CN114317354B

CN114317354B - 一种动物双歧杆菌及其培养方法和其在促进骨细胞生长和成熟中的应用

Info

Publication number: CN114317354B
Application number: CN202111653578.3A
Authority: CN
Inventors: 刘庆军; 沈鹤霄; 张帆; 李国龙; 刘慧敏; 熊云
Original assignee: Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Current assignee: Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114317354A

Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌及其培养方法和其在促进骨细胞生长和成熟中的应用，涉及微生物领域，本发明实施例筛选获得了一种动物双歧杆菌MB‑424，其保藏号为CGMCC NO.23904，其可促进骨细胞C3H10T1/2生长，将有效促进正常的骨骼生长和成熟，具有潜在的骨骼发育缓慢、疏松问题的防治潜力；此外，MB‑424也可以促进垂体GH3细胞产生生长激素，能促进骨骼、内脏和全身生长、促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢的潜在能力，防止因生长激素分泌不足带来的一系列问题，在人体潜在生长发育中起着关键性作用。

Description

一种动物双歧杆菌及其培养方法和其在促进骨细胞生长和成熟中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种动物双歧杆菌及其培养方法和其在促进骨细胞生长和成熟中的应用。

背景技术

益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。目前主要有乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、酪酸梭菌等，越来越广泛的应用于食品、药品、农业、畜牧业、生物工程等。

其中，双歧杆菌是人肠道中最重要的菌群之一，也是衡量人健康长寿的重要指标之一，被称为人类的“健康卫士”。多种报道均证明双歧杆菌能够增强肠道粘膜屏障功能，防止致病菌侵入肠道；通过刺激肠道免疫系统，产生分泌型抗体sIgA，激活T细胞的非特异性免疫功能，产生多种细胞因子等增强人体免疫功能；同时，双歧杆菌还具有抗肿瘤、抗感染的功能。定植于人体肠道的双歧杆菌可在体内合成维生素K、B1、B2、B12、叶酸等维生素，产生乙酸、甲酸、乳酸、乙醇，抑制腐败菌的生长，刺激肠道蠕动缓解便秘症状。

因此，开发具有更好技术效果的双歧杆菌及其新的应用方向具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种动物双歧杆菌及其培养方法和其在促进骨细胞生长和成熟中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种动物双歧杆菌，其保藏号为CGMCC NO.23904。

第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌的培养方法，其包括将所述动物双歧杆菌置于培养基中进行厌氧培养。

第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在制备促进骨细胞生长和/或成熟的产品中的应用。

第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在促进骨细胞生长和/或成熟中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

第五方面，本发明实施例提供了一种促进骨细胞生长和/或成熟的产品，所述产品的活性成分包括如前述实施例所述的动物双歧杆菌。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在制备促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

第八方面，本发明实施例提供了促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品，所述产品的活性成分包括如前述实施例所述的动物双歧杆菌。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例筛选获得了一种动物双歧杆菌MB-424，其保藏号为CGMCCNO.23904，其可促进骨细胞C3H10T1/2生长，将有效促进正常的骨骼生长和成熟，具有潜在的骨骼发育缓慢、疏松问题的防治潜力；此外，MB-424也可以促进垂体GH3细胞产生生长激素，能促进骨骼、内脏和全身生长、促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢的潜在能力，防止因生长激素分泌不足带来的一系列问题，在人体潜在生长发育中起着关键性作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中动物双歧杆菌MB-424的菌落形态。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种动物双歧杆菌MB-424(Bifidobacterium animalis)，其保藏号为CGMCC NO.23904。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期：2021年11月15日。

动物双歧杆菌MB-424的16s rDNA的序列如下(5’-3’)：GCGGCGGGTGCTTACCATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGAGCCGTCTAAGAGAGATCTT。

该菌株已经过全基因组测序，经Blast比对后，未发现与该菌株基因组序列完全相同的菌株。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌MB-424的培养方法，其包括将所述动物双歧杆菌置于培养基中进行厌氧培养。

在没有限定的情况下，本发明提供的动物双歧杆菌MB-424可以采用一般适用于动物双歧杆菌的培养方法或者发酵方法进行培养或发酵。

优选地，所述厌氧培养的条件包括：于32～42℃；培养1～48h。具体地，培养温度可以包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃中的任意一项或任意两项之间的范围；培养时间包括但不限于1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h和48h中的任意一项或任意两项之间的范围。

优选地，所述培养基为适于双歧杆菌生长的培养基；

优选地，培养基的pH为6.2～6.6，可以在该范围内任意选择，包括但不限于6.2、6.3、6.4、6.5和6.6中的任意一项或任意两项之间的范围。

优选地，所述培养基为乳酸细菌培养基MRS。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在制备促进骨细胞生长和/或成熟的产品中的应用。

优选地，所述动物双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种，后续实施例提供的应用中所述的动物双歧杆菌同此理解。无论是采用动物双歧杆菌MB-424的活菌体，灭菌体、其培养物和发酵物，只要应用于对应产品的制备均属于本申请保护的发内。

优选地，所述骨细胞包括骨细胞C3H10T1/2。骨细胞C3H10T1/2是由C3H10T1/2定向分化获得的骨细胞。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在促进骨细胞生长和/或成熟中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

在培养骨细胞时，给予前述实施例所述的动物双歧杆菌MB-424或其培养液或其发酵液，即可达到促进骨细胞生长和/或成熟的效果，给予的量可以根据培养中骨细胞的状态、数量以及培养基的类型和体积进行选择性设置。

优选地，所述骨细胞包括但不限于骨细胞C3H10T1/2。

本发明实施例还提供了一种促进骨细胞生长和/或成熟的产品，所述产品的活性成分包括如前述实施例所述的动物双歧杆菌。

优选地，所述产品还包括另一种具备促进骨细胞生长和/或成熟功能的物质。

优选地，所述骨细胞包括骨细胞C3H10T1/2。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在制备促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。

优选地，所述垂体细胞包括GH3细胞。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的动物双歧杆菌在促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

优选地，所述机体为动物的全部或部分机体。

优选地，所述部分机体包括骨骼、内脏和肌肉中的至少一种；

优选地，所述动物为非人动物，优选为非人的哺乳动物，包括但不限于猪、牛、羊、马、兔、鸡、鸭和鹅等动物。

此外，本发明实施例还提供了一种促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品，所述产品的活性成分包括如前述实施例所述的动物双歧杆菌。

优选地，所述产品还包括其他具备促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品的功能的物质。

需要说明的是，前述任意实施例中所述的产品均可以为药品。

优选地，所述产品还包括对应领域(医学)所接受的载体。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明提供了一种动物双歧杆菌MB-424(保藏号CGMCCNO.23904)，来源于25岁左右健康成人粪便中，在乳酸细菌培养基(MRS)中混合2.5mg/L莫匹罗星锂盐分离得到。于乳酸细菌培养基(MRS)中，pH 6.2-6.6，在37℃恒温培养箱静置过夜培养。镜检(400X)下菌体呈蓝紫色，见图1。

实施例2

菌株MB-424促进骨细胞(C3H10T1/2)生长的检测。

菌株的培养与发酵液的制备：将待测动物双歧杆菌MB-424用MRS液体培养基连续活化3代，用无菌PBS缓冲液洗涤细菌，调整密度为3×10⁸mL。按2％体积量向MRS液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4 000r/min离心30min，对上清液用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除菌，调节pH值至7.2，分装冻存备用。

培养骨细胞(C3H10T1/2)，使用待测菌株(MB-424)的发酵液(过滤除菌)刺激骨细胞，用MTT法检测细胞生长。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

(一)基本原理：其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法己广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

(二)MTT溶液的配制方法：

MTT：3-<(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliu mromide；汉语化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐；商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml，可以称取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

(三)MTT法检测MB-424对骨细胞增殖的作用：

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度1000-10000孔，边缘孔用无菌PBS填充；

2.5％ CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，吸弃细胞培养基20μl/孔，加入细菌发酵液20μl/孔。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，本实施例在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100μl，设3-5个复孔；

3.5％ CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；

4.每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；

5.终止培养，小心吸去孔内培养液；

6.每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；

7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)(CK对照)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)(空白对照)。

表1动物双歧杆菌对于骨细胞C3H10T1/2生长率的影响结果

备注：表1为3次重复实验的结果，cb29Y5与MB-424的来源方法相同，可参照实施例1。

实施例3

动物双歧杆菌MB-424促进大鼠垂体瘤GH3细胞产生生长激素的检测。

除动物双歧杆菌MB-424外，还设置了几组对照组，包括阴性对照(CK)，空白对照(MRS)，动物双歧杆菌cb29Y5。需要说明的是，动物双歧杆菌cb29Y5的获得途径同菌株MB-424，可参照实施例1中所述。

方法：培养大鼠垂体瘤GH3细胞，使用细菌发酵液刺激48小时，用大鼠GH的ELISA试剂盒(南京建成购买，见表2)检测生长激素。

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠GH单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GH与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠GH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，GH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GH浓度。

表2试剂盒组成(2～8℃保存)

酶标板(Coated Wells)	96孔	酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate)	12ml
				10×标本稀释液(Sample Buffer)	12ml	20×浓缩洗涤液(Wash Buffer)	50ml
标准品(Standards)：160ng/瓶	2瓶	底物工作液(TMB Solution)	12ml
				第一抗体工作液(Biotinylated Antibody)	12ml	终止液(Stop Solution)	12ml

准备试剂与收集血样：

1.收集标本：血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存，避免反复冻融。血清、血浆建议作1：2稀释(取60ul，加标本稀释液60μl，稀释2倍)。

2.标准品液配制：使用前加入2ml蒸馏水混匀，配成80ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900μl，第二至第八管加入标本稀释液500μl。在第一管中加入80ng/ml的标准品溶液100μl混匀后用加样器吸出500μl，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500μl弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

4.洗涤液：用重蒸水1：20稀释(示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)。

检测程序：

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟；

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；

3.每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟；

4.洗板：同前；

5.每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃30分钟；

6.洗板：同前；

7.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟；

8.每孔加入100μl终止液混匀；

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果与判断：

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算；2.标准品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线；3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应GH含量，再乘上稀释倍数即可，结果见表3。

表3检测结果

备注：表3为3次重复实验的结果。

基于前述实施例的结果可知，动物双歧杆菌MB-424可促进骨细胞C3H10T1/2生长，将有效促进正常的骨骼生长和成熟，具有潜在的骨骼发育缓慢、疏松问题的防治潜力；MB-424也可以促进垂体GH3细胞产生生长激素，能促进骨骼、内脏和全身生长、促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢的潜在能力，防止因生长激素分泌不足带来的一系列问题，在人体潜在生长发育中起着关键性作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis的保藏号为CGMCC NO.23904。

2.如权利要求1所述的动物双歧杆菌的培养方法，其特征在于，其包括将所述动物双歧杆菌置于培养基中进行厌氧培养。

3.根据权利要求2所述的动物双歧杆菌的培养方法，其特征在于，所述厌氧培养的条件包括：于32~42℃；培养1~48h。

4.根据权利要求2所述的动物双歧杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基为适于双歧杆菌生长的培养基。

5.根据权利要求4所述的动物双歧杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基为乳酸细菌培养基MRS。

6.如权利要求1所述的动物双歧杆菌在制备促进骨细胞生长和/或成熟的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌为活菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述骨细胞包括骨细胞C3H10T1/2。

9.如权利要求1所述的动物双歧杆菌在促进骨细胞生长和/或成熟中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨细胞包括骨细胞C3H10T1/2。

11.一种促进骨细胞生长和/或成熟的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括如权利要求1所述的动物双歧杆菌。

12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述动物双歧杆菌为活菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

13.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品还包括另一种促进骨细胞生长和/或成熟的物质。

14.如权利要求1所述的动物双歧杆菌在制备促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述垂体细胞包括GH3细胞。

16.一种促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括如权利要求1所述的动物双歧杆菌。

17.根据权利要求16所述的产品，其特征在于，所述动物双歧杆菌为活菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

18.根据权利要求16或17所述的产品，其特征在于，所述产品还包括另一种促进机体生长发育和/或促进垂体细胞分泌生长激素的物质。