发明内容
本发明的目的是提供一种耐高温、耐酸、耐胆盐且具有降解霉菌 毒素并产乙酸乙酯作用的饲用异常威克汉姆酵母及其应用。
为了实现本发明的目的,本发明的异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomycesanomalus)是从北京市某养猪实验基地附近土壤 中筛选得到,命名为Y4。经18S RNA基因序列分析,该菌株Y4为 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。该菌株已于2018年9月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科 学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomyces anomalus),保藏号为CGMCC No.16540。
异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的微生物 学特性为:细胞形态为椭圆形,长度约15-20μm,宽度约2-4μm;单 菌落大小为10-12mm,颜色呈乳白色,不透明,菌落表面平滑,边 缘规则。菌体在80℃处理20min后存活率可达95%以上,100℃处理20min后存活率仍达90%以上,可在pH值1.0以上的酸性环境生长, 耐胆盐能力强。且具有一定的降解霉菌毒素的能力,其对伏马毒素的 降解率达到14.77%,对呕吐毒素的降解率达到5.81%。产乙酸乙酯的 能力,发酵120小时后乙酸乙酯产量达到7.8g/L。
本发明提供含有该异常威克汉姆酵母Y4的菌剂。
本发明还提供一种含有该异常威克汉姆酵母Y4的动物饲料添加 剂。该饲料添加剂含有的异常威克汉姆酵母Y4活菌数为1.9×108CFU/g~1.9×1012CFU/g;优选地,含有的异常威克汉姆酵母Y4 饲料添加剂的活菌数为1.9×109CFU/g~1.9×1011CFU/g。
本发明还提供一种含有该异常威克汉姆酵母Y4的动物饲料。其 中,所述动物饲料中异常威克汉姆酵母Y4的活菌数为1.9×107 CFU/kg~1.9×1011CFU/kg,优选1.9×108CFU/kg~1.9×109CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了异常威克汉姆酵母Y4的益生效果,结 果表明,异常威克汉姆酵母Y4能够耐酸、酸胆盐,能抵抗胃肠道的 内环境,具备益生菌的潜力。
本发明还发现异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素的能力, 因此本发明提供了含有异常威克汉姆酵母Y4的抑制霉菌毒素的药 物,以及提供了异常威克汉姆酵母Y4在降低食品或饲料中霉菌毒素 污染中的应用。
本发明实施例中,验证了异常威克汉姆酵母Y4对伏马毒素的降 解率达到14.77%,对呕吐毒素的降解率达到5.81%。本领域技术人员 能够基于本发明提供的异常威克汉姆酵母Y4,用于验证其对其他霉 菌毒素的降解效果,这不超出本领域技术人员的基本能力范围,因此 异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素并用于制备降解霉菌毒素的 药物、以及在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用均属于本发明 的保护范围。
进一步地,本发明提供了异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4或含有其的菌剂在制备添加剂或抑制霉菌毒素的药物 中的应用。
所述的添加剂为饲料添加剂或食品添加剂。
本发明还发现异常威克汉姆酵母Y4具有产乙酸乙酯的能力。本 发明实施例中,验证了异常威克汉姆酵母Y4在发酵120小时后,其乙 酸乙酯产量达7.8g/L。
本发明涉及的饲用异常威克汉姆酵母,由于出芽生殖的方式对干 燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强,这种稳定性增加了它 作为益生菌的潜力。本发明进一步验证了异常威克汉姆酵母Y4在断 奶仔猪饲料添加中的应用效果,发现该菌株具有降低断奶仔猪腹泻率 提高饲料转化率的作用。表明异常威克汉姆酵母Y4可作为一种新型 的益生菌添加剂,广泛应用于饲料和食品中。本发明筛选得到的异常 威克汉姆酵母Y4具有提高饲料利用率,促进饲料中营养物质的消化 吸收;增强动物的免疫功能,增加采食量,提高日增重,降低料肉比; 无污染,无残留,生物环保等特点,在促进动物生长和提高动物体重 方面具有显著的效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明,均可从商 业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配置方法如下:YPD 培养基:蛋白胨20g,酵母提取物10g,溶解于900ml蒸馏水,葡萄糖 20g,溶解于100ml蒸馏水,高压灭菌后混合。
实施例1异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的分 离与鉴定
一、菌株Y4的鉴定
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学西校区养猪基地附近的土壤样 品装入有9ml生理盐水的试管中,漩涡器震荡混匀,即为1:10稀释 液,再取稀释液进行10倍递增稀释,然后选择3个适宜梯度的稀释 液各1ml涂布于YPD培养基上。30℃培养48-72小时,观察并记录菌落形态,挑取长势良好的单菌落,进行划线分离纯化。
2.菌株的美蓝染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水,挑取一个单菌落(菌落形态 图见图1)在水中溶解,加入美蓝染液1滴,盖上盖玻片;在普通光 学显微镜上观察,若菌体呈透明样则为活菌,菌体呈蓝色则判定菌体 已经死亡,半小时后再次观察,结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进 行下一步芽孢染色实验。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水,挑取一个单菌落(菌落形态 图见图1)在水中溶解,经刮片后,在酒精灯上烘干固定。滴加结晶 紫染色液,染2min,水洗,自然晾干;滴加碘液媒染2min,水洗, 自然晾干;滴加碱性品红乙醇溶液50S,水洗,自然晾干;在普通光 学显微镜上观察,菌体呈紫色便于观察其出芽情况,结果见图3。
通过步骤1-3的分离筛选,得到一株通过出芽生殖的方式进行繁殖的菌株,将该菌株编号为Y4。
二、菌株Y4的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株Y4进行单菌落状态描 述,主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘 状态。所得单菌落大小为10-12mm,颜色呈乳白色,不透明,菌落 表面平滑,边缘规则。
其次对处于对数生长期的菌株Y4进行染色,采用光学显微镜观 察菌体形态。分离并筛选到的菌株Y4,革兰氏染色呈紫色,细胞形 态为椭圆形,长度约15-20μm,宽度约2-4μm。
2.18S RNA序列同源性分析
菌株总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的基因组DNA 提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司 进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对, 确定菌株类别为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。
上述实验结果表明,该菌株为异常威克汉姆酵母。该菌株已于 2018年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中 国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus),保藏号为CGMCC No.16540。
实施例2异常威克汉姆酵母Y4的抗逆性检测
1.耐热性检测:将异常威克汉姆酵母Y4(CGMCC No.16540)菌 液至于水浴锅内20分钟,分别用60℃、80℃、100℃处理,每个处 理3个重复,处理结束后采用倾注法测定其活菌数。
异常威克汉姆酵母Y4CGMCC No.16540在60℃处理20分钟后, 存活率可达99%,80℃处理20分钟后可达95%以上,100℃处理20 分钟后仍可达到90%以上。
2.耐酸性检测:将异常威克汉姆酵母Y4分别接种到pH值为2.0、 3.0、4.0的YPD培养基中,分别在1h、2h、3h、4h采用平板倾注法 测定其活菌数。
异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540能够在pH为4的环境 中正常生长,结果见图4。当pH为1、2、3时,在接种活菌4小时 后,活菌数量与接种时相比有所上升,说明异常威克汉姆酵母Y4具 有在pH最低为1的环境下繁殖的能力,但相对pH为4的环境来说 繁殖速度较低,该菌种对酸性环境有一定的耐受能力。结果提示异常 威克汉姆酵母Y4可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测:将活化好的异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540用无菌生理盐水做倍比稀释,选取合适的稀释梯度并吸取 1ml稀释液放于无菌培养皿里,做6个重复,然后用含不同浓度牛胆 酸钠(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的YPD培养基倾注平板,30℃培 养4小时,每隔1小时菌落计数,同时用不含牛胆酸钠的YPD培养 基倾注平板,30℃培养48小时,菌落计数,作为对照组,见图5, 结果显示不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长普遍呈下降趋势。 0.1%的胆盐作用对异常威克汉姆酵母Y4的影响比较微弱,几乎不影 响其正常生长。在0.2%和0.3%的胆盐作用4小时后,活菌数平均仍 然可以保持在10lg cfu/ml,在0.4%的胆盐作用4小时后,活菌数平 均为9.11lg cfu/ml,半数以上的异常威克汉姆酵母Y4在0.4%的胆盐 下存活,说明异常威克汉姆酵母Y4的耐胆盐能力较强。
4.抗生素敏感性检测:将适宜浓度的异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540涂布于YPD培养基上,每个培养皿中均匀的贴附 4个药敏纸片,培养36小时,观察抑菌圈大小。
表1异常威克汉姆酵母Y4对不同抗生素敏感性结果
这一结果表明,异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540并不具 有良好的耐药性,因此作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
5.异常威克汉姆酵母Y4对霉菌毒素的降解效果实验
将异常威克汉姆酵母分别接种在2ml含有40μg/ml呕吐毒素及 2ml含有40μg/ml伏马毒素的液体培养基中,适宜环境下培养3天, 扩大浓度到60μg/ml进行重复试验,3天后采用高效液相色谱方法检 测培养基中呕吐毒素和伏马毒素的浓度,均出现不同程度的下降,表 明异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素的能力。其对伏马毒素的 降解率达14.77%,对呕吐毒素的降解率达5.81%。降解率的计算方式 为(霉菌毒素添加量-霉菌毒素残留量)/霉菌毒素添加量×100%。
实施例3异常威克汉姆酵母Y4的生长曲线测定
生长曲线代表了菌株在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死 亡全过程的动态变化。将异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540按 10%(v/v)的接种量,接种到YPD培养基中,30℃培养46小时,以 不加菌液的YPD培养基作为空白对照,每隔2-6小时测定OD600值,从而计算活菌数。实验设三次重复,结果取其平均值,记录数据并绘 制生长曲线。如图6所示,在0-18小时,异常威克汉姆酵母Y4处于 对数生长阶段,繁殖速率较高。在18-46小时异常威克汉姆酵母Y4 数目趋于稳定。46小时以后进入生长率下降阶段。
实施例4异常威克汉姆酵母Y4制剂的制备
1.发酵培养基配方:甘蔗糖蜜15%、硫酸铵1%、无水氯化钙 0.008%、磷酸二氢钾0.15%、酵母膏0.16%、硫酸镁0.15%、消泡剂 0.05%,加水充分溶解,控制pH在6.5制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时,接种菌龄24小时的菌液5% (v/v)。
4.在30℃条件下,保持转速500rpm搅拌,发酵培养24小时,放 罐,得到异常威克汉姆酵母的活菌数大于2.0×1011cfu/ml,出芽率达 95%以上。
5.将菌泥放入高压均质机进行细胞壁破碎,然后放入低温真空干 燥箱内干燥,过筛,收集产品,得到异常威克汉姆酵母制剂。
实施例5异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540制剂的安全性评 价
本实施例以小鼠作为实验动物,采用灌胃试验的方法,评价异常 威克汉姆酵母的安全性,具体方法如下:
1.实施例4方法制得的异常威克汉姆酵母Y4菌剂的冻干粉,经 平板计数测定,其异常威克汉姆酵母Y4菌数为1.9×1010cfu/g。
2.选取6周龄左右的小鼠72只,随机分为4组(A组为对照组 灌服无菌生理盐水,B组为高剂量组按照1.9×1010cfu/只的量灌服菌 液,C组为中剂量组按照1.9×109cfu/只的量灌服菌液,D组为低剂量 组按照1.9×108cfu/只的量灌服菌液),每组3个重复,每个重复6只 鼠。
3.每天上午九点灌胃一次,连续灌服21天。实验鼠房控制温度 湿度恒定,自然光照,小鼠自由采食、饮水,每7天清扫鼠笼一次。 实验过程中,每天观察并记录小鼠的状态,存活情况,有无临床异常 症状等。检测指标如下:
1.于实验结束当天采用心脏取血的方式,取得实验小鼠血液样 品,经静止离心后获得血清,用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密 度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死 因子等血液生化指标。
2.取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重,分别计算心脏指数 =(心脏湿重/体重)×100%、肝脏指数=(肝脏湿重/体重)×100%、 脾脏指数=(脾脏湿重/体重)×100%、肾脏指数=(肾脏湿重/体重) ×100%。
3.取各组实验鼠的空肠、回肠、结肠、肝脏、脾脏、肺组织于4% 的多聚甲醛中固定,经脱水、包埋等步骤制成切片,通过苏木精伊红 染色的方法观察形态的变化,结果见图7。
表2不同处理组小鼠存活情况
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A组 |
B组 |
C组 |
D组 |
7天 |
存活 |
存活 |
存活 |
存活 |
14天 |
存活 |
存活 |
存活 |
存活 |
21天 |
存活 |
存活 |
存活 |
存活 |
从表2可以看出,使用异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540 给小鼠灌胃21天后,实验各处理组小鼠均存活,说明上述异常威克 汉姆酵母对动物安全。
表3不同处理组小鼠的脏器系数
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A组 |
B组 |
C组 |
D组 |
心脏 |
0.59 |
0.62 |
0.62 |
0.64 |
肝脏 |
5.51 |
5.52 |
5.55 |
5.43 |
脾脏 |
0.44 |
0.41 |
0.40 |
0.42 |
肾脏 |
1.32 |
1.34 |
1.33 |
1.35 |
从表3可以看出,处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显 变化,说明上述异常威克汉姆酵母没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、 低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等,结 果均显示正常,说明本发明实施例4提供的异常威克汉姆酵母制剂对 小鼠的生理指标不构成影响。
实施例6异常威克汉姆酵母Y4发酵饲料的制备
1.发酵底物配方:85%的小麦麸,5%的玉米粉,10%的豆粕,加 水50%,搅拌混匀。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵底物降温至30℃时,接种菌龄24小时的菌液25%(v/v), 搅拌混匀,用纱布封口。
4.在30℃条件下,静态发酵,培养120小时,得到异常威克汉姆 酵母发酵饲料。
5.利用气相色谱法测定异常威克汉姆酵母发酵饲料中乙酸乙酯 的含量,气相色谱条件:初始温度为50℃,保持2min后,以4℃每 分钟的速率升至230℃,保持15min。进样口和检测口温度均为250℃, 载气为氦气,流速为2ml/min。
6.发现在发酵120小时后,乙酸乙酯的含量为7.8g/L。
实施例7异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540制剂的应用
本实验选取28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪72头,实验期45 天,按照随机区组设计分为2个组,每组6个重复,每个重复6头猪。 A组为对照组(基础日粮组),B组为处理组(基础日粮中添加250g/t 的实施例4制得的异常威克汉姆酵母制剂,有效活菌数为 1.9×1010cfu/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内,温度控制在25-27℃, 自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素,仔猪免疫按照常规免 疫程序进行。
测定指标:各处理组断奶仔猪的生产性能,具体包括以下指标:
1.每天记录仔猪的采食量,试验结束后计算平均日采食量;
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重,计算平均日增重;
3.通过a、b的试验结果计算料肉比,其计算方式为平均日采食 量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况,计算断 奶仔猪腹泻率,腹泻率(%)=(腹泻头数×腹泻天数)/(猪只数×试 验天数)×100%。
表4基础日粮中添加异常威克汉姆酵母制剂对 断奶仔猪生产性能及腹泻率的影响
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平均日采食量(kg) |
平均日增重(kg) |
料肉比 |
腹泻率(%) |
A组 |
0.476 |
0.348 |
1.368 |
2.3 |
B组 |
0.492 |
0.378 |
1.302 |
1.1 |
从表4可以看出,处理组仔猪平均日采食量和平均日增重都显著 高于对照组(P<0.05),料肉比显著低于对照组(P<0.05),说明添 加异常威克汉姆酵母制剂的饲料效益更好。饲料中添加异常威克汉姆 酵母制剂的仔猪腹泻率显著降低(P<0.05),说明本发明的菌剂具有 降低断奶仔猪腹泻率的作用。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发 明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进, 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。