ES2783885A1

ES2783885A1 - Procedimiento de obtencion de una composicion moduladora del microbioma intestinal humano

Info

Publication number: ES2783885A1
Application number: ES201930280A
Authority: ES
Inventors: Gracia Luis Usan
Original assignee: Igen Biolab Group AG
Current assignee: Igen Biolab Group AG
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2020-09-18
Also published as: ES2783723A1

Abstract

Procedimiento de obtención de una composición moduladora del microbioma intestinal humano que comprende cultivar cepas de microorganismos probióticos que comprenden cepas de los géneros Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium, al menos hasta que hayan alcanzado su plena fase logarítmica de crecimiento, en caldos de cultivo separados para obtener caldos de biomasas, recuperar por separado biomasas microbianas húmedas y someterlas por separado a lisis celular hasta alcanzar un porcentaje de rotura celular de al menos 90%; para obtener respectivas biomasas de lisados microbianos que se secan y se mezclan en unas proporciones determinadas.

Description

DESCRIPCI N

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE UNA COMPOSICIÓN MODULADORA DEL MICROBIOMA INTESTINAL HUMANO

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba en el campo técnico de los productos y métodos destinados a modular la composición del microbioma humano, para conservar y/o reestablecer un equilibrio del microbioma en pacientes humanos afectados o susceptibles de ser afectados por enfermedades o trastornos relacionados con disbiosis del microbioma.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN

Se ha podido comprobar que el desequilibrio del microbioma humano o microbiota humana, también denominado disbiosis, puede tener efectos nocivos en la salud de las personas, que no sólo afectan sistemas tales como el tracto intestinal, la piel o el aparato reproductor, sino también pueden tener influencias sobre otras partes del cuerpo humano. Recientes investigaciones sugieren que la disbiosis incluso puede participar en o hasta generar la aparición de varios tipos de cáncer, autismo, etc.

Esto ha resultado, por una parte, en investigaciones destinadas a desarrollar métodos basados en el análisis del microbioma humano a efectos de detectar equilibrios para el diagnóstico y la detección precoz de una pluralidad de enfermedades y trastornos y, por otra, en productos como por ejemplo los productos probióticos y prebióticos así como los productos postbióticos, destinados a conservar y/o reestablecer un equilibrio del microbioma en pacientes humanos afectados o susceptibles de ser afectados por enfermedades o trastornos.

Así, se ha descrito que la administración oral de un extracto postbiótico que contiene metabolitos secundarios de bacterias comensales presentes en el suero de pacientes que sufren cáncer podría tener efectos beneficiosos en la salud de los pacientes a los que se les había administrado dicho extracto (J. Jimeno et al. “A microbiome based model of anticancer intervention”. European Journal of Cancer, December 2016 Volume 69, Supplement 1, Page S151 Poster Session https://doi.org/10.1016/S0959-8049(16)33049-0).

Los probióticos, son definidos por la Organización para la Alimentación y Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), como una mezcla de microorganismos vivos, no patógenos, que al ser administrados en cantidades adecuadas proporcionan o generan efectos benéficos sobre la salud del hospedador [Reyes Esparza, Jorge A. y Rodríguez Fragoso, Lourdes: LOS PROBIÓTICOS: ¿CÓMO UNA MEZCLA DE MICROORGANISMOS HACEN UN GRAN TRABAJO?. Rev. mex. cienc. farm [online]. 2012, vol.43, n.1, pp.7-17. ISSN 1870-0195.]. Se cree que los probióticos mejoran las propiedades de la microflora intestinal al evitar la colonización del tracto por bacterias patógenas. En relación a lo anterior, hay tres formas básicas de lograr este efecto: (i) la exclusión inmune de una bacteria patógena, (ii) la exclusión de un patógeno por adhesión competitiva y (iii) la síntesis de compuestos antimicrobianos que dificultan la colonización del tracto gastrointestinal por el patógeno [Casula, Gabriella, and Simon M. Cutting. "BACILLUS PROBIOTICS: SPORE GERMINATION IN THE GASTROINTESTINAL TRACT.” Applied and Environmental Microbiology 68.5 (2002): 2344-2352. PMC. Web. 14 Mar. 2018.].

La identificación de distintos subproductos metabólicos producidos por especies probióticas, para los cuales se ha acuñado recientemente el término "postbióticos”, puede representar una oportunidad para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas efectivas que evitarían los riesgos asociados a la administración de estas bacterias vivas [Cicenia A, Scirocco A, Carabotti M, Pallotta L, Marignani M, Severi C. POSTBIOTIC ACTIVITIES OF LACTOBACILLI-DERIVED FACTORS. J Clin Gastroenterol 2014;48:S18e22].

En general, los postbióticos incluyen subproductos metabólicos bacterianos, como bacteriocinas, ácidos orgánicos, etanol, diacetilo, acetaldehídos y peróxido de hidrógeno, pero también es cierto que ciertos probióticos muertos por calor retienen importantes estructuras bacterianas que pueden ejercer actividad biológica en el hospedador. Los postbióticos son no tóxicos, no patógenos y resistentes a la hidrólisis por las enzimas de los mamíferos, ya que estos son productos bacterianos no viables o subproductos metabólicos de los probióticos [Islam SU. CLINICAL USES OF PROBIOTICS. Medicine (Baltimore) 2016;95:1e5]. Además, estudios recientes sugieren que estos productos metabólicos causarían efectos más beneficiosos que los propios microorganismos probióticos que los producen.

El intestino grueso del ser humano se encuentra colonizado por billones de microorganismos (agrupados en unas 1000 especies diferentes) que componen un ecosistema muy complejo, la microbiota intestinal humana. Numerosos trabajos inciden en el importante papel que la microbiota intestinal ejerce en el mantenimiento de una correcta homeostasis y de cómo las variaciones poblacionales de la microbiota pueden conducir a estados patológicos que modifican el equilibrio homeostático. Estas alteraciones de equilibrio microbiano intestinal, llamada disbiosis, pueden ser debidas tanto a hábitos alimenticios, como físicos, o infecciosos, entre otros.

La microbiota intestinal comensal contribuye a las funciones tróficas del intestino (la producción de productos de fermentación y vitaminas que utilizan los enterocitos) estimula el sistema inmunológico, favorece el tracto gastrointestinal, transforma / excreta sustancias tóxicas, protege al hospedador frente a la invasión de especies patógenas, regenera y preserva la barrera intestinal, modula la motilidad intestinal, etc...

En la progresión de la enfermedad en enfermos de cáncer es muy frecuente observar un elevado cuadro de malnutrición que en muchos casos interfiere con el correcto tratamiento de la enfermedad y recuperación de los pacientes. En última instancia este cuadro de malnutrición observado puede degenerar en caquexia.

La microbiota comensal asegura la integridad mecánica de la barrera de la mucosa, al ofrecer protección contra microbios patógenos nocivos. Las bacterias comensales pueden adherirse al moco intestinal e inhibir competitivamente la adhesión de enteropatógenos; también producen bacteriocinas y AGCC, compuestos que pueden inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Además, algunos metabolitos antimicrobianos, como las defensinas secretadas en el intestino, contribuyen al control del hospedador de estos microorganismos [Salzman NH, Underwood MA and Bevins CL. 2007. Paneth cells, defensins, and the commensal microbiota: a hypothesis on intimate interplay at the intestinal mucosa. Seminars in Immunology. 19,70-83].

El sistema inmune combate las bacterias patógenas, pero tolera la presencia de especies comensales, a pesar de que sus estructuras celulares son bastante similares y tienen mecanismos comunes de interacción con los receptores de las células inmunes del hospedador, Este fenómeno se llama tolerancia inmune. De esta manera, las células inmunitarias del ser humano diferencian entre comensales y patógenos. Esto es llevado a cabo por el sistema inmune innato del ser humano a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), incluyendo receptores Toll-like (TLR), receptores transmembrana que escanean el medio externo de la luz intestinal y receptores intracelulares similares a Nod (NODLR), que protegen el espacio citoplasmático [Claes AK, Zhou JY and Philpott DJ. 2015. NOD-like receptors: guardians of intestinal mucosal barriers. Physiology (Bethesda) 30, 241-250; Sellge G and Kufer TA. 2015. PRR-signaling pathways-Learning from microbial tactics. Seminars in Immunology. 27, 75-84; Hevia A, Delgado S, Sanchez B et al. 2015. Molecular Players Involved in the Interaction Between Beneficial Bacteria and the Immune System. Frontiers in Microbiology 6:1285].

El desequilibrio microbiano en el intestino, comúnmente denominado disbiosis, se ha asociado con una serie de enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal, la alergia al asma, las enfermedades metabólicas y cardiovasculares, así como el cáncer [Klimesova K, Kverka M, Zakostelska Z et al. 2013. Altered gut microbiota promotes colitis-associated cancer in IL- 1 receptor-associated kinase M-deficient mice. Inflamm. Bowel Dis. 19: 1266-1277]. De hecho, evidencias convincentes demostraron que la disbiosis intestinal puede conducir a una sobrerrepresentación de ciertas especies bacterianas que pueden promover la carcinogénesis del colon al favorecer la inflamación crónica o la inmunosupresión local [Grivennikov SI, Wang K, Mucida D et al. 2012. Adenomalinked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature 491: 254-258]. Cabe destacar que las alteraciones experimentales de la microbiota intestinal incluso influyen en la aparición y progresión de tumores extraintestinales, como el carcinoma de mama y hepatocelular, probablemente a través de circuitos inflamatorios y metabólicos [Yoshimoto S, Loo TM, Atarashi K et al.2013. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature 499: 97-101; Dapito DH, Mencin A, Gwak GY et al. 2012. Promotion of hepatocellular carcinoma by the intestinal microbiota and TLR4. Cancer Cell 21: 504- 516; Marinelli L, Tenore GC and Novellino E. 2017. Probiotic species in the modulation of the anticancer immune response. Semin Cancer Biol 46: 182-190].

El sistema inmune humano ha co-evolucionado con el ecosistema microbiológico que se encuentra en el organismo del ser humano. De esta manera, los microorganismos comensales son capaces de eludir la respuesta inmune mediante la atenuación de la respuesta inflamatoria, como ejemplo, generando ácidos grasos de cadena corta, mientras que el sistema inmune controla concentración, localización y tipos de microorganismos mediante una gran cantidad de receptores PRR (NLRs como receptor citosólico que señaliza en caso de infección o daño celular, y TLRs y CLRs como receptores de membrana especializados en distintas moléculas como péptidoglicanos, lipopolisacáridos, flagelina...) capaces de lanzar una fuerte respuesta inmune innata en caso de ser necesario [Maynard CL, Elson CO, Hatton RD et al.

2012. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature.

489: 231-41], y de activar posteriormente la respuesta inmune adaptativa.

En situaciones de homeostasis (equilibrio normal de microbiota) las células del epitelio intestinal secretan citoquinas TSLP, IL-33 y IL-25 que estimulan la expresión de CD103 en células dendríticas, y estas inducen el desarrollo de linfocitos T reguladores capaces de contener la respuesta inmunológica. También las células epiteliales son capaces de producir abundante TGF-a e IL-10 que inhibe los efectos proinflamatorios de la ruta de señalización de NFkB.

También se ha descrito la influencia de la microbiota en el número de los linfocitos Natural Killer (NK). Este tipo celular está especializado en eliminar células con infecciones víricas o células tumorales, y se observa en modelos de ratones germ-free como es necesaria una microbiota para la activación de estos linfocitos, en un proceso mediado por INF-I [Ganal SC, Sanos SL, Kallfass C et al. 2012. Priming of natural killer cells by nonmucosal mononuclear phagocytes requires instructive signals from commensal microbiota. Immunity. 37: 171- 186]. En general, los Natural Killer se activan con la presencia de interferones y de IL-2 secretada por linfocitos T y constituye una interesante diana para activar la respuesta inmunológica de los pacientes frente a tumores.

En los últimos años han proliferado estudios acerca del papel de la microbiota como inmunomodulador a nivel sistémico [Rescigno M. 2014. Intestinal microbiota and its effects on the immune system. Cell Microbiol. 16: 1004-13]. Los procesos inflamatorios pueden ser modulados por la microbiota a través de la respuesta inmune innata vía señalización TLR/NOD [Francescone R, Hou V, Grivennikov SI. 2014. Microbiome, Inflammation, and Cáncer. Cáncer Journal 20: 181-189], o se han observado variaciones en la concentración y diferenciación de los distintos tipos linfocitarios en situaciones de disbiosis o en animales germ-free. Por ejemplo [Cheng M, Qian L, Shen G et al. 2014. Microbiota modulate tumoral immune surveillance in lung through a Y5T17 immune cell-dependent mechanism. Cancer Res. 74: 4030-41] se muestra como variaciones en la microbiota de ratones causados por tratamientos antibióticos son capaces de disminuir la respuesta linfocitaria Th17 ante cáncer de pulmón al modificar la microbiota intestinal.

Los mecanismos epigenéticos -como la acetilación de las histonas, la metilación de los promotores del ADN y la presencia de RNAs no codificantes grandes o pequeños que afectan a la actividad de los factores de transcripción de los genes modulando su actividad- son sensibles a los metabolitos presentes en el medio generados por bacterias del hospedador. Estos metabolitos generados variaran en función de factores ambientales como la dieta, el tabaco o los fármacos [Passalacqua et al 2009]. Existe un interés creciente en la dieta, como ejemplo, el impacto del butirato, que actúa sobre los mecanismos epigenéticos conduciendo a estrategias terapéuticas específicas y eficaces en la prevención y el tratamiento de diferentes enfermedades, incluidas el cáncer a nivel sistémico [Berni Canani R, Di Costanzo M and Leone L.

2012. The epigenetic effects of butyrate: potential therapeutic implications for clinical practice. Clin epigenetics 4: 4].

Los microRNAs -miRNA- son los ARN no codificantes endógenos de unos 22 nucleótidos que regulan la expresión de genes en el nivel post -transcripcional. Al igual que los genes codificadores de proteínas, la expresión de miRNAs también está regulada por genes y mecanismos epigenéticos [Liu et al 2009]. Actualmente se han asociado estos tipos de ARN no codificantes como marcadores de cáncer de pulmón y de su evolución [Lin PY et al. 2010. MicroRNA in lung cancer. British Journal of cancer 103: 1144-48]. Además, se han descrito determinados miRNAs identificables en estadios tempranos de enfermedad [Lin PY et al. 2011. Circulating miRNA signature for early diagnosis of lung cancer. EMBO Molecular Medicine 3: 436-437, Ulivi P and Zoli W.2014. miRNAs as Non-Invasive biomarkers for lung cancer diagnosis. Molecules, 19: 8220-8237].

La acetilación y desacetilación cromosómica de las histonas alteran su interacción provocando cambios en regulación de la expresión génica. El principal donante de los grupos acetilo para la formación de acetil-CoA que participa en las reacciones de acetilación epigenómica es la microbiota intestinal. Las bacterias y los eucariotas comparten una vía común para la coenzima A (CoA), biosíntesis del pantotenato (vitamina B5), cisteína, y la b-alanina. Todos estos son cofactores esenciales que se encuentran en la mayoría de los alimentos en pequeñas cantidades y son también generados por la microbiota intestinal [Shenderov BA. 2012. Gut indigenous microbiota and Epigenetics. Microbial Ecology in Health & Disease 23: 17195].

La microbiota proporciona señales al epitelio intestinal que contribuyen a la función efectiva de la barrera intestinal. La exposición neonatal a una microbiota compleja establece el patrón de metilación CpG en células madre intestinales que están relacionadas con la renovación de células madre y la diferenciación de IEC [Yu DH, Gadkari M, Zhou Q et al. 2015. Postnatal epigenetic regulation of intestinal stem cells requires DNA methylation and is guided by the microbiome. Genome Biol 16:211]. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son absorbidos como energía por los colonocitos superficiales que recubren las criptas intestinales y así evitan la difusión al nicho de las células madre, donde estos metabolitos inhiben la proliferación de células madre [Kaiko GE, Ryu SH, Koues OI et al. 2016. The colonic crypt protects stem cells from microbiota-derived metabolites. Cell 165: 1708-1720]. Las interacciones entre los IEC y la microbiota implican la regulación de las desacetilasas de histonas (HDAC) para modificar el epigenoma del hospedador e influir en la expresión génica y la función de barrera [Alenghat et al 2013]. La expresión de HDAC en IEC mantiene la homeostasis intestinal y la integridad de la barrera [Alenghat T, Osborne LC, Saenz SA et al. 2013 Histone deacetylase 3 coordinates commensal-bacteria- dependent intestinal homeostasis. Nature 504: 153-157; Turgeon N, Gagne JM, Blais M et al.

2014. The acetylome regulators Hdac1 and Hdac2 differently modulate intestinal epithelial cell dependent homeostatic responses in experimental colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 306: G594-G605; Zimberlin CD, Lancini C, Sno R et al.

2015. HDAC1 and HDAC2 collectively regulate intestinal stem cell homeostasis. FASEB J 29: 2070-2080; Gonneaud A, Turgeon N, Boudreau F et al. 2016. Distinct roles for intestinal epithelial cell-specific Hdac1 and Hdac2 in the regulation of murine intestinal homeostasis. J Cell Physiol 231: 436-448].

Se sabe que, en la homeostasis, la microbiota se beneficia del ambiente cálido y rico en nutrientes, mientras que los humanos obtienen ventajas de un motor metabólico que funciona bien y que incrementa la capacidad del ser humano de extraer nutrientes de los alimentos [Maynard CL, Elson CO, Hatton RD et al. 2012. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489: 231-41]. Además de una ayuda metabólica, la microbiota intestinal influye en el desarrollo del tejido, la inflamación y la inmunidad, promoviendo la salud o la enfermedad humana [Lee YK, Mazmanian SK. 2010. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? Science 330: 1768-1773; Cho I & Blaser MJ. 2012. The human microbiome: at the interface of health and disease, Nat. Rev. Genet. 13: 260-270]. Las bacterias beneficiosas, que promueven la salud humana, se conocen comúnmente como "probióticos" y se definen como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del hospedador [FAO, WHO, 2001. Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk and Live Lactic Acid Bacteria, Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation Report. 1-34]. Como se mencionó anteriormente, existe una simbiosis mutualista entre la microbiota intestinal y la inmunidad del hospedador. De hecho, el sistema inmune tiene que establecer un equilibrio adecuado entre la tolerancia a la microbiota y la vigilancia contra los agentes infecciosos. La homeostasis intestinal se mantiene como un tono inflamatorio, lo que permite una respuesta autolimitada adecuada para los agentes infecciosos o el estrés [Peterson CT, Sharma V, Elmén L et al. 2015. Immune homeostasis, dysbiosis and therapeutic modulation of the gut microbiota, Clin. Exp. Immunol. 179: 363-377]. El equilibrio entre la tolerancia y la respuesta a las infecciones es el fruto de una extensa y cooperativa conversación cruzada entre la microbiota intestinal y el hospedador que involucra inmunidad tanto innata como adaptativa [Klaenhammer TR, Kleerebezem M, Kopp MV et al. 2012. The impact of probiotics and prebiotics on the immune system. Nat. Rev. Immunol. 12: 728-734; Marinelli L, Tenore GC and Novellino E. 2017. Probiotic species in the modulation of the anticancer immune response. Semin Cancer Biol 46: 182-190].

Lactobacillus acidophilus aislado de yogur casero tradicional indujo una significativa disminución en el patrón de crecimiento tumoral mamario utilizando un modelo de ratón [Maroof H, Hassan ZM, Mobarez AM et al. 2012. Lactobacillus acidophilus could modulate the immune response against breast cancer in murine model, J. Clin. Immunol. 32: 1353-1359].

La administración de leche fermentada por la cepa probiótica Lactobacillus casei CRL431 de manera preventiva, o cuando la administración comenzó después de la inyección de las células tumorales, dio como resultado un retraso o detención del desarrollo del tumor de mama en comparación con el grupo control [Aragón et al 2014]. Varias líneas de evidencias sugieren que parte del mecanismo de acción de L. casei CRL431 hacia el cáncer de mama sería la disminución de IL-6 en el suero sanguíneo y en las glándulas mamarias.

Un papel protector de Lactobacillus reuteri ATCC-PTA-6475, originalmente aislado de la leche humana, contra el tumor en dos modelos diferentes de ratón de cáncer de mama [Lakritz JR, Poutahidis T, Levkovich T et al. 2014. Beneficial bacteria stimulate host immune cells to counteract dietary and genetic predisposition to mammary cancer in mice, Int. J. Cancer 135: 529-540]. En lo que respecta al mecanismo de acción, L. reuteri pareció proteger del cáncer al favorecer el sistema inmunitario mediante la inducción de células T4 CD4 CD25 antiinflamatorias.

El Lactobacillus casei BL23, conocido por sus propiedades antiinflamatorias, se estudió por sus efectos protectores sobre el cáncer colorrectal en ratones [Lenoir M, Del Carmen S, Cortes-Perez NG et al. 2016. Lactobacillus casei BL23 regulates Treg and Th17 T-cell populations and reduces DMH-associated colorectal cancer, J. Gastroenterol. 51: 862-873]. El análisis de citocinas en los contenidos intestinales mostró que el desarrollo de cáncer colorrectal estuvo acompañado por un estado inflamatorio, con niveles elevados de citocinas proinflamatorias, como la proteína quimioatrayente monocito 1 (MCP-1) y el factor de necrosis tumoral a (TNF-a), en las muestras del grupo de control. Por el contrario, los ratones que recibieron el probiótico apreciablemente mostraron niveles disminuidos de las citocinas mencionadas anteriormente en las muestras intestinales y cantidades aumentadas de los antiinflamatorios, como IL-10.

En ratones tratados con el probiótico se observaron niveles más bajos de Tregs y un ligero aumento de células Th17, lo que sugiere que L. casei BL23 desencadena una respuesta inmune de tipo mixto Th17 / Treg [Lenoir M, Del Carmen S, Cortes-Perez NG et al. 2016. Lactobacillus casei BL23 regulates Treg and Th17 T-cell populations and reduces DMH-associated colorectal cancer, J. Gastroenterol. 51: 862-873].

Los experimentos in vivo han demostrado que los ratones pre-inoculados oralmente con probióticos Lactobacillus acidophilus NCFM mostraron una reducción del crecimiento tumoral en un 50,3%, en comparación con los ratones no tratados, después de recibir la implantación de cáncer de colon (células CT-26) [Chen CC, Lin WC, Kong MS et al. 2012. Oral inoculation of probiotics Lactobacillus acidophilus NCFM suppresses tumour growth both in segmental orthotopic colon cancer and extra intestinal tissue, Brit. J. Nutr. 107: 1623-1634].

Recientemente, se investigaron Lactobacillus rhamnosus (JF414108.1) y L. plantarum (KC836552.1) en un modelo de ratón de cáncer colorrectal (células CT26), por su capacidad de inducir respuestas inmunes, incluida la maduración de las CD, la secreción de citocinas, la polarización de las células T CD4 y la activación de la actividad de las células NK [Viaud S, Saccheri F, Mignot G et al. 2013. The intestinal microbiota modulates the anticancer immune effects of cyclophosphamide, Science 342: 971-976]. Se encontró que la pre-inoculación con L. plantarnm redujo significativamente el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia prolongado y la inmunidad innata activada, aumentando los niveles intratumorales de las células CD8 T y NK en el microambiente tumoral, mientras que L. rhamnosus fue de alguna manera menos eficaz con los pobres efectos protectores extendidos y una ligera disminución del volumen tumoral en ratones tratados [Hu J, Wang C, Ye L et al. 2015. Anti-tumour immune effect of oral administration of Lactobacillus plantarum to CT26 tumour-bearing mice, J. Biosci. 40: 269-279].

Se ha demostrado que L. rhamnosus GG es más eficaz que la inmunoterapia con Bacillus Calmette Guerin (BCG, Mycobacterium bovis) para reducir la incidencia de recidiva en el cáncer de vejiga [Seow SW, Cai S, Rahmat JN et al. 2010. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors, Cancer Sci. 101: 751-758]. El análisis ELISA de las proteínas de la vejiga reveló un aumento de XCL1, una quimiocina producida por las células T activadas CD8 y yS, NK y células maestras, que actúa como un atrayente quimioterápico para las células T y NK, ayudando así al proceso de regresión tumoral [Seow SW, Cai S, Rahmat JN et al. 2010. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors, Cancer Sci. 101: 751-758].

Se ha encontrado que la administración oral de Lactobacillus casei cepa Shirota (LcS) mejora la inmunidad innata estimulando la actividad de las células NK esplénicas. La alimentación oral con LcS muerta fue capaz de estimular la producción de citocinas Th1, lo que produjo una producción reprimida de anticuerpos IgE contra la ovoalbúmina en ratones experimentales. La capacidad de cambiar la respuesta inmune de la mucosa hacia Th1 con bacterias probióticas proporciona una estrategia para el tratamiento de los trastornos de la alergia Crecimiento de células tumorales METH A en los pulmones también se inhibieron mediante inyección intrapleural de LcS.

La administración oral de otras bacterias probióticas, tales como Streptococcus thermophilus (St), Lactobacillus fermentum (Lf) y levadura (Y), provocó respuestas inmunitarias diferentes. El antígeno de cofeeding con bacterias probióticas puede suprimir tanto la respuesta inmune celular como la del anticuerpo y puede proporcionar un protocolo eficaz para atenuar enfermedades autoinmunes, como la encefalomielitis alérgica experimental, mediante la administración conjunta de proteína básica de mielina y bacterias probióticas Matsuzaki T & Chin J. 2000. Modulating immune responses with probiotic bacteria. Immunology and Cell Biology 78: 67-73].

Un número significativo de estudios relevantes han destacado los efectos inmunomoduladores que las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium ejercen sobre el sistema inmune del hospedador. Por ejemplo, hay evidencia de que Bifidobacterium bifidum LMG13195 y Bifidobacterium breve IPLA20004 mejoran la función de barrera intestinal y provocan preferentemente la diferenciación de células Treg, que induce la expresión de citocinas antiinflamatorias, cuando se cocultivan con la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT29 [López P, González-Rodríguez I, Sánchez B et al. 2012. Interaction of Bifidobacterium bifidum LMG13195 with HT 29 cells influences regulatory-T-cell-associated chemokine receptor expression. Appl. Environ. Microbiol. 78. 2850-2857]. Lactobacillus rhamnosus GG interactúa con los macrófagos de forma tal que los macrófagos activados pueden discriminar entre bacterias probióticas y patogénicas mediante la regulación del gen TLR mediado por INF [Miettinen et al 2008] y la interacción entre Lactobacillus casei CRL431 y las células inmunes asociadas al intestino inducen un aumento en el número de receptores CD-206 y TLR2 [Aragón F, Carino S, Perdigón G. et al. 2014. The administration of milk fermented by the probiotic Lactobacillus casei CRL431 exerts an immunomodulatory effect against a breast tumour in a mouse model. Immunobiology 219: 457-464].

Los componentes solubles producidos por bacterias probióticas también pueden afectar la interacción entre bacterias y hospedadores. En Bifidobacterium longum, se ha demostrado que la secreción de serpina, un inhibidor de serina proteasa, que se une e inactiva específicamente a los neutrófilos humanos y la elastasa pancreática, contribuye a la homeostasis intestinal [Ivanov et al 2006]. Además, se ha observado que algunas proteínas con motivos bioquímicos característicos producidos por bacterias tanto comensal como patógena pueden provocar funciones específicas y afectar las células inmunes de la luz intestinal. Este es el caso de una familia de proteínas ricas en serina treonina, que se describió en especies de Lactobacillus y Bifidobacterium, con una función quinasa recientemente descrita [Zakharevich NV, Osolodkin DI, Artamonova II. et al. 2012. Signatures of the ATP-binding pocket as a basis for structural classification of the serine/threonine protein kinases of grampositive bacteria. Proteins 80: 1363-1376; Nezametdinova VZ, Zakharevich NV, Alekseeva MG et al. 2014. Identification and characterization of the serine/threonine protein kinases in Bifidobacterium. Arch. Microbiol. 196,125-136]. En los lactobacilos, se observó que un péptido de serina-treonina, STp, que está contenido en una proteína secretada por L. plantarum, está implicada en la agregación bacteriana [Hevia et al 2013]. Además, este péptido puede modular el fenotipo de células dendríticas de pacientes con colitis ulcerosa (CU) [Bernardo D, Sánchez B, Al-Hassi HO et al. 2012. Microbiota/ host crosstalk biomarkers: regulatory response of human intestinal dendritic cells exposed to Lactobacillus extracellular encrypted peptide. PLoSONE 7:e36262; Al-Hassi HO, Mann ER, Sanchez B et al.2014. Altered human gut dendritic cell properties in ulcerative colitis are reversed by Lactobacillus plantarum extracellular encrypted peptide STp. Mol. Nutr. FoodRes. 58: 1132-1143].

El efecto inmunomodulador de Lactobacillus paracasei está mediado, al menos en parte, por la proteasa secretada lactocepina, que degrada selectivamente la proteína 10 inducible por el IFN-g (IP-10) que funciona en el reclutamiento de linfocitos [von Schillde MA, Hormannsperger G, Weiher M, et al. 2012. Lactocepin secreted by Lactobacillus exerts anti- inflammatory effects by selectively degrading proinflammatory chemokines. Cell Host Microbe 11: 387-396]. Existen otros ejemplos de compuestos no proteináceos que pueden ejercer ciertos efectos sobre el hospedador. Algunas especies de Bifidobacterium poseen motivos CpG no metilados en su ADN que fueron capaces de inducir la activación de TLR9, que se sabe que desencadena una orientación Th1 del sistema inmune [Ménard O, Gafa V, Kapel N et al. 2010. Characterization of immune stimulatory CpG-rich sequences from different Bifidobacterium species. Appl. Environ. Microbiol. 76:2846-255; Hevia A, Delgado S, Sanchez B et al. 2015. Molecular Players Involved in the Interaction Between Beneficial Bacteria and the Immune System. Frontiers in Microbiology 6:1285]. Los metabolitos derivados de la microbiota: cadena corta ácidos grasos (AGCC) Las células mamíferas pueden detectar microbios a través del patrón receptores de reconocimiento tales como receptores de tipo peaje (TLR) que reconocen lipopolisacárido (LPS). Recientemente, se ha descubierto que los ácidos grasos de cadena corta derivados de microbios (SFCA) que son producidos por bacterias comensales, como Clostridia y Bifidobacteria, a partir de la fermentación de carbohidratos y la fibra, se han convertido en jugadores centrales que median la diafonía entre la microbiota y el anfitrión [Macfarlane S and Macfarlane GT. 2003. Regulation of short-chain fatty acid production. Proc Nutr Soc 62:67-72; Bolognini D, Moss CE, Nilsson K et al. 2016. A novel allosteric activator of free fatty acid 2 receptor displays unique gi-functional bias. J Biol Chem 291:18915-18931]. En particular, propionato, acetato y butirato, los tres SCFA más abundantes en la luz intestinal, han recibido un aumento atención en el campo debido a su potencial impacto beneficioso en la fisiología del hospedador, incluida la reducción inflamación y función de barrera epitelial mejorada, aunque estos efectos han variado entre los estudios [Brestoff JR and Artis D. 2013. Commensal bacteria at the interface of host metabolism and the immune system. Nat Immunol 14: 676-684; Rooks MG and Garrett WS. 2016. Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol 16: 341-352; Suzuki T, Yoshida S and Hara H. 2008. Physiological concentrations of short-chain fatty acids immediately suppress colonic epithelial permeability. Br J Nutr 100:297-305]. Los ratones libres de gérmenes expresan muy poco o ningún AGCC, indicativo que la producción de estos metabolitos depende de la microbiota [Maslowski KM, Vieira AT, Ng A et al. 2009. Regulation of inflammatory responses by gut microbiota and chemoattractant receptor GPR43. Nature 461:1282-1286].

Aunque su mecanismo de acción no se entiende completamente, se piensa que los AGCC modulan hospedar procesos celulares a través de (1) inhibición directa de Actividad HDAC y / o (2) activación de proteína G-cou-pled-receptores (GPCR) [Macia et al 2015; kim et al 2013]. Las HDAC eliminan el acetilo residuos de proteínas histonas o no histonas y dieciocho HDAC de mamíferos conocidos se clasifican en cuatro clases basadas en la homología de secuencia. Estos epigenomic- enzimas modificadoras a menudo están presentes en grandes complejos proteicos que se dirigen a la cromatina diana a través de interacciones de factores de transcripción. Dado que Los AGCC, y particularmente el butirato, se conocen desde hace tiempo para inhibir ampliamente la familia epigenómica HDAC de enzimas, varios estudios recientes han demostrado o sugirió que los AGCS median interacciones entre la microbiota a través de la regulación epigenómica [Woo V and Alenghat T. 2017. Hostmicrobiota interactions: epigenomic regulation. Current Opinion in Immunology 44:52-60].

Algunas bacterias tienen la capacidad de metabolizar derivados de aminoácidos aromáticos en el tracto intestinal dan lugar a numerosos compuestos con propiedades antitumorales (fundamentalmente antioxidantes como pasaba en el caso de los polifenoles) o tumorales como en el caso del fenol, indol o p-cresol que tienen propiedades mutagénicas además de alterar la composición de la microbiota. [Russell WR, Duncan SH, Scobbie L et al. 2013. Major phenylpropanoid-derived metabolites in the human gut can arise from microbial fermentation of protein. Mol Nutr Food Res. 57: 523-35, Louis P, Hold GL and Flint HJ. 2014. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer. Nature Reviews Microbiology 12: 661-72].

La microbiota comensal puede influir en la inmunidad antitumoral espontánea, así como en la terapia con mAb PD-L1. Dentro de las bacterias comensales intestinales de ratones, Bifidobacterium se identificó como el componente principal de los efectos inmunes beneficiosos antitumorales observados en ratones JAX. Esta bacteria de ratón se encontró similar a B. breve, B. longum y B. adolescentis (99% de identidad) que se encuentran comúnmente en un intestino humano sano.

Bifidobacterium altera la actividad de las células dendríticas (DC), lo que a su vez mejora la función de las células T CD8 específicas del tumor. El hecho de que el efecto antitumoral requiera bacterias vivas implica que Bifidobacterium coloniza compartimentos específicos dentro de la sección intestinal que permite la interacción con las células anfitrionas críticas para modular la función DC o crítica para la liberación de factores solubles que circulan sistémicamente y conduce a una función DC mejorada. Cabe destacar que estos resultados sugieren que existe otra fuente de heterogeneidad entre sujetos, con respecto a los efectos terapéuticos del mAb anti PD-L1, y que está representada por la composición de los microbios intestinales, además del estado inmunitario del paciente, la cantidad de infiltración de células T efectoras en el sitio del tumor, o el perfil de expresión de los puntos de control de células T.

Existen experimentos, que parecen revelar claramente que la microbiota intestinal es necesaria para los efectos anticancerígenos del bloqueo de CTLA-4 [Vétizou M, Pitt JM, Daillére R et al. 2015. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota, Science 350:1079-1084]. Estos resultados también se confirmaron en los modelos de melanoma Ret y MC38 de cáncer de colon. La investigación del funcionamiento de las células del sistema inmunitario de ratones tratados con antibióticos revela que la activación de las células T efectores CD4 esplénicas y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) inducidos por Ab contra CTLA-4 disminuyó significativamente si se compara con ratones SFP no tratados [Vétizou M, Pitt JM, Daillére R et al.2015. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota, Science 350:1079-1084].

El hecho de que la microbiota intestinal tiene una influencia sustancial en la respuesta inmune, tanto en animales como en humanos, se ha demostrado ampliamente [Maynard CL, Elson CO, Hatton RD et al.2012. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489: 231-41; Honda K and Littman DR. 2016. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease, Nature 535:75-842016]. La microbiota intestinal afecta la eficacia del bloqueo del punto de control contra múltiples modelos tumorales, al menos en ratones [Sivan A, Corrales L, Hubert N et al.

2015. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy, Science 350:1084-1089, Vétizou M, Pitt JM, Daillére R et al. 2015. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota, Science 350:1079-1084]. Sin embargo, mientras que una microbiota "optimizada" aumenta la eficacia del mAb anti-PD-1, esto era absolutamente necesario para la actividad del mAb anti-CTLA-4.

Claramente, todos estos hallazgos abren nuevas vías para la terapia del cáncer. Los experimentos en ratones sugerirían que, en principio, la microbiota intestinal puede manipularse con éxito para enriquecerse con una bacteria beneficiosa particular o un cóctel seleccionado de bacterias para mejorar la inmunidad antitumoral.

Tres artículos en Science respaldan la idea de que la composición de la microbiota intestinal modula la respuesta a la inmunoterapia bloqueando anticuerpos contra la proteína 1 de la muerte celular programada (PD1) o el ligando PD1 1 (PDL1) en pacientes con tumores epiteliales, incluido el pulmón de células no pequeñas cáncer y carcinoma de células renales o melanoma. En el primero de estos estudios, la disbiosis inducida por antibióticos de amplio espectro se relacionó con el fracaso de la inmunoterapia dirigida a PD1 o PDL1 tanto en pacientes como en ratones En los tres estudios, los análisis microbianos fecales de poblaciones de pacientes independientes condujeron a la identificación de entidades bacterianas que se correlacionan positivamente con la respuesta clínica [Kroemer G and Zitvogel L. 2018. Cancer Immunotherapy in 2017: The breakthrough of the microbiota. Nature Rev Immunol 18: 87-88]

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una composición moduladora del microbioma intestinal humano, que tiene utilidad en la prevención y el tratamiento de trastornos causados o al menos fomentados por disbiosis intestinal de la microbiota en humanos.

El procedimiento de obtención conforme a la invención comprende las etapas de cultivar cepas de microorganismos probióticos que comprenden cepas de los géneros Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium, en caldos de cultivo para obtener caldos de biomasas de los microorganismos probióticos que comprenden biomasas microbianas y caldos de cultivo, y recuperar las biomasas microbianas de los caldos de biomasas microbianas para obtener biomasas microbianas recuperadas húmedas y está caracterizado porque

las cepas de cada microorganismo se cultivan, al menos hasta que hayan alcanzado su plena fase logarítmica de crecimiento, en sendos caldos de cultivo separados;

las biomasas microbianas se recuperan por separado de los respectivos caldos de cultivo para obtener respectivas biomasas microbianas recuperadas húmedas; cada una de las biomasas microbianas recuperadas húmedas se somete a lisis celular hasta alcanzar un porcentaje de rotura celular de al menos 90% para obtener respectivas biomasas de lisados microbianos;

las respectivas biomasas de lisados microbianos se secan para obtener respectivos lisados microbianos secos;

los respectivos lisados microbianos secos se mezclan en proporciones de 30% a 70% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Saccharomyces,

10% a 30% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Lactobacillus,

10% a 30% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Bacillus,

3% a 10% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Streptococcus,

3% a 10% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Bifidobacterium,

para obtener una mezcla de lisados microbianos secos.

De la mezcla de lisados microbianos se extrae al menos una muestra de la mezcla de los lisados microbianos secos y se determina si la muestra comprende un mínimo de secuencias genómicas de 5000 copias/ml de cada una de las siguientes secuencias genómicas:

y, cuando se constata que la muestra comprende dicho mínimo de secuencias genómicas, se selecciona la mezcla de los lisados microbianos secos para obtener la composición moduladora.

En una realización preferente del procedimiento, el mínimo de secuencias genómicas comprende además al menos 5000 copias/ml de secuencias genómicas adicionales coincidentes en al menos un 75% con cada una de las siguientes secuencias genómicas adicionales

Cuando se constata que la muestra comprende dicho mínimo de secuencias genómicas, adicionales, se selecciona la mezcla de los lisados microbianos secos para obtener la composición moduladora.

En una realización del procedimiento, las cepas de microorganismos del género Saccharomyces son cepas de Saccharomyces cerevisiae.

Las de cepas de microorganismos del género Lactobacillus puedeb seleccionarse entre cepas de Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri, y combinaciones de las mismas, las cepas de microorganismos del género Bacillus pueden seleccionarse entre cepas de Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus clausii, y combinaciones de las mismas, y las cepas de microorganismos del género Bifidobacterium pueden seleccionarse entre cepas de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, y combinaciones de las mismas. A su vez, las cepas de microorganismos del género Streptococcus pueden ser cepas de Streptococcus thermophilus.

En una realización preferente, el procedimiento conforme a la invención, los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan a pH 6.4 10% en ausencia de oxígeno hasta obtener un caldo de cultivo anaeróbico en el que los microorganismos del género Lactobacillus se encuentran en plena fase logarítmica de crecimiento de su biomasa y, cuando los microorganismos han alcanzado su plena fase logarítmica de crecimiento ha sido alcanzada, se introduce oxígeno en el caldo de cultivo inicial hasta que contenga entre 25% y 30% de oxígeno disuelto para obtener un caldo de cultivo oxigenado. Así, los microorganismos del género Lactobacillus pueden cultivarse a pH 6.4% 0,1 en ausencia de oxígeno durante 5,5 a 6,5 horas.

Este caldo de cultivo oxigenado se siembra con, por ejemplo con 4 a 6% v/v, de un cultivo de microorganismos del género Saccharomyces, y los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces se cultivan conjuntamente, ajustándose y manteniéndose el caldo de cultivo con el 20% a 30% de oxígeno disuelto y manteniendo el caldo de cultivo a pH de 6.4 10%, particularmente a pH 6.4 0.1, y más particularmente durante una primera etapa y permitiendo en una segunda etapa que el pH descienda a 4.5 10%. El cultivo se detiene cuando el pH ha llegado a 4.5 10%, particularmente a pH 4.5 0.1, para obtener caldos de las biomasas microbianas formadas a partir de los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces.

Según esta realización preferente del procedimiento, los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan preferentemente en ausencia de oxígeno durante 5 a 7 horas y más preferentemente durante 5,5 y 6,5 horas, y, en la primera etapa, se cultivan conjuntamente los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces durante 7 a 9 horas, particularmente durante 7,5 a 8,5 horas.

Preferentemente, las biomasas microbianas se recuperan mediante centrifugación por separado de los respectivos caldos de cultivo, y se secan mediante secado por atomización o mediante liofilización.

Los microorganismos del género Bacillus pueden cultivarse a 30°C 1°C durante 20 24 horas, manteniendo una concentración de oxígeno disuelto de la menos 40% y un pH de 6,8 0,1, preferentemente manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador que puede comprender una solución acuosa de amonio al 25% p/v y/o una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

Los microorganismos del género Streptococcus pueden cultivarse a 37°C 1°C durante aproximadamente 24 horas en condiciones microaerófilas y un pH de 6,8 0,1 sin aplicar aireación al caldo de cultivo, particularmente a una saturación de oxigeno inicial inferior a un 10%, preferentemente a una saturación de oxigeno inicial inferior a un 2%. Preferentemente, los microorganismos del género Streptococcus se cultivan manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador, que puede comprender una solución acuosa de amonio al 25% p/v y/o una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

Los microorganismos del género Bifidobacterium pueden cultivarse a 37°C 1°C durante aproximadamente 24 horas en ausencia de oxígeno y un pH de 6,2 0,1.

Durante el cultivo de los microorganismos del género Bifidobacterium se cultivan manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador, que puede comprender una solución acuosa de amonio al 25% p/v y/o una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

Preferentemente, cada uno de los caldos de biomasas obtenidas al finalizar el cultivo, se enfrían, por ejemplo, hasta 4°C a 8°C para detener el metabolismo celular de los microorganismos presentes en los caldos de biomasas.

La composición que puede obtenerse conforme al procedimiento de la invención es una composición obtenida de lisados de microorganismos probióticos que comprende secuencias genómicas provenientes de lisados de cultivos de cepas de microorganismos de los géneros Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium, Estos lisados comprenden al menos 5000 copias/ml de cada una de las siguientes secuencias genómicas:

Por otra parte, el suplemento alimenticio comprende la composición obtenida de lisados de microorganismos probióticos.

De acuerdo con una realización preferente, los lisados además comprenden al menos 5000 copias/ml de secuencias genómicas al menos un 75% coincidentes con cada una de las siguientes secuencias genómicas:

Los lisados obtenidas de cultivos de cepas de microorganismos del género Saccharomyces pueden provenir de cultivos de Saccharomyces cerevisiae.

Por otra parte, los lisados obtenidos de cultivos de cepas de microorganismos del género Lactobacillus pueden provenir de cultivos de Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri, o combinaciones de los mismos.

A su vez, los lisados obtenidos de cultivos de cepas de microorganismos del género Bacillus pueden provenir de cultivos de Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus clausii, o combinaciones de los mismos.

En cuanto a los lisados obtenidos de cultivos de cepas de microorganismos del género Bifidobacterium, estos pueden provenir de cultivos de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, o combinaciones de los mismos.

Finalmente, los lisados obtenidos de cultivos de cepas de microorganismos del género Streptococcus pueden provenir de cultivos de Streptococcus thermophilus.

La composición puede comprender una abundancia relativa de al menos un 50% de proteínas provenientes de lisados de cultivos de Saccharomyces. Asimismo, la composición puede comprender una abundancia relativa de al menos un 3% de proteínas provenientes de lisados de cultivos de cada uno de los microorganismos siguientes: Lactobacillus, Saccharomyces, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium

En una realización de la invención, la composición comprende

proteínas con función enolasa clasificados en la categoría KO K01689 en un 0.5-5% de abundancia relativa,

proteínas parecidas a la histona con función ligante de ADN clasificadas en la categoría KO K03530 en una abundancia relativa de 0.5-5%,

proteínas con función deshidrogenasa de alcohol clasificadas en la categoría KO K13953 en una abundancia relativa de 0.5-5%,

y proteínas con función tioredoxina de la actividad metabólica total clasificadas en la categoría KO K03671 en una abundancia relativa de 0.5-5%.

La composición también puede comprender abundancias relativas de

0.1-5% de proteínas con función pirofosfatasa inorgánica clasificadas en la categoría KO K01507;

0.5-5% de proteínas con función de fosfoglicerato mutasa 2,3 biofosfogliceratodependiente clasificadas en la categoría KO K01834;

0.1-5%, de metiltransferasa de 5-metiltetrahidropoeroilglutamato de homocisteína clasificada en la categoría KO K00549;

0.1-5%, de sintetasa de S-adenosilmetionina clasificada en la categoría KO K00789.

Asimismo, la composición puede comprender abundancias relativas de

0.5-5% de proteínas ribosomales de subunidades grandes L24 clasificadas en la categoría KO K02895;

0.5-5% de chaperona Dnak molecular clasificada en la categoría KO K04043; 0.1-5% de proteína ribosomal de subunidad pequeña S5 clasificada en la categoría KO K02988;

0.1-5% de helicasa ARN Dead ATP dependiente clasificada en la categoría KO K05592;

0.1-5% de proteína ribosomal de subunidad pequeña S12 clasificadas en la categoría KO K02950.

Las categorías KO corresponden a la clasificación de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (=KEGG Orthologies; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes - https://www.genome.jp/kegg/).

Preferentemente, los lisados de cultivos de cepas de microorganismos en la composición conforme a la presente invención son lisados microbianos secos, que se han obtenido por atomización o liofilización.

Estos lisados microbianos secos pueden comprender una mezcla de

30% a 70% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Saccharomyces,

3% a 10% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Streptococcus.

Mediante el procedimiento conforme a la invención se obtiene un composición que comprende una combinación de bacterias probióticas que tras un proceso de crecimiento y lisado, a partir de lo que se genera un extracto consistente en una amalgama de metabolitos, proteínas, secuencias genéticas y demás compuestos, que dosificándose de manera eficiente es capaz de alterar y modificar la microbiota del hospedador mediante varios mecanismos, de manera que confiere una activación del sistema inmunitario revertiendo la disbiosis de manera natural.

Este conjunto de partes de microrganismos probióticos y simbióticos, así como sus metabolitos obtenidos a partir de cultivos en bioprocesadores suplen las funciones fisiológicas de la microbiota, regulan la disbiosis y producen un impacto clínico en las patologías asociadas a disbiosis, como enfermedades inflamatorias, neurodegenerativas, metabólicas y cáncer.

La administración oral del producto, actúa regulando la función de la microbiota, mediante la cantidad administrada de componentes con actividad biológica sobre el hospedador.

Los efectos de la toma del producto, vienen dados por un mecanismo de acción basado en un ajuste y reprogramación de la microbiota presente en el tracto intestinal. El efecto ejercido sobre la microbiota no es un efecto de tipo local ya que todo el organismo se ve beneficiado por esta modulación de la microbiota, convirtiéndose en un efecto sistémico.

Así, por ejemplo, los pacientes de cáncer presentan una disbiosis de la microbiota lo cual se traduce en una reducción de una serie de grupos bacterianos que viven de forma simbiótica y que proporcionan efectos beneficiosos en el hospedador y un posible aumento de bacterias patógenas. Además, esta disbiosis también se ve reflejado en una menor variedad dentro de la microbiota de los pacientes de cáncer, esto quiere decir que poseen un menor número de grupos bacterianos distintos que personas sanas.

La regulación de la microbiota se ve reflejada en multitud de efectos fisiológicos y un aumento en la calidad de vida de los pacientes. Una correcta microbiota produce una reducción de infecciones en el tracto intestinal y una menor posibilidad de translocación de bacterias patógenas. Todo ello es debido en parte gracias a una mejoría en la permeabilidad del epitelio intestinal unido a una correcta respuesta del sistema inmune, junto con un aumento en la producción y secreción de mucinas y de Tight Junction Proteins, proteínas fundamentales en la permeabilidad del epitelio intestinal y de otro tipo de péptidos de tipo antimicrobiano como son las defensinas.

Un efecto global de lo anteriormente expuesto es una reducción de la inflamación intestinal, síntoma que padecen los enfermos de cáncer y que al verse revertido produce una mejora en la calidad de vida de los pacientes.

Los pacientes que sufren de cáncer poseen una serie de metabolitos y productos carcinogénicos que se ven aumentados significativamente, como es el caso de las aminas, benzopirenos... entre otros. Una regulación de la microbiota intestinal reducirá la producción de estos compuestos, y por el contrario aumentando la ingesta de los metabolitos generados por los microorganismos beneficiosos como es el caso de los ácidos grasos de cadena corta, generará una corrección de las funciones del sistema inmune, disminuyendo los metabolitos carcinogénicos, promoviendo el aumento de población bacteriana beneficiosa en la microbiota y generando nuevamente conexiones interrumpidas con el sistema inmune para el mantenimiento de la homeostasis a través de mecanismos epigenéticos entre otros.

Uno de los efectores de esta cadena de reacciones se debe a los ácidos grasos de cadena corta (SCFA, de sus siglas en inglés: Short Chain Fatty Acids). Los ácidos grasos de cadena corta SCFA, se refieren ácidos grasos libre, con un número pequeño de carbonos. Los más comunes son: el ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico. Gracias a que su cadena hidrofóbica es corta y poseen un grupo carboxílico, son compuestos solubles en agua y puede absorberse y transportarse al interior de las células fácilmente.

Por tanto, refuerzan la barrera epitelial del intestino ya que son directamente fuente de energía para los colonocitos del intestino, afectando a la formación de moco intestinal, aumentando la supervivencia de las células epiteliales, mejorando las uniones proteínas en la monocapa intestinal.

Tienen actividad antiinflamatoria y antitumoral: Esta mejoría de las células epiteliales del colon, las condiciona para tener una mejor respuesta inmune y reducir la respuesta inflamatoria crónica que puede estar producida por el cáncer o por la invasión de patógenos. Los SCFA son quimiotácticos de neutrófilos, y pueden regular a macrófagos y a las células dendríticas. Tienen actividad antitumoral, promueven respuesta a estrés, arresto en el ciclo celular y apoptosis en células tumorales.

Con el aumento de estos metabolitos, se produce una acidificación en el medio, generando una actividad antimicrobiana ya que inhibe el crecimiento de determinadas cepas bacterias y por tanto puede modificar la población microbiana de intestino.

Por tanto, la composición obtenida según el procedimiento conforme a la invención ejerce un efecto inmoduladora en el organismo humano a través de modulación de la microbiota que se produce cuando el ser humano ingiere la composición.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

A continuación, se describen unos ejemplos en los que se hace referencia a las siguientes figuras que forman parte integrante de la presente memoria descriptiva.

La figura 1 refleja la distribución de los valores nemPAI (%) de una Muestra según una realización de la composición conforme a la presente invención.

La figura 2 muestra los resultados de las distintas actividades y producción de citoquinas obtenidos con la realización de la Muestra.

las figuras 3A y 3B representan la actividad fagocítica de esplenocitos de ratón en presencia de distintas concentraciones de la Muestra.

Las figuras 4A y 4B ilustran los resultados de la fagocitosis relativa (porcentaje; %) obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 4A) y C57BL/6 (figura 4B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 5 ilustra los resultados de la fagocitosis relativa (porcentaje; %) obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 6A y 6B ilustran los resultados de la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2-obtenida a partir de esplenocitos provenientes de ratones BalbC (figura 6A) y C57BL/6 (figura 6B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 7A y 7B ilustran los resultados de la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2-obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 7A) y C57BL/6 (figura 7B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 8 ilustra la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2- obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 9A y 9B ilustran los resultados de la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de esplenocitos provenientes de ratones BalbC (figura 9A) y C57BL/6 (figura 9B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 10A y 10B ilustran la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 10A) y C57BL/6 (figura 10B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 11 ilustra los resultados de la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 12 se refiere a un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de TNF-a, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos.

Las figuras 13A.y 13B ilustran los resultados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 13A) y C57BL/6 (figura 13B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 14A y 14B ilustran los resultados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 14A) y C57BL/6 (figura 14B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 15 ilustra los resultados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 16 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IFN-^y.

Las figuras 17A y 17B ilustran los resultados de la producción de IFN-y (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 17A) y C57BL/6 (figura 17B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 18A y 18B ilustran los resultados de la producción de IFN-^y(pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 18A) y C57BL/6 (figura 18B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 19 ilustra la producción de IFN-y (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 20 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-2.

Las figuras 21A y 21B ilustran la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 20A) y C57BL/6 (figura 20B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 22A y 22B ilustran los resultados de la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 22A) y C57BL/6 (figura 22B) cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 23 ilustra los resultados de la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 24 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-10.

Las figuras 25A y 25B ilustran los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 23A) y C57BL/6 (figura 25B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 26A y 26B ilustran los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 26A) y C57BL/6 (figura 26B) cultivados en presencia de la Muestra

La figura 27 ilustra los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra.

La figura 28 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-4.

Las figuras 29A y 29B ilustran los resultados de la producción de IL-4 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 29A) y C57BL/6 (figura 29B) cultivados en presencia de la Muestra.

Las figuras 30A y 30B ilustran los resultados de la producción de IL-4 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 30A) y C57BL/6 (figura 30B) cultivados en presencia de la Muestra.

La Figura 31B ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-13.

Las figuras 32A y 32B ilustran los resultados de la producción de IL-13 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 32A) y C57BL/6 (figura 32B) cultivados en presencia de la Muestra diluciones seriadas del estándar de IL-13.

Las figuras 33A y 33B. ilustran los resultados de la producción de IL-13 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 33A) y C57BL/6 (figura 33B) cultivados en presencia de la Muestra.

MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1 - PREPARACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN MODULADORA

Se preparan lotes separados de respectivos liofilizados de microorganismos de los géneros Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium en tubos Falcon de 10 o 50 mL,

Los microorganismos de partida se conservan a 4°C en forma de liofilizados, identificados a nivel de especie. La conservación de los géneros Bacillus y Streptococcus se lleva a cabo cultivando pequeñas proporciones de los liofilizados en sendos medios de inóculos Nutrient Broth y Trypticase Soy Broth durante 15 horas a 250 rpm a 30°C y 150 rpm a 37°C.

En el caso de Bifidobacterium y Lactobacillus una pequeña proporción del respectivo liofilizado se cultiva en medio líquido MRS Broth durante 48 horas a 37°C bajo condiciones de anaerobiosis. Transcurrido el tiempo de incubación, las células se concentran por centrifugación y se resuspenden en glicerol al 20%. Las suspensiones microbianas se reparten en respectivos viales que se congelan a -80°C. De esta manera, los microorganismos pueden permanecer sin pérdida de viabilidad durante 1 año.

Particularmente, los liofilizados de microrganismos del género Bacillus y Streptococcus, se aspiran con ayuda de una pipeta automática en campana de flujo laminar, 100 ^L de liofilizado y se resuspenden en 2 mL de agua milli-Q estéril. A continuación, se siembra un matraz de 500 mL, conteniendo 100 mL de medio de inóculo NB y TSB, respectivamente, con los 2 mL de la suspensión. Los matraces incuban a 250 rpm y 30°C y a 150 rpm y 37°C, respectivamente, durante 15 h. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se evalúa el crecimiento obtenido en el caldo mediante valoración de densidad óptica a 600 nm (DO600nm) y una lectura de pH. Además, se realiza una siembra en placa de medio TSA, BCA y agar nutritivo a modo de controles de esterilidad, que incuban durante 48 h a 30°C. El cultivo crecido se complementa con glicerol hasta una concentración final del 20%. La suspensión se distribuye en viales, a razón de 1.8 mL por tubo. De forma inmediata, los viales con las suspensiones de microbianas se congelan a -80°C y se almacenan.

En el caso de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, en una cabina para trabajo bajo condiciones de anaerobiosis, se resuspenden 100 ^L del liofilizado en 2 mL de agua milli-Q estéril. A continuación, se siembra un matraz de 500 mL con 100 mL de medio de inóculo MRS Broth con los 2 mL de la suspensión. El cultivo incuba sin agitación a 37°C durante 48 horas en una jarra de anaerobiosis Gas-Pak. Finalizado el tiempo de incubación, la producción de biomasa se evalúa mediante análisis de la DO600nm y el pH. Placas de medio TSA, BCA y agar nutritivo se siembran como controles de esterilidad. El cultivo crecido se complementa con glicerol hasta alcanzar una concentración final del 20%. La suspensión se distribuye a razón de 1.8 mL por vial, y los viales con las suspensiones microbianas se congelan de forma inmediata a -80°C.

Para el proceso de fermentación, se prepara un cultivo de inoculación en un medio de cultivo en matraz de cada microorganismo, en cantidad y volumen adecuados para poder proceder a inocular el fermentador con respectivos inóculos incubados.

Para ello, los viales almacenados a -80°C se sumergen en un baño de agua a 30°C para permitir una descongelación rápida y completa del inóculo del respectivo microrganismo. Sin pérdida de tiempo, se procede a la siembra de sendos matraces de inóculo con los microrganismos.

El medio de inóculo utilizado para el crecimiento del género Bacillus es Nutrient Broth (NB):

• Reparto en matraces de 500 mL (tapón de espuma) con 100 mL de medio.

• pH antes de la esterilización ajustado a 6.8.

• Esterilidad: 121°C durante 20 min.

• pH después de la esterilización: 6.8±0.2.

El medio de inóculo para crecimiento del género Streptococcus es Tryptic Soy Broth (TSB):

1. Reparto en matraces de 500 mL (tapón de espuma) con 100 mL de medio. 2. pH antes de la esterilización ajustado a 7.3.

3. Esterilidad: 121°C durante 20 min.

4. pH después de la esterilización: 7.3±0.2.

El medio de inóculo utilizado para el crecimiento del género Bifidobacterium y Lactobacillus es De Man, Rogosa, Sharpe Broth (MRS Broth), un medio formulado y no selectivo para el crecimiento de bacterias del ácido láctico:

• Reparto en matraces de 500 mL (tapón de espuma) con 100 mL de medio. • pH antes de la esterilización ajustado a 6.2.

• Esterilidad: 121°C durante 20 min.

• pH después de la esterilización: 6.2±0.2.

Los inóculos de los respectivos microrganismos se incuban en los medios de inóculo anteriormente descritos.

Las condiciones de incubación para obtener inóculos de microrganimos del género Bacillus son las siguientes:

- Temperatura: 30°C.

- Humedad relativa: 40% aproximadamente.

- Agitación: 250 rpm (2.5 cm excentricidad).

- Duración: 15 horas ± 2.

Las condiciones de incubación para obtener inóculos de microrganimos del género Streptococcus son las siguientes:

- Temperatura: 37°C.

- Humedad relativa: 40% aproximadamente.

- Agitación: 150 rpm (2.5 cm excentricidad).

- Duración: 24 horas ± 2.

Las condiciones de incubación para obtener inóculos de microrganimos del género Bifidobacterium y Lactobacillus:

- Temperatura: 37°C.

- Duración: 24 horas ± 2.

Una vez obtenidos los inóculos de los respectivos microorganismos se procede a la siembra directa de sendos fermentadores por separado. El porcentaje de siembra es de un 3% para Bacillus y de un 5% para cada uno de Bifidobacterium, Lactobacillus y Streptococcus.

El caldo de cultivo utilizado para la fermentación del género Bacillus se denomina MFIGEN. Para cada fermentador con un volumen geométrico de 30 L, se preparan 20 L de caldo de cultivo (antes de siembra) con la siguiente composición:

Los componentes del medio se disuelven en un vaso de precipitados de plástico de 5 L y se enrasa hasta el volumen final con agua de proceso. El pH antes de la esterilización se ajusta a 6.8 con H3PO435%. El ciclo de esterilidad en el fermentador es de 121°C durante 30 min con agitación constante a 150 rpm. Tras la esterilización, el pH se reajusta a 6.8±0.1 con NH4OH 25% y se comprueba que el nivel de medio corresponde al volumen inicial ± 1L. Para llevar a cabo este ajuste en condiciones estériles, anteriormente se habrá pinchado en el fermentador un sistema de adición con tres vías para: ácido, base y antiespumante.

El medio de cultivo utilizado para la fermentación del género Streptococcus se denomina MFSTREP. Para cada fermentador con un volumen geométrico de 30 L se preparan 20 L de medio de cultivo (antes de siembra) con la siguiente composición:

Los componentes del medio se disuelven en un vaso de precipitados de plástico de 5 L y se enrasa hasta el volumen final con agua de proceso. El pH antes de la esterilización se ajusta a 7.3 con H3PO435%. El ciclo de esterilidad en el fermentador es de 121°C durante 30 min con agitación constante a 150 rpm. Tras la esterilización, el pH se reajusta a 7.3±0.1 con NH4OH 25% y se comprueba que el nivel de medio corresponde al volumen inicial ± 1L. Para llevar a cabo este ajuste en condiciones estériles, anteriormente se habrá pinchado en el fermentador un sistema de adición con tres vías para: ácido, base y antiespumante.

Para ambas fermentaciones, cuando el medio ya se encuentre a la temperatura de trabajo, se tomará una muestra de antes de siembra para corroborar el valor del pH en un pH-metro de mesa, así como para realizar un control de esterilidad en medio sólido TSA y líquido TSB. Además, antes de realizar la siembra, la sonda de oxígeno debe ser calibrada. El 95% del valor de oxígeno disuelto se ajusta en las condiciones de aireación iniciales suministrando el mínimo de oxígeno necesario para la toma de muestras.

Para el género Bifidobacterium y Lactobacillus, el medio de cultivo tiene la siguiente composición:

El volumen final al que se enrasa el medio es de 20 L. El ciclo de esterilidad en el fermentador es de 121°C durante 30 min con una agitación constante de 150 rpm. El pH después de esteril se ajusta a 6.2±0.1 con NH4OH 25% o H3PO435%, según requerimientos. Para llevar a cabo este ajuste en condiciones estériles, anteriormente se habrá pinchado en el fermentador un sistema de adición con tres vías para: ácido, base y antiespumante. Tras enfriar a la temperatura de trabajo, se toma la muestra correspondiente a "antes de siembra”, para realizar un control de esterilidad y valoración externa de pH.

Después de la siembra del fermentador con el inóculo del microrganismo correspondiente, se procede a la fase de fermentación por separado de cada uno de los microrganismos para la generación de sendas biomasas microbianas, estableciendo las mejores condiciones de producción durante el menor tiempo de proceso posible. En la fermentación aerobia de Bacillus el principal parámetro que controla la fermentación es el oxígeno disuelto (OD), que deberá mantenerse por encima del 40%. Para el género Streptococcus la estrategia de crecimiento se basa en una fermentación en condiciones microaerófilas. Por último, en el caso de Lactobacillus y Bifidobacterium se desarrolla una fermentación anaerobia.

Para la fermentación de Bacillus las condiciones son las siguientes:

- Temperatura: 30°C ± 1°C durante todo el proceso. Al finalizar la fermentación, se baja a 4-8°C para detener el metabolismo celular y cosechar el caldo.

- Presión: 0.5 atm.

- pH: 6.8 ± 0.1 durante todo el proceso. Adición estéril de NH4OH 25% o H3PO4 35% de forma automática, conectando las gomas de silicona a las bombas peristáltica del fermentador y fijando el valor consigna en el equipo.

- Agitación: 150 rpm inicialmente. Dependiendo de la espuma y el oxígeno disuelto este parámetro aumenta por activación de una cascada hasta un máximo de 250 rpm

- Aireación: 1 V/V/min. Dependiendo de la espuma y el oxígeno disuelto, aumentar de forma manual de 0.1 en 0.1 V/V/min hasta un máximo de 1.5 V/V/min.

- Oxígeno disuelto: se mantiene >40%. Si el % desciende del límite establecido, comienza la modificación de los parámetros físicos del proceso: agitación y aireación. En primer lugar se activa la cascada de agitación hasta alcanzar el máximo y a continuación, de forma manual, comienza a incrementarse la aireación.

- Ciclo: 20-24 horas aproximadamente. El fin de la fermentación viene determinado por una detención en el consumo de base (NH4OH).

- Control de espuma: adición manual de pequeñas cantidades en caso de observarse mucha espuma en el fermentador.

En el caso de Streptococcus, se establecen unas condiciones de incubación microaerofilas:

- Temperatura: 37°C ± 1°C durante todo el proceso. Al finalizar la fermentación, se baja a 4-8°C para detener el metabolismo celular y cosechar el caldo.

- Presión: 0.5 atm.

- Agitación: 150 rpm durante todo el proceso.

- Aireación: 0 V/V/min. Se suministra el mínimo necesario para la toma de muestras.

- Oxígeno disuelto: Avance de forma libre.

- Ciclo: 20-24 horas aproximadamente.

Para la fermentación de Bifidobacterium las condiciones son las siguientes:

- Presión: 0.5 atm.

- pH: 6.2 ± 0.1 durante todo el proceso. Adición estéril de NH4OH 25% o H3PO4 35% de forma automática, conectando las gomas de silicona a las bombas peristáltica del fermentador y fijando el valor consigna en el equipo.

- Agitación: 50 rpm durante todo el proceso (el mínimo valor que garantice la correcta homogenización de los componentes del medio).

- Oxígeno disuelto: burbujear nitrógeno hasta que la concentración de oxígeno disuelto esté en 0%. Este valor se controla a lo largo de la fermentación y si bien no es necesario un aporte continuo, si se puede burbujear ocasionalmente cuando sea necesario.

- Ciclo: 24 horas aproximadamente. El fin de la fermentación viene determinado por una detención en el consumo de base (NH4OH).

Para la fermentación de Lactobacillus las condiciones son las siguientes:

- Temperatura: 37°C. Al finalizar la fermentación, se baja a 4°C para detener el metabolismo celular y cosechar el caldo.

- Presión: 0.5 atm.

- pH: 6.4 ± 0.1 durante las primeras 18 horas. Adición estéril de NH4OH 25% o H3PO4 35% de forma automática, conectando las gomas de silicona a las bombas peristáltica del fermentador y fijando el valor consigna en el equipo.

- Ciclo: 18-24 horas aproximadamente. El fin de la fermentación viene determinado por un descenso de pH hasta un valor próximo de 4.5.

A las 6 horas de fermentación, cuando se espera que el cultivo de Lactobacillus se encuentre en plena fase logarítmica de crecimiento, se procede a modificar las condiciones de fermentación. Se comienza a desplazar el nitrógeno del fermentador con un caudal de aire de forma que el % de oxígeno disuelto se situe en el rango del 25-30% (para mantener este valor puede ser necesario incrementar el caudal de aire de entrada y la agitación). De esta manera se crea un ambiente de aerobiosis, tolerable para el crecimiento de las bacterias lácticas y que a la vez, permite la proliferación de otro microorganismo aerobio en el fermentador. En relación a lo anterior, tan pronto como las condiciones anteriores se instauren en el fermentador, se procede a resembrar el biorreactor con un porcentaje de un cultivo de S. cerevisiae del 5%. Dicho stock de cultivo habrá proliferado anteriormente en medio YPD durante 24 horas a 150 rpm y 37°C. El pH se mantiene en 6.4 durante las primeras 8 horas de cocultivo y a partir de ese momento (14 horas de fermentación), el control de este parámetro se desactiva y se deja avanzar de forma libre. Debido a la acidificación del medio, el pH alcanzará un valor aproximado de 4.5, lo que determinará el fin de la fermentación, a causa de la conversión de la mayoría de azúcares residuales en ácidos orgánicos de cadena corta (ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, etc.) y otros metabolitos de interés. La productividad se ve incrementada si se compara con el monocultivo simple de las bacterias lácticas, a causa de la modificación de las condiciones de fermentación por parte de la levadura.

En cuanto a los motivos de llevar a cabo el cocultivo, es bien sabido que la levadura posee actividad catalasa, por lo que se produciría una reducción de la cantidad de peróxido de hidrógeno en el caldo, un radical que causa la inhibición del crecimiento de las bacterias lácticas. De esta forma, se acelera la tasa de crecimiento de las bacterias lácticas, con la consecuente generación de subproductos del metabolismo de gran interés y con potencial terapeutico, como se ha podido comprobar en etapas clínicas posteriores.

La fermentación se detiene en el propio fermentador, haciéndose descender la temperatura a un valor entre 4-8°C.

La recuperación de la biomasa obtenida en base a la fermentación de cada uno de los microorganismos, se lleva a cabo mediante centrifugación, obteniéndose sendas biomasas recuperadas húmedas.

Posteriormente, la rotura o lisis de las células de cada una de las biomasas recuperadas húmedas se realiza en un molino de bolas, obteniéndose respectivas biomasas de lisados microbianos que posteriormente se secan por separado en un atomizador. Los lisados microbianos secos se mezclan en un mezclador, para obtener la composición moduladora.

El listado de materias primas requerido para producción de un lote de biomasa del género Bacillus en un fermentador de 30 L de volumen geométrico es el siguiente:

En el caso de la fermentación de Streptococcus, el listado de materias primas requerido para producción de un lote de biomasa del género para un volumen de 30 L de fermentación es:

Para la fermentación de Bifidobacterium y Lactobacillus el listado de materias primas requerido para producción de un lote de biomasa del género para un volumen de 30 L de fermentación es:

Al final de la fermentación, se obtienen caldos de biomasas de los microorganismos probióticos que comprenden biomasas microbianas y caldos de cultivo

Para recuperar las biomasas microbianas de los caldos de biomasas microbianas y obtener biomasas microbianas recuperadas húmedas, el caldo de biomasas se cosecha del fermentador, y caldo cosechado se ceba a una centrífuga de discos o platos cónicos, operando en las siguientes condiciones:

- Flujo de alimentación: 5-10 L/h de promedio. Al inicio del proceso, este caudal puede ser notablemente superior; sin embargo, al final del proceso cuando se puede estar alcanzando cierto grado de saturación, el caudal puede reducirse hasta 1.5 L/h si el proceso se realiza de forma continua. Si en algún momento el clarificado sale turbio, puede ser consecuencia de un exceso de caudal en cuyo caso sería necesario reducir el mismo, o síntoma de que el bol está lleno de sólidos y los platos sucios, en cuyo caso habría que vaciar y limpiar el bol.

- Velocidad de centrifugación: 3.500 rpm.

Los análisis llevados a cabo durante este procedimiento son los siguientes:

- Biomasa PCV (%). Esta valoración se realiza inicialmente sobre el caldo total y a diferentes muestras de clarificado a lo largo de la centrifugación. Si la separación es satisfactoria, apenas deberían residir sólidos en las muestras de clarificado.

- Humedad (%). Este parámetro se determina sobre la muestra final, para hacer un seguimiento del porcentaje de humedad durante todo el proceso de recuperación. Para ello, 1 g de biomasa húmeda se seca en una termobalanza a una temperatura de 120°C.

La biomasa recuperada húmeda obtenida tras la centrifugación se pesa se somete a lisis celular. Para ello, la biomasa húmeda se resuspende en el mismo volumen de agua, y la rotura o lisis de la biomasa diluida se lleva a cabo en un molino de bolas, por efecto de la fricción generada por bolas de silicato de zirconio (2 mm) sobre la superficie de las paredes celulares, en el seno de una cámara de molienda con eje horizontal.

Las condiciones para cada ciclo de molienda son las siguientes:

- Carga de bolas y concentración celular. Proporción 1:1 de bolas de zirconio y de biomasa húmeda diluida, hasta llenar la cámara de molienda.

- Velocidad del agitador.3.000 rpm (con sistema de refrigeración activo).

- Tiempo de residencia.40 minutos de molienda.

- Temperatura. Ambiente controlada con un sistema de refrigeración del equipo mediante recirculación de agua por la camisa de la cámara de molienda.

En esta etapa del proceso se valora lo siguiente:

- Rotura celular (%). Mediante una visualización al microscopio óptico se evalua el porcentaje de rotura final, que debe ser superior al 90%. Si el porcentaje de rotura es menor del 90% se realizan ciclos a mayores de 20 minutos.

- Viscosidad (cP). Esta valoración se lleva a cabo en un viscosímetro rotacional con un husillo estándar para viscosidad media-alta y permite relacionar este parámetro alta con un mayor grado de rotura, como resultado de la estructura interconectada que suelen formar las partículas dispersas de menor tamaño. - Coloración de la biomasa rota. Valoración de la tonalidad de la muestra final, para asociarla a un cierto grado de rotura celular. En general, una coloración blanquecina se asocia a un porcentaje de rotura bajo, mientras que si se incrementa la coloración grisácea, este hecho es indicativo de un mayor porcentaje de rotura.

La biomasa de lisados microbianos obtenida en el paso anterior, se seca en un atomizador utilizando la técnica de spray drying, que permite el secado de la suspensión de células rotas en agua mediante su pulverización en el seno de una corriente de aire a una temperatura elevada (Ta de entrada). Como consecuencia de la evaporación del agua, la corriente de aire se enfría hasta una temperatura que es función de la cantidad de agua evaporada (Ta de salida).

Las condiciones de atomización son las siguientes:

- Ta entrada y salida.180°C ±2°C y 80°C ±10°C, respectivamente.

- Diámetro de la aguja pulverizadora.0.7 mm.

- Velocidad de alimentación. Debido a la viscosidad alta de la biomasa rota, este parámetro se ajusta de tal forma que la temperatura de salida se mantenga estable en torno a 80°C, permitiendo el secado completo de la muestra. Si en la cámara de secado o en el ciclón se observan gotas de líquido, entonces la velocidad de alimentación debe reducirse hasta que el equipo complete el secado de toda la muestra suministrada. En general, la viscosidad de la mezcla no debería superar las 300 cP de viscosidad para que la bomba peristáltica pueda alimentar al sistema.

De la muestra final atomizada se realizan los siguientes análisis:

- Humedad (%) y residuo seco (%). Para ello, 1 g de biomasa atomizada se seca en una termobalanza a una temperatura de 120°C.

- Peso seco (g/L). Valoración en termobalanza a 120°C y estufa a 65°C.

Tras el secado por atomización se obtienen los lisados mcirobianos secos, en cuatro lotes de lisados microbianos secos diferentes a saber, un primer lote proveniente del cultivo de microrganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces, un segundo lote proveniente del cultivo de microrganismos del género Bifidobacterium, un tercer lote proveniente del cultivo de microrganismos del género Bacillus, y un cuarto lote proveniente del cultivo de microrganismos del género Streptococcus,

Se mezclan lisados microbianos de estos cuatro lotes, en las siguientes proporciones:

70% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Saccharomyces, y de cultivos de cepas del género Lactobacillus, 20% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Bacillus,

5% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Streptococcus,

5% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Bifidobacterium

De la mezcla de lisados se extraen muestras y se determina si la muestra comprende un mínimo de secuencias genómicas de 5000 copias/ml de cada de una las secuencias genómicas anteriormente identificadas en esta memoria descriptiva:

y si comprende además al menos 5000 copias/ml de secuencias genómicas adicionales coincidentes en al menos un 90% con cada una de las siguientes secuencias genómicas adicionales, también anteriormente identificadas en esta memoria descriptiva:

La determinación de si la muestra comprende el mínimo de secuencias genómicas de 5000 copias/ml de cada de una de las secuencias genómicas anteriormente identificadas se realiza mediante técnicas de secuenciación masiva en sí conocidas.

Cuando se constata que la muestra comprende dichos mínimos de secuencias genómicas, se recoge la mezcla de lisados microbianos secos para obtener la composición moduladora

EJEMPLO 2 - Análisis de la composición de la composición preparada en el ejemplo 1

Preparación de las muestras y digestión de proteínas

400 mg de la composición del ejemplo 1 (en adelante. Muestra) se disolvieron con un tampón caotrópico que contenía 8,4 M de urea (USB Corporation, Cleveland, OH, USA), 2,4 M de tiourea (Sigma Aldrich), 5% de CHAPS (Sigma Aldrich), 5mM TCEP (Sigma Alrich) y un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma Aldrich) y se incubó sobre hielo durante 15 minutos. Se realizó una homogenización mediante sonicación por aplicación de ultrasonidos durante 5 minutos en baño Branson 2510 (Marshall Scientific, New Hampshire, USA). El homogenizado se centrifugó a 20000 x g a 4°C durante 10 minutos, y el sobrenadante que contenía las proteínas solubilizadas se empleó para el ulterior análisis, A continuación, se precipitaron 40 ^g de proteínas mediante el método metanol/cloroformo, y se resuspendieron en 40 ^g de un tampón UTT (7M urea, 2M tiourea, 10mM TEAB (sigma Aldrich) de solución muestra multicaotrópica.

La Muestra re-suspendida se redujo con 2 ^ de TCEP 50mM a 37°C durante 60 minutos, seguido de adición de 1 ^L de reactante MMTS (SCIEX, Foster City, CA, USA) bloqueante de cisteína durante 10 minutos a temperatura ambiente. La Muestra se diluyó a 140 ^l con TEAB mM a fin de reducir la concentración de urea. Finalmente, la digestión se inició añadiendo 2 ^g de tripsina Pierce de grado MS (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) a cada fracción en una proporción de 1:20 (p/p), y se incubó a 37°C durante la noche en un agitador. La Muestra digerida se sometió a evaporación hasta sequedad en un concentrador de vacío.

Análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS)

La Muestra digerida se lavó/desaló usando Stage-Tips con discos Empore 3M C18 (Sigma Aldrich). Una parte alícuota de 1 ^g de los péptidos resultante se sometió a análisis 1D-nano LC ESI-MS/MS (Liquid Chromatography Electrospray lonization Tandem Mass Spectrometric) usando un sistema de cromatografía nano-líquido Eksigent Technologies nanoLC Ultra 1D plus (SCIEX, Foster City, CA, USA) acoplado a un espectrómetro de masas de alta velocidad Triple TOF 5600 (SCIEX) con una fuente Nanspray lll. La columna de análisis empleada era una columna Acquity UPLC M-Class Peptide BEH C18 de fase inversa con base de sílice (Waters Corporation, Milford, MA, USA). La columna trampa era una C18 Acclaim PepMapTM 100 (Thermo-Fisher Scientific Inc.), 100 ^m * 2 cm, 5 ^m de diámetro de partícula, tamaño de poro de 100 Á, conectado en línea con la columna de análisis. La bomba de carga suministró una solución de ácido fórmico al 0,1% en agua a at 2 ^l/min. Se aplicó una velocidad de flujo de 250 nL mediante una nano-bomba operada en condiciones de elución de gradiente. Los péptidos se separaron usando un gradiente de 250 min que con una fase B que oscilaba de 2% a 90% (fase móvil A: 2% acetonitrilo (Scharlab, S.L., España), 0,1% ácido fórmico (Sigma Aldrich); fase móvil B: 100% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico). El volumen de inyección fue de 5 ^l. Los datos se obtuvieron empleando un voltaje flotante Ionspray de 2300 V, gas cortina 35, temperatura de calentador interfaz 150, gas fuente 1 25 y potencial desagrupador 150 V. Para parámetros IDA (Análisis Inteligente de Datos) se siguió un escaneo 0.25 s MS en el intervalo de masas de 350 a 1250 Fa mediante escaneos 35 MS/MS de 100 ms en el intervalo de masas de 100 a 1800. Los criterios de cambio fuero establecidos a iones mayores que una relación masa/carga (m/z) de 350 y menor de m/z 1250, con un estado de carga de 2-5 y un umbral de abundancia mayor que 90 conteos/segundo (cps). Los iones diana anteriores fueron excluidos durante 15 s.

Análisis de datos proteómicos y búsqueda de secuencias

Los datos espectrométricos obtenidos fueron procesados utilizando el software PeakView v2.2 (SCIEX) y exportados a archivos mgf que fueron sometidos a búsqueda utilizando Mascot Server v2.5.1 (Matrix Science, London, Reno Unido) frente a una base de datos de proteínas que contenía secuencias de proteínas de microorganismos de los géneros Bacillus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus y Saccharomyces de la base de conocimientos Uniprot/Swissprot (https://www.uniprot.org/statistics/Swiss-Prot - actualización: 20170412, 2.542.118 secuencias de proteínas), junto con contaminantes comúnmente existentes. La obtención de datos del número total de espectros de péptidos coincidente para una determinada proteína (referidos como Peptide-to-Spectrum-Matching (PSM) y expontially modified Protein Abundance Index (emPAI)) se calcularon para cada una de las proteínas. PSM y emPAI, y se pueden usar como un resultado cuantitativo relativo de las proteínas en una mezcla compleja basado en la cobertura de las proteínas mediante las coincidencias con péptidos en una base de datos de resultados. Los análisis LC-MS fueron realizados en las instalaciones de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, que forman parte de ProteoRed.

Abundancias de y funciones de proteínas en la Muestra

La Muestra se analizó exhaustivamente en cuanto a las proteínas expresadas, y se identificaron 937 proteínas Para las 937 proteínas identificadas se obtuvieron conteos espectrales para tener una indicación de su abundancia. Se obtuvieron valores emPAI normalizados (nemPAI%) en base a los valores emPAI dividiendo cada valor individual por la suma de todos los valores emPAI y multiplicando cada valor resultante por 100%, para obtener la abundancia relativa de cada proteína con respecto a las proteínas totales.

Además, se realizó un análisis funcional de las proteínas en la Muestra asignando números k usando la herramienta de anotación interna de KEGG para Ortologías KEGG (KO), y buscando clústeres de grupos ortólogos (COG) para analizar la abundancia relativa de proteínas específicas en determinados procesos metabólicos definidos en la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG) y COG (http://eggnogdb.embl.de/#/app/home).

La figura 1 refleja la distribución de los valores nemPAI. Los resultados más relevantes pueden apreciarse en las tablas 1A y 1B.

Tabla 1A

Tabla 1B

En esta tabla, las indicaciones eggNOG tienen los significados especificados en la tabla 1C:

Tabla 1C

Como se puede apreciar en la figura 1, la distribución de los valores nemPAI obtenida tiene forma exponencial lo que indica a existencia de una gran diversidad de proteínas en la Muestra.

Se detectó que solo 10 de las 937 de las proteínas tienen una abundancia relativa de 1% o más. Estas proteínas y sus valores nemPAI se identifican en la figura 1D.

Tabla 1D

Para identificar el origen microbiano de las proteínas existentes en la Muestra, se realizó una búsqueda comparativa entre los datos de espectrografía de masas de la Muestra frente a las proteínas de microorganismos de los géneros Bacillus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus y Saccharomyces de la base de datos Uniprot/Swissprot. Los orígenes microbianos y contribución al proteoma de la Muestra se resumen en la tabla 2:

Tabla 2

Como se puede apreciar, los microorganismos del género Saccharomyces parecen ser los mayores contribuidores en términos del número total de proteínas y en términos del nivel de expresión de proteínas contenidas en la Muestra.

El análisis funcional basado en la ortología KEGG (KO) realizado para comprobar las funciones de las proteínas en las diferentes rutas metabólicas que se definen mediante KEHH y COG reveló que 643 de las 937 proteínas se pudieron asignar a 352 categorías funcionales. Se obtuvieron los valores nemPAI para cada categoría KO sumando todos los valores nemPAI para cada proteína que contribuye a cada categoría KO.

Cuando se compararon las categorías funcionales KO y los niveles de abundancia de las proteínas en la Muestra de las categorías funcionales y los niveles de abundancia de las proteínas a partir de un proteoma de una microbiota intestinal de humano adulto sano obtenido empleando espectrometrías de masas y cromatografía líquida, lo que resultó en la obtención de demás de 3100 proteínas asignadas a 560 categorías KO La tabla 3 resume esta comparación:

Tabla 3

La comparación de las categorías KO de la Muestra y la microbiota human reveló además que los respectivos proteomas sólo compartían 78 categorías KO comunes, es decir un 9,4% del total de categorías KO, aproximadamente un 32,8% de categorías KO sólo estaban presentes en la Muestra, y aproximadamente un 57,8% de categorías KO se encontraban en la microbiota intestinal. Esto sugiere que la administración de la Muestra contribuye a la microbiota intestinal con proteínas participantes en actividades metabólicas que no están presentes o sólo están presentes en un nivel inferior en la microbiota.

Funciones destacables están representadas por las de las categorías KO K01689 (enolasa [EC: 4.2.1.11]), K03530 (proteína de unión a ADN similar a la histona) K13953 (alcohol deshidrogenasa) y K03671 (tioredoxina) que tienen una contribución a la actividad metabólica total de al menos un 1%.

Así, la enolasa cataliza la conversión reversible de 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato y es esencial a la degradación de los carbohidratos por medio de la glicólisis. Por otra parte, las histonas empaquetan y ordenan los genomas eucariotas en cromatina que juega un papel importante en la regulación epigenética con modificaciones covalentes variable. A su vez, el alcohol deshidrogenasa sirve para desintegrar alcoholes que en caso contrario serían tóxicos, mientras que la tioredoxina ayuda a controla especies de oxígeno reactivo y a la señalización redox en general.

Adicionalmente, en lo que se refiere a las capacidades metabólicas inherentes especialmente en la Muestra, se observaron diferencias importantes entre la Muestra y la microbiota intestinal. Así. un total de 9 de las 78 categorías KO estaban representados al menos 10 veces más en la Muestra que en la microbiota intestinal, tal como resume la tabla 4:

Tabla 4

Cabe destacar las siguientes categorías KO:

K01507: La pirofosfatasa inorgánica juega un papel critico en el metabolismo de los lípidos, la absorción de calcio y la síntesis de ADN

K01834: La mutasa fosfoglicerato 2,3 bifosfoglicerato-dependiente participa en la sub-ruta que sintetiza piruvato a partir de 3-fosfato trigliceraldehido, la ruta de la glicolisis y en la degradación de los carbohidratos.

K00549: La 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa cataliza la transferencia de un grupo metilo desde el 5-metiltetrahidrofolato a la homocisteína lo que resulta en la formación de metionina por medio de la ruta de novo que por sí forma parte de la biosíntesis de los aminoácidos.

K00789. La S-adenosilmetionina sintetasa es una enzima que crea S-adenosilmetionina (SAM) haciendo reaccionar metionina y ATP; permite la metilación de ADN y participa en la transcripción de genes, la proliferación celular y la producción de metanolitos secundarios.

EJEMPLO 3 - Estudio in vitro de la capacidad inmunomoduladora de la composición analizada en el ejemplo 2

Se evaluó in vitro la capacidad inmunomoduladora de la Muestra preparada de acuerdo con el ejemplo 1 y analizada en el ejemplo 2. Para la evaluación se emplearon varios tipos celulares, incluidos monocitos murinos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea de ratón diferenciados (BMM) y esplenocitos de explantes de bazo de ratón, estas dos últimas líneas celulares provenientes de dos tipos diferentes de ratones; Balb/c (prototípico de inmunidad Th2) y C57BL/6 (prototípico de inmunidad Th1).

La capacidad inmunomoduladora se determinó en los tipos celulares mencionados mediante la realización de varias pruebas, incluida la capacidad fagocítica, la liberación de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2-, la actividad arginasa y la liberación de citoquinas de tipo Th1 y Th2.

METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTO

Tratamiento de la Muestra

La Muestra se sometió al tratamiento con luz ultravioleta durante 15 min en una campana de flujo laminar, con el fin de esterilizar el contenido antes de introducirla en los cultivos celulares. Finalizado el tratamiento de esterilización, se disolvió a una concentración de 60 mg/ml en el mismo medio en el que fuesen a crecer las células frente a las que iban a testarse (RPMI o DMEM, según el tipo celular). A pesar de que la Muestra era soluble, no llegó a disolverse completamente apreciándose restos de precipitado en la solución madre. A partir de la solución madre de la Muestra, se realizaron tres diluciones seriadas 1:10 en los medios correspondientes a cada tipo celular para obtener las soluciones de trabajo, cuyas concentraciones fueron de 6 mg/ml, 0,6 mg/ml y 0,06 mg/ml. El volumen que se añadió de cada una de estas soluciones a cada pocillo se ajustó de modo que la concentración testada para cada muestra fue de 1 mg/ml (C1), 0,1 mg/ml (C2) y 0,01 mg/ml (C3).

Obtención y mantenimiento de las líneas celulares

Para evaluar la respuesta inmunomoduladora se emplearon tres tipos de células de la serie blanca: células monocíticas RAW 264.7, células de médula ósea de ratón y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón.

Los monocitos RAW 264.7 se adquirieron a Sigma (Ref.: 91062702) y se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado y 100 U/ml penicilina-100 ^g/ml estreptomicina a 37°C en presencia de 5% de CO2. Tanto la densidad celular como la frecuencia de subcultivo se realizaron de acuerdo a las indicaciones del proveedor.

Para la obtención de macrófagos de médula ósea y de esplenocitos, se adquirieron 5 ratones Balb/c (inmunidad tipo Th2) y 5 ratones C57BL/6 (inmunidad tipo Th1) a través del Animalario de la Universidad de León, respetando la normativa vigente sobre manejo y bienestar de animales de experimentación. Tras el sacrificio de los animales de modo eutanásico, se extrajo el bazo y fémures, procediendo a la recuperación de los esplenocitos y células de la médula ósea, respectivamente, siguiendo los protocolos puestos a punto en el laboratorio de Toxicología de la Universidad de León.

Los esplenocitos se resuspendieron en medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado y 100 U/ml penicilina-100 ^g/ml estreptomicina y se utilizaron inmediatamente para la realización del experimento, incubándose a 37°C en presencia de 5% de CO2.

Las células pluripotenciales de médula ósea procedentes de fémur se resuspendieron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/ml penicilina-100 ^g/ml estreptomicina y 20% de sobrenadantes de células L929, las cuales expresan el factor de estimulación de colonias de macrófagos (MCSF), y se incubaron durante 8 días a 37°C en presencia de 5% de CO2. A continuación, los macrófagos diferenciados se recogieron y resuspendieron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/ml penicilina-100 ^g/ml estreptomicina, procediéndose inmediatamente a la realización del experimento. En algunos casos, los cultivos celulares fueron suplementados con lipopolisacáridos (LPS) de Eschenchia coli O111:B4 (Sigma, Ref.: L4391-1MG). Este producto se preparó a una concentración de 1 mg/ml en medio RPMI/DMEM y luego se ajustó su concentración final a 60 ^g/ml en el medio correspondiente. El volumen de esta última solución que se añadió a cada pocillo se ajustó para que la concentración final de LPS por cada pocillo fuese de 10 ^g/ml (tablas 5a y 5B).

Diseño experimental

El diseño y planteamiento experimental fueron los siguientes en función de los ensayos a realizar:

Disposición de placas de 48 pocilios (0.95 cm2 de superficie de cultivo, volumen total 600 l^) para la evaluación de la actividad arginasa y la producción de citoquinas

Las líneas celulares se sembraron a una densidad de:

- Células de médula ósea: 6x105 células/pocillo (6,3x105 células/cm2).

- Esplenocitos: 1,2x106 células/pocillo (1,26x106 células/cm2).

- RAW. 2x105 células/pocillo (2,1x105 células/cm2). Se usaron menos células RAW debido a que éstas se multiplicarán durante las 48 h que dura el experimento, a diferencia de los esplenocitos y las células de médula ósea.

Disposición de placas de 96 pocilios (0,35 cm2 de superficie de cultivo, volumen total 150 l^) para la evaluación de la capacidad fagocítica y producción de RNS

Las líneas celulares se sembraron a una densidad de:

- Células de médula ósea: 1,5x105 células/pocillo (4,28x105 células/cm2).

- Esplenocitos: 3x105 células/pocillo (8,57x105 células/cm2).

- RAW: 5x104 células/pocillo (1,43x105 células/cm2). Se usaron menos células RAW debido a que éstas se multiplicarán durante las 48 h que dura el experimento, a diferencia de los esplenocitos y las células de médula ósea.

Una vez añadidas las células, el experimento presentó la siguiente disposición:

- Control negativo: células con medio RPMI/DMEM.

- Control positivo: células con medio RPMI/DMEM y LPS (10 ^g/ml concentración final en pocillo).

- Muestra test 1: células con medio RPMI/DMEM y Muestra a tres concentraciones diferentes: 1 mg/ml (C1), 0,1 mg/ml (C2) y 0,01 mg/ml (C3) en RPMI/DMEM (concentración final en pocillo).

- Muestra test 1 LPS: células con medio RPMI/DMEM, LPS (10 ^g/ml concentración final en pocillo) y Muestra a tres concentraciones diferentes: 1 mg/ml (C1), 0,1 mg/ml (C2) y 0,01 mg/ml (C3) en RPMI/DMEM (concentración final en pocillo).

Los volúmenes se ajustaron de modo que en las placas de 48 pocillos hubiese un volumen final por pocilio de 600 j l (Tabla 5.1) y en las de 96 pocilios de 150 j l (Tabla 5.2):

Tabla 5A

Contenido de los diferentes pocillos que se dispusieron en placas de 48 pocillos para la realización de los experimentos de evaluación de la actividad arginasa y producción de citoquinas.

Tabla 5B

Contenido de los diferentes pocillos que se dispusieron en placas de 96 pocillos para la realización de los experimentos de evaluación de la capacidad fagocítica y producción de NO.

Se realizaron tres réplicas técnicas de cada condición y en todos los casos las células se incubaron durante 48 h a 37°C con un 5% de CO2. Transcurrido este tiempo se procedió a la realización de los análisis pertinentes para la medición de las distintas actividades.

Determinación de la capacidad fagocítica de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

Una vez finalizado el tiempo de incubación, se extrajo el sobrenadante de los cultivos realizados en la placa de 96 pocillos, el cual se reservó para la valoración de producción de NO (ver más adelante).

Las células adheridas a los pocillos se emplearon para valorar la capacidad fagocítica mediante la prueba del Rojo Neutro. Este colorante se internaliza en los lisosomas de los macrófagos, con lo cual, una mayor actividad fagocítica conlleva un mayor acúmulo de rojo neutro en el interior celular. Para ello, inmediatamente después de extraer los sobrenadantes, se añadieron a cada pocillo 150 Ml de medio RPMI/DMEM (según línea celular como se indicó anteriormente) y 15 Ml de 0.33% Neutral Red Solution (Sigma, Ref. N-2889) previamente filtrada para evitar la aparición de cristales. Las células se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 3 h en oscuridad.

Posteriormente, se eliminó el medio con el colorante no incorporado con mucho cuidado y las células se lavaron dos veces con PBS, eliminando bien los restos del mismo.

A continuación, se añadieron a cada pocillo 150 Ml de solución de rotura y desorción (1% ácido acético, 50% etanol, 49% agua), pipeteando hacia arriba y hacia abajo dicha solución. De este modo se produjo el triturado celular, la liberación del colorante y la mezcla del mismo. Este proceso cesó cuando se observó una solución homogénea rojiza. Posteriormente, se extrajeron 100 ^L de cada pocilio y se dispusieron en una nueva placa de 96 pocilios. En ese momento se determinó la absorbancia a 540 nm y a 690 nm (absorbancia de fondo). Esta última se restó de la obtenida a 540 nm. La fagocitosis relativa se estimó en porcentaje, fijando el valor proporcionado por el Control negativo como 100%.

Determinación de la producción de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO²por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

El acúmulo de NO2 empleó como un indicador de la producción de NO y se estimó mediante la reacción de Griess. Para ello se emplearon los sobrenadantes de los cultivos crecidos en placas de 96 pocillos. Con este fin, se extrajeron 50 ^l de los sobrenadantes de cada cultivo celular, los cuales se dispusieron en una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, se mezclaron con otros 50 ^l del reactivo de Griess modificado (Sigma, Ref.: G4410), el cual fue preparado siguiendo las recomendaciones del fabricante. La mezcla se incubó durante 15 min a temperatura ambiente y se medió la absorbancia a 540 nm.

La producción relativa de NO se estimó en porcentaje, fijando el valor proporcionado por el Control negativo como 100%.

Determinación de la actividad arginasa en monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea de ratón y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

Una vez finalizado el tiempo de incubación, se extrajo el sobrenadante de los cultivos realizados en la placa de 48 pocillos, el cual se reservó para la valoración de producción de citoquinas (ver más adelante).

Las células adheridas a los pocillos se emplearon para valorar la actividad arginasa, la cual se determinó mediante el kit Arginase Activity Assay (Sigma, Ref.: MAK112) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La actividad arginasa relativa se estimó en porcentaje, fijando el valor proporcionado por el Control negativo como 100%.

Determinación de la producción de moléculas mediadoras de la respuesta inmune (citoquinas) en monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea de ratón y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

Para la determinación de la producción de moléculas mediadoras de la respuesta inmune por las líneas celulares testadas, se emplearon los sobrenadantes de los cultivos crecidos en placas de 48 pocillos.

Se analizó la producción de tres citoquinas de tipo Th1 (inmunidad celular: IL2, IFN-y y TNF-a) y 3 de tipo Th2 (inmunidad humoral: ILl0, IL4 e IL13) mediante el empleo de kits de ELISA comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió en un equipo Varioskan™ LUX multimode microplate reader (Thermo Fisher) y la producción de citoquinas se expresó en pg/ml.

- Citokinas IFN^y, IL2, IL4 e IL10: Th1/Th2 Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates (Thermo Fisher, eBiosciences, Ref.: 88-7711-44)

- TNF-a: TNF-alpha Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher, eBiosciences, Ref.: BMS607HS)

- IL13: IL-13 Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher, eBiosciences, Ref.: BMS6015)

A continuación, se indican brevemente algunos detalles de las citoquinas que se analizaron:

* TNF-a: Estimula la fase aguda de la reacción inflamatoria, produciendo activación local del endotelio vascular, liberación de óxido nítrico con vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular, que conduce al reclutamiento de las células inflamatorias, inmunoglobulinas y complemento, provocando la activación de los linfocitos T y B.

* IFN-y : Su función principal es la activación de macrófagos, aumentando la capacidad fagocitaria de estos, tanto en la respuesta innata como en la adaptativa. Otra de sus funciones es dirigir la diferenciación de los Linfocitos T CD4+ en linfocitos Th1, activación de células dendríticas y linfocitos "natural killer" (NK) para inducir mayor secreción de IL-12, la cual promueve más diferenciación a Th1, amplificando fuertemente la reacción.

* IL-2: Actúa como factor de crecimiento de los linfocitos T, induce todos los tipos de subpoblaciones de linfocitos y activa la proliferación de linfocitos B. Interviene en la reacción inflamatoria estimulando la síntesis de interferón, induce la liberación de IL-1, TNF-a y TNF

* IL-4: Actúa como antiinflamatorio al bloquear la síntesis de IL-1, TNF-a, IL-6 y la proteína inflamatoria del macrófago. Entre otras funciones, promueve la diferenciación de linfocitos Th2, la proliferación y diferenciación de linfocitos B y es un potente inhibidor de la apoptosis.

* IL-10: Citoquina capaz de inhibir la síntesis de citoquinas proinflamatorias por los linfocitos T y los macrófagos.

* IL-13: Modula la producción de IL-1, TNF, IL-8 y de la proteína inflamatoria del macrófago. Estimula el crecimiento y la diferenciación de las células B, e inhibe las células Th1, así como la producción de citoquinas inflamatorias.

Análisis estadístico de los resultados

Los resultados se representaron como la media ± desviación estándar de tres réplicas. Se consideró un resultado estadísticamente significativo cuando el test de ANOVA arrojó un valor p<0.05.

Los resultados de las distintas actividades y producción de citoquinas se han expresado de modo gráfico, siguiendo siempre un mismo esquema, el cual se indica en la figura 2 que muestra los resultados para las distintas actividades y producción de citoquinas en las distintas líneas celulares.

Capacidad fagocítica de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

La capacidad fagocítica se determinó mediante la prueba del Rojo Neutro tal y como se indicó en el apartado ' Determinación de la capacidad fagocítica de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra”

En la figura 3A y 3B se representa la actividad fagocítica de esplenocitos de ratón en presencia de distintas concentraciones de la Muestra. Como puede observarse, existe un efecto significativo dosis-dependiente potenciador de la fagocitosis promovido por la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra en esplenocitos provenientes de ratones BalbC y C57BL/6. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestras, produjo un aumento significativo de la capacidad fagocítica hasta valores similares a los proporcionados por el control positivo. Se puede ver la fagocitosis relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de esplenocitos provenientes de ratones BalbC (figura 3A) y C57BL/6 (figura 3B) cultivados en presencia de la Muestra, testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones de la Muestra se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados.

Las figuras 4A y 4B ilustran los resultados de la fagocitosis relativa (porcentaje; %) obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 4A) y C57BL/6 (figura 4B) cultivados en presencia de la Muestra, los cuales fueron testadas a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. La actividad fagocítica de los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6, también se incrementó significativamente de modo dosis-dependiente debido a las dos concentraciones más altas (1 y 0,1 mg/ml) de la Muestra. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestras, produjo un aumento significativo de la capacidad fagocítica hasta valores similares a los del control positivo.

La figura 5 ilustra los resultados de la fagocitosis relativa (porcentaje; %) obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones, se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Se puede apreciar que, en el caso de los macrófagos RAW, si bien se observó un aumento respecto al control negativo de la capacidad fagocítica con la concentración más alta de la Muestra, este no fue significativo. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestras, produjo un aumento significativo de la capacidad fagocítica hasta valores similares a los del control positivo.

Producción de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO²- por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

La producción de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2- se determinó mediante la reacción de Griess tal y como se indicó anteriormente

Las figuras 6A y 6B ilustran los resultados de la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2- obtenida a partir de esplenocitos provenientes de ratones BalbC (figura 6A) y C57BL/6 (figura 6B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Como puede apreciarse en estas figuras, únicamente la concentración más alta fue capaz de aumentar significativamente la producción de RNS en esplenocitos provenientes de ratones BalbC y C57BL/6 respecto al control negativo. En presencia de LPS, únicamente la concentración más alta produjo un aumento significativo, hasta valores similares a los proporcionados por el control positivo, de la producción de RNS en esplenocitos de los dos tipos de ratones. Cabe señalar que la señal proporcionada por la reacción enzimática fue débil, aunque detectable por el espectrofotómetro y por encima de la proporcionada por los pocillos blanco.

Las figuras 7A y 7B ilustran los resultados de la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2- obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 7A) y C57BL/6 (figura 7B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Respecto a la producción de RNS por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6, se apreció un incremento significativo de tipo dosis-dependiente, aumentando con las dos concentraciones más altas (1 y 0,1 mg/ml) de la muestra. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestra, produjo un aumento significativo de la producción de RNS hasta valores similares, e incluso superiores a los proporcionados por el control positivo.

La figura 8 ilustra la producción relativa expresada en porcentaje (%) de especies reactivas de nitrógeno (RNS) derivadas de NO2- obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Puede observarse que en el caso de los macrófagos RAW (Figura 8), si bien se observó un aumento de la producción de RNS con las concentraciones más altas de la muestra, este no fue significativo. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestra, produjo un aumento significativo de la producción de RNS hasta valores similares a los proporcionados por el control positivo.

Actividad arginasa en monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

Está aceptado que la expresión específica de la Arginasa-1 por parte de macrófagos promueve la inflamación, la fibrosis y la curación de heridas mediante el incremento de los niveles de L-prolina, poliaminas, y la producción de citoquinas de tipo Th2. Por ello es interesante el análisis de la actividad arginasa en estas células, el cual se llevó a cabo como se indicó anteriormente..

Las figuras 9A y 9B ilustran los resultados de la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de esplenocitos provenientes de ratones BalbC (figura 9A) y C57BL/6 (figura 9B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Con respecto a estas figuras, en las que se indica la actividad arginasa producida por esplenocitos, cabe señalar que la señal proporcionada por la reacción enzimática fue débil, aunque detectable por el espectrofotómetro y por encima de la proporcionada por los pocillos blanco. En aquellas células procedentes de ratones BalbC, no se observaron diferencias entre el control positivo y negativo ni entre estos y el resto de las muestras. Por el contrario, con las células procedentes de ratones C57BL/6 sí se apreciaron diferencias significativas entre el control positivo y negativo, y aunque se observó un aumento de la actividad arginasa únicamente con la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra, éste no fue significativo. En presencia de LPS, la actividad arginasa aumentó en todos los casos, pero no de modo significativo.

Las figuras 10A y 10B ilustran la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 10A) y C57BL/6 (figura 10B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Puede observarse que la actividad arginasa de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6 fue más alta que la proporcionada por los esplenocitos. Por otra parte, al igual que ocurrió con los esplenocitos, en aquellos macrófagos de médula ósea procedentes de ratones BalbC no se observaron diferencias entre el control positivo y negativo, existiendo únicamente un aumento significativo de la actividad arginasa respecto al control negativo, en el caso de la concentración más alta (1 mg/m) en presencia de LPS. En los macrófagos procedentes de médula ósea de ratones C57BL/6 sí se apreciaron diferencias significativas en la actividad arginasa entre el control positivo y negativo, siguiendo el mismo esquema proporcionado por los esplenocitos. En este caso concreto, todas las concentraciones (1, 01 y 0,01 mg/ml) de la muestra proporcionaron aumentos significativos de la actividad arginasa respecto al control negativo. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestras, produjo un aumento significativo de la actividad arginasa hasta valores similares, e incluso superiores, a los proporcionados por el control positivo.

La figura 11 ilustra los resultados de la actividad arginasa relativa expresada en porcentaje (%) obtenida a partir de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. El valor proporcionado por el Control negativo se fijó como 100%. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. En este caso de los macrófagos RAW, cabe señalar que la señal proporcionada por la reacción enzimática fue débil, aunque detectable por el espectrofotómetro y por encima de la proporcionada por los pocillos blanco. Con esta línea celular se observó un aumento significativo respecto al control negativo, de la actividad arginasa con las dos concentraciones más altas (1 y 01 mg/ml). En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestra, produjo un aumento de la actividad arginasa hasta valores similares a los proporcionados por el control positivo, aunque fue únicamente significativo en el caso de las concentraciones 0,1 y 0,01 mg/ml.

Producción de moléculas mediadoras de la respuesta inmune (citoquinas) por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra

Con el fin de ahondar en las propiedades inmunomoduladoras de la muestra proporcionada por IGEN BIOLAB se procedió a evaluar su capacidad para modificar la secreción de citoquinas por parte de varios tipos de macrófagos. La producción de citoquinas se analizó mediante ELISA tal y como se indicó en el apartado 2.7, evaluándose tres citoquinas típicas de respuesta Th1 (inmunidad celular: TNF-a, IFN-^ye IL2) y tres citoquinas típicas de respuesta Th2 (inmunidad humoral: IL10, IL4 e IL13).

La figura 12 se refiere a un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de TNF-a, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos

Respuesta Th1

-TNF-a

Para cuantificar la producción de TNF-a por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra, se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de TNF-a el cual estaba incluido en el kit TNF-alpha Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 3,13-200 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 0,75 pg/ml. Cabe señalar que hubo que diluir la muestra (1:3) para poder realizar una correcta cuantificación de los resultados.

Las figuras 13A.y 13B ilustran los resutados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 13A) y C57BL/6 (figura 13B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Como puede observarse en estas figuras, la producción de TNF-a sufrió un incremento significativo respecto al control negativo cuando los esplenocitos provenientes tanto de ratones BalbC como de ratones C57BL/6 se cultivaron en presencia de cualquiera de las tres concentraciones de la muestra. Este aumento fue incluso superior a los valores proporcionados por el control positivo. La presencia conjunta de LPS y muestra produjo un aumento de la producción de TNF-a hasta valores similares o incluso superiores a los proporcionados por el control positivo.

Las figuras 14A y 14B ilustran los resultados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 14A) y C57BL/6 (figura 14B) cultivados en presencia de la Muestra testados a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Respecto a la producción de TNF-a por parte de macrófagos obtenidos de médula ósea de ratones BalbC, se obtuvieron unas diferencias pequeñas, aunque significativas, entre el control positivo y negativo. En este tipo celular, únicamente las dos concentraciones más altas (1 y 0,1 mg/ml) de la muestra produjeron un discreto aumento respecto al control negativo. La presencia conjunta de LPS y muestras produjo un discreto aumento de la producción de TNF-a hasta valores similares a los proporcionados por el control positivo. En relación con los resultados obtenidos con los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones C57BL/6, se apreció una diferencia mayor entre los valores proporcionados por ambos controles. En este caso, las dos concentraciones más altas (1 y 0,1 mg/ml) de la muestra produjeron un incremento en la producción de TNF-a respecto al control negativo. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestras produjo un aumento en la producción de esta citoquina hasta niveles similares a los obtenidos con el control positivo.

La figura 15 ilustra los resultados de la producción de TNF-a (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Puede observarse que, cuando se analizó la producción de TNF-a en mácrofagos RAW (Figura 15), únicamente la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra produjo un aumento significativo de la misma respecto al control negativo. En todos los casos, la presencia conjunta de LPS y muestra produjo un aumento en la producción de esta citoquina hasta niveles similares a los obtenidos con el control positivo.

-IFN-y

La figura 16 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IFN-^y, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos. Para cuantificar la producción de IFN-y por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de IFN-^y, el cual estaba incluido en el kit Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 15-2000 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 15 pg/ml.

Las figuras 17A y 17B ilustran los resultados de la producción de IFN-y (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 17A) y C57BL/6 (figura 17B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados.

Sorprendentemente, la producción de IFN-y fue mucho mayor en esplenocitos procedentes de ratones BalbC que en esplenocitos de ratones C57BL/6 (Figura 3.16). En los primeros, la adición de 1 mg/ml de muestra produjo una marcada reducción en la producción de esta citoquina (por debajo del límite de cuantificación), mientras que la presencia de 0,1 y 0,01 mg/ml de muestra produjo un gran aumento de los niveles de IFN-y incluso por encima de los observados con el control positivo. Curiosamente, la presencia conjunta de LPS y de 1 mg/ml de muestra, también originó una reducción en los valores de esta citoquina por debajo del control negativo y del límite de cuantificación, mientras que con el resto de las concentraciones se obtuvieron valores similares a los proporcionados por el control positivo. Los resultados con esplenocitos de ratones C57BL/6 fueron peculiares, estando los valores muy cercanos al límite de cuantificación y no existiendo diferencias significativas entre el control negativo y el positivo. Únicamente se apreció un aumento en la producción de IFN- y cuando se añadieron a los cultivos 0,01 mg/ml de muestra .

Las figuras 18A y 18B ilustran los resultados de la producción de IFN-y (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 18A) y C57BL/6 (figura 18B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. En relación con los resultados obtenidos con los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6, se obtuvieron valores muy bajos de IFN-y, estando éstos por debajo del límite de cuantificación y no permitiendo un análisis correcto de los resultados.

La figura 19 ilustra la producción de IFN-y (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Se puede observar que, con macrófagos RAW se produjo una situación similar, obteniéndose valores muy bajos de IFN-y, estando éstos por debajo del límite de cuantificación y no permitiendo un análisis correcto de los resultados.

-IL-2

La figura 20 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-2, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos. Para cuantificar la producción de IL-2 por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra, se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de IL2, el cual estaba incluido en el kit Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 2-200 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 2 pg/ml.

Las figuras 21A y 21B ilustran la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 20A) y C57BL/6 (figura 20B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. En ambos tipos de esplenocitos se observó un patrón similar de producción de IL-2. La producción de esta citoquina fue ligeramente superior en el control positivo respecto al control negativo, produciéndose una disminución significativa en los valores de la misma cuando se añadió a los cultivos 1 mg/ml de la muestra. Curiosamente, la presencia conjunta de LPS y de 1 mg/ml de la muestra también originó una reducción en los valores de esta citoquina por debajo del control negativo, mientras que con el resto de las concentraciones, se obtuvieron valores similares a los proporcionados por los controles.

Las figuras 22A y 22B ilustran los resultados de la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 22A) y C57BL/6 (figura 22B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. En relación con los resultados obtenidos con los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6 sólo se obtuvieron valores muy bajos de IL-2, estando éstos rozando el límite de cuantificación y no permitiendo un análisis correcto de los resultados.

La figura 23 ilustra los resultados de la producción de IL-2 (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Cabe indicar que con macrófagos RAW también se obtuvieron sólo valores muy bajos de IL2, estando en algunos casos por debajo del límite de cuantificación. Esto no ha permitido un análisis correcto de los resultados (Figura 23).

Respuesta Th2

-IL-10

La figura 24 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-10, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos.

Para cuantificar la producción de IL-10 por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra, se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de IL-10, el cual estaba incluido en el kit Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 30-4000 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 30 pg/ml.

Las figuras 25A y 25B ilustran los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 23A) y C57BL/6 (figura 25B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Para ambos tipos de esplenocitos se observó un patrón similar de producción de IL-10, aunque ésta fue mayor en caso de los esplenocitos provenientes de ratones C57BL/6. Con la muestra se apreció un efecto dosis dependiente. La adición de 1 y 0,1 mg/ml de muestra produjo un aumento significativo, en relación con el control negativo, en los niveles de IL-10, aunque estos estuvieron por debajo de los proporcionados por el control positivo (Figuras 25A y 25B). La presencia conjunta de LPS y de cualquiera de las tres concentraciones de la muestra produjo aumentos significativos de IL-10 respecto al control negativo, aunque en general estos valores estuvieron por debajo de los proporcionados por el control positivo.

Las figuras 26A y 26B ilustran los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 26A) y C57BL/6 (figura 26B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Puede observarse que, en relación con los resultados obtenidos con los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC y C57BL/6 , se obtuvieron valores más bajos de IL-10 en comparación con los obtenidos con esplenocitos. Cabe destacar que en macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC, únicamente se obtuvo un aumento significativo de la producción de IL-10 cuando la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra se añadió en presencia de LPS, alcanzándose unos valores por encima de los proporcionados por el control positivo (Figuras 26A y 26B). Con los macrófagos provenientes de médula ósea de ratones C57BL/6 sí se obtuvo un aumento significativo de la producción de IL-10 respecto al control negativo, con la concentración más alta (1 mg/ml) de muestra. Como en el caso de los macrófagos de médula ósea de ratones BalbC, también se obtuvo un aumento significativo de la producción de IL-10. Cuando la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra se añadió en presencia de LPS, alcanzándose unos valores por encima de los proporcionados por el control positivo. El resto de las concentraciones de la muestra cuando se testaron en presencia de LPS, dieron lugar a una producción de IL-10 similar a la proporcionada por el control positivo.

La figura 27 ilustra los resultados de la producción de IL-10 (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Se puede observar que con macrófagos RAW se obtuvieron unos valores de IL-10 muy próximos al límite de cuantificación. Únicamente la adición de 1 mg/ml de Muestra en presencia de LPS, produjo aumento significativo de la producción de esta citoquina, aunque el hecho de que se obtuviesen valores tan bajos no ha permitido un análisis correcto de los resultados (Figura27).

-IL-4

La figura 28 ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-4, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos. Para cuantificar la producción de IL-4 por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra, se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de IL-4, el cual estaba incluido en el kit Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 4-500 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 4 pg/ml. La producción de IL-4 por parte de esplenocitos no se vio modificada, ni por la presencia de LPS, ni por la presencia de ninguna concentración de la muestra. Cabe señalar que en todos los casos se obtuvieron valores muy bajos, aunque por encima del límite de cuantificación.

Las figuras 29A y 29B ilustran los resultados de la producción de IL-4 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 29A) y C57BL/6 (figura 29B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. La producción de IL-4 por parte de esplenocitos no se vio modificada, ni por la presencia de LPS, ni por la presencia de ninguna concentración de la muestra. Cabe señalar que en todos los casos se obtuvieron valores muy bajos, aunque por encima del límite de cuantificación.

Las figuras 30A y 30B ilustran los resultados de la producción de IL-4 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 30A) y C57BL/6 (figura 30B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Por otra parte, la figura 31A muestra los resultados de la producción de IL-4 (pg/ml) por parte de macrófagos RAW cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Puede observarse que, en el caso de macrófagos de médula ósea (Figuras 30A y 30B) y RAW (Figura 31), no se detectó la producción de esta citoquina en ningún caso al estar los valores obtenidos por debajo del límite de cuantificación.

-IL-13

La Figura 31B ilustra un ejemplo representativo de la gráfica y ecuación obtenida con diluciones seriadas del estándar de IL-13, la cual se empleó para calcular la producción de esta citoquina por parte de los distintos tipos de macrófagos, mientras que las figuras 32A y 32B ilustran los resultados de la producción de IL-13 (pg/ml) por parte de esplenocitos obtenidos a partir de ratones BalbC (figura 32A) y C57BL/6 (figura 32B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados.

Para cuantificar la producción de IL-13 por parte de monocitos RAW 264.7, macrófagos de médula ósea y esplenocitos procedentes de explantes de bazo de ratón en presencia de la Muestra, se empleó la ecuación de la curva proporcionada por diluciones seriadas del estándar de IL-13 (Figuras 32A y 32B), el cual estaba incluido en el kit IL-13 Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher, eBiosciences). En todos los casos se obtuvieron valores de R2 superiores a 0,99. El rango de ensayo fue de 7,8 500 pg/ml, siendo la sensibilidad analítica de esta citoquina con este kit de 2,8 pg/ml. Los valores obtenidos para esta citoquina fueron en general muy bajos, no pudiendo ser cuantificados en macrófagos RAW. En esplenocitos, estos valores también fueron muy bajos, estando en general por debajo del índice de cuantificación. Únicamente se apreciaron valores fiables para los esplenocitos procedentes de ratones BalbC en el caso de la concentración 2 (0,1 mg/ml) de la muestra en presencia de LPS, estando dichos valores por encima de los proporcionados por el control positivo (Figura 32A). En esplenocitos procedentes de ratones C57BL/6 solo se pudo cuantificar la producción de IL-13 en el control positivo y en el caso de la concentración 1 (1 mg/ml) de la muestra en presencia de LPS (Figura 32B). Estos valores tan bajos, no obstante, dificultan una correcta interpretación de los resultados.

Las figuras 33A y 33B. ilustran los resultados de la producción de IL-13 (pg/ml) por parte de macrófagos provenientes de médula ósea de ratones BalbC (figura 33A) y C57BL/6 (figura 33B) cultivados en presencia de la Muestra testada a tres concentraciones diferentes (C1: 1 mg/ml; C2: 0,1 mg/ml y C3: 0,01 mg/ml). Esas mismas concentraciones se testaron también en presencia de lipopolisacárido (LPS). Cada condición se testó por triplicado. Se representa la media y desviación estándar de tres réplicas para cada grupo de resultados. Cuando se testaron las muestras en macrófagos procedentes de médula ósea de ratones BalbC, únicamente se observaron valores cuantificables en el caso de las concentraciones 2 y 3 (0,1 y 0,01 mg/ml) de la muestra Para las células procedentes de médula ósea de ratones C57BL/6, se observaron valores similares a los obtenidos por el control positivo en el caso de la concentración más alta (1 mg/ml) de la muestra con y sin la adición conjunta de LPS. Los valores tan bajos obtenidos, no obstante, dificultan la adecuada interpretación de los resultados.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtención de una composición moduladora del microbioma intestinal humano que comprende

cultivar cepas de microorganismos probióticos que comprenden cepas de los géneros Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus y Bifidobacterium, en caldos de cultivo para obtener caldos de biomasas de los microorganismos probióticos que comprenden biomasas microbianas y caldos de cultivo;

recuperar las biomasas microbianas de los caldos de biomasas microbianas para obtener biomasas microbianas recuperadas húmedas;

caracterizado porque

los respectivos lisados microbianos secos se mezclan en proporciones de 30% a 70% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Saccharomyces,

10% a 30% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Lactobacillus,

3% a 10% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Streptococcus,

3% a 10% en volumen de lisados microbianos secos provenientes de cultivos de cepas del género Bifidobacterium,

para obtener una mezcla de lisados microbianos secos;

se extrae al menos una muestra de la mezcla de los lisados microbianos secos y se determina si la muestra comprende un mínimo de secuencias genómicas de 5000 copias/ml de cada una de las siguientes secuencias genómicas;

2.

Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el mínimo de secuencias genómicas comprende además al menos 5000 copias/ml de secuencias genómicas adicionales coincidentes en al menos un 75% con cada una de las siguientes secuencias genómicas adicionales

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las cepas de microorganismos del género Saccharomyces son cepas de Saccharomyces cerevisiae.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque las de cepas de microorganismos del género Lactobacillus se seleccionan entre cepas de Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuteri, y combinaciones de las mismas.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, caracterizado porque las cepas de microorganismos del género Bacillus se seleccionan entre cepas de Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus clausii, y combinaciones de las mismas.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las cepas de microorganismos del género Bifidobacterium se seleccionan entre cepas de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, y combinaciones de las mismas.

7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las cepas de microorganismos del género Streptococcus son cepas de Streptococcus thermophilus.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque

los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan a pH 6.4 10% en ausencia de oxígeno hasta obtener un caldo de cultivo anaeróbico en el que los microorganismos del género Lactobacillus se encuentran en plena fase logarítmica de crecimiento de su biomasa,

cuando dicha plena fase logarítmica de crecimiento ha sido alcanzada, se introduce oxígeno en el caldo de cultivo inicial hasta que contenga entre 25% y 30% de oxígeno disuelto para obtener un caldo de cultivo oxigenado;

sembrar el caldo de cultivo oxigenado con un cultivo de microorganismos del género Saccharomyces;

cultivar conjuntamente los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces ajustando y manteniéndose el caldo de cultivo con el 20% a 30% de oxígeno disuelto y manteniendo el caldo de cultivo a pH de 6.4 ^10% durante una primera etapa y permitiendo en una segunda etapa que el pH descienda a 4.5 10%;

detener el cultivo cuando el pH ha llegado a 4.5 10% para obtener caldos de las biomasas microbianas formadas a partir de los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado porque durante la primera etapa el caldo de cultivo se ajusta y mantiene a pH 6.4 0.1.

10. Procedimiento, según la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque, en la segunda etapa se permite que el pH descienda a 4.5 0.1.

11. Procedimiento, según la reivindicación 8, 9 o 10, caracterizado porque los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan en ausencia de oxígeno durante 5 a 7 horas.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, caracterizado porque los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan en ausencia de oxígeno durante 5,5 y 6,5 horas.

13. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque en la primera etapa se cultivan conjuntamente los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces durante 7 a 9 horas.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, caracterizado porque en la primera etapa se cultivan conjuntamente los microorganismos de los géneros Lactobacillus y Saccharomyces durante 7,5 a 8,5 horas.

15. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque el caldo de cultivo oxigenado se siembra con 4 a 6% v/v de un cultivo de microorganismos del género Saccharomyces.

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, caracterizado porque el caldo de cultivo oxigenado se siembra con 5% 0,1% v/v de un cultivo de microorganismos del género Saccharomyces.

17. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, caracterizado porque los microorganismos del género Lactobacillus se cultivan a pH 6.4 10% en ausencia de oxígeno durante 5,5 a 6,5 horas.

18. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las biomasas microbianas se recuperan mediante centrifugación por separado de los respectivos caldos de cultivo.

19. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las biomasas de lisados microbianos se secan mediante secado por atomización.

20. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las biomasas de lisados microbianos se secan mediante liofilización.

21. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los microorganismos del género Bacillus se cultivan a 30°C 1°C durante 20-24 horas, manteniendo una concentración de oxígeno disuelto de la menos 40% y un pH de 6,8 0,1.

22. Procedimiento, según la reivindicación 21, caracterizado porque los microorganismos del género Bacillus se cultivan manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador.

23. Procedimiento, según la reivindicación 22, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de amonio al 25% p/v

24. Procedimiento, según la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

25. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los microorganismos del género Streptococcus se cultivan a 37°C 1°C durante aproximadamente 24 horas en condiciones microaerófilas y un pH de 6,8 0,1 sin aplicar aireación al caldo de cultivo.

26. Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado porque los microorganismos del género Streptococcus se cultivan a una saturación de oxigeno inicial inferior a un 10%.

26. Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado porque los microorganismos del género Streptococcus se cultivan a una saturación de oxigeno inicial inferior a un 2%.

27. Procedimiento, según la reivindicación 25, 26 o 27, caracterizado porque los microorganismos del género Streptococcus se cultivan manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador.

28. Procedimiento, según la reivindicación 27, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de amonio al 25% p/v

29. Procedimiento, según la reivindicación 27 o 28, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

30. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los microorganismos del género Bifidobacterium se cultivan a 37°C 1°C durante aproximadamente 24 horas en ausencia de oxígeno y un pH de 6,2 0,1.

31. Procedimiento, según la reivindicación 30, caracterizado porque los microorganismos del género Bifidobacterium se cultivan manteniendo estable el pH mediante adición de al menos un agente estabilizador.

32. Procedimiento, según la reivindicación 31, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de amonio al 25% p/v

33. Procedimiento, según la reivindicación 31 o 32, caracterizado porque el agente estabilizador comprende una solución acuosa de ácido tetraoxofosfórico al 35% p/v.

34. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque cada uno de los caldos de biomasas obtenidas al finalizar el cultivo, se enfrían paa detener el metabolismo celular de los microorganismos presentes en los caldos de biomasas.

35. Procedimiento, según la reivindicación 29, caracterizado porque los caldos de biomasas se enfrían hasta 4°C a 8°C.