CN110358702B - 一株史雷克氏菌及其在降解呕吐毒素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株史雷克氏菌及其在降解呕吐毒素中的应用。本发明首次筛选得到了一株史雷克氏菌(Slackia sp.)D‑G6，该菌株已于2019年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60661。该菌株能将DON高效降解成DOM‑1，活性稳定、代谢DON的能力强，可应用于饲料加工或食品加工领域中呕吐毒素的脱毒、DON脱毒制剂和DON脱环氧代谢酶的制备，以及构建DON脱毒工程菌、培育DON耐受转基因植物等中，对进一步筛选脱毒基因具有重要意义，且在控制真菌毒素的污染中具有很好的推广应用前景。

Description

一株史雷克氏菌及其在降解呕吐毒素中的应用
技术领域
本发明属于真菌真菌毒素降解技术领域。更具体地，涉及一株史雷克氏菌及其在降解呕吐毒素中的应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)产生的真菌毒素，因能引起猪等真菌动物呕吐，故又称为呕吐毒素。粮食作物在潮湿、温热的环境下极容易滋生真菌，禾谷镰刀菌等真菌寄生在作物上，必然会积累次级代谢产物，DON属于该次级代谢产物中的一种，且DON在所有已知能够检测出的真菌毒素中的检出率最高(平均约为95.8％)。在作物污染比较严重时，DON含量的中位数可高达933.0mg/kg，远远超过了我国制定的DON的限量标准(1.0mg/kg，国标GB 2761-2011)。目前，全球均面临着真菌毒素(如黄曲霉毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等)污染的严峻形势，据不完全统计，全球约有25％的谷类作物遭受真菌毒素的污染，其它食物(如坚果类、水果类、香料)及其副食品中也检测出了各种真菌毒素的残留。因此，解决真菌毒素的污染问题，是全世界科学家共同面临的难题。DON作为真菌毒素中污染最广泛的毒素，也越来越受到广大科研工作者的关注。
目前，主要有三种措施可控制真菌毒素污染，一是在粮食作物收获前，进行适当的田间管理(使用抑菌剂、轮作、培育抗真菌的转基因作物等)；二是在粮食作物收获过程中，注意保持作物的完整性，避免过多的机械损伤；三是在粮食作物保存时，控制储藏室内的湿度、温度，做好通风等。以上是在条件允许的情况下，可以借助的利于控制真菌毒素污染的措施。而在大多数情况下，尤其是在发展中国家，生产技术和管理水平较低，自然条件下，真菌污染和真菌毒素残留是无法有效避免的。
目前，DON的脱毒方法主要包括物理、化学和生物方法，物理脱毒法主要包括：烹饪、烘烤、微波加热、射线处理、吸附剂等；化学脱毒法包括：酸、碱等的处理；生物脱毒法即生物降解法：使用微生物或者酶制剂将有毒有害的物质转化为低毒甚至无毒的产物。物理和化学脱毒法的脱毒效果有限，在烹饪、烘烤等条件下，可能会使得DON含量增加；酸、碱等的处理后，饲料或食品等的营养价值降低并改变了其原有的风味。生物降解法因微生物降解的高效性、代谢产物明确等优点，越来越受到重视。
DON具有热稳定性，能耐170℃～350℃的高温，并耐酸、碱，DON的主要毒性基团为C12、13的环氧基团，研究表明DON脱环氧代谢产物脱环氧呕吐毒素(Deepoxideoxynivalenol，DOM-1)的毒性大大降低，仅相当于DON原药毒性的1/55。关于DON脱环氧代谢，目前只明确了相关的菌株可以进行脱环氧代谢反应，但是还未能解析到相关蛋白或者酶类。且已报道的DON进行脱环氧代谢反应主要是由微生物作用产生，多数为肠道微生物，如BBSH797、Bacillus sp.LS100、SS3、Eggerthela sp.DⅡ-9等，其中，Eggerthelasp.DⅡ-9在本实验室所申请的专利CN106337031A中公开，该菌株是从鸡肠道中分离得到的具有代谢DON功能的菌株，该菌株可高效地将DON完全降解成其弱毒产物——脱环氧呕吐毒素(DOM-1)，且该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON的持续存在。该菌株活性稳定、代谢能力强、代谢温度和pH值范围广，可用于饲料加工和食品加工领域DON的脱毒、DON脱毒制剂的制备，以及DON脱环氧代谢相关酶的分离、DON脱环氧代谢工程菌的制备和DON耐受转基因植物的培育等方面，具有很好的应用前景。
因此，具有高效DON脱环氧代谢能力的微生物的筛选，对控制真菌毒素的污染，开发DON脱毒制剂，以及进一步筛选脱毒基因具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效DON脱环氧代谢能力的史雷克氏菌D-G6。
本发明的第二个目的是提供史雷克氏菌在代谢DON中的应用。
本发明的第三个目的是提供史雷克氏菌在制备DON脱毒制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供史雷克氏菌在制备DON脱环氧代谢酶中的应用。
本发明的第六个目的是提供史雷克氏菌在构建DON脱毒工程菌或培育DON耐受转基因植物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明经过长期的筛选和分离，从鸡的肠道中成功分离到一株具有高效DON脱环氧代谢能力的菌株，经形态学和分子生物学鉴定，该菌株为史雷克氏菌(Slackia sp.)D-G6，该菌株已于2019年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60661，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明还提供了史雷克氏菌在代谢DON中的应用。
具体地，所述应用是将DON降解为DOM-1。
所述应用是将史雷克氏菌应用于饲料加工或食品加工领域中DON的脱毒。
本发明还提供了史雷克氏菌在制备DON脱毒制剂中的应用。
本发明还提供了史雷克氏菌在制备DON脱环氧代谢酶中的应用。
本发明还提供了史雷克氏菌在构建DON脱毒工程菌或培育DON耐受转基因植物中的应用。
优选地，所述史雷克氏菌为上述史雷克氏菌D-G6。
优选的，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6的培养基为WCA改良培养基。
所述WCA改良培养基的配方包括：L-精氨酸、胰酪蛋白胨、葡萄糖、维生素K1、氯化钠、蛋白胨、氯化血红素、酵母浸粉、丙酮酸钠、鸡肠道提取物。
优选地，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6的浓度为106～108CFU/mL。
更优选地，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6的浓度为107CFU/mL。
优选的，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6的培养温度为37℃～47℃，pH为6～9。
更优选地，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6的培养温度为42℃，pH为7～8。
优选的，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6培养的气体环境为：在N2：H2：CO2的体积比为75～85：5～15：5～15的混合气体环境中。
更优选地，用于代谢DON时，史雷克氏菌D-G6培养的气体环境为：在N2：H2：CO2的体积比为80：10：10的混合气体环境中。
该菌株在体外优选的培养条件下，按照106～108CFU/mL的浓度接种，200uL体系，在24h时间内，能够将25μg/mL的DON完全转化为DOM-1。
另外，该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON的存在，在不含DON的培养基中连续培养多代，不会导致活性降低或丢失。
本发明具有以下有益效果：
本发明从鸡的肠道中成功分离到一株具有高效DON脱环氧代谢能力的菌株，经形态学和分子生物学鉴定，该菌株为史雷克氏菌(Slackia sp.)D-G6。该菌株能将DON高效降解成DOM-1，而且该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON的存在，在不含DON的培养基中连续培养多代，不会导致活性降低或丢失。
该菌株的活性稳定、代谢DON的能力强，可应用于饲料加工或食品加工领域中呕吐毒素的脱毒，DON脱毒制剂和DON脱环氧代谢酶的制备，以及构建DON脱毒工程菌、培育DON耐受转基因植物等中，对进一步筛选脱毒基因具有重要意义，且在控制真菌毒素的污染中具有很好的推广应用前景。
附图说明
图1是单克隆菌株DON脱环氧代谢能力的HPLC检测结果图；其中，a图为DON，DOM-1标准品30ng的HPLC检测结果；b图为单克隆菌株DON脱环氧代谢的HPLC检测结果。
图2是单克隆菌株的透射电镜形态图。
图3是单克隆菌株16S rRNA基因序列的系统发育树结果图。
图4是不同培养基对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果。
图5是不同温度对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果。
图6是不同pH对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 DON脱环氧代谢原代鸡肠道微生物的初步筛选
使用连续传代培养法对原代鸡肠道微生物DON脱环氧代谢的初步筛选，具体方法及结果如下：
1、实验方法
(1)从市场取现宰活鸡的肠道20份，放入厌氧箱里，尽快返回实验室，进行后续实验；
(2)每份肠道取大肠、小肠和盲肠的内容物至50mL康宁离心管中，按照1g内容物加1mL脑心浸液(BHI)培养基的比例混合均匀，得到菌液，备用；
(3)以步骤(2)中制备的菌液为种子液，再将菌液按照1：100的比例接种至BHI培养基中(200μL体系)，然后加入DON，使其终浓度为25μg/mL，37℃厌氧培养3d，得到培养后的菌液；
(4)取步骤(3)中培养后的菌液，加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡、混匀后静置5min，然后取上层(乙酸乙酯层)至新的离心管中，再用N2将乙酸乙酯吹干，加入200uL 25％的甲醇溶解后，用0.22μm尼龙针式滤器将样品过滤至上样瓶里；
(5)使用高效液相色谱(HPLC)检测样品中的DON及其脱环氧代谢产物DOM-1，筛选阳性样本；
(6)将步骤(5)中的阳性样本继续传代三次以上，进一步筛选得到阳性样本。
2、实验结果
经HPLC检测发现，在20份鸡肠道筛选样本中，有10份样本可以将DON转化为DOM-1，为阳性样本。阳性样本继续传代三次以上，稀释10-5(1：105)后，仍然活性良好(转化率大于50％)的样本定义为阳性样本。最终得到了6个样本，后续的实验在上述6个样本的基础上进行后续的筛选。
实施例2史雷克氏菌D-G6的分离鉴定
一、采用连续梯度稀释法对阳性样本进行富集培养
对实施例1中的6个阳性样本进行梯度稀释、96孔板筛选获得具备DON脱环氧代谢能力的富集菌群，具体方法及结果如下：
1、实验方法
(1)将实施例1中得到的6个阳性样本用96孔板进行梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12(筛选过程中若不加以说明，则使用的培养基为BHI培养基，加入DON的终浓度为25μg/mL)，筛选原则为：在梯度传代培养的过程中，若梯度稀释10-5有活性，梯度稀释10-6无活性，则选择10-5保的种继续进行筛选，直到获得稳定且活性好的阳性样本；
(2)按照步骤(1)的筛选原则，传代次数大于20次以后，筛选获得具备DON脱环氧代谢能力的富集菌群；
(3)以步骤(2)筛选获得的富集菌群的少量菌液为模板，用16S rRNA基因的通用引物27F/1492R进行PCR扩增细菌的16S rRNA基因，测序。
2、实验结果
传代次数大于20次以后，获得了2个活性稳定的富集菌群E2、H2，富集菌群DON脱环氧代谢的情况如表1所示，可以看出，当菌液梯度稀释10-6时，富集菌群E2、H2的DON脱环氧代谢的活性均强，因此，得到了富集菌群梯度稀释10-6的菌液，初步认定已经获得了具备DON脱环氧代谢能力的富集菌群。
表1富集菌群DON脱环氧代谢的情况
Figure BDA0002087835010000061
注：“―”代表不长菌。
二、从富集菌群中筛选得到DON脱环氧代谢的单克隆菌株
使用平板克隆法和优化培养基对上述得到的具备DON脱环氧代谢能力的2个富集菌群E2、H2进行筛选，得到DON脱环氧代谢的单克隆菌株，具体方法及结果如下：
1、实验方法
(1)将上述得到的2个富集菌群E2、H2梯度稀释10-6后，均分为两份，其中一份加入DON，经HPLC检验其DON脱环氧代谢能力；另一份涂布在BHI培养基的平板上，37℃厌氧培养3d后，随机挑克隆20～40个至含有DON的培养基中，再次37℃厌氧培养3d，并对其DON脱环氧代谢能力进行验证；
(2)使用更多的基础培养基和改良培养基进行优化筛选；
(3)使用步骤(2)中的培养基重复步骤(1)，并反复进行DON脱环氧代谢能力验证；
(4)将步骤(3)反复验证得到的可以DON脱环氧代谢的克隆进行连续划线3～4次，每次挑5～10个克隆单独进行DON脱环氧代谢的稳定性验证。
其中，哥伦比亚琼脂改良培养基的配方为：酪蛋白胰酶消化物10.0g，肉胃酶消化物5.0g，心胰酶消化物3.0g，酵母浸出粉5.0g，玉米淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加终浓度为5％脱纤维羊血。
2、实验结果
经梯度稀释后的菌液能一直保持DON脱环氧代谢的活性，而挑克隆后培养得到的菌液均无DON脱环氧代谢的活性，推测：目的菌株在BHI培养基上没有生长，可能是在BHI培养基上目的菌株本身无法生长，也可能是因为杂菌抑制了其生长。经过培养基的优化筛选后，在哥伦比亚琼脂改良培养基上筛选到一株可以对DON进行脱环氧代谢的克隆(来自H2菌群)，起初，该菌株活性不稳定，降解率范围在20％～80％之间。对该菌株进行连续三次以上划线，挑的克隆经验证，都有活性；第四次划线后，挑到的单克隆与DON孵育，单克隆菌株DON脱环氧代谢能力的HPLC检测结果如图1所示，可以看出，该菌株可以将DON转化为其脱环氧代谢产物DOM-1。
三、DON脱环氧代谢的单克隆菌株的形态学鉴定
对上述得到的具有稳定的DON脱环氧代谢能力单克隆菌株进行形态学鉴定，具体方法及结果如下：
1、实验方法
(1)用革兰氏染色试剂盒对单克隆菌株进行革兰氏染色，鉴定该菌株为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；
(2)用透射电镜观察单克隆菌株的形态。
2、实验结果
经革兰氏染色试剂盒鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌。单克隆菌株的透射电镜形态图如图2所示，可以看出，该菌株无鞭毛，表面光滑，菌体大小为0.2～0.4μm×0.6～1.0μm。
四、单克隆菌株的分子生物学鉴定
对上述得到的具有稳定的DON脱环氧代谢能力单克隆菌株进行分子生物学鉴定，具体方法及结果如下：
1、实验方法
对上述单克隆菌株进行16S rRNA基因测序，序列比对，并构建该菌株16S rRNA基因序列的系统发育树。
2、实验结果
依据单克隆菌株16S rRNA基因的序列比对，构建的系统发育树结果如图3所示，因此，判断该菌株属于Slackia sp.，命名为史雷克氏菌(Slackia sp.)D-G6，并于2019年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60661，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3史雷克氏菌D-G6代谢DON条件的优化
一、不同培养基影响史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力
1、实验方法
(1)将保存的菌株1：100接种到不同的培养基中，包括基础培养基和改良培养基，基础培养基包括：NB、NB+1％L-Arg、BHI、BHI+0.3％L-Arg+0.3％L-His+0.05％L-Cys、WCA、GAM、TSB；改良培养基是在上述基础培养基的基础上，添加50％的鸡肠道提取物(Extract)；
(2)加DON毒素，使其终浓度为25μg/mL，37℃厌氧培养3d，然后使用HPLC检测代谢DON的能力。
WCA改良培养基的配方为：L-精氨酸0.5g，胰酪蛋白胨5.0g，葡萄糖0.5g，维生素K10.00025g，氯化钠2.5g，蛋白胨5.0g，氯化血红素0.0025g，酵母浸粉0.5g，丙酮酸钠0.5g，再加入500mL过滤除菌后的鸡肠道提取物。
2、实验结果
将孵育后的菌液制备成HPLC检测样本，不同培养基对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果如图4所示，经检测发现：添加50％的鸡肠道提取物的改良培养基，其史雷克氏菌D-G6的DON脱环氧代谢活性较基础培养基好，且在WCA改良培养基(WCA+Extract)中，有利于史雷克氏菌D-G6的DON脱环氧代谢活性的发挥。
二、不同温度影响史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力
1、实验方法
(1)将史雷克氏菌D-G6涂布在哥伦比亚琼脂培养基上，培养1～2d后，将菌体用无菌水冲洗下来，离心，弃上清，菌体用WCA改良培养基重悬；
(2)菌体的密度在106～108CFU/mL，200μL体系，加DON毒素，使其终浓度为25μg/mL，设置温度梯度27℃、32℃、37℃、42℃、47℃，厌氧培养1～2d，然后使用HPLC检测代谢DON的能力。收集不同温度孵育不同时间的菌液，制备成样品后进行HPLC检测DOM-1的生成，并计算转化率。
2、实验结果
不同温度对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果如图5所示，可以看出，低温27℃～32℃时，明显抑制了脱环氧代谢活性，37℃～47℃时，有利于DON转化为DOM-1。
三、不同pH影响史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力
1、实验方法
(1)将史雷克氏菌D-G6涂布在哥伦比亚琼脂培养基上，培养1～2d后，将菌体用无菌水冲洗下来，离心，弃上清，待用；
(2)用HCl和NaOH调WCA改良培养基的pH，设置pH范围为3～11；
(3)用步骤(2)中不同pH培养基重悬菌体，保证菌体量一致，菌体的密度在106～108CFU/mL，200μL体系，加DON毒素，使其终浓度为25μg/mL，37℃厌氧培养1～2d，然后使用HPLC检测代谢DON的能力。收集不同pH孵育不同时间的菌液，制备成样品后进行HPLC检测DOM-1的生成，并计算转化率。
2、实验结果
不同pH对史雷克氏菌D-G6代谢DON的能力的影响结果如图6所示，中性偏碱pH 6～10的环境下，有利于史雷克氏菌D-G6的DON脱环氧代谢活性的发挥。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株史雷克氏菌(Slackia sp.)D-G6，其特征在于，该菌株已于2019年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60661。
2.史雷克氏菌在代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用，所述史雷克氏菌为权利要求1所述史雷克氏菌D-G6。
3.史雷克氏菌在制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒制剂中的应用，所述史雷克氏菌为权利要求1所述史雷克氏菌D-G6。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，史雷克氏菌D-G6的培养基为WCA改良培养基。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，史雷克氏菌D-G6的浓度为106～108CFU/mL。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，史雷克氏菌D-G6的培养温度为37℃～47℃，pH为6～9。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是将史雷克氏菌D-G6应用于饲料加工或食品加工领域中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱毒。
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