways in BIF-1 vs. treaties.
  • Table 4 List of repressed metabolic pathways in C. elegans after treatment with BIF-1 regarding control feeding. ID: identification according to KEGG database. KGGE ID Metabolic pathways repressed in BIF-1 treaties
  • Tables 6 and 7 show the detailed list of over-expressed or repressed processes observed in nematodes treated with BIF-1.
  • Table 7 List of the 76 regulated biological processes downwards in C. elegans treated with BIF-1.
  • GO Gene Ontology (database).
  • the results of the transcriptomic study show that dietary nematodes with the BIF-1 strain show an increase in metabolic pathways and processes related to carbohydrate metabolism (oxidative phosphorylation, ATP synthesis, etc.), glutathione metabolism (reduction of oxidative stress levels), cofactor and vitamin biosynthesis, lipid metabolism, nucleotide metabolism, glycosylation and membrane metabolism.
  • carbohydrate metabolism oxidative phosphorylation, ATP synthesis, etc.
  • glutathione metabolism reduction of oxidative stress levels
  • cofactor and vitamin biosynthesis lipid metabolism
  • nucleotide metabolism glycosylation and membrane metabolism.
  • the change in the metabolic profile of C. elegans after the intake of the BIF-1 strain was analyzed compared to the profile of nematodes with control feeding (NG + E. coli OP50 medium).
  • the trials consisted of feeding C. elegans with the BIF-1 strain from the egg phase to the young adult phase (3 days).
  • the standard feeding of the nematode was medium NG, which contained a lawn of Escherichia coli bacteria.
  • the nematodes obtained at this time were subjected to a metabolomic analysis by applying different analytical techniques, LC-MS / MS (+ ESI) (-ESI) and GC-MS, and a subsequent bioinformatic treatment.
  • Glutathione metabolism and oxidative stress:
  • GHT ⁇ -glutamileucine and ⁇ -glutamylthionine were higher in nematodes fed with BIF-1 compared to the control feeding group, which would be consistent with a possible increase of the ⁇ -glutamyltransferase (GGT) activity, and therefore, glutathione (GSH) recycling in response to BIF-1.
  • ophthalmolate a metabolite used for the synthesis of GSH, showed a significant decrease in the group fed with BIF-1, which is consistent with the decrease in GSH biosynthesis. This is probably due to a lower demand for glutathione produced by a lower level of oxidative stress. This is reinforced by observing lower levels of GSSG (oxidized GSH) and cysteine-glutathione disulfide, biomarkers of oxidative stress, in the group fed with the BIF-1 strain.
  • Nucleotide metabolism One of the consequences of the observed changes in the activity of the pentose phosphate pathway is the alteration of the nucleotide metabolism. BIF-1-fed nematodes showed higher levels of N-carbamoylaspartate and orotate, two intermediates in the synthesis of pyrimidines. Similar changes in purine metabolism were also observed. Thus, allantoin (purine degradation product) showed lower levels in nematodes treated with BIF-1.
  • Membrane and cholesterol metabolism An increase in choline and acetylcholine, which participate not only in glycosylation processes, but also in membrane metabolism was observed in nematodes undergoing feeding with BIF-1.
  • 7-dihydrocholesterol an intermediate in cholesterol biosynthesis, was found in higher levels in nematodes fed with BIF-1, which is consistent with the effect of this probiotic on the modulation of cholesterol biosynthesis.
  • Changes in the cholesterol content in the membrane could affect the environment of the receptors, the ion channels or other membrane proteins, and therefore alter their function.
  • cholesterol metabolism affects processes related to lipids and hormones.
  • BIF-1 produces an increase in phosphopantetein, 3'-defosphocoenzyme A and coenzyme A (CoA) levels in C. elegans. In addition, it also produces an increase in flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD), consistent with the upward regulation of FAD biosynthesis. CoA and FAD participate in the metabolism of carbohydrates, lipids and amino acids.
  • feeding with the BIF-1 strain produces a series of metabolic changes in C. elegans related to antioxidant metabolism, carbohydrate and nucleotide metabolism. Glutathione metabolism seems to be a probiotic target to reduce oxidative stress levels.
  • the diet with BIF-1 produces an increase in the activity of the pentose phosphate pathway and glycosylation. Alterations in the metabolism of glycogen, nucleotides, lipids and cofactors were also observed.
  • Figure 6 illustrates quantitatively the proportion of body fat reduction as a function of the differential expression of the related genes in Table 8.
  • strain BIF-1 The safety study of strain BIF-1 was carried out following the guidelines set by FAO / WHO (FAO / WHO, 2002). Specifically, the production of unwanted metabolites was evaluated: lactic acid isomers (Table 8), bile salt decontamination capacity (Table 9) and biogenic amines (Table 10), and their antibiotic resistance profile (Table 11) was obtained. ).
  • Table 1 Production of biogenic amines by strain BI F-1 (ND: not detected).
  • the BIF-1 strain was subjected to tests of resistance to digestive conditions. At this point, two tests were carried out, one of resistance to low pHs, and one test of resistance to bile salts. In the first, the strain was contacted with saline solution (0.09% NaCl) at decreasing pHs for 15 minutes and the number of cells present was evaluated ( Figure 18). In the second case, the BIF-1 strain was contacted for 15 minutes with added saline solution of bile salts (Oxgall) in increasing amounts (Figure 19). No major survival differences were observed except for incubation at pH 4 where a slight loss of viability was detected.
  • a first step the fermentative capacity of BIF-1 on the milk matrix was analyzed.
  • a volume of commercial skim milk was inoculated with different doses of the bacteria (10 6 , 10 7 and 10 8 CFU / mL), incubating 24 h at 37 ° C.
  • the results showed a positive fermentation of the probiotic by inoculating 10 7 or 10 8 CFU / mL.
  • a functional yogurt was prepared by adding 10 8 CFU / mL of bifidobacteria BIF-1 and a mixture of commercial yogurt ferments on a commercial skim milk and powdered milk basis (0.6%).
  • a control fermentation that contained only commercial yogurt ferments (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and Streptococcus thermophilus) was included in the study.
  • the presence of the BIF-1 strain at the end of the fermentation was verified by means of a selective plate count for Bifidobacterium.
  • the inactivation was performed by autoclaving the culture at 121 ° C, 30 min.
  • the juice supplemented with strain BIF-1 at an OD: 30, was added on the surface of the culture medium of C. elegans (NGM). The effect on the reduction of body fat of C. elegans fed with juice containing both live and thermally inactivated bacteria was studied.

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Abstract

La presente invención se enmarca dentro de la industria alimentaria y farmacéutica. Se refiere en concreto a una nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145, sus componentes celulares, metabolitos y moléculas secretadas, que incorporadas a formulaciones alimentarias y/o farmacéuticas presentan utilidad en el tratamiento y/o prevención del sobrepeso y la obesidad así como las enfermedades relacionadas, tales como síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales, infertilidad, etc.

Description

NUEVA CEPA DE Bifidobacteríum animalis subsp. lactis CECT 8145 Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE SOBREPESO Y OBESIDAD Y
ENFERMEDADES ASOCIADAS
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se enmarca dentro de la industria alimentaria y farmacéutica. Se refiere en concreto a una nueva cepa de la especie Bifidobacteríum animalis subsp. lactis CECT 8145, sus sobrenadantes y/o cultivo, así como extractos y/o compuestos bioactivos liberados por la cepa, que, incorporados a formulaciones alimentarias y/o farmacéuticas, inducen saciedad, reducen el apetito, la grasa corporal y el riesgo cardiovascular, provocan pérdida de peso, tienen actividad antioxidante y anti-inflamatoria y, en consecuencia, tienen aplicación en el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y/o obesidad y/o sus enfermedades asociadas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La obesidad y el sobrepeso son un trastorno metabólico y nutricional de serias consecuencias para la salud, siendo el sobrepeso un grado de obesidad. A pesar de existir un mejor conocimiento clínico y epidemiológico del problema, la prevalencia de la obesidad y el sobrepeso ha aumentado significativamente en países industrializados y en desarrollo. Se reconoce el alto riesgo que representa la obesidad en la incidencia de varias enfermedades crónicas: hipertensión arterial, enfermedad isquémica coronaria, accidentes cerebro-vasculares, diabetes tipo 2 y ciertas formas de cáncer, que son causa importante de morbilidad y mortalidad en los países del hemisferio occidental.
En la lucha contra el sobrepeso y la obesidad, la industria alimentaria ha incorporado nuevos ingredientes con el objetivo de ayudar a los consumidores a obtener un peso adecuado. En el ámbito del desarrollo e investigación de nuevos productos, una opción es que ciertos ingredientes puedan añadirse para que actúen inhibiendo la acumulación de energía en forma de grasa, bien disminuyendo la absorción o formación de grasa, bien estimulando la movilización de la grasa con una lipolisis aumentada o bien mejorando sus tasas de oxidación lipídica.
Otro de los aspectos que inciden de forma positiva en la prevención o tratamiento del sobrepeso y la obesidad es controlar y/o reducir el apetito a través de la inducción de un efecto saciante en el individuo activando la regulación metabólica del apetito. Igualmente, algunos estudios sugieren que la obesidad se acompaña de un estado de estrés oxidante crónico, el cual se ha propuesto como el nexo de unión entre la obesidad y algunas comorbilidades asociadas tales como la resistencia insulínica y las patologías cardiovasculares. (Molnar D, Decsi T, Koletzko B. "Reduced antioxidant status in obese children with multimetabolic síndrome". Int J Obes Relat Metab Disord 2004; 28: 1197-202). Por ello, en los últimos años también se están llevando a cabo diferentes investigaciones sobre el posible papel de la suplementación con diferentes antioxidantes dietéticos en la mejoría y prevención del sobrepeso y la obesidad.
Por otra parte, la microbiota intestinal y los probióticos producen un efecto positivo para la salud regulando las funciones inmunológicas del individuo y protegiéndolo de infecciones y procesos de inflamación crónica. Hay estudios que señalan a la microbiota intestinal como un nuevo factor que podría estar implicado en la regulación del peso corporal y las enfermedades asociadas a la obesidad. Por ello, la manipulación intencionada de la microbiota intestinal a través de la dieta se propone como una posible nueva herramienta para prevenir o modificar el riesgo de obesidad y, en particular, las enfermedades metabólicas asociadas a ésta.
En este sentido, se han atribuido numerosos efectos beneficiosos a cepas de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis en relación con el tratamiento o prevención de sobrepeso y obesidad así como con sus enfermedades asociadas. El documento de patente estadounidense US2011027348 describe el microorganismo Bifidobacterium animalis subsp. lactis (no especifica una cepa en concreto), con actividad frente a inflamación, síndrome metabólico, obesidad e hipertensión.
Además, otros ejemplos concretos en este mismo ámbito de aplicación son las cepas Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 y Bb12. Así, el artículo con título "Study of Danisco probiotics shows positive impact on metabolic síndrome (MetS)", Food Engineering & Ingredients, 2010, Vol. 35, Issue 2, p.9, DuPont, describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 y su actividad frente a síndrome metabólico, inflamación, endotoxemia metabólica, etc.
Igualmente, el documento de patente estadounidense US20120107291 describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis B420 con actividad frente a diabetes, síndrome metabólico, obesidad, inflamación de tejidos, etc.
De acuerdo con la información contenida en dicha solicitud de patente, la cepa B420 actúa influenciando de forma positiva el sistema inmune a través del tejido linfoide asociado al intestino y muestra capacidad para inducir una mejora en la tolerancia a la glucosa, la reducción del tejido adiposo mesentérico, la reducción en los índices de inflamación, etc. No obstante, en la información disponible respecto a esta cepa no se contiene mención alguna respecto a una posible capacidad para inducir reducción de apetito o aumento de efecto saciante así como capacidad antioxidante de la cepa.
La referencia no patente con título "Bifidobacterium lactis Bb12 enhances intestinal antibody response in formula-fed infants: a randomized, doublé-blind, controlled trial", Holscher et al., describe la cepa Bifidobacterium lactis Bb12 y su actividad frente a la pérdida de función inmune.
El documento de patente estadounidense US2008267933 describe la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 con actividad frente al control de peso y obesidad a través de la inducción de efecto saciante, la mejora del metabolismo energético, la mejora de la sensibilidad a la insulina, el síndrome metabólico, etc. Los efectos producidos por esta cepa pueden ser el resultado de la sobreexpresión de ciertos genes relacionados con el metabolismo energético -grasa, azúcar e insulina además de la saciedad-, tales como Scd1 , Acrp30, Adn, Thrsp, Car3 y Apoa-4. No obstante, en la información disponible respecto a esta cepa no se contiene mención alguna respecto a una posible capacidad antioxidante de la cepa. Por tanto, el problema técnico de la presente invención se refiere a la provisión de nuevos microorganismos con capacidad para ser utilizados como ingredientes en formulaciones farmacéuticas y alimentarias con mejor actividad terapéutica y/o preventiva frente al sobrepeso y la obesidad así como a sus enfermedades asociadas.
Dicho problema técnico se ha resuelto con la provisión de la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, el Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest, así como composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan
A diferencia de las cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica, la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan, además de reducir la grasa corporal, presentan capacidad para inducir saciedad y reducir el apetito y aumentar la capacidad de resistencia al estrés oxidativo en mamíferos tras su ingesta. Adicionalmente, la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan reducen la concentración de colesterol total y triglicéridos en sangre, además de reducir la concentración de glucosa y algunos marcadores de inflamación. Todo ello lleva a concluir que los efectos de la cepa de la presente invención, así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que las contengan, en el control del sobrepeso, esto es, en el tratamiento y/o prevención de la obesidad y las enfermedades asociadas es efectiva y superior a otras cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, c/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest, los compuestos bioactivos liberados por esta cepa, los sobrenadantes y los cultivos de la cepa, los extractos que contengan los compuestos biaoactivos, los sobrenadantes y/o los cultivos, y la formulación de cualquiera de ellos en composiciones alimenticias y farmacéuticas.
La cepa de la invención, así como los productos derivados de la misma objeto de la presente invención, actúan modulando la expresión diferenciada de ciertos genes que inciden de forma positiva en la reducción de grasa corporal, lo cual hace especialmente efectiva a la cepa de la presente invención en el tratamiento y/o prevención del sobrepeso y/o la obesidad así como las enfermedades asociadas, tales como: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales, infertilidad, etc. Tras su ingesta en mamíferos, la cepa de la presente invención actúa reduciendo la grasa corporal, el peso, el nivel de triglicéridos totales, el colesterol total, la glucosa, el factor TNFa e incrementando la adiponectina. Adicionalmente, produce un aumento de la saciedad, tal y como se desprende de la reducción en los niveles de grelina, y aumenta la resistencia al estrés oxidativo, tal y como se demuestra a través de una reducción en la concentración de malondialdehido en mamíferos tratados con la cepa de la presente invención.
El estudio transcriptómico de la cepa de la presente invención muestra que la ingesta de la cepa induce un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (entre otros, fosforilación oxidativa y síntesis de ATP), el metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), la biosíntesis de cofactores y vitaminas, el metabolismo de lípidos, el metabolismo de nucleótidos, la glicosilación y el metabolismo de membrana.
Además, tal y como se confirma a partir del estudio metabolómico realizado con la cepa de la presente invención y detallado en la parte de experimental de la memoria de patente, la ingesta de esta cepa induce una serie de cambios metabólicos relacionados con el metabolismo antioxidante y con el metabolismo de carbohidratos y nucleótidos. Se identifica el metabolismo del glutatión como una diana de la presente cepa para reducir los niveles de estrés oxidativo y se destaca también un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación, siendo también aparentes diversas alteraciones en el metabolismo del glucógeno, de los nucleótidos, de los lípidos y de los cofactores.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un microorganismo así como las composiciones alimenticias y farmacéuticas que lo contengan, con utilidad en el tratamiento y prevención en mamíferos del sobrepeso y la obesidad así como sus enfermedades relacionadas.
Dicho microorganismo se refiere, en concreto, a una nueva cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, el Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest.
En la presente memoria de solicitud de patente, la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 aparecerá también referida con la denominación BIF-1. A los efectos de la presente invención, los términos "enfermedades relacionadas o asociadas" y "enfermedades causadas por el sobrepeso y/o la obesidad" comprenden: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales, infertilidad, etc. A los efectos de la presente invención, se entiende por productos bioactivos obtenidos a partir de la cepa de la presente invención, tanto sus componentes celulares, compuestos y moléculas que formen parte de la cepa, como los metabolitos y las moléculas secretadas por la misma, tales como: componentes intracelulares (por ej., ADN, péptidos, ácidos grasos, etc.) como componentes de la pared celular (proteínas, péptidos, ácidos grasos, etc.) que confieran la actividad preventiva o terapéutica deseada.
Se entiende por composición alimenticia, los alimentos funcionales, probióticos, simbióticos, suplementos dietéticos y/o nutracéuticos que incorporan la cepa de la presente invención, los productos bioactivos que derivan de la misma, el sobrenadante y/o el extracto y/o el cultivo de la misma.
En el contexto de la presente invención, se entiende por composiciones farmacéuticas aquellas que incorporan la cepa de la presente invención, los productos bioactivos que derivan de la misma, el sobrenadante y/o el extracto y/o su cultivo de la misma junto con, al menos, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables a utilizar en la presente invención son conocidos en el estado de la técnica para un experto en la materia.
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han conseguido identificar una nueva cepa CECT8145 de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis que posee actividades biológicas novedosas frente a otras cepas de la misma especie pertenecientes al estado de la técnica, que la hacen especialmente efectiva en el tratamiento y/o prevención del sobrepeso y/o la obesidad así como de enfermedades causadas por y/o relacionadas con el sobrepeso y/o la obesidad.
Estudios genómicos comparativos entre la cepa de la presente invención y otras cepas pertenecientes a la misma especie del estado de la técnica, en concreto, las cepas B420 y Bb12, demuestran que la cepa de la presente invención presenta regiones y genes que son únicos en ella y no tienen homólogos correspondientes en las otras dos cepas. En concreto, y a partir de los estudios genómicos realizados, se ha podido determinar que la cepa de la presente invención, a diferencia de las cepas B420 y Bb12, no tiene genes con función molecular de unión a lípidos ("lipid-binding").
Una de las actividades biológicas novedosas en la cepa de la presente invención es su actividad antioxidante y, en definitiva, la capacidad de aumentar la resistencia al estrés oxi dativo.
El estrés oxidativo está causado por un desequilibrio entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes del organismo responsable de la detoxificación de dichos radicales. En pacientes obesos, el estrés oxidativo no se genera por un único mecanismo, sino por la confluencia de varios factores que, en definitiva, se pueden resumir como una disminución de agentes antioxidantes de forma paralela a un aumento de elementos pro-oxidantes. Diversos estudios avalan la existencia de una relación directa entre la obesidad y una reducción de la actividad de las principales enzimas antioxidantes.
La actividad biológica de resistencia al estrés oxidativo inducida por la cepa de la presente invención se demuestra a través de una reducción en la concentración de malondialdehido en mamíferos tratados con la cepa de la presente invención (figura 16).
El malondialdehido es un marcador indicativo del grado de oxidación a nivel corporal; a mayor grado de oxidación, se incrementa el nivel de este marcador y se produce una menor protección frente a estrés oxidativo; y viceversa.
En la figura 5 se demuestra, mediante la supervivencia en Caenorhabditis elegans, un incremento de protección frente a estrés oxidativo.
Otra de las actividades biológicas novedosas de la cepa de la presente invención es la capacidad para inducir un aumento de saciedad tras su ingesta, disminuyendo los niveles de grelina (figura 17).
Actualmente, la grelina es la única hormona circulante con potencial para aumentar o estimular el apetito y, en consecuencia, actúa como reguladora del hambre y del peso corporal. Es un neuropéptido gastrointestinal (ligando endógeno del receptor del secretagogo de la GH) aislado recientemente de la mucosa oxíntica producida principalmente en el estómago. Su concentración sanguínea depende de la dieta, la hiperglucemia y la adiposidad y la leptina. Se secreta 1-2 horas antes de la comida y su concentración disminuye drásticamente después de comer. Actúa en hipotálamo lateral y, teóricamente, inhibe la secreción de citoquinas proinflamatorias y antagoniza a la leptina. La grelina, fisiológicamente, aumenta la secreción ácida gástrica y tiene otras funciones hormonales y cardiovasculares.
La cepa de la presente invención es capaz de disminuir los niveles de grelina, induciendo un incremento de saciedad.
Adicionalmente, la cepa de la presente invención actúa reduciendo el nivel de triglicéridos totales, colesterol, glucosa, factor TNFa, e incrementando los niveles de adiponectina (figuras 12, 9, 13, 14 y 15, respectivamente). De forma ventajosa, se ha podido constatar que los niveles de reducción de grasa corporal alcanzados por la cepa de la presente invención son sorprendentemente superiores a los niveles alcanzados a través de otras cepas del genero Bifidobacterium y, en especial, con respecto a la cepa comercial perteneciente a la misma especie denominada Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 (figura 2). Los resultados ilustrados en el ejemplo 1 de la presente memoria confirman que la ingesta de la cepa de la presente invención provoca en el nematodo Caenorhabditis elegans una reducción de grasa corporal en, al menos, un 40% respecto a condiciones de alimentación estándar. Comparativamente a la reducción de grasa corporal producida por otras cepas de la misma especie conocidas del estado de la técnica y, en concreto, de la cepa Bb12, la cepa de la presente invención es capaz de producir un efecto reductor de grasa corporal superior al 28,5% respecto a esta cepa Bb12; lo cual demuestra una mayor efectividad de la cepa BIF-1 de la presente invención frente a cepas de su misma especie.
Del mismo modo, cuando la cepa de la presente invención es incorporada a un producto alimenticio, como por ejemplo, yogur, soja fermentada o zumo, su efecto sobre la reducción de grasa corporal es superior al 11 %, en comparación al efecto producido por un alimento convencional, ya sea yogur, soja fermentada o zumo.(figuras 20, 21 y 22).
Según se detalla en la parte experimental aportada a modo de ejemplo, el estudio transcriptómico muestra que la ingesta de la cepa de la presente invención induce un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (entre otros, la fosforilación oxidativa y la síntesis de ATP), el metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), la biosíntesis de cofactores y vitaminas, el metabolismo de lípidos, el metabolismo de nucleótidos, la glicosilación y el metabolismo de membrana.
Además, tal y como se confirma a partir del estudio metabolómico realizado y detallado en la parte experimental de la memoria de patente, la ingesta de esta cepa induce una serie de cambios metabólicos relacionados con el metabolismo antioxidante y con el metabolismo de carbohidratos y de nucleótidos. Se identifica el metabolismo del glutatión como una diana de la presente cepa para reducir los niveles de estrés oxidativo y se destaca también un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación, siendo también aparentes diversas alteraciones en el metabolismo del glucógeno, de los nucleótidos, de los lípidos y de los cofactores. Dichos cambios metabolómicos confirman las actividades biológicas de reducción de grasa corporal y protección frente a estrés oxidativo inducidas por la cepa de la presente invención.
Estos resultados se han podido confirmar a través de un ensayo realizado con mutantes del nematodo C. elegans según se detalla en el ejemplo 8, que ha permitido identificar diversos genes que se hallan diferencialmente expresados tras la ingesta de la cepa BIF-1 de la presente invención y que explicarían las actividades biológicas proporcionadas por la cepa, así como su superior efectividad frente al sobrepeso y la obesidad.
En concreto, se han identificado los genes diferencialmente expresados como los siguientes: Acox-1 , Acs-5, Daf-22, Fat-7, Daf-16, Sod-4, Trxr-2, Asg-2 y Tph-1.
Los genes Acox-1 , Acs-5 y Daf-22 codifican para enzimas de la beta oxidación de ácidos grasos en peroxisoma; los genes Fat-7 y Daf-16 codifican para enzimas que actúan en el proceso de desaturación de los ácidos grasos; los genes Sod-4, Trxr-2 y Asg-2 codifican para enzimas involucradas en mantener el balance celular redox y eliminar especies reactivas del oxígeno; el gen Asg-2, por sí solo, codifica para una enzima involucrada en procesos de fosforilación oxidativa; y el gen Tph-1 codifica para una enzima implicada en el metabolismo del triprófano y, por tanto, en la síntesis de serotonina.
La cepa de la presente invención y los productos bioactivos secretados por la misma, así como los sobrenadantes, los cultivos y/o los extractos de la cepa, pueden formularse e incorporarse, de forma individual o en combinación con otros microorganismos y/o ingredientes funcionales, a composiciones alimenticias así como a composiciones farmacéuticas, para ser utilizados de acuerdo con la presente invención.
Cuando la cepa de la presente invención se incorpora en combinación con otros microorganismos, éstos pertenecen preferiblemente a los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Saccharomyces y/o Kluyveromyces, como por ejemplo: L. rhamnosus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. kéfir, L. parakefir, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. paracasei, L. acidophilus, L paraplantarum, L. reuteri, Sí thermophilus, B. longum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. pseudocatenulatum, S. cerevisiae, S. boulardii, K. lactis, y K. marxianus. La presente invención también se refiere a una composición que incorpora los compuestos bioactivos obtenidos a partir de la cepa de la presente invención, los sobrenadantes y/o los cultivos de la cepa, así como los extractos obtenidos a partir del cultivo de la cepa de la invención.
Las composiciones de la presente invención, que incorporan la cepa de la presente invención y/o los productos bioactivos secretados por la misma y/o los sobrenadantes y/o los cultivos y/o los extractos, pueden ser composiciones alimenticias o farmacéuticas.
Dichas composiciones alimenticias o farmacéuticas puede presentarse en forma líquida o sólida, incluyendo pero no limitándose a, cápsulas y/o comprimidos. Las composiciones alimentarias y/o farmacéuticas de la presente invención incorporan la cepa de la presente invención en una cantidad de entre 105 ufe y 1012 ufe por gramo o mililitro de la composición y, preferiblemente, entre 107 y 1011 ufe/g o ufc/ml.
Cuando las composiciones alimentarias y/o farmacéuticas de la presente invención incorporan los compuestos bioactivos derivados de la cepa de la presente invención, tales como sobrenadantes, extractos, péptidos, etc., estos se incorporan a la composición en una proporción de entre 0,01 - 99% en peso sobre el total de la composición y, preferiblemente, en una proporción de entre 0,01 - 40%. De forma preferente, las composiciones alimenticias que incorporan la cepa de la presente invención, así como los compuestos bioactivos derivados de la misma, los sobrenadantes, los extractos de su cultivo y/o el cultivo, pueden seleccionarse del grupo que comprende: zumos de frutas o vegetales, helados, formulaciones infantiles, leche, yogur, queso, leche fermentada, leche en polvo, cereales, productos de repostería, productos en base a leche y/o cereales, complementos nutricionales, bebidas refrescantes y/o suplementos dietéticos, etc. Los productos alimenticios lácteos a los cuales hace referencia la presente invención, tales como leche fermentada, quesos frescos o yogures o sus equivalentes, secados o liofilizados, representan de forma preferente sistemas de suministro adecuados que incorporan la cepa de la presente invención y/o los compuestos bioactivos derivados de la misma y/o los sobrenadantes y/o los extractos y/o el cultivo. La cepa de la presente invención y/o los compuestos bioactivos derivados de la misma y/o los sobrenadantes y/o los extractos y/o el cultivo de la cepa pueden, en su caso, ser envasados en cápsulas de celulosa o gelatina, capsulas de gel o comprimidos, entre otros, con fines alimentarios y farmacéuticos.
La cepa de la invención, así como las composiciones que la contengan, están especialmente destinadas para ser utilizadas en mamíferos, esto es, animales y humanos, para el tratamiento del sobrepeso y la obesidad y las enfermedades relacionadas.
Son por tanto objetos de la presente invención la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, composiciones alimenticias y farmacéuticas que la comprendan, en forma activa e inactiva, y opcionalmente en combinación con otros microorganismos así como un método para el tratamiento y/o prevención en mamíferos del sobrepeso y/o la obesidad así como enfermedades asociadas, tales como: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales e infertilidad, caracterizado por comprender la administración de una cantidad eficaz de la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145 así como de las composiciones alimenticias y farmacéuticas que la contengan de acuerdo con la presente invención
En el contexto de la presente invención es también un objeto de invención un método para la reducción de peso, colesterol total, triglicéridos y glucosa en sangre, niveles de factor TNFa, malondialdehido y grelina, así como incremento de adiponectina en mamíferos, caracterizado por comprender la administración de una cantidad eficaz de la cepa de la invención Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT8145, así como de las composiciones alimenticias y farmacéuticas que la contengan de acuerdo con la presente invención. En este sentido, es importante destacar que la presente invención contempla la utilización de la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145, tanto en su forma de célula viable como no viable (figura 4).
Las células no viables de la invención, inactivadas por distintos procedimientos (congelación, calor, radiación, etc.), pueden utilizarse según la presente invención y forman parte de la presente invención, ya que los efectos deseados son ejercidos, al menos, en parte, por componentes estructurales (como ADN, componentes de la pared celular, etc.). Esto hace posible que la cepa de la presente invención mantenga parte de las propiedades frente a síndrome metabólico y enfermedades relacionadas sin que mantenga necesariamente la viabilidad. Así, tal y como se muestra en el ejemplo 4, un cultivo inactivado de la cepa de la presente invención reduce la grasa corporal en el modelo animal C. elegans; lo cual podría inducir a pensar que el efecto funcional no se debe solamente al metabolismo de la cepa, sino a la presencia de ciertos compuestos en la pared celular.
Se aportan a continuación las siguientes figuras y ejemplos al objeto de ilustrar la presente invención. En ningún caso se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Escrutinio de 23 cepas del género Lactobacillus sobre la reducción de grasa corporal en C. elegans. Figura 2: Escrutinio de 15 cepas del género Bifidobacterium sobre la reducción de grasa corporal en C. elegans.
Figura 3: Cuantificación de triglicéridos en C. elegans N2 alimentado con la cepa CECT8145 (BIF-1) o sometidos a dieta estándar (medio NG).
Figura 4: Efecto sobre la reducción de grasa en C. elegans de un cultivo de la cepa CECT8145 (BIF-1) inactivado a 70°C "overnight".
Figura 5: Actividad antioxidante de la cepa CECT8145 (BI F-1) estimada tras aplicar un estrés oxidativo con agua oxigenada a C. elegans (N2). Figura 6: Reducción de grasa corporal respecto a C. elegans (N2; cepa salvaje) y mutantes.
Figura 7: Determinación de peso corporal en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día (■) de la cepa CECT8145 (BIF-1) durante las 17 semanas del ensayo. Se incluye un grupo control de ratas Zücker obesas ( · ) y el grupo de ratas Zücker delgadas (O).
Figura 8: Ingesta sólida observada en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día (■ ) de la cepa CECT8145 (BIF-1). Se incluye un grupo control de ratas Zücker obesas (· ) y el grupo de ratas Zücker delgadas (O).
Figura 9: Colesterol total determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 10: Colesterol HDL determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca). Figura 11 : Ratio Colesterol total/Colesterol HDL (índice de Riesgo Cardiovascular) determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 12: Concentración de triglicéridos determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 13: Concentración de glucosa determinada en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca). Figura 14: Niveles de TNFa (marcador de inflamación) determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca). Figura 15: Niveles de adiponectina determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 16: Concentración de malondialdehído (marcador de oxidación) determinado en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 17: Niveles de grelina (marcador de apetito) determinados en ratas Zücker obesas tratadas con 1010 UFC/día de la cepa CECT8145 (BIF-1) (barra gris), respecto a ratas Zücker control (barra negra). Se incluye el control de ratas Zücker delgadas (barra blanca).
Figura 18: Resistencia de la cepa BIF-1 a pHs ácidos. Figura 19: Resistencia de la cepa BIF-1 a sales biliares.
Figura 20: El yogur fermentado con la cepa BIF-1 produce mayor reducción de grasa corporal en C. elegans (11 ,4%) que el yogur convencional comercial. Figura 21 : Efecto reductor de grasa en C. elegans de leche de soja fermentada con la cepa BIF-1.
Figura 22: Efecto reductor de grasa en C. elegans de zumo con la cepa BIF-1 viva e inactiva. EJEMPLO 1
Escrutinio de bacterias sobre la reducción de grasa corporal en Caenorhabditis elegans.
Se realizó un escrutinio de 23 cepas del género Lactobacillus y 15 cepas del género Bifidobacterium para analizar su efecto sobre la reducción de grasa corporal en el nematodo Caenorhabditis elegans tras su ingesta. Se incluyeron dos cepas comerciales en el estudio, LGG (Lactobacillus rhamnosus) y Bb12 (β. animalis subsp. lactis). C. elegans acumula grasa en forma de gotas que pueden ser visualizadas mediante tinción con Rojo Nilo (fluorescente). La fluorescencia emitida por dicho colorante se puede cuantificar por fluorimetría. Por tanto, la evaluación del efecto de los distintos microorganismos sobre la acumulación de grasa corporal en el nematodo, se ha llevado a cabo analizando la reducción de fluorescencia en gusanos alimentados con los distintos microorganismos con respecto a gusanos alimentados en condiciones control (NG + Escherichia coli).
Los ensayos han consistido en alimentar a C. elegans con los distintos microorganismos desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo ha sido el medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia coli.
La tinción de las gotas de grasa se ha realizado mediante adición directa del colorante Rojo Nilo a las placas de medio NG. Los nematodos se incubaron a 20°C en las distintas condiciones durante la duración del ensayo, y tras el periodo de ingesta, se tomaron muestras de cada condición y se cuantificó la fluorescencia emitida en cada caso. Se ha tomado la condición de alimentación control (medio NG + Escherichia coli) como referencia para cuantificar la fluorescencia en el resto de condiciones.
La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con las cepas de Lactobacillus en la reducción de grasa corporal de C. elegans (expresados como porcentaje de reducción de fluorescencia cuantificada en gusanos teñidos con el colorante Rojo Nilo). El mayor porcentaje de reducción de grasa lo proporcionó la cepa LAC-1 (32,4% respecto a condiciones de alimentación estándar).
La Figura 2 muestra el escrutinio de cepas del género Bifidobacterium. La cepa más efectiva en la reducción de grasa corporal fue BIF-1 (40,5% respecto a condiciones de alimentación estándar) En base a los resultados obtenidos con las 38 cepas analizadas, se seleccionó la cepa Bifidobacterium BIF-1 como la más efectiva frente a reducción de grasa, por lo que se procedió a una mayor caracterización funcional y tecnológica de la misma. EJEMPLO 2
Identificación taxonómica y secuenciación genómica
2.1. Identificación
La identificación inequívoca de la cepa BIF-1 se realizó a nivel de género y especie mediante secuenciación del ADN ribosómico (ADNr) 16S. La secuencia obtenida permitió su identificación mediante la comparación de la secuencia de la cepa BIF-1 con el total de secuencias del gen depositadas en las bases de datos públicas utilizando la herramienta en línea BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), obteniéndose la mayor homología (99%) con las secuencias públicas pertenecientes a la especie B. animalis subsp. lactis.
2.2. Secuenciación del genoma
Con el objetivo de caracterizar a nivel genómico tanto la seguridad como la funcionalidad de la cepa BIF-1 , se llevó a cabo la secuenciación del genoma completo de la cepa BIF-1 mediante pirosecuenciación en la plataforma 454 Life Science-Roche. Tras la secuenciación, se obtuvieron un total de 434581 secuencias crudas. El ensamblaje de novo posterior permitió organizar las secuencias en 5 scaffolds, siendo el de mayor tamaño de 1.923.368 nucleótidos. El tamaño del genoma de la cepa BIF-1 se ha estimado en 2, 1 Mb. No se ha detectado la presencia de genes que codifiquen para factores de virulencia, ni genes de resistencia a antibióticos localizados en zonas con riesgo de transferencia horizontal.
EJEMPLO 3
Cuantificación de la reducción de triglicéridos en C. elegans tratado con BIF-1
Se analizó el efecto de la ingesta de la cepa BIF-1 sobre la reducción de triglicéridos en la cepa salvaje N2 de C. elegans. La determinación de triglicéridos se realizó a partir de poblaciones sincronizadas de C. elegans en fase adulto joven. Los nematodos de cada condición se lavaron en tampón PBS y se sonicaron para su lisado. Las muestras lisadas se utilizaron para determinar los triglicéridos totales mediante un kit comercial basado en una determinación fluorimétrica. Todas las muestras se normalizaron en cuanto a concentración de proteína.
La Figura 3 muestra la cuantificación de triglicéridos en nematodos con alimentación estándar (medio NG) o alimentados con la cepa BIF-1. Se observó una reducción de los triglicéridos totales en nematodos alimentados con la bifidobacteria BIF-1.
EJEMPLO 4
Reducción de grasa corporal en C. elegans con cultivo inactivado de BIF-1
Se analizó el efecto funcional sobre la reducción de grasa en C. elegans tras inactivar a la cepa BIF-1 mediante tratamiento térmico de 70°C durante 18 horas. Los ensayos consistieron en alimentar a C. elegans con la cepa BIF-1 activada e inactivada desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo se llevó a cabo en medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia col i.
La tinción de las gotas de grasa se realizó mediante adición directa del colorante Rojo Nilo a las placas de medio NG. Los nematodos se incubaron a 20°C en las distintas condiciones durante la duración del ensayo, y tras el periodo de ingesta, se tomaron muestras de cada condición y se cuantificó la fluorescencia emitida en cada caso. Se tomó la condición de alimentación control (medio NG + Escherichia coli) como referencia para cuantificar la fluorescencia en el resto de condiciones. Los resultados (Figura 4) mostraron que la cepa inactivada a 70°C mantenía el efecto reductor de grasa en el nematodo, observándose el mismo porcentaje de fluorescencia que con el cultivo fresco.
EJEMPLO 5
Actividad antioxidante de la cepa BIF-1 en C. elegans
Se analizó si la ingesta de la cepa BIF-1 producía en C. elegans (N2) una mayor resistencia al estrés oxidativo agudo. Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo la metodología descrita por Martorell y colaboradores (201 1). Se utilizó la cepa salvaje N2 de C. elegans. Los ensayos incluyeron una condición control (medio NG al que se adicionó en césped la cepa de E. coli OP50) y la cepa BI F-1. Los ensayos se iniciaron con poblaciones de nematodos sincronizados en edad, que se cultivaron en placas de NG con las distintas condiciones de alimentación. Las placas se incubaron a 20°C durante 7 días. Tras este periodo, se aplicó un estrés oxidativo con H202 (2 mM), y se determinó la viabilidad de los nematodos tras 5 horas de incubación. La Figura 5 muestra los resultados obtenidos en supervivencia de nematodos tras aplicar un estrés con agua oxigenada. Los nematodos alimentados durante 7 días con BI F-1 fueron mucho más resistentes al estrés oxidativo, ya que se contabilizó una supervivencia mayor que en la población sometida a alimentación estándar.
EJEMPLO 6
Estudio transcriptómico en C. elegans con la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis BI F-1 Se estudió el efecto de la ingesta de B. animalis subsp. lactis BI F-1 sobre el transcriptoma de C. elegans. Mediante tecnología de "chips", se estudiaron los cambios en la expresión génica, en rutas metabólicas y en procesos biológicos de nematodos alimentados con BI F-1 frente a nematodos con alimentación estándar. En el análisis estadístico, el nivel de significancia utilizado fue de P≤0.05. 6.1. Expresión génica diferencial en nematodos tratados con BI F-1
Se determinó que los nematodos alimentados con la cepa BI F-1 presentaban un perfil de expresión génica diferente a los nematodos con alimentación control. Así, presentaron 296 genes sobre-expresados y 26 genes reprimidos respecto a los nematodos control (Tabla 1 ).
N° genes N° genes N° genes sobre- reprimidos sin expresados
expresión
Tratado BI F-1 vs. Control 26 22303 296 Tabla 1. Expresión génica diferencial observada en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1.
El escrutinio de los 296 genes que aparecían sobre-expresados en presencia de BIF-1 reveló distintas agrupaciones funcionales. Así, dichos genes están relacionados con proteólisis, reproducción, desarrollo embrionario, metabolismo de carbohidratos, ciclo de muda, morfogénesis corporal, locomoción, procesos de óxido-reducción, metabolismo de proteínas, transporte, metabolismo de glutatión, metabolismo de aminoácidos aromáticos, respuesta a la radiación gamma, metabolismo de ácidos grasos y rutas de señalización de neuropéptidos.
En cuanto a los 26 genes reprimidos en C. elegans tratados con BIF-1 , éstos están relacionados mayoritariamente con la regulación positiva del crecimiento.
6.2. Rutas metabolicas
En cuanto a las rutas metabolicas, se determinó que los nematodos alimentados con BIF-1 presentaban 23 rutas metabolicas sobre-expresadas y 20 reprimidas respecto a nematodos con alimentación control (Tabla 2). Las Tablas 3 y 4 muestran el listado de las correspondientes rutas metabolicas reguladas al alza o a la baja tras el tratamiento con la bifidobacteria BIF-1.
Tabla 2. Número de rutas metabolicas diferencialmente expresadas en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1.
N°Rutas N°Rutas N°Rutas
metabolicas metabolicas no metabolicas sobre- reprimidas afectadas expresadas
Tratado BIF-1 vs. control 20 55 23
Tabla 3. Lista de rutas metabolicas sobre-expresadas en C. elegans tras el tratamiento con BIF-1 respecto a alimentación control. ID: identificación según base de datos KEGG. ID KEGG Rutas metabolicas sobre-expresadas en tratados BIF-1 vs.
Control
00190 Fosforilación oxidativa
00480 Metabolismo Glutatión
00982 Metabolismo fármacos-citocromo P450
00980 Metabolismo de xenobióticos por citocromo P450
00983 Metabolismo fármacos - otras enzimas
00670 Biosíntesis folato (Metabolismo, cofactores y vitaminas)
04142 Lisosoma
00260 Metabolismo de glicinina, serina y treonina
00330 Metabolismo de arginina y prolina
00860 Metabolismo de porfirina y clorofila
00270 Metabolismo de cisteína y metionina
01040 Biosíntesis de ácidos grasos insaturados
00040 Interconversiones pentosa y glucuronato
04146 Peroxisoma
00590 Metabolismo ácido araquidónico
00053 Metabolismo ascorbato y aldarato
00514 Otros tipos de biosíntesis de O-glicano
00910 Metabolismo de nitrógeno
00250 Metabolismo de alanina, aspartato y glutamato
00380 Metabolismo del triptófano
00620 Metabolismo del piruvato
00650 Metabolismo del butanoato
00410 Metabolismo de beta-alanina
Tabla 4. Lista de rutas metabolicas reprimidas en C. elegans tras el tratamiento con BIF-1 respecto a alimentación control. ID: identificación según base de datos KEGG. ID KGGE Rutas metabólicas reprimidas en tratados BIF-1
vs. Control
04330 Ruta de señalización Notch
03440 Recombinación homologa
04340 Ruta de señalización Hedgehog
03410 Reparación DNA dañado (Base excisión repair)
04310 Ruta de señalización Wnt
03018 Degradación RNA
04710 Ritmo circadiano
04150 Ruta de señalización mTOR
03430 Reparación DNA dañado (Mismatch repair)
03420 Reparación de nucleótidos por escisión
03050 Proteosoma
03013 Transporte RNA
04350 Ruta de señalización TGF-beta
03015 Rutas de vigilancia de mRNA
03040 Spliceosoma
04120 Proteolisis mediada por ubiquitina
03030 Replicación DNA
04141 Procesado proteínas en retículo endoplasmático
04144 Endocitosis
04914 Maduración de oocitos mediada por progesterona
6.3. Procesos biológicos
Se determinó en nematodos alimentados con la cepa BI F-1 un total de 26 procesos biológicos regulados al alza y 76 procesos regulados a la baja respecto a nematodos con alimentación control (Tabla 5).
Tabla 5. Número de procesos biológicos diferencialmente expresados en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1 , frente a nematodos con alimentación control. GO Regulados a la baja GO Reguladas a la alta
Tratados BIF-1 vs. control 76 26
Las Tablas 6 y 7 muestran el listado detallado de los procesos sobre-expresados o reprimidos observados en nematodos tratados con BIF-1.
Tabla 6. Lista de los 26 procesos biológicos sobre-expresados en C. elegans tratado con BIF-1. GO: Gene Ontology (base de datos).
GO Nombre
GO:0030259 Glicosilación de lípidos
GO:0006937 Regulación de la contracción del músculo
GO:0042775 Síntesis de ATP mitocondrial acoplado a cadena de transporte de
GO:0009156 Procesos biosintéticos de ribonucleósido monofosfato
GO:0034220 Transporte transmembrana de iones
GO:0009072 Procesos de metabolismo de aminoácidos aromáticos
GO:0030241 Ensamblaje de miosina del músculo esquelético en filamentos
GO:00091 12 Procesos de metabolismo de nucleobases
GO:0015992 Transporte de protones
GO:0006508 Proteolisis
GO:0040018 Regulación positiva del crecimiento de organismo multicelular
GO:0034607 Comportamiento implicado en apareamiento GO:0007218 Ruta de señalización de neuropéptido
GO:0046942 Transporte de ácido carboxílico
GO:0072529 Procesos catabólicos de compuestos que contienen pirimidina
GO:0042398 Procesos biosintéticos de aminoácidos modificados
GO:0015833 Transporte de péptidos
GO:0006754 Procesos de biosíntesis de ATP
GO:0009063 Procesos catabolismo de aminoácidos celulares
GO:0048521 Regulación negativa del comportamiento
GO:0055074 Homeostasis del ion calcio
GO:0006637 Procesos del metabolismo de acyl-CoA
GO:0042338 Desarrollo de cutícula (ciclo de muda) basado en colágeno y cuticulina.
GO:0006814 Transporte de ion sodio
GO:0036293 Respuesta a niveles reducidos de oxigeno
GO:0009069 Procesos metabólicos de metabolismo de aminoácidos de la
Tabla 7. Lista de los 76 procesos biológicos regulados a la baja en C. elegans tratado con BIF-1. GO: Gene Ontology (base de datos).
GO Nombre
GO:0016477 Migración celular
GO:0008406 Desarrollo gónadas
GO:0040027 Regulación negativa del desarrollo de la vulva
GO:0042127 Regulación proliferación celular GO:0040020 Regulación de la meiosis
GO:0006511 Procesos catabólicos de proteínas dependientes de
ubiquitina
GO:0045167 Localización asimétrica de proteínas implicada en destino celular
GO:0000070 Segregación de cromátidas hermanas en mitosis
GO:0051729 Ciclo celular germinal
GO:0007052 Organización de mitosis
GO:0007098 Ciclo del centrosoma
GO:0070918 Producción de pequeños RNA implicados en silenciamiento génico
GO:0045144 Segregación de cromátidas hermanas en mitosis
GO:0032465 Regulación de la citocinesis
GO:0000079 Regulación actividad proteína quinasa dependiente de ciclina
GO:0009410 Respuesta a xenobióticos
GO:0030261 Condensación cromosómica
GO:0007606 Percepción sensorial a estímulos químicos
GO:0035046 Migración pronuclear
GO:0090387 Ensamblaje fagolisosoma eliminación células apoptóticas
GO:0045787 Regulación positiva ciclo celular
GO:0006261 Replicación DNA GO:0006898 Endocitosis mediada por receptores
GO:0001714 Destino celular
GO:0032320 Regulación positiva actiivdad GTPasa
GO:0000281 Citoquinesis después de mitosis
GO:0090068 Regulación positiva del ciclo celular
GO:0030703 Formación de envoltura del huevo
GO:0018991 Ovoposición
GO:0006997 Organización del núcleo
GO:0000132 Orientación del eje mitótico
GO:0040022 Línea germinal
GO:0006030 Metabolismo de quitina
GO:0032506 Citoquinesis
GO:0032880 Regulación localización proteínas
GO:0040015 Regulación negativa crecimiento organismo multicelular
GO:0045944 Regulación positiva transcripción
GO:0008630 Respuesta al daño a DNA
GO:0000122 Regulación negativa transcripción
GO:0043066 Regulación negativa apoptosis
GO:0010638 Regulación positivia organización orgánulo
GO:0000398 "Eliminación de intrones vía Spiiceosoma GO:0042464 Compensación de dosis por hipoactivación del cromosoma X
GO:0007127 Meiosis
GO:0042693 Destino células del músculo
GO:0032012 Regulación proteina ARF señal de trasducción
GO:0006310 Recombinación DNA
GO:0038032 Ruta de señalización de receptor acoplado a proteína G
GO:0016331 Morfogénesis de epitelio embrionario
GO:0007219 Ruta de señalización Notch
GO:0008356 División celular asimétrica
GO:0042026 Replegamiento de proteínas
GO:0007040 Organización de lisosoma
GO:0045595 Regulación de la diferenciación celular
GO:0032446 Modificación de proteínas por conjugación de proteínas pequeñas
GO:0034968 Metilación de histonas
GO:0008595 Especificación del eje anterior/posterior en embrión
GO:0001703 Gastrulación con formación de boca
GO:0042176 Regulación de catabolismo de proteínas
GO:0006606 Importe proteínas al núcleo
GO:00311 14 Regulación de la depolimerización de microtúbulos
GO:0007411 Orientación axón GO:0006200 Catabolismo de ATP
GO:0016055 Ruta de señalización del receptor Wnt
GO:0000212 Organización del eje mitótico
GO:0006911 Fagocitosis
GO:0046777 Autofosforilación de proteínas
GO:0035194 Silenciamiento génico post-transcripcional mediante RNA
GO:0032269 Regulación negativa del metabolismo de proteínas celulares
GO:0006289 Reparación por escisión de nucleótidos
GO:0006661 Biosíntesis de fosfatidil inositol
GO:0048557 Morfogénesis tracto digestivo embrionario
GO:0051295 Establecimiento de localización del eje meiótico
GO:0006906 Fusión de vesículas
GO:0030071 Regulación de la transición metafase/anafase mitótica
GO:0051053 Regulación negativa del metabolismo de DNA
En resumen, los resultados del estudio transcriptómico muestran que nematodos sometidos a dieta con la cepa BIF-1 presentan un incremento en rutas y procesos metabólicos relacionados con el metabolismo de carbohidratos (fosforilación oxidativa, síntesis ATP, etc.), metabolismo del glutatión (reducción de los niveles de estrés oxidativo), biosíntesis de cofactores y vitaminas, metabolismo de lípidos, metabolismo de nucleótidos, glicosilación y metabolismo de membrana. EJEMPLO 7
Estudio metabolómico en C. elegans con la cepa BIF-1
Se analizó el cambio en el perfil metabolico de C. elegans tras la ingesta de la cepa BIF-1 comparado con el perfil de nematodos con alimentación control (medio NG + E. coli OP50). Los ensayos consistieron en alimentar a C. elegans con la cepa BIF-1 desde la fase huevo a la fase de adulto joven (3 días). La alimentación estándar del nematodo fue medio NG, que contenía un césped de la bacteria Escherichia coli.
Los nematodos obtenidos a este tiempo, fueron sometidos a un análisis metabolómico mediante la aplicación de distintas técnicas analíticas, LC-MS/MS (+ESI) (-ESI) y GC- MS, y un posterior tratamiento bioinformático.
Los resultados mostraron cambios estadísticamente significativos, que se detallan a continuación:
- Metabolismo del glutatión (GSH) y estrés oxidativo: En el estudio, los niveles de γ-glutamileucina y γ-glutamilmetionina fueron mayores en nematodos alimentados con BIF-1 comparado con el grupo de alimentación control, lo que sería consistente con un posible incremento de la actividad γ- glutamiltransferasa (GGT), y por tanto, reciclaje de glutatión (GSH) en respuesta a BIF-1. Además, el oftalmolato, un metabolito que se utiliza para la síntesis de GSH, mostró un descenso significativo en el grupo alimentado con BIF-1 , lo que es consistente con el descenso de biosíntesis de GSH. Esto se debe probablemente a una menor demanda de glutatión producida por un menor nivel de estrés oxidativo. Esto se refuerza con el hecho de observar menores niveles de GSSG (GSH oxidado) y cisteina-glutation disulfido, biomarcadores de estrés oxidativo, en el grupo alimentado con la cepa BIF-1.
- Metabolismo de carbohidratos: Muchos metabolitos que participan en el metabolismo de carbohidratos mostraron cambios en el grupo alimentado con BIF-1. Los niveles de maltotetraosa y maltopentosa mostraron altos niveles, mientras que la trealosa 6-fosfato y la glucosa mostraron menores niveles en el grupo alimentado con la cepa BIF-1 respecto a condiciones control. Otras rutas afectadas fueron el metabolismo del glucógeno y la ruta de las pentosas fosfato. Así, el 6-fosfogluconato, mostró un incremento significativo en el grupo BIF-1. Este hecho junto con los altos niveles de ribosa y bajos niveles de ribulaso-5 fosfato, serían consistentes con un posible incremento de la actividad de la ruta de las pentosas fosfato en presencia de BIF-1.
Metabolismo de nucleótidos: Una de las consecuencias de los cambios observados en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato es la alteración del metabolismo de nucleótidos. Los nematodos alimentados con BIF-1 mostraron mayores niveles de N-carbamoilaspartato y orotato, dos intermediarios de la síntesis de pirimidinas. También se observaron cambios similares en el metabolismo de las purinas. Así, la alantoína (producto de degradación de purinas) presentó niveles inferiores en nematodos tratados con BIF-1. Además, se determinaron niveles mayores de nucleósidos de purina (adenosina y guanosina), bases (adenina e hipoxantina) y nucleótidos [adenosina 5'-monophosphate (AMP) y guanosina 5'-monofosfate (GMP)] en el grupo tratado con BIF-1. Estos resultados junto con el incremento en precursores de aminoácidos (glutamato y glutamina) observado, y el posible incremento en la actividad de la ruta de pentosas fosfato, darían soporte a la idea de un incremento en la biosíntesis de purinas acompañadas con una disminución de la degradación de las mismas.
Metabolismo de membrana y colesterol: Se observó en nematodos sometidos a alimentación con BIF-1 un incremento de colina y acetilcolina, que participan no sólo en procesos de glicosilación, sino también en el metabolismo de membrana. Además, el 7-dihidrocolesterol, un intermediario en la biosíntesis de colesterol, se encontró en niveles mayores en nematodos alimentados con BIF-1 , lo que es consistente con el efecto de este probiótico sobre la modulación de la biosíntesis del colesterol. Cambios en el contenido de colesterol en la membrana podrían afectar al ambiente de los receptores, los canales de iones u otras proteínas de membrana, y por tanto alterar su función. Además, el metabolismo del colesterol afecta a procesos relacionados con lípidos y hormonas. Observaciones adicionales: BIF-1 produce en C. elegans un incremento de los niveles de fosfopanteteina, 3'-defosfocoenzima A y coenzima A (CoA). Además, también produce un aumento de flavin mononucleótido (FMN) y flavin adenina dinucleótido (FAD), consistente con la regulación al alza de la biosíntesis de FAD. El CoA y FAD participan en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos.
En resumen, la alimentación con la cepa BIF-1 produce un serie de cambios metabólicos en C. elegans relacionados con el metabolismo antioxidante, metabolismo de carbohidratos y nucleótidos. El metabolismo del glutatión parece ser una diana del probiótico para reducir los niveles de estrés oxidativo. Además, la dieta con BIF-1 produce un incremento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato y en la glicosilación. Se observaron adicionalmente alteraciones en el metabolismo del glucógeno, nucleótidos, lípidos y cofactores.
Estos resultados concuerdan con los observados en el estudio transcriptómico (ejemplo 6).
EJEMPLO 8
Identificación de genes diferencialmente expresados
Con el objeto de explicar el mecanismo de acción a partir de los resultados de transcriptómica descrito en el ejemplo 6, se abordó un ensayo de reducción de grasa corporal en C. elegans alimentado con la cepa BIF-1. En este ensayo se utilizó tanto la cepa salvaje de C. elegans N2, como distintos mutantes en aquellos genes que se consideraron clave en el estudio transcriptómico. Un gen es clave en el mecanismo de acción de un determinado ingrediente, cuando el efecto funcional observado en la cepa salvaje N2 de C. elegans, desaparece total o parcialmente. Los resultados que se indican en la tabla 8 adjunta y Figura 6 permiten identificar algunos de los genes mutados diana en C. elegans y que se hallan diferencialmente expresados tras la ingesta de la cepa BIF-1 en C. elegans (estudio transcriptómico). Estos resultados permiten explicar las actividades biológicas asociadas a la ingesta de la cepa de la presente invención. Tabla 8: Lista de genes mutados diana en C. elegans
Figure imgf000033_0001
La Figura 6 ilustra de forma cuantitativa la proporción de reducción de grasa corporal en función de la expresión diferencial de los genes relacionados en la tabla 8.
EJEMPLO 9 Estudio pre-clínico en modelo murino
Se abordó un estudio en modelo de rata Zücker obesa, en el que se suministraron tres dosis distintas del probiótico BIF-1 (108, 109 y 1010 UFC/día). El estudio incluyó como control dos grupos de ratas Zücker delgadas. La duración del ensayo fue de 12 semanas, determinándose el peso corporal, y también la ingesta sólida y líquida durante la duración del ensayo. Adicionalmente se realizaron determinaciones bioquímicas al final del ensayo: colesterol total, colesterol HDL, triglicéridos, factor TNFa (marcador inflamación), malondialdehído (marcador de estrés oxidativo), adiponectina y grelina (marcadores de saciedad).
Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 17. En resumen, los resultados del estudio pre-clínico en modelo murino mostraron un efecto positivo en la reducción de peso en ratas Zücker obesas alimentadas con el probiótico BIF-1 a la dosis de 1010 UFC/día (reducción de ganancia de peso de un 6,42% durante el tratamiento frente al grupo control). Además, los animales sometidos a dicha dieta presentaron una menor ingesta sólida. Por otra parte, la determinación de parámetros bioquímicos mostró una reducción de colesterol total, acompañado con un incremento del colesterol HDL. También se observó una ligera tendencia reductora de triglicéridos y glucosa. Finalmente, el tratamiento con el probiótico BIF-1 dio lugar a una reducción de los niveles de factor TNFa, malondialdehído y grelina, así como un incremento de los niveles de adiponectina. EJEMPLO 10
Estudio de seguridad
El estudio de seguridad de la cepa BIF-1 se realizó siguiendo las directrices marcadas por FAO/OMS (FAO/WHO, 2002). En concreto, se evaluó la producción de metabolitos indeseados: isómeros del ácido láctico (Tabla 8), capacidad de desconjugación de sales biliares (Tabla 9) y aminas biógenas (Tabla 10), y se obtuvo su perfil de resistencia a antibióticos (Tabla 11).
Tabla 9. Producción de isómeros de ácido láctico por la cepa BIF-1.
Acido láctico (g/L de
sobrenadante)
CEPA D-Láctico L-Láctico
BIF-1 0,020 ± 0,000 2, 158 ± 0,025 Tabla 10. Capacidad de hidrólisis de sales biliares por la cepa BIF-1 (ND: no detectada).
Figure imgf000035_0001
Tabla 1 1. Producción de aminas biógenas por la cepa BI F-1 (ND: no detectada).
Figure imgf000035_0002
Tabla 12. Concentración mínima inhibitoria de distintos antibióticos obtenida para la cepa BIF-1.
Antibiótico CMI (Mg/mL)
Gentamicina 64
Estreptomicina 128
Eritromicina 0,5
Vancomicina 1
Ampicilina 2
Tetraciclina 8
Kanamicina 128
Cloranfenicol 4
Clindamicina 0,25 EJEMPLO 11
Propiedades probióticas de la cepa BIF-1
Uno de los principales requerimientos de una cepa probiótica es que pueda permanecer viva durante el tránsito grastrointestinal. Por ello, la cepa BIF-1 se sometió a ensayos de resistencia a condiciones digestivas. En este punto, se realizaron dos ensayos, uno de resistencia a pHs bajos, y un ensayo de resistencia a sales biliares. En el primero, la cepa se puso en contacto con solución salina (0,09% NaCI) a pHs decrecientes durante 15 minutos y se evaluó el número de células presentes (Figura 18). En el segundo caso, se puso a la cepa BIF-1 en contacto 15 minutos con solución salina adicionada de sales biliares (Oxgall) en cantidades crecientes (Figura 19). No se observaron grandes diferencias de supervivencia a excepción de la incubación a pH 4 donde se detectó una ligera pérdida de viabilidad.
EJEMPLO 12
Obtención de un yogur funcional con la cepa BIF-1 (Bifidobacterium animalis subps. /actfs CECT 8145)
En un primer paso, se analizó la capacidad fermentativa de BIF-1 sobre la matriz láctea. Para ello, se inoculó un volumen de leche desnatada comercial con distintas dosis de la bacteria (106, 107 y 108 UFC/mL), incubando 24 h a 37°C. Los resultados mostraron una fermentación positiva del probiótico al inocular 107 ó 108 UFC/mL. Posteriormente, se elaboró un yogur funcional adicionando 108 UFC/mL de la bifidobacteria BIF-1 y una mezcla de fermentos de yogur comercial sobre una base de leche desnatada comercial y leche en polvo (0,6%). Se incluyó en el estudio una fermentación control que únicamente contenía los fermentos de yogur comercial (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Mediante recuento en placa selectivo para Bifidobacterium se comprobó la presencia de la cepa BIF-1 al final de la fermentación.
Finalmente, con el yogur obtenido, se abordó un estudio funcional en el modelo pre- clínico de C. elegans para analizar su efecto sobre la reducción de grasa corporal. Los resultados mostraron que el yogur fermentado con la cepa BIF-1 producía una reducción de grasa corporal en C. elegans mayor (1 1 ,4%) que el yogur convencional comercial (Figura 20).
Además, se determinó el mismo grado de reducción de grasa en C. elegans alimentados con leche de soja fermentada con la cepa BIF-1 (Figura 21). EJEMPLO 13:
Obtención de un zumo con la cepa BIF-1 (Bifidobacterium animalis subps. lactis CECT 8145).
Se utilizó un zumo de naranja comercial suplementado con distintas dosis (106, 107 y 108 UFC/mL), de la cepa BIF-1 {Bifidobacterium animalis subps. lactis CECT 8145) tanto activa como inactiva. La inactivación se realizó mediante tratamiento del cultivo en autoclave a 121°C, 30 min. Para el análisis funcional, el zumo suplementado con la cepa BIF-1 a una DO: 30, se adicionó sobre la superficie del medio de cultivo de C. elegans (NGM). Se estudió el efecto sobre la reducción de grasa corporal de C. elegans alimentados con zumo que contenía tanto bacterias vivas como inactivadas térmicamente.
Los resultados (Figura 22) mostraron que el zumo suplementado con 107 UFC/mL de la cepa BIF-1 viva producía una reducción de la grasa en el nematodo de un 10,3% respecto a condiciones control (medio NG). Además, el grado de reducción observado en el caso del zumo con 107 UFC/mL de la cepa BIF-1 inactivada fue muy similar, determinándose un 7,2% de reducción de grasa respecto al control.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa de la especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, depositada el 14/05/12 con número de acceso: CECT8145 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
La cepa de acuerdo con la reivindicación 1 , en forma de células viables.
La cepa de acuerdo con la reivindicación 1 , en forma de células no viables.
Sobrenadante y/o cultivo y/o extracto y/o compuesto bioactivo que comprende la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
Composición que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1
6. Composición según la reivindicación 5, donde la cepa se halla presente en una cantidad entre 105 ufe y 1012 ufe por gramo o mililitro de la composición.
Composición que comprende el sobrenadante y/o cultivo y/o extracto y/o los compuestos bioactivos según la reivindicación 4.
Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde dicha composición es una composición farmacéutica.
Composición de acuerdo con la reivindicación 8, donde además comprende al menos un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Composición según las reivindicaciones 5 a 7, donde dicha composición es una composición alimentaria.
11. Composición según la reivindicación 10, donde la composición alimentaria se selecciona del grupo que comprende: zumos de frutas o vegetales, helados, formulaciones infantiles, leche, yogur, queso, leche fermentada, leche en polvo, cereales, productos de repostería, productos en base a leche y/o cereales, complementos nutricionales, bebidas refrescantes y/o suplementos dietéticos.
12. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 caracterizada por comprender al menos otro microorganismos seleccionado del grupo que comprende los géneros Lactobacillus, Streptococcus,
Bifidobacterium, Saccharomyces y/o Kluyveromyces, L. rhamnosus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. kéfir, L. parakefir, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. paracasei, L. acidophilus, L. paraplantarum, L. reuteri, St. thermophilus, B. longum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. pseudocatenulatum, S. cerevisiae, S. boulardii, K. lactis, y K. marxianus.
13. Composición de acuerdo con la reivindicación 12 para uso en el tratamiento y/o prevención del sobrepeso y/o la obesidad y/o sus enfermedades relacionadas.
14. Composición para uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde las enfermedades relacionadas se seleccionan del grupo que comprende: síndrome metabólico, hipertensión, glucemia, inflamación, diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, alteraciones hormonales y/o infertilidad.
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