CN109984249A - 一种发酵免疫增强剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药生物制剂技术领域，特别涉及一种发酵免疫增强剂，使用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌发酵党参多糖得到。发酵免疫增强剂能单独或协同PHA促进猪外周血淋巴细胞增殖，显著增强体外免疫活性，有效刺激淋巴细胞增殖，能增强粘膜屏障和调整肠道菌群，降低多种病原微生物的易感率。

Description

一种发酵免疫增强剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药生物制剂技术领域，特别涉及一种发酵免疫增强剂，还涉及所述发酵免疫增强剂的制备方法和应用。

背景技术

目前国内外对中兽药的研究水平都非常低，所应用的中药存在着剂型单一、质量粗糙、用药量大、成本高、使用不方便等许多缺点。例如其制剂形式主要停留在中药粗粉及中药浸提水平上，大大限制了中药在防治动物疾病方面的规模化应用。而将“微生物发酵手段”应用到中药制药上来，开创现代中药发酵制药技术是发展的必然趋势。传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的，而现代中药发酵制药是在继承传统的中药发酵制药的基础上，吸取现代微生态学研究的成果，结合现代生物工程发酵技术而形成的高科技中药制药新技术。它以优选的有益菌作为菌种，在无菌条件下，按照现代发酵工艺制成产品，其中既含有中药有效成分，又含有菌体及其代谢产物。中药经过微生物发酵后，有效成分含量升高，药效增强，并且可以明显降低中药的用药量，这为中药在养殖业的大量应用找到了一条很好的出路，降低了养殖业的用药成本，具有重要的经济价值和现实意义。中药党参为桔梗科植物党参、素花党参或川党参的干燥根，研究表明党参具有增强免疫、抗肿瘤和抗氧化等作用。党参多糖是党参的有效成分之一，具有明显的免疫增强作用。

益生菌是指某种微生物制剂或发酵制品能通过调节宿主黏膜与系统免疫功能、通过改善肠道营养与菌群平衡对宿主产生有益的生理作用或通过定殖于宿主改变宿主某一部位菌群的组成，从而有利于宿主健康的单一微生物或组成明确的混合微生物。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌与其它微生物制成的益生菌制品的不同表现在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以在条件不利的情况下形成休眠体芽孢，因此在通过动物胃酸环境过程中的稳定性相对较高。这些休眠体芽孢进入动物体内会在肠道内对厌氧环境的维持很有帮助；同时，枯草芽孢杆菌能产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶类，这些酶有助于动物体对植物性饲料中某些复杂化合物的消化。

中医学和微生态学在理论和实践中均有许多相通之处，比如对机体的生态平衡，他们虽从不同角度进行认识，但其看法是一致的，均从生物整体来进行认识，强调辨证论治，这些相通之处预示着两者之间有着必然的联系。随着微生态学的发展，人们逐渐认识到生物体内的微生态系对口服中药药理作用的发挥有着重要的作用，同时中药又有助于维持微生态系的平衡，二者间不仅在理论上有共通性，而且在预防、治疗疾病的过程中相互作用。益生菌可以促进中药的吸收和利用,中药可以促进益生菌的增殖,实践证明中药和益生菌在防病促生长方面是相辅相成的。

CN 104013650 A公开了一种广泛的应用于微生物技术领域中的地衣芽孢杆菌与中药多糖组合物及其制剂，包括地衣芽孢杆菌、中药多糖、辅料，地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌CMCC63516活菌粉，地衣芽孢杆菌CMCC63516活菌粉与中草药提取物的质量比为1：1.25-25，中药多糖是枸杞多糖、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖、刺五加多糖中的一种；所述中药多糖中的多糖含量为70％-95％；在耗氧和厌氧状态下，每种中药多糖对地衣芽孢杆菌都具有增殖作用，且每种中药多糖对地衣芽孢杆菌的增殖作用与种子培养基中的添加量有关；将该组合物制备成口服制剂，制备成普通片剂。该发明地衣芽孢杆菌与中药多糖组合物在耗氧和厌氧条件下都能够促进地衣芽孢杆菌显著增殖，增强其恢复肠道菌群平衡能力，迅速提高肠道定植抗力，组合物在治疗腹泻等肠道疾病时起效更快，疗程更短。但此组合物中中药多糖仅仅是促进菌种增值的作用，所发挥的作用并没有完全挖掘出来，仍然有很大的研究空间。

发明内容

为了解决以上现有技术中党参多糖提取液中多糖含量低，及有益生菌在中药中的增殖技术，本发明提供了一种可以在中药提取物党参多糖中发酵枯草芽孢杆菌制备的一种发酵免疫增强剂，不仅可在党参多糖提取液中快速、高效地增殖枯草芽孢杆菌，还通过发酵过程显著提高党参多糖的含量。

本发明还提供了所述一种发酵免疫增强剂的制备方法。

本发明还提供了所述一种发酵免疫增强剂的应用。

一种发酵免疫增强剂，是通过以下步骤得到的：

将含有枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的种子液，加入含有党参多糖的培养基中进行培养，得到混合培养物，离心后加入载体，干燥粉碎即得。

所述的发酵免疫增强剂，种子液中菌液浓度为0.5×10⁸-1.0×10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌落比例为8-10：1。

所述的发酵免疫增强剂，培养基中含有高温豆饼粉1.8-3.5％、尿素0.1-0.3％、玉米浆0.1-0.5％、玉米淀粉0.5-1.0％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、硫酸镁0.1-0.3％、硫酸锰0.01-0.05％。

所述的发酵免疫增强剂，种子液按2％的比例加入到培养基，调控pH值在6.5-7.0，通气，搅拌，控制溶氧20-50％，37℃培养18-24小时，得到混合培养物。

所述的发酵免疫增强剂，将混合培养物利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5％，粉碎过100目钢筛，即得。

所述的发酵免疫增强剂，培养结束后，培养基中的溶氧为零，活菌总数为0.5×10⁹-2.5×10⁹CFU/mL。

所述的发酵免疫增强剂用于畜禽养殖上饲料或饮水添加剂。

所述的应用，所述的发酵免疫增强剂以5％比例混入饲料中，或100倍稀释后加入饮水中。

采用酶联免疫法检测发酵免疫增强剂发酵前后成分的变化：中药中的一些成分经过发酵后含量增加1～4倍。并且在发酵后的图谱中产生了某些新的特征吸收峰，同时发酵前的几个特征吸收峰消失了。表明中药制剂经过发酵后成分发生了变化，一些原有的成分含量提高了，同时增加了某些新的药物成分。

饲喂仔猪试验对发酵前后的党参多糖增免剂的效能进行比较：试验结果显示，发酵免疫增强剂组的仔猪血清中PRRSV抗体效价、免疫器官指数高于未发酵制剂组差异显著(P<0.05)，且饲料利用率比未发酵制剂组明显提高，有显著差异(P<0.05)。表明党参多糖经过微生物发酵后应用效果优于未发酵的制剂。

采集健康猪肺脏分离PAM(猪肺泡巨噬细胞)，提取RNA，通过RT-PCR扩增获得pCD163基因。然后将该基因插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163。将该质粒转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选。采用有限稀释法获得单克隆细胞并扩大培养，IFA、Western blot鉴定获得的细胞系，通过pCD163-MARC与CN103525773A中的细胞系对PRRSV增殖的差异比较试验，证实pCD163-MARC细胞系增殖PRRSV的优势。

本发明发酵免疫增强剂有效提高仔猪对PRRSV疫苗的免疫效果，可显著增强仔猪免疫力，有利于畜牧业生产。

我们研发的发酵免疫增强剂是一种新型天然中药制剂，该制剂研制将部分替代抗生素的使用，产生的经济、社会及生态效益不可估量，有利于推进中药现代化和国际化进程，提高我国中药行业的国际竞争力。

本发明的有益效果：

(1)发酵免疫增强剂能单独或协同PHA促进猪外周血淋巴细胞增殖，显著增强体外免疫活性，

(2)本产品有效刺激淋巴细胞增殖，能增强粘膜屏障和调整肠道菌群，降低多种病原微生物的易感率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：发酵免疫增强剂的制备

将含有枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的种子液，种子液中菌液浓度为0.5×108CFU/mL，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌落比例为10：1，加入含有党参多糖的培养基中进行培养，培养基中含有高温豆饼粉1.8％、尿素0.3％、玉米浆0.1％、玉米淀粉1.0％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.05％，种子液按2％的比例加入到培养基，调控pH值在6.5，通气，搅拌，控制溶氧0％，37℃培养18小时，得到混合培养物，培养结束后，培养基中的溶氧为零，活菌总数为0.5×109CFU/mL。。将混合培养物利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5％，粉碎过100目钢筛，即得。

实施例2：发酵免疫增强剂的制备

将含有枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的种子液，种子液中菌液浓度为1.0×108CFU/mL，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌落比例为8：1，加入含有党参多糖的培养基中进行培养，培养基中含有高温豆饼粉3.5％、尿素0.1％、玉米浆0.5％、玉米淀粉0.5％、磷酸氢二钾0.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.3％、硫酸锰0.01％，种子液按2％的比例加入到培养基，调控pH值在7.0，通气，搅拌，控制溶氧20％，37℃培养24小时，得到混合培养物，培养结束后，培养基中的溶氧为零，活菌总数为2.5×109CFU/mL。。将混合培养物利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5％，粉碎过100目钢筛，即得。

对比实施例1：

同实施例1相比，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌落比例为5：1，其余同实施例1相同。

对比实施例2：

同实施例1相比，不添加酿酒酵母菌，其活菌菌落用枯草芽孢杆菌替换，其余同实施例1相同。

实施例3：稳定性和安全性测试

本实验在发酵免疫增强剂质量标准的基础上，为考察发酵免疫增强剂化学或物理性质在温度、湿度、光线的影响下随时间的变化规律，进行加速试验、光加速试验，预测的稳定性，为新兽药申报生产、包装、运输及贮存条件提供科学依据。

1.材料与方法

1.1.材料

1.1.1.发酵免疫增强剂三批供试品

本品为浅黄色液体，多糖含量不低于96％，pH 5.0～7.2，密度不低于1.00g/mL。

1.1.2.主要试剂

标准葡萄糖溶液、5％苯酚溶液、30％硫酸锌试液、15％亚铁氰化钾试液、浓硫酸。

1.1.3.主要仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PHSJ-4A型实验室pH计，上海精密科学仪器有限公司；日本岛津LC-10ATvp、酶联免疫仪、SPD-10Avp可见紫外检测器、GSP-781型隔水式电热恒温培养箱、N-1330照度计、MP500B电子天平、MettlerAE-240分析天平。

1.2.方法

1.2.1.发酵制剂中活菌稳定性的测定

将发酵罐生产的枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌发酵液密封室温保存，保存前用平板菌落计数法检测每mL发酵液中的活菌数，并做好记录。分别在存放后的第1、3、5个月时，测定保存样品中的枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的数目，以测定发酵液中活菌的稳定性。

1.2.2.发酵制剂安全性的测定

1.2.2.1.存放1个月发酵制剂安全性的测定

分别选择35、45、55日龄健康断奶仔猪各10头，将发酵液原液，让主自由饮用，连续应用5天，每天观察猪健康状况，记录死亡情况。

1.2.2.2.存放3个月发酵制剂安全性的测定

操作同上。

1.2.2.3.存放5个月发酵制剂安全性的测定

操作同上。

2.结果

2.1.发酵制剂活菌稳定性测定结果

将刚培养好的发酵液用平板菌落计数法测定每mL中的活菌数，结果为1.98×109cfu/mL，存放1、3、5个月时的测数结果分别为：1.90×10⁹cfu/mL、1.91×10⁹cfu/mL、1.88×10⁹cfu/mL，存活率分别为95.96％、96.46％、94.95％。由以上数据可知，在发酵制剂制成后，存放5个月，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的有效活菌数仍然较高，存活率在95％左右，表明发酵制剂中有效活菌含量比较稳定。

2.2.发酵制剂安全性的测定结果

将保存不同时间的发酵制剂原液，应用于不同日龄断奶仔猪，结果表明，每一个试验组的猪生长正常，没有出现死亡的情况。存放5个月后，原液给猪使用，不会造成中毒死亡，表明发酵制剂安全性较高。

对发酵制剂安全性进行测定，结果表明，试验期内动物存活率为100％，安全性较高。一方面原因可能是党参多糖、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌本身没有毒副作用或副作用较小，另一方面也说明发酵制剂本身在进行分装过程中没有受到污染，或有害菌含量较低。

实施例4：应用

1.实验材料与方法

1.1试剂与仪器

青链霉素液：将青链霉素用PBS配制成含青、链霉素各1万单位，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

RPMI1640培养液：RPMI1640培养液，Gibco公司产品，按说明书用三蒸水配制后过滤除菌，分装，加入双抗(青、链霉素各100IU·100mL-1)，4℃保存备用，临用前加入10％的小牛血清作为细胞生长液。

小牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，56℃30min灭活，分装，-20℃保存备用。

RNase A：称取RNase A 1mg，加入1mL PBS，溶解后100℃水浴15min，-20℃保存备用。

碘化丙啶(PI)：称取PI 1mg，EDTA.2Na 0.7mg，Triton X-100 20μL，加入PBS10mL，-20℃保存备用。

anti-CD4-FITC抗体，批号：H4809-MM62B，美国SBA公司。

anti-CD8-PE抗体，批号：G149-X523，美国SBA公司。

CO2培养箱MC0175，日本Sanyo公司；

FACSCanto流式细胞仪，美国BD公司；

Multiskan FC型酶标仪，上海沃元科技有限公司；

75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；

96孔微量血凝板，海门市三和华兴实验玻璃仪器厂；

洁净工作台SW-CJ-1FD，江苏安泰空气技术有限公司；

XD-101型倒置生物显微镜，南京江南永新光学有限公司；

离心机，湘仪TGL-16M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

24孔细胞培养板、96孔细胞培养板，海门市三和华兴实验玻璃仪器厂

1.2药物来源实施例1制备得到的发酵免疫增强剂。

1.3试验动物试验用健康断奶肉仔猪购自山东六合集团。上猪前一周，用福尔马林+高锰酸钾(2/1)熏蒸消毒，进猪前2天进行通风、火碱消毒、再通风，保持猪舍清洁无异味。温度保持在25～26℃，并根据外界环境及仔猪的反应，随机调节室内温度。采用自由采食、饮水，并记录每日喂料量、撒料量、各组死亡数等。免疫程序为35日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗皮下注射。饲养试验期为42d。

1.4动物分组及处理为了研究发酵免疫增强剂对肉仔猪生产性能及免疫功能的影响，并确定其最适添加量。选取35日龄健康断奶肉仔猪49头，随机分为7个试验组，设未发酵党参多糖对照组，免疫对照组(NA)，空白对照组(BC)，Lev对照组，对比实施例1的发酵免疫增强剂组(试验I组)，实施例1的发酵免疫增强剂组(试验II组)，对比实施例2的发酵免疫增强剂组(试验III组)。试验I、II、III组饲养全程只用发酵液(饮水给药)，对照组按场内正常保健程序进行保健。分别于首次免疫后第7、14、21、28d翼静脉采血检测血清HI抗体效价，心脏采血测定外周血T淋巴细胞增殖、细胞周期、CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群的变化，处死仔猪后称取胸腺、脾脏和胰腺的重量，计算免疫器官指数。

1.5淋巴细胞增殖测定

7日龄仔猪，心脏采血15mL，利用肝素抗凝，将血样用Hank’s液稀释1倍，混匀后小心加至淋巴细胞分离液的上层，2 000rpm离心20min，吸取中间云雾状白细胞层，用Hank's液洗2遍，1 500rpm离心15min。细胞计数活细胞大于90％后，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为每mL 1.5×106个，一半加入PHA(终浓度为10μg·mL-1)，一半不加PHA，分别加入到96孔细胞培养板中，每孔80μL，再加20μL RPMI1640补足到100μL，然后每孔加入各浓度的多糖100μL，每个样品重复4孔，另设细胞对照孔(CC)和PHA对照孔(PC)，38.5℃、5％CO2条件下培养44h，取出后每孔加入MTT 30μL，继续培养4h后，每孔加裂解液DMSO 100μL，将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光值(A570值)，作为T淋巴细胞增殖的指标。当试验组A570值显著大于对照组时，表明多糖显著促进T淋巴细胞增殖。综合评价，与党参多糖作比较，发酵免疫增强剂能单独或协同PHA促进猪外周血淋巴细胞增殖，显著增强体外免疫活性。结果见表1。

表1对淋巴细胞增殖的影响

(A570值)

1.6猪血清PRRSV抗体效价测定

翼静脉采血1mL，置37℃，待血清析出后，用竞争ELISA试验测定PRRSV抗体滴度。

1.7淋巴细胞周期的测定心脏采血，收集淋巴细胞，1000rpm.min-1离心5min，PBS洗涤2次，70％预冷的乙醇固定，-20℃固定24h以上PBS洗涤2次，加入500μL缓冲溶液，加入终浓度为0.25mg.mL-1的RNaseA，37℃水浴30min之后，然后加入终浓度为50μg.mL-1的PI染液，4℃避光孵育30min。在流式细胞仪上检测各个时间点细胞的周期分布情况。

1.8 CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群的测定心脏采血，收集淋巴细胞，1000rpm.min-1离心5min，PBS洗涤2次，100μL重悬细胞，各管加入anti-CD4-FITC和anti-CD8-PE抗体，避光孵育30min。PBS洗涤1次，流式细胞仪检测。

1.9免疫器官指数首次免疫后第7、14、21、28d，每组随机选取三头仔猪称重，杀死后将免疫器官胸腺、脾脏和胰腺立即切除并称重。免疫器官指数的计算根据以下公公式：免疫器官指数(mg/g)＝(免疫器官的重量)/体重

2.结果

2.1外周血T淋巴细胞增殖的变化

见表2。在免疫后所有时间点，试验I、II、III和党参多糖对照组的A570值均显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。

表2外周血T淋巴细胞增殖的变化

(A570值，n＝30)

组别Group	7d	14d	21d	28d
					试验Ⅰ	0.231±0.009<sup>b</sup>	0.233±0.034<sup>ab</sup>	0.271±0.022<sup>a</sup>	0.245±0.045<sup>ab</sup>
试验Ⅱ	0.237±0.006<sup>a</sup>	0.241±0.014<sup>a</sup>	0.274±0.023<sup>a</sup>	0.272±0.039<sup>a</sup>
					试验Ⅲ	0.226±0.010<sup>bc</sup>	0.238±0.011<sup>bc</sup>	0.247±0.025<sup>b</sup>	0.243±0.032<sup>b</sup>
党参多糖	0.223±0.112<sup>c</sup>	0.245±0.112<sup>ab</sup>	0.252±0.129<sup>b</sup>	0.233±0.112<sup>c</sup>
					Lev	0.221±0.018<sup>c</sup>	0.232±0.014<sup>c</sup>	0.238±0.054<sup>c</sup>	0.234±0.021<sup>c</sup>
NA	0.167±0.031<sup>d</sup>	0.176±0.019<sup>d</sup>	0.187±0.036<sup>d</sup>	0.173±0.018<sup>d</sup>
					BC	0.156±0.014<sup>d</sup>	0.146±0.023<sup>e</sup>	0.172±0.021<sup>e</sup>	0.167±0.042<sup>e</sup>

免疫后第7-28d，试验I、II组的A570值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。试验III组和党参多糖对照组，分别在免疫后第21、28d和14、21d的A570值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。免疫后第7-28d，试验II组的A570值均显著高于Lev对照组、试验I组、试验III组和党参多糖对照组(P<0.05)。因此，在促进淋巴细胞增殖方面，试验II组的效果较稳定，添加量比较合适。

2.2血清ND-HI抗体效价变化

见表3。免疫后所有时间点，试验I、II、III和党参多糖对照组的抗体效价显著高于无佐剂组(P<0.05)；试验I、II组的抗体效价显著高于Lev对照组。

表3血清ND-HI抗体效价的变化

Log₂，n＝6

免疫后第21、28d，试验I、II的抗体效价显著高于试验III和党参多糖对照组组(P<0.05)；试验II组的抗体效价最高，其次为试验I组。因此，在提高PRRS疫苗抗体方面，试验II组效果最好。

2.3猪外周血淋巴细胞周期的影响

见表4。免疫后第7-28d，与Lev对照组相比较，试验I、II组G0/G1期细胞的百分比明显降低(P<0.05)，处于S期和G2/M期的细胞百分比明显增多(P<0.05)。与党参多糖组相比较，试验I、II组免疫7、21和28d，试验III组在免疫28d后G0/G1期细胞的百分比明显降低，S期细胞百分比明显增多(P<0.05)。

表4在不同时间点对猪淋巴细胞周期分布的影响

(n＝4)

试验I、II组免疫21d后，S期细胞的百分比的升高效果最显著。因此在促进淋巴细胞增殖方面，两者效果最明显。

2.4 CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群的变化

见表5，免疫后所有时间点，试验组的CD4+、CD8+淋巴细胞百分率均显著高于无佐剂对照组(P<0.05)，试验II组的CD4+、CD8+淋巴细胞百分率显著高于试验III组、党参多糖组和Lev对照组(P<0.05)；试验I组在免疫后14-28d，CD4+淋巴细胞百分率显著高于党参多糖组(P<0.05)。因此，试验II组可以显著提高CD4+、CD8+淋巴细胞百分率。

表5在不同时间点对猪淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的影响

n＝4

2.5免疫器官指数的变化

2.5.1胸腺指数的动态变化见表6。在免疫后所有时间点，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和党参多糖组的胸腺指数均高于无佐剂对照组(P<0.05)。

表6各组胸腺指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

组别Group	7d	14d	21d	28d
					试验Ⅰ	3.359±0.067<sup>a</sup>	3.710±0.141<sup>ab</sup>	4.208±0.238<sup>a</sup>	4.6253±0.227<sup>a</sup>
试验Ⅱ	3.434±0.125<sup>a</sup>	3.883±0.145<sup>a</sup>	4.323±0.134<sup>a</sup>	4.732±0.373<sup>a</sup>
					试验Ⅲ	3.268±0.065<sup>ab</sup>	3.543±0.113<sup>ab</sup>	4.034±0.212<sup>ab</sup>	4.302±0.691<sup>b</sup>
党参多糖	3.183±0.071<sup>b</sup>	3.383±0.009<sup>bc</sup>	3.857±0.134<sup>b</sup>	4.237±0.030<sup>b</sup>
					Lev	3.116±0.077<sup>b</sup>	3.502±0.049<sup>bc</sup>	3.806±0.113<sup>b</sup>	4.029±0.180<sup>c</sup>
NA	2.821±0.058<sup>c</sup>	3.340±0.095<sup>cd</sup>	3.453±0.062<sup>c</sup>	3.654±0.117<sup>d</sup>
					BC	2.712±0.034<sup>c</sup>	3.064±0.098<sup>d</sup>	3.330±0.101<sup>c</sup>	3.453±0.067<sup>d</sup>

首免后第7、21d，试验Ⅰ、Ⅱ组的胸腺指数显著高于党参多糖和Lev对照组(P<0.05)。第14d，试验Ⅱ组的胸腺指数显著高于党参多糖和Lev对照组(P<0.05)。第21、28d，试验Ⅰ、Ⅱ组的胸腺指数显著高于党参多糖和Lev对照组(P<0.05)。因此，结果表明试验Ⅱ组能显著促进胸腺的发育。

2.5.2脾脏指数的变化

脾脏指数的动态变化见表7。在免疫后所有时间点，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和党参多糖组的脾脏指数均高于无佐剂对照组(P<0.05)。

表7各组脾脏指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

组别Group	7d	14d	21d	28d
					试验Ⅰ	1.218±0.107<sup>ab</sup>	1.916±0.114<sup>a</sup>	3.154±0.118<sup>a</sup>	3.542±0.106<sup>a</sup>
试验Ⅱ	1.312±0.060<sup>a</sup>	1.941±0.110<sup>a</sup>	3.175±0.103<sup>a</sup>	3.546±0.147<sup>a</sup>
					试验Ⅲ	1.137±0.214<sup>bc</sup>	1.753±0.131<sup>b</sup>	2.854±0.044<sup>ab</sup>	3.286±0.280<sup>b</sup>
党参多糖	1.084±0.101<sup>c</sup>	1.624±0.056<sup>bc</sup>	2.579±0.034<sup>bc</sup>	3.017±0.055<sup>b</sup>
					Lev	1.053±0.033<sup>c</sup>	1.503±0.056<sup>c</sup>	2.368±0.086<sup>c</sup>	2.908±0.079<sup>c</sup>
NA	0.914±0.037<sup>d</sup>	1.232±0.030<sup>d</sup>	1.762±0.043<sup>d</sup>	1.970±0.092<sup>d</sup>
					BC	0.818±0.041<sup>d</sup>	1.079±0.092<sup>d</sup>	1.531±0.062<sup>e</sup>	1.647±0.078<sup>e</sup>

首免后第7-28d，试验Ⅰ、Ⅱ组的脾脏指数显著高于党参多糖和Lev对照组(P<0.05)。因此，结果表明试验Ⅰ、Ⅱ组能显著促进脾脏的发育。

2.5.3胰腺指数的变化

胰腺指数的动态变化见表8。在免疫后所有时间点，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和党参多糖组的胰腺指数均高于无佐剂对照组(P<0.05)。

表8各组胰腺指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

试验Ⅱ组在首免后第7-28d，试验Ⅰ在首免后第7-21d的胰腺指数显著高于党参多糖和Lev对照组(P<0.05)。因此，结果表明试验Ⅰ、Ⅱ组能显著促进胰腺的发育，Ⅱ组效果更好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种发酵免疫增强剂，其特征在于是通过以下步骤得到的：

将含有枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的种子液，加入含有党参多糖的培养基中进行培养，得到混合培养物，离心后加入载体，干燥粉碎即得。

2.根据权利要求1所述的发酵免疫增强剂，其特征在于种子液中菌液浓度为0.5×10⁸-1.0×10⁸ CFU/mL，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌落比例为8-10：1。

3.根据权利要求1所述的发酵免疫增强剂，其特征在于培养基中含有高温豆饼粉1.8-3.5%、尿素0.1-0.3%、玉米浆0.1-0.5%、玉米淀粉0.5-1.0%、磷酸氢二钾0.1-0.5%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、硫酸镁0.1-0.3%、硫酸锰0.01-0.05%。

4.根据权利要求1所述的发酵免疫增强剂，其特征在于种子液按2%的比例加入到培养基，调控pH值在6.5-7.0，通气，搅拌，控制溶氧20-50%，37°C培养18-24小时，得到混合培养物。

5.根据权利要求1所述的发酵免疫增强剂，其特征在于将混合培养物利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40°C以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，即得。

6.根据权利要求1所述的发酵免疫增强剂，其特征在于培养结束后，培养基中的溶氧为零，活菌总数为 0.5×10⁹-2.5×10⁹CFU/mL。

7.一种权利要求1-6中任一项所述的发酵免疫增强剂用于畜禽养殖上饲料或饮水添加剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的发酵免疫增强剂以5%比例混入饲料中，或100倍稀释后加入饮水中。