CN110452843B - 一种饲用枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种饲用枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物与饲料添加剂制备技术领域。本发明提供的饲用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)命名为Ma.k，保藏编号为CGMCC NO.17613，该菌能够同时耐90℃的高温、可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强，同时具有降解霉菌霉素的作用，将枯草芽孢杆菌Ma.k制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠，在促进营养物质消化吸收，降低腹泻率，提高饲料转化效率，促进生长方面有积极作用。

Description

一种饲用枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及饲料添加剂领域，具体地涉及一种饲用枯草芽孢杆菌及其菌剂在作为养殖动物饲料添加剂中的应用。
背景技术
现代规模化养猪都实行早期断奶，断奶仔猪容易出现食欲下降、消化功能异常、免疫力降低、高频腹泻、生长迟缓等一系列应激综合征，是养猪生产中的一大难题。以往的养殖过程中，通过添加抗生素来应对仔猪断奶应激现象。由于抗生素的长期使用导致耐药菌株不断产生等问题，我国将于2020年底实行养殖过程中抗生素的全面禁用。微生态制剂作为一类抗生素的有效替代品得到越来越多的关注。益生素因其安全性、无残留、有利于生态环境的可持续性发展等优点成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌更是益生素中使用最为广泛的一种微生态制剂。不同的芽孢杆菌的抗逆性不同，筛选出一株高抗逆性的芽孢杆菌是一种微生态制剂是否发挥作用的重要前提。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)具有安全高效、无药残、无毒副作用，能促进动物生长，增强动物免疫力和抗病力，是我国饲料添加剂目录中允许应用于养殖动物的营养性饲料添加剂中常用菌种之一。
玉米赤霉烯酮是一种酚的二羟基苯酸内酯化合物，是由镰刀菌产生的一类次生代谢物质，是世界上污染范围最广泛的镰刀菌毒素之一。玉米赤霉烯酮与雌二醇结构相似，具有雌激素活性，在人和动物中积累诱发一系列雌激素效应，包括影响雌性哺乳动物乳房发育，导致其产生发情周期紊乱、外阴道炎、假孕不孕、流产、死胎畸胎等症状。此外，有研究证实玉米赤霉烯酮还具有细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、致肿瘤毒性。谷物和饲料原料中玉米赤霉烯酮的污染严重，应引起足够重视。因此，解决玉米赤霉烯酮在谷物和饲料原料中的脱毒问题迫在眉睫。通过对粮食及饲料进行脱毒处理，不仅可以挽回经济损失，还可以从源头上预防玉米赤霉烯酮中毒等问题从而保障人畜健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑菌能力，耐高温、耐酸、耐胆盐且具有降解霉菌毒素作用的饲用枯草芽孢杆菌及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从北京市某养猪实验基地的猪肠道中筛选并经过紫外光诱变得到，命名为Ma.K。经16S RNA基因序列分析，该菌株Ma.K为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株已于2019年4月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCC No.17613。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，长度不超过4μm，宽度不超过1.3μm，具有芽孢且芽孢不膨大；单菌落大小约为3mm，颜色呈米白色，不透明，菌落表面平整，边缘不规则。枯草芽孢杆菌Ma.K在高温90℃下处理1h、2h后的活菌数均大于1010CFU/ml。Ma.K可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。且具有一定的降解霉菌毒素的能力，其在正常条件下对玉米赤霉烯酮的降解率达到54.17％。
本发明提供含有该枯草芽孢杆菌Ma.K的菌剂。
本发明还提供一种含有该枯草芽孢杆菌Ma.K的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有的枯草芽孢杆菌Ma.K活菌数为2×108CFU/g～1×1012CFU/g；优选地，含有的枯草芽孢杆菌Ma.K饲料添加剂的活菌数为1×1011CFU/g～2×1011CFU/g。
本发明还提供一种含有该枯草芽孢杆菌Ma.K的动物饲料。其中，所述动物饲料中枯草芽孢杆菌Ma.K的活菌数为2×106CFU/kg～2×109CFU/kg，优选2×107CFU/kg～2×108CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了枯草芽孢杆菌Ma.K的益生效果，结果表明，枯草芽孢杆菌Ma.K能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
本发明还发现枯草芽孢杆菌Ma.K具有降解霉菌毒素的能力，因此本发明提供了含有枯草芽孢杆菌Ma.K的抑制霉菌毒素的药物，以及提供了枯草芽孢杆菌Ma.K在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用。本发明实施例中，验证了枯草芽孢杆菌Ma.K对玉米赤霉烯酮的降解率达到54.17％。本领域技术人员能够基于本发明提供的枯草芽孢杆菌Ma.K，用于验证其对其他霉菌毒素的降解效果，这不超出本领域技术人员的基本能力范围，因此枯草芽孢杆菌Ma.K具有降解霉菌毒素并用于制备降解霉菌毒素的药物、以及在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果主要体现在：
1、由于芽孢结构对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。枯草芽孢杆菌Ma.K在高温90℃下处理1h、2h后的活菌数均大于1010CFU/ml。本领域普遍认为益生菌活菌数能够在肠道内发挥作用的数量即106CFU/ml，这说明本发明的枯草芽孢杆菌能够在极端条件下产生孢子，在条件适宜的情况下活化后活菌数含量至少大于1010CFU/ml。
2、本发明的枯草芽孢杆菌Ma.K具有显著的益生性，能够提高饲料利用率。本发明进一步验证了枯草芽孢杆菌Ma.K在断奶仔猪饲料添加中的应用效果，发现该菌株具有降低断奶仔猪腹泻率提高饲料转化率的作用。不但能减少动物的病害率、减少动物因饮食抗生素类添加剂所致的腹泻率、以及降低死淘率，更重要的是可以增强动物的免疫功能，增加动物的日采食量、提高饲料转化率、降低料肉比、增强动物的生产性能、改善动物体内消化道内环境的稳态，具有促进营养的吸收利用、促进动物生长等功效，从而节约成本、提高经济效益，具有良好的应用前景。
3、本发明的枯草芽孢杆菌Ma.K具有较强的抗逆性，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的芽孢存活率。由于饲料加工制粒的过程中温度较高，能达到75-90℃，因此菌株需要耐受住这个温度范围才能保证动物吃到的是活菌，活的芽孢杆菌才具有益生性。而耐受胃酸和胆盐是为了使芽孢杆菌在动物消化道内可以发挥其作用。本发明的芽孢杆菌在饲料制备过程中，能够耐受高达90℃的温度，可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。且具有一定的降解霉菌毒素的能力，其在正常条件下对玉米赤霉烯酮的降解率达到54.17％。
4、本发明的枯草芽孢杆菌作为益生菌和饲料添加剂成分，不存在抗生素类饲料添加剂的耐药性和残留问题。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613的菌落形态图。
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613的革兰氏染色图。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613的耐酸性检测结果。
图4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613的耐胆盐检测结果。
图5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613的生长曲线。
图6为利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K CGMCC No.17613进行小鼠灌胃实验后的组织学形态图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，用5mol/L的氢氧化钠将pH调至7.0。
实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.K的分离与鉴定
一、菌株Ma.K的分离
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学养猪实验基地中，猪的肠道食糜样品装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1ml涂布于LB培养基上。37℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的紫外诱变与筛选
将灭菌后的LB培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在60个左右，培养12小时后，距离紫外灯20cm，诱变30s。
挑取诱变后的菌株，接种于LB液体培养基中，培养24小时，测定OD值，选取生长速度较快的菌株，取适量的菌悬液涂布于LB平板上，在37℃恒温培养箱中培养至24小时，进行下一步革兰氏染色。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，随机挑取一个诱变后生长速度较快的单菌落(菌落形态图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50S，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为阳性，菌体呈红色为阴性，结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进行下一步荚膜染色实验。
4.菌株的荚膜染色
用接种环挑取步骤2诱变后的单菌落，均匀涂抹在载玻片上，滴加1％结晶紫染色液，染3min；用20％的硫酸铜冲洗，自然晾干；在普通光学显微镜上观察，背景呈蓝紫色，菌体呈紫色，荚膜无色。
5.菌株的芽孢染色
取经步骤2诱变后生长速度较快的菌株，在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加5％孔雀石绿溶液3-5滴，在酒精灯上加热3-5min，注意不能使液体沸腾或者干枯，水洗，自然晾干；滴加蕃红溶液染色2min，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
通过步骤1-5的分离筛选，最终获得一株革兰氏染色阳性，具有芽孢且芽孢不膨大的菌株。将该菌株编号为Ma.K。
二、菌株Ma.K的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株Ma.K进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落大小约为3mm，颜色呈米白色，不透明，菌落表面平整，边缘不规则。
其次对处于对数生长期的菌株Ma.K进行染色，采用光学显微镜观察菌体形态。分离并筛选到的菌株Ma.K，革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，直径不超过1.3μm，有荚膜，有芽孢生成且芽孢不膨大。
2.16S RNA序列同源性分析
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
上述实验结果表明，该菌为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏号为CGMCC No.17613。
实施例2枯草芽孢杆菌Ma.K的抗逆性检测
1.耐热性检测
将枯草芽孢杆菌Ma.K(CGMCC No.17613)菌液至于水浴锅内20分钟，分别用60℃、80℃、90℃处理，每个处理3个重复，处理结束后采用倾注法测定其活菌数，活菌数芽孢存活率为符合实际生产中要求益生菌所具备的加工特性的最低要求。
结果显示，初始大于1010CFU/ml的枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613分别在60℃、80℃处理20分钟后，活菌数可保持在1010CFU/ml以上；枯草芽孢杆菌Ma.K在高温90℃下处理1h、2h后的活菌数均大于1010CFU/ml。
2.耐酸性检测
将108CFU/ml枯草芽孢杆菌Ma.K分别接种到pH值为2.0、3.0、4.0的LB培养基中，分别在1h、2h、3h、4h采用平板倾注法测定其活菌数。
当处于酸性环境即pH为4.0以及3.0时，枯草芽孢杆菌可以正常生长，当pH为2.0时，活菌数较pH4.0时有较大下降，但仍然能维持在1×106CFU/ml。结果见图3，当pH为3时，在接种活菌4小时后，活菌数量与接种时基本保持一致。说明该菌种对酸的耐受能力较强。结果提示枯草芽孢杆菌Ma.K可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测
将活化好的枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1ml稀释液放于无菌培养皿里，做6个重复，然后用含不同浓度牛胆酸钠(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)的LB培养基倾注平板，37℃培养4小时，每隔1小时菌落计数，同时用不含牛胆酸钠的LB培养基倾注平板，37℃培养48小时，菌落计数，作为对照组，见图4，结果显示不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长未呈现明显下降趋势。0.1％、0.2％、0.3％、0.4％胆盐作用对枯草芽孢杆菌Ma.K的影响比较微弱，几乎不影响其正常生长。说明枯草芽孢杆菌Ma.K的耐胆盐能力较强。
4.抗生素敏感性检测
将适宜浓度的枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613涂布于LB培养基上，每个培养皿中均匀的贴附1个药敏纸片，培养36小时，观察抑菌圈大小。
表1枯草芽孢杆菌Ma.K对不同抗生素敏感性结果
名称 抑菌圈直径(mm) 敏感度
四环素 15 高敏
多黏菌素 15 高敏
青霉素 14 中敏
复方新诺明 32 极敏
米诺环素 32 极敏
红霉素 33 极敏
头孢氨苄 44 极敏
氧氟沙星 32 极敏
氯霉素 35 极敏
这一结果表明，枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613并不具有良好的耐药性，因此作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
5.枯草芽孢杆菌Ma.K对霉菌毒素的降解效果实验
(1)极高温条件下降解玉米赤霉烯酮能力的检测：
取发霉饲料若干，粉碎混匀，并用无霉饲料与其混合，将玉米赤霉烯酮的浓度调制1000μg/mg，将活化好的枯草芽孢杆菌Ma.K离心，弃上清取活菌体并用无菌蒸馏水将其浓度调制1012CFU/ml。取玉米赤霉烯酮浓度为1000μg/mg的饲料100g，按5％比例将5ml 1012CFU/ml枯草芽孢杆菌Ma.K均匀喷洒于饲料上后置于90℃恒温箱培养，分别于1h、2h后取样并测定其玉米赤霉烯酮的浓度分别为636.8μg/mg、634.8μg/mg，即枯草芽孢杆菌Ma.K在高温90℃下处理1h对玉米赤霉烯酮的降解率为36.32％，在高温90℃下处理2h对玉米赤霉烯酮的降解率为36.52％。且枯草芽孢杆菌Ma.K在高温90℃下处理1h、2h后的活菌数均大于1010CFU/ml。
(2)极酸性条件下降解玉米赤霉烯酮的能力检测：取发霉饲料若干，粉碎混匀，并用无霉饲料与其混合，将玉米赤霉烯酮的浓度调制1000μg/mg，将活化好的枯草芽孢杆菌Ma.K离心，弃上清取活菌体并用无菌蒸馏水将其浓度调制1012CFU/ml。取玉米赤霉烯酮浓度为1000μg/mg的饲料100g，按5％比例将pH 2、pH 3、pH 4、5ml 1012CFU/ml枯草芽孢杆菌Ma.K均匀喷洒于饲料上后置于37℃恒温箱培养，分别于1h、2h后测定其玉米赤霉烯酮的浓度。接种pH 2、pH 3、pH 4枯草芽孢杆菌Ma.K菌液1h后的饲料玉米赤霉烯酮的浓度分别为892.8μg/mg、437.3μg/mg、279.6μg/mg，接种pH 2、pH 3、pH 4枯草芽孢杆菌Ma.K菌液2h后的饲料玉米赤霉烯酮的浓度分别为898.4μg/mg、411.4μg/mg、277.1μg/mg，即pH 2、pH 3、pH 4枯草芽孢杆菌Ma.K在37℃下处理发霉饲料1h对玉米赤霉烯酮的降解率为10.72％、56.27％、72.1％，pH 2、pH 3、pH 4枯草芽孢杆菌Ma.K在37℃下处理发霉饲料2h对玉米赤霉烯酮的降解率为10.16％、58.8％、72.3％。枯草芽孢杆菌Ma.K菌液在pH 2、pH3、pH 4下处理1h、2h后的活菌数为均大于109CFU/ml，(大于一般市面上认为能够在肠道内发挥作用的数量即106CFU/ml)。玉米赤霉烯酮降解率的计算方式为(霉菌毒素添加量-霉菌毒素残留量)/霉菌毒素添加量×100％。
实施例3枯草芽孢杆菌Ma.K的生长曲线测定
生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613按10％(v/v)的接种量，接种到LB培养基中，37℃培养36小时，以不加菌液的LB培养基作为空白对照，每隔2-6小时测定OD600值，从而计算活菌数。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图5所示，在0-14小时，枯草芽孢杆菌Ma.K处于对数生长阶段，繁殖速率较高。在14-24小时枯草芽孢杆菌Ma.K数目趋于稳定处于静止期。24小时以后进入生长率下降阶段。
实施例4枯草芽孢杆菌制剂的制备
1.发酵培养基配方：红糖60g/L、豆粕35g/L、氯化钠4g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.03g/L、消泡剂0.05％(v/v)加水充分溶解，控制pH在6.5-6.9的范围内制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时，接种菌龄12小时的菌液5％(v/v)。
4.在37℃条件下，保持转速200rpm搅拌，发酵培养20小时，放罐，得到枯草芽孢杆菌的活菌数大于2×1010cfu/ml，芽孢率达95％以上。
5.将菌泥用无菌水稀释后，放入喷雾干燥器中干燥，收集产品，得到枯草芽孢杆菌制剂。
实施例5枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613制剂的安全性评价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价枯草芽孢杆菌的安全性，具体方法如下：
1.实施例4方法制得的枯草芽孢杆菌菌剂，经平板计数测定，其枯草芽孢杆菌Ma.K菌数为1×109cfu/g。
2.选取8周龄左右的小鼠72只，随机分为4组(A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照1×109cfu/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照1×108cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量组按照1×107cfu/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复6只鼠。
3.每天上午九点灌胃一次，连续灌服21天。
实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
检测指标：
(1)于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等血液生化指标。
(2)取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算心脏指数＝(心脏湿重/体重)×100％、肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％、脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％、肾脏指数＝(肾脏湿重/体重)×100％。
(3)取各组实验鼠的空肠、回肠、结肠、肝脏、脾脏、肺组织于4％的多聚甲醛中固定，经脱水、包埋等步骤制成切片，通过苏木精伊红染色的方法观察形态的变化，结果见图6。
表2不同处理组小鼠存活情况
A组 B组 C组 D组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
从表2可以看出，使用枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613给小鼠灌胃21天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述枯草芽孢杆菌对动物安全。
表3不同处理组小鼠的脏器系数
A组 B组 C组 D组
心脏 0.65 0.63 0.61 0.69
肝脏 5.49 5.48 5.52 5.47
脾脏 0.40 0.45 0.42 0.44
肾脏 1.29 1.33 1.31 1.36
从表3可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明上述枯草芽孢杆菌没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等，结果均显示正常，说明本发明实施例4提供的枯草芽孢杆菌制剂对小鼠的生理指标不构成影响。
实施例6枯草芽孢杆菌Ma.K CGMCC No.17613制剂的应用
本实验选取28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪72头，实验期45天，按照随机区组设计分为2个组，每组6个重复，每个重复6头猪。A组为对照组(基础日粮组)，B组为处理组(基础日粮中添加240g/t的实施例4制得的枯草芽孢杆菌制剂，有效活菌数为1×1010cfu/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内，温度控制在25-27℃，自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素，仔猪免疫按照常规免疫程序进行。
测定指标：各处理组断奶仔猪的生产性能，具体包括以下指标：
1.每天记录仔猪的采食量，试验结束后计算平均日采食量；
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重，计算平均日增重；
3.通过a、b的试验结果计算料肉比，其计算方式为平均日采食量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况，计算断奶仔猪腹泻率，腹泻率(％)＝(腹泻头数×腹泻天数)/(猪只数×试验天数)×100％。
表4基础日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响
平均日采食量(kg) 平均日增重(kg) 料肉比 腹泻率(％)
A组 0.462 0.328 1.409 2.8
B组 0.477 0.356 1.339 1.1
从表4可以看出，处理组仔猪平均日采食量和平均日增重都显著高于对照组(P＜0.05)，料肉比显著低于对照组(P＜0.05)，说明添加枯草芽孢杆菌制剂的饲料效益更好。饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂的仔猪腹泻率显著降低(P＜0.05)，说明本发明的菌剂具有降低断奶仔猪腹泻率的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k，保藏编号为CGMCC NO.17613。
2.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k的菌剂。
3.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k的饲料添加剂或动物饲料。
4.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k的药物。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k在制备饲料添加剂中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ma.k在非疾病治疗目的的促进动物生长或提高动物体重中的应用。
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