CN112574929B

CN112574929B - 一株吉林类芽孢杆菌ypg26及其医用用途

Info

Publication number: CN112574929B
Application number: CN202110030851.0A
Authority: CN
Inventors: 杨勇军; 马轲; 陈巍; 蔺小奇
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN112574929A

Abstract

本发明公开了一株吉林类芽孢杆菌YPG26及其医用用途，保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020899；本发明为类芽孢杆菌属的一个新菌种：吉林类芽孢杆菌，模型菌株为YPG26^T。该新菌种的发现和利用丰富了可待实际应用的微生物资源，该新菌种能够产生抑菌物质，为开发和生产新的抗菌药物提供一种新的菌种资源；为开发新型抗菌药物提供了良好的先导化合物。

Description

一株吉林类芽孢杆菌YPG26及其医用用途

技术领域

本发明公开一株吉林类芽孢杆菌YPG26及其医用用途，具体涉及一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

微生物组学揭示土壤、海洋、植物体、动物体等均存在大量的未培养的微生物，构成一个巨大的未开发的微生物资源库，蕴藏着丰富的新基因，是寻找潜在的新结构微生物药物的源泉。本发明从鸡肠道分离获得了一株类芽孢杆菌属新菌种，具有开发新抗菌药物的潜力。类芽孢杆菌属最早因具有芽孢杆菌的特征，如呈杆状、好氧或兼性厌氧、并且可形成芽孢，归属于芽孢杆菌属第三类群菌。1993年，Carol Ash等通过16s rDNA基因序列分析，将第三类群菌从芽孢杆菌属中独立出来，新建了类芽孢杆菌属。至今已从各种外界环境特别是土壤中分离出多种类芽孢杆菌，截至2020年12月，类芽孢杆菌属含有正确命名和正式出版的不同菌种就已经达到254个，加上未正确命名或未正式出版的，达到了314个。类芽孢杆菌具有丰富的生物合成基因簇，能分泌产生多种生物活性的次级代谢产物，也能通过核糖体途径和非核糖体途径等合成分泌多种抗菌活性物质，在医药、农业等方面具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种吉林类芽孢杆菌YPG26及其培养方法和应用。

本发明进一步公开了吉林类芽孢杆菌YPG26的医用用途，用于制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素屎肠球菌、产气荚膜梭菌在内的多种病原菌抑菌作用的药物。

本发明提供的一种类芽孢杆菌属新菌种，已于2020年12月14日，保藏于中国典型微生物保藏中心，英文名命名为Paenibacillus jilinensis，中文名命名为：吉林类芽孢杆菌，模型菌株为YPG26，保藏编号为CCTCC M：2020899。

本发明的目的之二在于提供该新菌种的筛选及培养方法。该方法的具体步骤为：

其筛选培养基为YPG培养基，具体配方为（每520 ml添加的克数）：胰蛋白胨 20g，酵母提取物 10g，葡萄糖 5g，L-半胱氨酸 0.5g，NaCl 0.08g，CaCl₂ 0.008g，MgSO₄ 0.008g，NaHCO₃ 0.4g，淀粉 2.6g，果胶 0.26g，琼脂 7.8g（仅固体）。收集鸡肠道内容物，于YPG固体培养基上划线纯化得到吉林类芽孢杆菌（Paenibacillus jilinensis），革兰氏染色阳性。

对该新菌种的培养方法进行分析。吉林类芽孢杆菌（Paenibacillus jilinensis）可以在TSB、BHI等常用细菌培养基上生长，20℃-50℃和pH 5-8均可生长，37℃和pH 7-8为适宜生长生长条件，在低于3%NaCl的TSB培养基中生长良好，在有氧和厌氧环境均可生长。

本发明的目的之三在于提供的上述吉林类芽孢杆菌医用用途在于：不具有溶血活性，未见耐药特性，具有对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素屎肠球菌、产气荚膜梭菌在内的多种病原菌抑菌作用。

本发明的积极效果在于：

本发明提供了类芽孢杆菌属的一个新菌种：吉林类芽孢杆菌，模型菌株为YPG26。该新菌种的发现和利用丰富了可待实际应用的微生物资源，该新菌种能够产生抑菌物质，为开发和生产新的抗菌药物提供一种新的菌种资源；为开发新型抗菌药物提供了良好的先导化合物。

附图说明

图1.为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26的16S rRNA系统发育进化树；

图2为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26的全基因组与类芽孢杆菌属其他菌全基因组的ANI值；

图3为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26在不同培养基上的形态；

图4为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26革兰氏染色；

图5为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26在不同温度下的生长状况；

图6为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26在不同pH环境下的生长状况；

图7为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26在不同NaCl浓度下的生长状况；

图8为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26的溶血特性；

图9为本发明涉及的类芽孢杆菌属新菌种吉林类芽孢杆菌YPG26包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素屎肠球菌、产气荚膜梭菌在内的多种病原菌的抑菌作用。

具体实施方式

下面由特定的具体实施例进一步说明本发明，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，但也并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，或按照商品说明书进行。

实施例1、

本发明新菌种YPG26的分离

无菌条件下取鸡肠道内容物，称重，按照10ml/1g的比例，加入高压灭菌的PBS，充分混匀，在YPG培养基（具体配方如前所述）上划线，并分别于37℃，厌氧和有氧环境培养24h后，挑取单菌落于液体YPG培养基中扩增培养，然后反复多次划线扩增，纯化得到编号为YPG26的菌株。为了更便于后续功能探究，将该菌株分别在常规培养基TSB、BHI、LB上划线培养，发现YPG26菌株可以在TSB、BHI上生长，而不能在LB培养基上生长。

实施例2

本发明新菌种YPG26的鉴定及进化地位确定

基因组的提取：

挑取YPG26单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养12h，调节OD₆₀₀=1，按1%体积比例转接至100 ml TSB液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养10h，于4℃，10000rpm离心20min，收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体两次，再次10000rpm离心20min，收集菌体，根据细菌基因组提取试剂盒（天根）操作说明，提取YPG26菌的基因组DNA。

16S rRNA序列扩增及测序：

以27F和1492R为引物，以YPG26基因组DNA为模板，使用 2×TransTaq® HighFidelity（HiFi） PCR SuperMix I，进行PCR 扩增16S rRNA序列目的片段。

具体PCR程序如下：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行测序。测序由吉林省库美生物科技有限公司完成。测序完成后将测序结果输入Genebank中，利用BLAST功能组件将测得的基因序列与Genebank 数据库中16S rRNA 序列进行同源性比较。

测序结果表明，YPG26菌的16S rRNA 序列（具体序列见后面序列附表），与类芽孢杆菌属细菌Paenibacillus telluris PS38（GenBank：HQ257247）相似性最高，相似比为97.61%。绘制YPG26菌的系统发育进化树（见附图1），并因此将YPG26菌归于类芽孢杆菌属（paenibacillus），因最高相似度小于新菌种判定标准（>98.65%即认为是同一菌种），且基于YPG26全基因组比对，参考JSpeciesWS数据库(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)计算YPG26全基因组序列与同属其他菌之间的ANI (Average NucleotideIdentity)值，结果可见，YPG26与同属其他菌之间的ANI值均小于80%（小于新菌种判定标准的ANI临界值（95%））（见附图2），因此，结合16S rRNA序列比对及全基因组序列比对，可确定YPG26菌为类芽孢杆菌属的一个新菌种；于2020年12月14日，保藏于中国典型微生物保藏中心（简称CCTCC，中国），保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学，中国典型微生物保藏中心，英文名命名为Paenibacillus jilinensis，中文名命名为：吉林类芽孢杆菌，模型菌株为YPG26，保藏编号为CCTCC NO：M 2020899。

实施例3 本发明新菌种YPG26的菌落特征

取YPG26菌，分别在YPG、TSB、BHI固体培养基上划线，于37℃有氧环境培养24h后，分别观察菌落大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、透明度等特点。结果显示，YPG26菌在YPG培养基上和TSB、BHI培养基上具有不同的形态（见附图3），在YPG培养基上，形成边缘整齐、微凸起、光滑、不透明的白色菌落，而在TSB和BHI培养基上，则形成边缘整齐、微凸起、光滑、透明的菌落。革兰氏染色呈阳性（见附图4）。

实施例4 本发明新菌种YPG26的生长特性

取-80℃冻存的YPG26菌液，在TSB平板上划线，于37℃，倒置培养16h-20h，形成单菌落，挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养12h，调节OD₆₀₀=1，作为种子液，备用。

生长温度：

取备用的种子液，按10%（v/v）接种量转接至新鲜无菌的TSB液体培养基中，混合均匀。分别置于4℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃培养，分别每隔2h取样，测定OD₆₀₀值，绘制生长曲线，确定生长状况。可知YPG26菌在20-50℃范围内均可生长，最适温度是37℃（见附图5）。

生长pH范围：

取备用的种子液，按10%（v/v）接种量转接至新鲜无菌的pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10的TSB液体培养基中，混合均匀。置于37℃培养，每隔2h取样，测定OD₆₀₀值，绘制生长曲线，确定生长状况。结果可知，YPG26菌生长pH范围为5-8，以7-8为最适生长pH（见附图6）。

生长NaCl耐受性：

取备用的种子液，按10%（v/v）接种量转接至新鲜无菌的分别含有1%、2%、3%、4%、5%质量浓度NaCl的TSB液体培养基中，混合均匀，以不加NaCl作为对照。置于37℃培养，每隔2h取样，测定OD₆₀₀值，绘制生长曲线，确定生长状况。结果显示YPG26菌在小于3%NaCl质量浓度的TSB中均可生长（见附图7）。

实施例5

本发明新菌种YPG26的溶血特性、生理生化特性及抗生素敏感性

溶血特性：

上述备用YPG26菌液1ml，7000rpm，离心3min，收集培养上清，将菌体用PBS洗2遍，之后用100μL PBS重悬，备用。取摇至对数期的金黄色葡萄球菌，按照相同方法收集培养上清及菌体，作为溶血特性验证的阳性对照。取含有5%绵羊脱纤维血的TSB平板，在平板上分别加YPG26菌和金葡菌的培养上清（用牛津杯，每个杯中加200μL）、菌体（直接滴加10μL），于37℃培养24h，观察结果。结果显示金葡菌培养上清和菌体均具有溶血活性，而YPG26菌的培养上清及菌体均不具有溶血活性（见附图8）。

生理生化特性：

取购买自杭州微生物试剂有限公司的非发酵细菌生化鉴定管（15种×10支），在无菌条件下打开，在每支管中加入备用的YPG26菌液100μL，根据每种鉴定管的要求培养，实验结束后，根据判定标准，分析结果。鉴定结果如下表，结果可知，YPG26菌可利用多种糖，ONPG反应和H₂S反应呈阴性。

抗生素敏感性：去上述备用菌液，在每个平板上滴加YPG26菌液100μL，用涂布棒涂布均匀，在每个平板上均匀放置4个药敏纸片（购自杭州微生物试剂有限公司（30种）），于37℃，倒置培养16h，测定抑菌圈直径，根据每种药敏片的判定标准，判定抗生素敏感特性。以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌鸡白痢沙门菌作为对照。鉴定结果（见下表）可知，YPG26菌对抗生素表现出很强的敏感性，不具备耐药性，在应用时一般不存在潜在威胁。

实施例6

本发明新菌种YPG26的抑菌活性分析

取-80℃冻存的YPG26菌液，在TSB平板上划线，于37℃，倒置培养16h-20h，形成单菌落，挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养12h，调节OD₆₀₀=1，按1%体积比例转接至1000 ml TSB液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养10h，于4℃、10000rpm离心20min，收集上清，用0.22μm滤器过滤除菌，之后保存在4℃，备用。

取-80℃冻存的各指示病原菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus USA300 TCH-1516）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens ATCC13124）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes 10403S）、耐万古霉素屎肠球菌（Vancomycin -resistant E. faecium 4P-SA）、耐万古霉素粪肠球菌（Vancomycin - resistant E. faecalis N10、Vancomycin - resistant E. faecalis ATCC 51299）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium SL1344）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC27853）、鸡白痢沙门菌（Salmonella pollurum ATCC19945）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae K7）。将革兰氏阳性菌在TSB平板上划线，革兰氏阴性菌在LB平板上划线，之后于37℃，培养16h至形成单菌落。挑取单菌落至3ml相应的液体培养基中，37℃，200rpm摇晃培养至对数期，调节OD₆₀₀=1，备用。

取收集备用的YPG26培养上清，添加到液体培养基中，使培养上清占比为50%，混合均匀，之后在每个孔中按1%接入上述制得的OD₆₀₀=1的各指示病原菌，混合均匀后，于37℃恒温培养箱静置培养6h。以不加YPG26培养上清的孔作为对照。培养结束后，测定在OD₆₀₀处吸光度值，与对照组相比，判定抑菌效果。结果可以看出，YPG26菌可以产生对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素屎肠球菌、产气荚膜梭菌在内的多种病原菌具有广泛抑菌效果的物质（附图9）。为后续纯化和开发抑菌药物提供了参考。

由上述实施例可以看出，本发明提供了一种类芽孢杆菌新菌种，并对新菌种的基本特性、培养方法和应用进行了说明，但也可以看出，在本发明基础上，可以对之做出一些修改，因此，在不偏离本发明精神和原则的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一株吉林类芽孢杆菌YPG26及其医用用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1384

<212> DNA

<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus jilinensis)

<400> 1

cctgatggtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtaggca acctgcctgt aagactggga 60

taactaccgg aaacggtagc taataccgga taattcacgt tgctgcatgg cggcgtgatg 120

aaagacggag caatctgtca cttacagatg ggcctgcggc gcattagcta gttggtgagg 180

taatggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgaacgg ccacactggg 240

actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 300

aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt 360

gccagggaag aacgtccggt agagtaactg ctaccggagt gacggtacct gagaagaaag 420

ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggggcaagcg ttgtccggaa 480

ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtc acttaagtct ggtgtttaat cctggggctc 540

aaccccgggt cgcactggaa actgggtgac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca 600

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg 660

ggctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 720

agtccacgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttaggggtt tcgataccct tggtgccgaa 780

gttaacacat taagcattcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 840

tgacggggac ccgcacaagc agtggagtat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 900

ttaccaagtc ttgacatccc tctgaatcct ctagagatag aggcggcctt cgggacagag 960

gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020

aacgagcgca acccttgatt ttagttgcca gcatttcggg tgggcactct agaatgactg 1080

ccggtgacaa accggaggaa ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacttg 1140

ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg aaggagcgat ctggagcgaa 1200

tcctagaaaa gccggtctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca tgaagtcgga 1260

attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1320

cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc gcaaggagcc 1380

agcc 1384

Claims

1.一株吉林类芽孢杆菌（Paenibacillus jilinensis）YPG26，于2020年12月14日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020899。

2.如权利要求1所述的吉林类芽孢杆菌在制备对抗生素敏感性药物中的用途。

3.如权利要求1所述的吉林类芽孢杆菌在制备抑制病原菌生长药物中的用途；

上述的病原菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus）、耐万古霉素屎肠球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus faecium）以及产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）。