CN109609393B - 一种饲用异常威克汉姆酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种饲用异常威克汉姆酵母及其应用，本发明的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4，保藏编号为CGMCC NO.16540，该酵母菌能够耐100℃的高温、可在pH值1.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强，具有降解霉菌毒素的作用，同时具有产乙酸乙酯的作用，将异常威克汉姆酵母Y4制成饲料添加剂后用于饲喂动物效果安全可靠，在促进营养物质消化吸收，降低腹泻率，提高饲料转化效率，促进生长方面有积极作用。

Description

一种饲用异常威克汉姆酵母及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和饲用益生菌领域，具体地说，涉及一种具 有高产乙酸乙酯能力，且耐高温、耐酸、耐胆盐的饲用异常威克汉姆 酵母及其应用。
背景技术
随着畜禽养殖业的快速发展，饲料行业面临着数量与质量的双重 挑战。抗生素在饲料中的添加应用对集约化、规模化畜禽养殖的发展 作出了巨大贡献。然而，随着时间推移，抗生素的大量和不规范使用 又导致动物抗病力降低、致病菌耐药性增强、产品药物残留、食品安 全等问题的出现，严重制约了养殖业的发展。同时，养殖业快速发展， 对蛋白饲料的需求量越来越大。近年来，我国常规蛋白原料(鱼粉、 豆粕等)面临着依赖进口、价格高昂、质量参差不齐等问题。
酵母菌作为应用时间较长的益生菌具有稳定的繁殖性能，用于生 产发酵饲料及酵母源生物饲料都具有很好的应用前景。酵母菌是单细 胞真菌，具有典型的真核细胞结构，在自然界广泛存在。酵母细胞中 蛋白质占细胞干重的32％～75％，糖类物质占细胞干重的27％～63％。 酵母细胞中还富含维生素、多种消化酶和未知的生长因子。饲料酵母 含有动物生长发育所必需的各种营养物质，其中蛋白质含有20多种氨 基酸，含有8种生命必需氨基酸，含量与鱼粉很接近；同时含有极为 丰富的B族维生素，含量比鱼粉、肉粉高，因此饲料酵母可作为优质 蛋白质源部分或全部替代饲料中的鱼粉。利用酵母菌制作的发酵饲料，含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、维生素、 活性小肽、氨基酸、抑菌物质等，改善了动物饲料的品质和适口性， 消化吸收率明显提高，具有维持动物肠道菌群平衡、促进动物生长、 提高动物免疫力等作用。
因此获得新型具有益生特性的酵母菌的研究具有重大意义。分离 和筛选具有高产乙酸乙酯能力的酵母菌，可以更好的应用于饲料添加 剂以及生物饲料发酵领域。但异常威克汉姆酵母作为饲料添加剂或生 物饲料发酵菌种的研究与应用较少，具有很大的发展潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐高温、耐酸、耐胆盐且具有降解霉菌 毒素并产乙酸乙酯作用的饲用异常威克汉姆酵母及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomycesanomalus)是从北京市某养猪实验基地附近土壤 中筛选得到，命名为Y4。经18S RNA基因序列分析，该菌株Y4为 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。该菌株已于2018年9月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomyces anomalus)，保藏号为CGMCC No.16540。
异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的微生物 学特性为：细胞形态为椭圆形，长度约15-20μm，宽度约2-4μm；单 菌落大小为10-12mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面平滑，边 缘规则。菌体在80℃处理20min后存活率可达95％以上，100℃处理20min后存活率仍达90％以上，可在pH值1.0以上的酸性环境生长， 耐胆盐能力强。且具有一定的降解霉菌毒素的能力，其对伏马毒素的 降解率达到14.77％，对呕吐毒素的降解率达到5.81％。产乙酸乙酯的 能力，发酵120小时后乙酸乙酯产量达到7.8g/L。
本发明提供含有该异常威克汉姆酵母Y4的菌剂。
本发明还提供一种含有该异常威克汉姆酵母Y4的动物饲料添加 剂。该饲料添加剂含有的异常威克汉姆酵母Y4活菌数为1.9×108CFU/g～1.9×1012CFU/g；优选地，含有的异常威克汉姆酵母Y4 饲料添加剂的活菌数为1.9×109CFU/g～1.9×1011CFU/g。
本发明还提供一种含有该异常威克汉姆酵母Y4的动物饲料。其 中，所述动物饲料中异常威克汉姆酵母Y4的活菌数为1.9×107 CFU/kg～1.9×1011CFU/kg，优选1.9×108CFU/kg～1.9×109CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了异常威克汉姆酵母Y4的益生效果，结 果表明，异常威克汉姆酵母Y4能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的 内环境，具备益生菌的潜力。
本发明还发现异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素的能力， 因此本发明提供了含有异常威克汉姆酵母Y4的抑制霉菌毒素的药 物，以及提供了异常威克汉姆酵母Y4在降低食品或饲料中霉菌毒素 污染中的应用。
本发明实施例中，验证了异常威克汉姆酵母Y4对伏马毒素的降 解率达到14.77％，对呕吐毒素的降解率达到5.81％。本领域技术人员 能够基于本发明提供的异常威克汉姆酵母Y4，用于验证其对其他霉 菌毒素的降解效果，这不超出本领域技术人员的基本能力范围，因此 异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素并用于制备降解霉菌毒素的 药物、以及在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用均属于本发明 的保护范围。
进一步地，本发明提供了异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4或含有其的菌剂在制备添加剂或抑制霉菌毒素的药物 中的应用。
所述的添加剂为饲料添加剂或食品添加剂。
本发明还发现异常威克汉姆酵母Y4具有产乙酸乙酯的能力。本 发明实施例中，验证了异常威克汉姆酵母Y4在发酵120小时后，其乙 酸乙酯产量达7.8g/L。
本发明涉及的饲用异常威克汉姆酵母，由于出芽生殖的方式对干 燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它 作为益生菌的潜力。本发明进一步验证了异常威克汉姆酵母Y4在断 奶仔猪饲料添加中的应用效果，发现该菌株具有降低断奶仔猪腹泻率 提高饲料转化率的作用。表明异常威克汉姆酵母Y4可作为一种新型 的益生菌添加剂，广泛应用于饲料和食品中。本发明筛选得到的异常 威克汉姆酵母Y4具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化 吸收；增强动物的免疫功能，增加采食量，提高日增重，降低料肉比； 无污染，无残留，生物环保等特点，在促进动物生长和提高动物体重 方面具有显著的效果。
附图说明
图1为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540的菌落形态图。
图2为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540在光学显微镜下的美蓝染色图。
图3为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540在光学显微镜下的革兰氏染色形态图。
图4为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540的耐酸性检测结果。
图5为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540的耐胆盐检测结果。
图6为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540的生长曲线。
图7为利用异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4 CGMCC No.16540进行小鼠灌胃实验后的组织学形态图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配置方法如下：YPD 培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，溶解于900ml蒸馏水，葡萄糖 20g，溶解于100ml蒸馏水，高压灭菌后混合。
实施例1异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的分 离与鉴定
一、菌株Y4的鉴定
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学西校区养猪基地附近的土壤样 品装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释 液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释 液各1ml涂布于YPD培养基上。30℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的美蓝染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落(菌落形态 图见图1)在水中溶解，加入美蓝染液1滴，盖上盖玻片；在普通光 学显微镜上观察，若菌体呈透明样则为活菌，菌体呈蓝色则判定菌体 已经死亡，半小时后再次观察，结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进 行下一步芽孢染色实验。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落(菌落形态 图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶 紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗， 自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50S，水洗，自然晾干；在普通光 学显微镜上观察，菌体呈紫色便于观察其出芽情况，结果见图3。
通过步骤1-3的分离筛选，得到一株通过出芽生殖的方式进行繁殖的菌株，将该菌株编号为Y4。
二、菌株Y4的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株Y4进行单菌落状态描 述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘 状态。所得单菌落大小为10-12mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落 表面平滑，边缘规则。
其次对处于对数生长期的菌株Y4进行染色，采用光学显微镜观 察菌体形态。分离并筛选到的菌株Y4，革兰氏染色呈紫色，细胞形 态为椭圆形，长度约15-20μm，宽度约2-4μm。
2.18S RNA序列同源性分析
菌株总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的基因组DNA 提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司 进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对， 确定菌株类别为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。
上述实验结果表明，该菌株为异常威克汉姆酵母。该菌株已于 2018年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，保藏号为CGMCC No.16540。
实施例2异常威克汉姆酵母Y4的抗逆性检测
1.耐热性检测：将异常威克汉姆酵母Y4(CGMCC No.16540)菌 液至于水浴锅内20分钟，分别用60℃、80℃、100℃处理，每个处 理3个重复，处理结束后采用倾注法测定其活菌数。
异常威克汉姆酵母Y4CGMCC No.16540在60℃处理20分钟后， 存活率可达99％，80℃处理20分钟后可达95％以上，100℃处理20 分钟后仍可达到90％以上。
2.耐酸性检测：将异常威克汉姆酵母Y4分别接种到pH值为2.0、 3.0、4.0的YPD培养基中，分别在1h、2h、3h、4h采用平板倾注法 测定其活菌数。
异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540能够在pH为4的环境 中正常生长，结果见图4。当pH为1、2、3时，在接种活菌4小时 后，活菌数量与接种时相比有所上升，说明异常威克汉姆酵母Y4具 有在pH最低为1的环境下繁殖的能力，但相对pH为4的环境来说 繁殖速度较低，该菌种对酸性环境有一定的耐受能力。结果提示异常 威克汉姆酵母Y4可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测：将活化好的异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取 1ml稀释液放于无菌培养皿里，做6个重复，然后用含不同浓度牛胆 酸钠(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)的YPD培养基倾注平板，30℃培 养4小时，每隔1小时菌落计数，同时用不含牛胆酸钠的YPD培养 基倾注平板，30℃培养48小时，菌落计数，作为对照组，见图5， 结果显示不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长普遍呈下降趋势。 0.1％的胆盐作用对异常威克汉姆酵母Y4的影响比较微弱，几乎不影 响其正常生长。在0.2％和0.3％的胆盐作用4小时后，活菌数平均仍 然可以保持在10lg cfu/ml，在0.4％的胆盐作用4小时后，活菌数平 均为9.11lg cfu/ml，半数以上的异常威克汉姆酵母Y4在0.4％的胆盐 下存活，说明异常威克汉姆酵母Y4的耐胆盐能力较强。
4.抗生素敏感性检测：将适宜浓度的异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540涂布于YPD培养基上，每个培养皿中均匀的贴附 4个药敏纸片，培养36小时，观察抑菌圈大小。
表1异常威克汉姆酵母Y4对不同抗生素敏感性结果
Figure BDA0001918908210000071
Figure BDA0001918908210000081
这一结果表明，异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540并不具 有良好的耐药性，因此作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
5.异常威克汉姆酵母Y4对霉菌毒素的降解效果实验
将异常威克汉姆酵母分别接种在2ml含有40μg/ml呕吐毒素及 2ml含有40μg/ml伏马毒素的液体培养基中，适宜环境下培养3天， 扩大浓度到60μg/ml进行重复试验，3天后采用高效液相色谱方法检 测培养基中呕吐毒素和伏马毒素的浓度，均出现不同程度的下降，表 明异常威克汉姆酵母Y4具有降解霉菌毒素的能力。其对伏马毒素的 降解率达14.77％，对呕吐毒素的降解率达5.81％。降解率的计算方式 为(霉菌毒素添加量-霉菌毒素残留量)/霉菌毒素添加量×100％。
实施例3异常威克汉姆酵母Y4的生长曲线测定
生长曲线代表了菌株在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死 亡全过程的动态变化。将异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540按 10％(v/v)的接种量，接种到YPD培养基中，30℃培养46小时，以 不加菌液的YPD培养基作为空白对照，每隔2-6小时测定OD600值，从而计算活菌数。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘 制生长曲线。如图6所示，在0-18小时，异常威克汉姆酵母Y4处于 对数生长阶段，繁殖速率较高。在18-46小时异常威克汉姆酵母Y4 数目趋于稳定。46小时以后进入生长率下降阶段。
实施例4异常威克汉姆酵母Y4制剂的制备
1.发酵培养基配方：甘蔗糖蜜15％、硫酸铵1％、无水氯化钙 0.008％、磷酸二氢钾0.15％、酵母膏0.16％、硫酸镁0.15％、消泡剂 0.05％，加水充分溶解，控制pH在6.5制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时，接种菌龄24小时的菌液5％ (v/v)。
4.在30℃条件下，保持转速500rpm搅拌，发酵培养24小时，放 罐，得到异常威克汉姆酵母的活菌数大于2.0×1011cfu/ml，出芽率达 95％以上。
5.将菌泥放入高压均质机进行细胞壁破碎，然后放入低温真空干 燥箱内干燥，过筛，收集产品，得到异常威克汉姆酵母制剂。
实施例5异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540制剂的安全性评 价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价异常 威克汉姆酵母的安全性，具体方法如下：
1.实施例4方法制得的异常威克汉姆酵母Y4菌剂的冻干粉，经 平板计数测定，其异常威克汉姆酵母Y4菌数为1.9×1010cfu/g。
2.选取6周龄左右的小鼠72只，随机分为4组(A组为对照组 灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照1.9×1010cfu/只的量灌服菌 液，C组为中剂量组按照1.9×109cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量 组按照1.9×108cfu/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复6只 鼠。
3.每天上午九点灌胃一次，连续灌服21天。实验鼠房控制温度 湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。 实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常 症状等。检测指标如下：
1.于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样 品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密 度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死 因子等血液生化指标。
2.取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算心脏指数 ＝(心脏湿重/体重)×100％、肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％、 脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％、肾脏指数＝(肾脏湿重/体重) ×100％。
3.取各组实验鼠的空肠、回肠、结肠、肝脏、脾脏、肺组织于4％ 的多聚甲醛中固定，经脱水、包埋等步骤制成切片，通过苏木精伊红 染色的方法观察形态的变化，结果见图7。
表2不同处理组小鼠存活情况
A组 B组 C组 D组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
从表2可以看出，使用异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540 给小鼠灌胃21天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述异常威克 汉姆酵母对动物安全。
表3不同处理组小鼠的脏器系数
A组 B组 C组 D组
心脏 0.59 0.62 0.62 0.64
肝脏 5.51 5.52 5.55 5.43
脾脏 0.44 0.41 0.40 0.42
肾脏 1.32 1.34 1.33 1.35
从表3可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显 变化，说明上述异常威克汉姆酵母没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、 低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等，结 果均显示正常，说明本发明实施例4提供的异常威克汉姆酵母制剂对 小鼠的生理指标不构成影响。
实施例6异常威克汉姆酵母Y4发酵饲料的制备
1.发酵底物配方：85％的小麦麸，5％的玉米粉，10％的豆粕，加 水50％，搅拌混匀。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵底物降温至30℃时，接种菌龄24小时的菌液25％(v/v)， 搅拌混匀，用纱布封口。
4.在30℃条件下，静态发酵，培养120小时，得到异常威克汉姆 酵母发酵饲料。
5.利用气相色谱法测定异常威克汉姆酵母发酵饲料中乙酸乙酯 的含量，气相色谱条件：初始温度为50℃，保持2min后，以4℃每 分钟的速率升至230℃，保持15min。进样口和检测口温度均为250℃， 载气为氦气，流速为2ml/min。
6.发现在发酵120小时后，乙酸乙酯的含量为7.8g/L。
实施例7异常威克汉姆酵母Y4 CGMCC No.16540制剂的应用
本实验选取28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪72头，实验期45 天，按照随机区组设计分为2个组，每组6个重复，每个重复6头猪。 A组为对照组(基础日粮组)，B组为处理组(基础日粮中添加250g/t 的实施例4制得的异常威克汉姆酵母制剂，有效活菌数为 1.9×1010cfu/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内，温度控制在25-27℃， 自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素，仔猪免疫按照常规免 疫程序进行。
测定指标：各处理组断奶仔猪的生产性能，具体包括以下指标：
1.每天记录仔猪的采食量，试验结束后计算平均日采食量；
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重，计算平均日增重；
3.通过a、b的试验结果计算料肉比，其计算方式为平均日采食 量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况，计算断 奶仔猪腹泻率，腹泻率(％)＝(腹泻头数×腹泻天数)/(猪只数×试 验天数)×100％。
表4基础日粮中添加异常威克汉姆酵母制剂对 断奶仔猪生产性能及腹泻率的影响
平均日采食量(kg) 平均日增重(kg) 料肉比 腹泻率(％)
A组 0.476 0.348 1.368 2.3
B组 0.492 0.378 1.302 1.1
从表4可以看出，处理组仔猪平均日采食量和平均日增重都显著 高于对照组(P<0.05)，料肉比显著低于对照组(P<0.05)，说明添 加异常威克汉姆酵母制剂的饲料效益更好。饲料中添加异常威克汉姆 酵母制剂的仔猪腹泻率显著降低(P<0.05)，说明本发明的菌剂具有 降低断奶仔猪腹泻率的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4，保藏编号为CGMCC NO.16540。
2.含有权利要求1所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的菌剂。
3.含有权利要求1所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的饲料添加剂、动物饲料或食品。
4.含有权利要求1所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4的药物。
5.权利要求1所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4或权利要求2所述的菌剂在制备添加剂或抑制霉菌毒素的药物中的应用；所述霉菌毒素为伏马毒素、呕吐毒素。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的添加剂为饲料添加剂或食品添加剂。
7.权利要求1所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y4或权利要求2所述的菌剂在增加动物采食量方面、提高饲料转化率、促进动物生长或提高动物体重方面的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Antifungal activity and expression patterns of extracellular chitinase and β-1,3-glucanase in Wickerhamomyces anomalus EG2 treated with chitin and glucan;Sin-HyoungHong等;《Microbial Pathogenesis》;20170930;第110卷;第159-164，参见全文 *
Isolation and characterization of gluten-degrading Enterococcus mundtii and Wickerhamomyces anomalus, potential probiotic strains from indigenously fermented sourdough (Khamir);Hafiz ArbabSakandar等;《LWT》;20180531;第91卷;第271-277页，参见全文 *

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