TWI684642B - 一種產細菌素之類芽孢桿菌及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種產細菌素之愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1，其係可促進水產養殖生物之成長及免疫反應。同時，該菌株還可提升水產養殖生物感染病原菌後的存活率。此外，該愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1所產細菌素Peocin，係飢餓/停滯期DNA保護蛋白，對包含養殖病原菌、食源性病原菌及臨床性病原菌之多種病菌具抗菌活性。該細菌素Peocin係首次發現具抗菌活性的飢餓/停滯期DNA蛋白。

Description

一種產細菌素之類芽孢桿菌及其應用
水產養殖生物在養殖過程中，由於多為集約式養殖，病原菌的感染容易迅速傳播使養殖生物大量死亡，造成巨大的經濟損失。因此，疾病問題係阻礙水產養殖產業發展的嚴重問題。面對疾病問題，目前市面上主要係應用抗生素或化學藥劑進行預防或治療處理，然而，化學藥劑對非標的生物亦具有毒性，連續使用容易危害人體或造成環境汙染。同時，抗生素的濫用則會導致病原菌抗藥性的產生，造成生態環境的破壞。因此，近年來，基於食用安全與環境永續發展之觀點，水產養殖業對生物性防治法的需求日漸增加。
生物防治法中，使用從自然界分離之益生菌，係對環境影響較小，且可減少抗藥性菌產生之風險，為替代抗生素預防疾病的有效策略之一。其中，愛媛類芽孢桿菌(Paenibacillus ehimensis)已被應用於經濟作物中做為益生菌，例如，用於防治番茄中的根結線蟲病(Hong,Anees,& Kim,2013)以及鐮刀菌枯萎病；用於防治辣椒中的辣椒疫病菌Phytophthora capsici等。然而，由於水產養殖生物的生存環境與上述經濟作物相比，具有水質、酸鹼度、鹽分以及共生的微生物等更複雜的環境變因，在水產養 殖領域中，尚未有任何應用愛媛類芽孢桿菌作為益生菌的專利或研究被揭露。
作為益生菌之細菌所產生的抗菌物質通稱為細菌素(Bacteriocin)，與其他化學合成的抗菌添加物及抗生素相比，細菌素主要為核醣體合成的蛋白質或是小分子胜肽，通常對人體和環境無害，因此可進一步應用於食品產業與臨床醫藥，取代抗生素等作為抗菌物質。目前已鑑定出的愛媛類芽胞桿菌所產的細菌素，可列舉例如：由P.ehimensis B7菌株中鑑定出的PE1與PE2，此兩個環狀脂胜肽(Cyclic lipopeptide)對臨床上具抗藥性之耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、大腸桿菌(E.coli)與綠膿桿菌(P.aeruginosa)具有抗菌效果(Z.Huang et al.,2013)；由P.ehimensis MA2012菌株中鑑定出的細菌素polypeptin C，其對植物性真菌與細菌性病源菌有抑制效果(Kyaw Wai Naing et al.,2015)。然而，尚未有應用愛媛類芽孢桿菌所產之細菌素於水產養殖領域的專利或研究被揭露。
此外，過去對於水產養殖生物之益生菌應用的研究，主要係探討益生菌促進水產養殖生物生長以及疾病保護能力，但近年來，益生菌對於水產養殖生物的免疫調節作用逐漸被關注。多種益生菌提升水產養殖生物免疫反應之效果已被揭露，例如可列舉：Clostridium butyricum能夠提升鮸(Miichthys miiuy)的溶菌酶、吞噬活性以及免疫球蛋白表現，以及鮸感染Vibrio anguillarum後的存活率(Pan et al.,2008)；Kocuria species能夠提升虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的溶菌酶、吞噬活性以及免疫球蛋白表現，以及虹鱒感染Vibrio anguillarum後的存活率(Sharifuzzaman & Austin,2009) 等。
【非專利文獻】
Hong, S. H., Anees, M., & Kim, K. Y. (2013). Biocontrol of Meloidogyne incognita inciting disease in tomato by using a mixed compost inoculated with Paenibacillus ehimensis RS820. Biocontrol Science and Technology, 23(9), 1024-1039.
Huang, Z., Hu, Y., Shou, L., & Song, M. (2013). Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7. BMC Microbiology, 13(1), 87.
Pan, X., Wu, T., Song, Z., Tang, H., & Zhao, Z. (2008). Immune responses and enhanced disease resistance in Chinese drum, Miichthys miiuy (Basilewsky), after oral administration of live or dead cells of Clostridium butyrium CB2. Journal of Fish Diseases, 31(9), 679-686.
Sharifuzzaman, S. M., & Austin, B. (2009). Influence of probiotic feeding duration on disease resistance and immune parameters in rainbow trout. Fish & Shellfish Immunology, 27(3), 440-445.
綜上所述，在水產養殖領域中，對可替代抗生素與化學藥劑的產細菌素之益生菌之研發必然有需求。同時，考量研發需要花費大量時間與金錢成本，亦期望所研發之益生菌生產的細菌素可對多種病原菌具有抗菌活性，或是該益生菌具有提升水產養殖生物免疫反應之功效，可藉此等優勢廣泛應用於多種病害之防治。進一步地，為追求產量提升，亦期望該益生菌兼具促進養殖生物成長之功效。
因此，本發明之目的，在於提供一種可應用於水產養殖領域的產細菌素之益生菌，其不僅可作為提升水產養殖生物免疫反應之益生菌，同時，該益生菌所產細菌素，可對多種病原菌具有抗菌活性。此外，該益生菌，還具有促進養殖生物成長之功效。
本發明者為了解決前述課題而深入研究，藉由自吳郭魚養殖池中篩選出產細菌素之愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1，進一步將所產細菌素Peocin純化及分析，並分析餵食該愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1之斑馬魚以及吳郭魚的免疫反應，從而獲得一種產細菌素之愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1，其係可促進水產養殖生物之成長及免疫反應。同時，該菌株還可提升水產養殖生物感染病原菌後的存活率。
此外，該愛媛類芽孢桿菌菌株NPUST-1所產細菌素Peocin，係飢餓/停滯期DNA保護蛋白，對包含養殖病原菌、食源性病原菌及臨床性病原菌之多種病菌具抗菌活性。該細菌素Peocin係首次發現具抗菌活性的飢餓/停滯期DNA蛋白。
因此，本發明提供以下技術手段：
(1)一種類芽孢桿菌菌株NPUST-1，經鑑定為一愛媛類芽孢桿菌菌株(Paenibacillus ehimensis)，其係寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存日期為民國2017年11月14日，寄存編號為BCRC910802。
(2)如項1所記載之類芽孢桿菌菌株，其中，前述菌株係可促進水產養殖生物之成長及免疫反應。
(3)一種項1所記載之菌株用於作為益生菌餵食水產養殖生物之用途。
(4)一種細菌素蛋白，其特徵係其為類芽孢桿菌菌株(寄存編號為BCRC910802)所生產之飢餓/停滯期DNA保護蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：1。
(5)如項4所記載之細菌素蛋白，其中，前述細菌素蛋白係表現對於養殖病原菌、食源性病原菌及臨床性病原菌之抗菌活性。
(6)如項5所記載之細菌素蛋白，其中，前述養殖病原菌、食源性病原菌及臨床性病原菌係包含：親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、酵母菌(Debaryomyees hansenii)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸道沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)。
(7)一種項4所記載之細菌素蛋白用於作為食品或化妝品中的天然抗菌劑之用途。
(8)一種項4所記載之細菌素蛋白用於製造替代抗生素治療具抗藥性病原菌之感染之蛋白藥物的用途。
(9)一種水產養殖生物飼料，其特徵係其飼料配方含有專利範圍第1項所記載之類芽孢桿菌菌株。
(10)如項9所記載之水產養殖生物飼料，其中，其係用於增加水產養殖生物感染親水性產氣單胞菌後之存活率。
本發明之NPUST-1菌株，作為應用於水產養殖生物之益生 菌係優異，可提升飼料轉換率與飼料效益，並促進多種免疫相關基因、魚類免疫指標重要指標之表現，係兼具促進成長及提升免疫反應之功效，可有效提升水產養殖的漁獲量。同時，該菌株對Ampicillin與磺胺劑已產生抗性，生物防治上可共同使用。
該菌株所產細菌素Peocin，對包含養殖病原菌、食源性病原菌及臨床性病原菌之多種病菌具有抗菌活性，在水產養殖、食品、臨床醫藥、農業疾病防治多種領域具有廣泛應用的潛力。此外，該細菌素Peocin更具有耐高溫、耐酸鹼、耐蛋白酶作用、及在40℃高溫下長期保存仍具有66%抗菌活性等特性。藉此，該細菌素Peocin作為天然抗菌添加物，不僅在需高溫之飼料製程，在需耐熱性、pH耐受性之產品開發上亦具有優勢。
【圖1】NPUST-1之生長曲線、蛋白質濃度變化及抗菌活性變化之圖。
【圖2】表示NPUST-1所產抗菌蛋白Peocin經純化後之抗菌活性之圖。
【圖3】抗菌蛋白Peocin之分子量與覆蓋實驗中抑菌帶位置的SDS-PAGE蛋白電泳結果對照圖。
【圖4】表示LC/MS分析鑑定中抗菌蛋白Peocin與飢餓/停滯期DNA保護蛋白比對覆蓋率之圖。
【圖5】抗菌蛋白Peocin分子量經LC/MS分析鑑定之圖。
【圖6】以E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin所表現之抗菌 蛋白Peocin之SDS-PAGE蛋白電泳圖，及含有pET-28空載體之破菌上清液與E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin之破菌上清液的抗菌活性比較圖。
【圖7】NPUST-1餵食斑馬魚之安全濃度測試結果圖。
【圖8】表示不同溫度下抗菌蛋白Peocin之抗菌活性之圖。
【圖9】表示不同pH值下抗菌蛋白Peocin之抗菌活性之圖。
【圖10】表示經蛋白酶Protease K與Trypsin處理後抗菌蛋白Peocin之抗菌活性之圖。
【圖11】表示在不同溫度下存放70天後之抗菌蛋白Peocin之抗菌活性之圖。
【圖12】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之腸道的免疫基因表現量比較圖。
【圖13】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之腸道的免疫基因表現量比較圖。
【圖14】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之腸道的免疫基因表現量比較圖。
【圖15】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之全身的免疫基因表現量比較圖。
【圖16】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之全身的免疫基因表現量比較圖。
【圖17】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚之全身的免疫基因表現量比較圖。
【圖18】餵食含NPUST-1飼料之斑馬魚感染親水性產氣單胞菌後之存活率比較圖。
【圖19】餵食含NPUST-1飼料之吳郭魚之脾臟與頭腎的免疫基因TNF-α及TGF-β表現量比較圖。
【圖20】餵食含NPUST-1飼料之吳郭魚感染親水性產氣單胞菌後之存活率比較圖。
【圖21】餵食含NPUST-1飼料之吳郭魚的超氧化物歧化酶(SOD)活性、呼吸爆、吞噬細胞活性及血液中溶菌酶含量比較圖。
以下揭示本發明實施方式，其並非限制本發明必須以下述方式實施，而係為了闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。
〔菌種篩選鑑定〕
從吳郭魚養殖池中採取樣本，將其序列稀釋至100倍後，塗抹於含有指標菌株E.coli的TSB平版培養基上，於28℃培養4天，每日觀察菌落之生長與抑菌圈之有無。將具有抑菌圈之菌落挑出，於TSB培養基篩選以四區畫線法篩選為單一菌株。委託Bioresource Collection and Research Center(BCRC)鑑定此菌株，根據其16s rDNA序列及生物化學特徵，鑑定為愛媛類芽孢桿菌，並命名為Paenibacillus ehimensis NPUST-1(以下，簡稱為NPUST-1)。
〔菌株培養與保存〕
將P.ehimensis NPUST1菌液接種於含有50ml TBS培養基 之250ml三角瓶中，並在恆溫培養箱中以28℃、175rpm振盪培養24小時，此視為活化菌液。翌日取1ml活化菌液加入至含有100ml TBS培養基之500ml三角瓶中，並在恆溫培養箱中以28℃、175rpm振盪培養24小時，取培養完成的菌液0.5ml分裝至1.7ml微量離心管中，並加入50%甘油(glycerol)混和至最終甘油濃度為25%(v/v)，此視為菌種保存液，隨後將其放置於-80℃冰箱中保存。重新活化使用時，需先在28℃下，於TSB液態培養基培養24小時。
〔菌株特性測定〕
將前述-80℃保存的NPUST-1加入至50ml之TSB液態培養基中培養，在28℃中培養24小時，使其活化。接著，取已活化的NPUST-1菌株之菌液1ml培養於100ml新鮮的TSB液態培養基中，定時取培養液測定吸光值OD600繪製生長曲線，並抽取蛋白質濃度測定及抗菌活性檢測所需的菌液樣本。前48小時為每4小時測定及抽樣1次，之後為每6小時測定及抽樣1次。
蛋白質濃度測定是使用蛋白質濃度測定套組(Bio-Rad，USA)來檢測。其係經由蛋白質濃度檢測試劑中的Coomassie brilliant blue G-250與蛋白質中的鹼性和芳香族氨基酸殘基結合而變色，根據吸光值OD595測定蛋白質濃度。以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)作為實驗的對照組，將其配置成濃度為0、20、40、60、80及100μg/ml，之後取50μl的各濃度BSA以及前述各時間點之NPUST-1菌液樣本分別置入於96孔盤中，隨後再各別加入200μl經稀釋的蛋白濃度檢測試劑，放置於抽屜中避光靜置10分鐘後，測定吸光值OD595。將對照組數據做出標準曲線，再將樣本數 據經由標準曲線推算出蛋白濃度。
抗菌活性檢測，係使用刃天青(Resazurin)測定法評估。刃天青檢測的原理乃利用Resazurin經過粒線體中的NADH去氫酶作用後，會將原本呈現深藍色的Resazurin還原成呈現粉紅色的Resorufin，藉此來檢測細菌或是細胞的活性。將預先培養的指標菌株E.coli稀釋為1×107CFU/ml，與配置濃度為0.25mg/ml刃天青染劑，以利後續實驗的進行。將96孔盤分別以每3個孔做為1組樣品之三重覆，總共分成21組，而每個孔洞均加入60l TSB培養基、10μl刃天青染劑、10μl指標菌株以及20μl樣品，總量為100μl。前述20μl樣品，為分別依序添加0、1、2、3...至20μl的培養液，並使用TSB培養基將所有樣品補至總量為20μl。將完成的96孔盤放置於37℃中培養12小時，並觀察其結果變化。抗菌單位(Antibacterial unit)以AU表示，經由刃天青測定法，最小抑制顏色變化之培養液樣品添加量定義為1AU，並將各時間點培養液中之抗菌活性以每毫升培養液含有多少AU表示。
將生長曲線、蛋白質濃度變化及抗菌活性變化根據採樣時間點繪製於圖表上，進行比較。如圖1所示，NPUST-1在培養36小時後開始進入平穩期，且在平穩期之後期，培養液中之蛋白質濃度以及抗菌物質的活性逐漸升高。此結果說明培養液中蛋白質的濃度與抗菌物質呈正相關，NPUST-1所生產的蛋白質具有抗菌能力。同時，抗菌物質是在平穩期後期才開始產生，在菌株進入死亡期時被大量表現。
〔抗菌蛋白純化〕
抗菌蛋白的純化係使用硫酸銨沉澱法，將抗菌蛋白鹽析而沉 澱。硫酸銨(Ammonium sulfate)是一種中性鹽，對蛋白質具有良好的安定作用。該方法的原理是將離子容積較大的硫酸銨與水分子結合，使原本溶於水中的蛋白質暴露出蛋白質的非極性區域，蛋白質藉由此非極性區域相互結合，使蛋白質形成大分子而沉澱。各種蛋白質會因其表面的非極性區域分佈不同，分別在不同的硫酸銨飽和濃度之下沉澱。經由不同濃度的硫酸銨(10、20、30、40、50、60、70以及80%)測定，發現抗菌蛋白係於硫酸銨濃度為60%時被析出，因此使用60%硫酸銨進行下述抗菌蛋白的純化。
從-80℃保存的NPUST-1菌株取500μl菌液，加入至50ml TSB液態培養基中，培養於28℃中24小時，使其活化。接著，從其中取1ml菌液加入100ml TSB液態培養液中，再放置於28℃培養4天。培養完成的菌液分裝於50ml離心管中，以4000rpm離心20分鐘後，將上清液取出並集中於燒杯中，之後將燒杯置於冰上並緩慢加入硫酸銨，使最終濃度為60%，待硫酸銨均勻溶解後，放置於4℃冰箱中16小時，使抗菌蛋白析出。沉澱完成的樣品分裝於50ml離心管中，以4000rpm 4℃離心(Eppendorf,5810R)30分鐘，將其抗菌物質分離。沉澱的抗菌物質加入1ml PBS(pH 7.4)混和後，將混合液加入透析模中，放置於4℃冰箱中16小時，以1L PBS(pH 7.4)Buffer進行透析。透析完成的樣本，使用0.45μm微量過濾器去除雜質後，獲得純化的抗菌蛋白，保存於4℃冰箱中。
將透析純化後的抗菌蛋白樣本進行抗菌活性測定，結果如圖2所示，初步純化之樣本的抗菌活性明顯高於未經過純化的上清培養液。
〔抗菌蛋白電泳分析〕
將所純化抗菌蛋白，利用聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis/SDS-PAGE)配合抗菌測試，分析抗菌蛋白質分子量。其步驟如下：首先，將樣本、marker各別與Sample buffer混合後，於100℃加熱10分鐘，隨後置於冰上5分鐘後，再將樣品注入SDS-PAGE的凹槽中，以100伏特電壓進行電泳120分鐘後，將SDS-page膠片以Coomassie Brilliant Blue R-250染劑染色30分鐘，再以Destain solution退染至各條帶清楚易辨為止。另一方面，將另一片以同樣條件完成電泳步驟的SDS-page膠片，以ddH2O重覆沖洗2~3次，充分去除膠體上殘留之Running buffer後，將膠體緩慢覆蓋於含有指標菌株E.coli之TSB培養基上，於28℃中隔夜培養，觀察膠體所覆蓋的區域中，培養基出現透明條帶的位置。將透明條帶位置與Coomassie Brilliant Blue R-250染劑染色之膠片比對。
結果如圖3，根據marker對應箭頭處所示抑菌帶位置之分子量，經純化抗菌蛋白的分子量大小約為10kDa。
〔抗菌蛋白LC-MS鑑定〕
進一步地，利用液相層析儀和質譜儀鑑定(LC-MS鑑定)蛋白質身分與分子量大小。首先，根據下述步驟進行膠體內水解(gel digestion)：將以Coomassie Brilliant Blue R-250染劑染色之SDS-PAGE膠片以手術刀切割，取出抗菌物質所在之藍色條帶，以ddH2O沖洗後，以手術刀切割，取大小約1mm2之塊狀，以100μl ddH2O或100μl 25mM碳酸氫銨(Ammonium bicarbonate/ABC)溶液清洗2次後，加入100μl含有50mM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol/DTT)之25mM ABC buffer，於37℃中反應1小時，使蛋白 復性。接著，以迷你微量離心機離心10秒後，以微量吸管去除上清液，再加入100μl含有100mM碘乙酸(Iodoacetic acid/IAM)的25mM ABC buffer，放置於室溫下避光30分鐘，使其烷基化。將反應完後的樣本以迷你微量離心機離心10秒，使用微量吸管去除上清液，再加入100μl含有50%乙腈(Acetonitrile/ACN)之25mM ABC buffer，放置於超音波震盪機中退染15分鐘，震盪完後，以13000rpm離心1~2分鐘，重覆此震盪-離心步驟至少2次，直到膠體沒有顏色。退染完後的樣本，以迷你微量離心機離心10秒後，使用微量吸管去除上清液，加入100μl 100%ACN反應5分鐘，之後將液體吸出，以冷凍乾燥機凍乾5分鐘。凍乾後之膠體，加入100~150μl之25mM ABC buffer，以研磨杵壓碎，大約左右各轉半圈後，使用桌上型震盪器震盪稍微震盪，並以迷你微量離心機離心將碎片離下，接著，加入適量胰蛋白酶(Trypsin)放置於37℃中反應16小時。酵素添加的比例為Enzyme：Protein=1：20(酵素量=蛋白的重量/回溶的體積(μl)/蛋白條帶數量)。反應完成後，將樣本的上清液取出收集，剩餘的膠體碎片則加入100ml含有50%CAN以及5%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid/TFA)之buffer，在超音波震盪機中震盪10秒後停止10秒，重覆進行10次後以13000rpm離心2分鐘後，將上清液收集(重覆此震盪離心收集步驟3次)。
收集的上清液以冷凍乾燥機凍乾，回溶後取適當體積進行LC-MS鑑定。
結果如圖4、圖5所示，該抗菌蛋白身分為飢餓/停滯期DNA保護蛋白，紅色標示處為匹配之胺基酸，鑑定之覆蓋率為36%，分子量大小為16.348kDa，將抗菌蛋白命名為peocin。
〔以大腸桿菌載體表現抗菌蛋白peocin〕
將經由LC-MS所鑑定的此段功能性蛋白質基因構築(construct)於pET-28載體，並將載體轉型(transformation)至大腸桿菌BL-21(DE3)中，稱為E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin，使該大腸桿菌表現抗菌蛋白peocin。誘導表現步驟如下所述。
將30μl E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin菌液，以及3μl Kanamycin(100mg/ml)加入至3ml LB液態培養基中活化24小時，活化後，將0.5ml培養液與50μl Kanamycin(100mg/ml)加入至50ml LB液態培養基中，培養3個小時後，再加入50μl 1M IPTG讓轉型蛋白大量表現，之後再培養9個小時，然後測定培養菌液的OD600nm吸光值，之後將菌液濃縮成OD600nm=60/ml，以1×PBS清洗1次，放置離心機中以1300rpm離心15分鐘，將上清液去除後，再加入2ml 1×PBS放置於超音波細胞粉碎機下以啟動5秒鐘休息5秒鐘的頻率持續破菌5分鐘，之後再放置於離心機中以4000rpm在4℃的環境下離心20分鐘，將上清液吸出以0.45μm針筒過濾器過濾後，將樣品保存於4℃冰箱中等待後續實驗進行。將E.coliBL21(DE3)/pET-28以及E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin樣品進行蛋白質電泳(SDS-PAGE)，確認轉型進去的載體有將抗菌蛋白大量表現出來，之後再將E.coliBL21(DE3)/pET-28以及E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin蛋白質樣品以含有E.coli之TSB培養基進行抗菌活性測定及抑菌圈的測量，確認所表現蛋白質的抗菌能力。
結果顯示，在誘導E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin大量表現抗菌蛋白後，E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin大腸桿菌本身菌體的生長 並未受影響，然而，若將E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin打破後離心之上清液進行抗菌活性分析，如圖6所示，只含有pET-28空載體之破菌上清液(圖6中樣本1)並無菌活性，而E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin之破菌上清液則顯示出明顯的抗菌效果(圖6中樣本2)。此結果說明，前述飢餓/停滯期DNA保護蛋白(即peocin)，表現於大腸桿菌胞內時並無抗菌活性，但當釋放於胞外時則可展現抗菌效果，且該抗菌蛋白可通過E.coliBL21(DE3)/pET-28-peocin大量表現。
〔NPUST-1投予魚體安全劑量測試〕
以斑馬魚為實驗動物模式，評估NPUST-1是否對魚體具毒性，以及其投予魚體的安全劑量。測試的詳細步驟如下：取出-80℃保存之NPUST-1甘油保存菌液，接種0.5ml保存菌液至50ml之TBS液態培養基中，並在28℃中培養24小時，翌日將培養後之菌液吸取1ml加入至100ml新鮮的TBS液態培養基中，在28℃中培養24小時後以平版塗佈法測定菌數，再將培養過後的P.ehimensisNPUST-1以12000rpm離心10分鐘去除上清培養液，隨後再加入1倍的PBS緩衝溶液回溶，將菌液分別稀釋成1×107、1×108、1×109、1×1010、及1×1011CFU/ml，將各濃度分別取10μl以30G注射針頭施打至斑馬魚腹腔，各濃度分別施打10隻斑馬魚，施打過後將其分別飼養在獨立缸中2個星期，期間觀察魚隻健康狀態以及死亡率。
結果如圖7所示，注射量為1×105、1×106、1×107、1×108CFU/fish時，斑馬馬魚的存活率仍為100%。由於注射高濃度NPUST-1(1×108CFU/fish)並無死亡情形發生，由此得知，NPUST-1對魚體應不具有毒性。同時，投予魚體的安全劑量可為1×106或1×107CFU/fish。
〔含NPUST-1菌株之飼料的配製〕
配置含NPUST-1菌株之飼料時，需預先培養NPUST-1，在飼料製造的當天將培養的NPUST-1與其他原料混合均勻。添加量只要在安全劑量內，並無特別限制。例如，可使用添加菌量為1×106CFU/g及1×107CFU/g的飼料作為斑馬魚及吳郭魚的飼料，其配製步驟如下所述。
飼料配方如表1、表2所示。將適量之NPUST-1菌液、魚粉、大豆粕、麩質、玉米澱粉、羧甲基纖維素以及α澱粉等原料以粗秤秤好後，放入攪拌器中攪拌。攪拌均勻後，緩慢加入含有維生素以及礦物質的菜籽油。均勻混合後，再緩慢並且間斷地加入RO水，直至原料呈現麵團狀，再以手搓揉確認飼料團的水分，使飼料在後續塑型的步驟上不會過於濕潤或者或於乾燥，導致飼料難以塑型。確認濕度適中後，將飼料團取出，從飼料團中捏取一小團飼料塞入擠壓器中，一邊擠壓，一邊以美工刀將擠出之條狀飼料切割適當的大小，將飼料均切割完後，將其均勻散佈至盤子上後，放置於冷氣風口下以冷風吹乾，直到確認飼料乾燥後，才可將其裝袋，保存於4℃冰箱。進一步地，將飼料以研磨機磨碎，接著，分別以兩種篩網過篩，一種為極細小的篩網，用以過濾過於細小的飼料，而另一種篩網為適中大小的篩網，用以篩出過於大顆的飼料。過篩的飼料需再各別加以研磨，進而製作出適合斑馬魚或吳郭魚進食大小的飼料。
Figure 107103899-A0305-02-0017-1
Figure 107103899-A0305-02-0018-2
〔NPUST-1作為益生菌投予方式〕
將前述含NPUST-1菌株之飼料，作為益生菌投予投予生物之方式，並無特別限制。例如，可如下述所列舉之將NPUST-1作為益生菌投予斑馬魚及吳郭魚之方式。
投予斑馬魚之方式：每日所餵食的飼料量為魚體重的2%，並分兩個時段餵食。
投予吳郭魚之方式：每日分為兩個時段餵食，所餵食的飼料量為魚體重的5%，並於餵食開始後的每一週均重新測量體重，並調整相對應之飼料量。
實施例
以下揭示實施例而具體闡述本發明之目的與功效，惟本發明內容係並非限定於此等之實施例者。
〔抗菌蛋白Peocin對溫度之耐受性評估〕
將本發明中經純化的抗菌蛋白Peocin針對不同溫度之耐受 性進行評估，測試步驟如下所述。
取100μl Peocin分別放置於30、40、50、60、70、80、90、100以及121℃中反應1小時，30℃~100℃係使用恆溫乾浴槽(Major Science,MC-01N-110/220)設定條件溫度，121℃則是使用滅菌釜進行濕熱滅菌。以放置於4℃之Peocin為對照組。1個小時後，以含有E.coli之TSB培養基進行抗菌活性測定及抑菌圈的測量。
結果如圖8所示，純化之Peocin於30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃與121℃中處理1個小時後仍然能夠保有原來的抗菌活性，即使高溫達121℃處理1小時，抗菌活性仍然不會受到破壞，此結果說明Peocin具有良好的溫度耐受性。
〔抗菌蛋白Peocin對pH之耐受性評估〕
將本發明中經純化的抗菌蛋白Peocin針對不同pH之耐受性進行評估。測試步驟如下所述，測試步驟如下所述。
將純化的抗菌物質在PBS buffer pH 7.4作為對照組，測試的pH值為pH 2、3、4、5、6、7、8、9與10，pH測試Buffer分別為Glycine-HCl buffer(pH 2.0)、Citrate-phosphate McIlvaine buffer(pH 3.0,4.0,5.0 and 6.0)、Sodium-phosphate buffer(pH 7.0)、Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer(pH 8.0 and 9.0)以及Glycine-NaOH buffer(pH 10.0)。首先，吸取500μl純化的抗菌蛋白，個別分裝於15ml離心管中，之後再分別加入2ml不同pH值Buffer改變抗菌物質之pH值，隨後將其放置於28℃中反應4小時。4個小時後，以含有E.coli之TSB培養基進行抗菌活性測定及抑菌圈的測量。
結果如圖9所示，純化的Peocin在3~10不同pH值的條件下處理4個小時後抗菌活性仍維持穩定，即使在pH 2的高酸性環境下，抗菌活性仍維持87%。此結果說明Peocin具有良好的pH值耐受性。
〔抗菌蛋白Peocin對蛋白酶的敏感性評估〕
將本發明中經純化的抗菌蛋白Peocin針對蛋白酶的敏感性進行評估，測試步驟如下所述。
分別使用蛋白酶K(Proteinase K)以及胰蛋白酶(Trypsin)兩種蛋白酶進行測試。首先，取180μl之純化抗菌蛋白peocin，加入1.7ml微量離心管中，之後分別加入20μl濃度為10mg/ml的蛋白酶K以及胰蛋白酶，使蛋白酶最終濃度為1mg/ml，將其置於37℃中反應4小時。接著，以含有E.coli之TSB平版培養基進行抗菌活性測定以及抑菌圈的測量。Buffer為未添加抗菌蛋白之PBS緩衝溶液，對照組為不含蛋白酶之純化抗菌蛋白peocin樣品。結果如圖10所示，純化的Peocin經蛋白酶Protease K與Trypsin處理4小時後，仍表現出穩定的抗菌活性，由此得知，Peocin不會受到Protease K與Trypsin水解，蛋白酶敏感性低，有利於產業應用上保存。
〔抗菌蛋白Peocin在不同溫度下之穩定性評估〕
將本發明中經純化的抗菌蛋白Peocin針對不同溫度下之穩定性進行評估，測試步驟如下所述。
將純化後的抗菌蛋白Peocin樣本分別放置於40℃、室溫、4℃以及-20℃中保存70天，在實驗進行中，每個星期均抽取樣品以含有E.coli之TSB培養基進行抗菌活性測定以及抑菌圈的測量。
結果如圖11所示，純化的Peocin在-20℃及4℃的環境下保存70天仍還保有約90%的抗菌活性；在室溫環境下保存70天仍保有約80%的抗菌活性；在40℃的環境下保存70天約保存66%的抗菌活性。由此得知，即使將Peocin長時間保存在-20以及4℃的環境下仍可保持活性穩定，有利於產業應用上保存。
〔抗菌蛋白Peocin對各種病原菌之抗菌效果評估〕
將本發明中經純化的抗菌蛋白Peocin對於其他各類水產養殖上之病原菌以及各類食源性病原菌等之抗菌效果進行評估，測試步驟如下所述。
測試的菌種包含：水產養殖之病原菌的親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)及酵母菌(Debaryomyces hansenii)；食品腐敗與食品中毒菌的金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸道沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、及單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；臨床感染病原菌之綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)；植物葉斑性病源菌之伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)。將這些菌株各別培養後，製成含有菌株之固態培養基(106CFU/ml)，待固態培養基凝固後，加入抗菌蛋白，進行抗菌活性測定以及抑菌圈的測量。
結果如表3所示，Peocin對於上述不同來源之病源菌均具有抗菌效果。其中，抑制效果較佳的菌株為伯克霍爾德菌(B.gladioli)、無乳鏈 球菌(S.agalactiae)以及大腸桿菌(E.coli)。由此可知，Peocin之抗菌功能具有廣效性，且具有潛力應用於不同致病菌引起之疾病問題。
Figure 107103899-A0305-02-0022-4
〔各種水產抗生素對於NPUST-1菌株的抑制效果評估〕
為了解NPUST-1菌株在作為益生菌使用的期間可與何種抗生素共同使用，測試各種水產養殖業上所使用的抗生素對NPUST-1菌株的抑制效果，測試步驟如下所述。
測試的抗生素為安默西林(Amoxicillin)、(Ampicillin)、(Doxycycline)、(Erythromycin)、(Furazolidone)、(Flumequine)、(Ormetoprim)、(Oxytetracycline)、(Sulfadimethoxine)、(Chloramphenicol)、(Gentamycin)以及(Kanamycin)。測試的抗生素濃度為目前水產養殖產業上所限定之最高濃度(詳如表4所示)。配置完所有的抗生素後，將此等抗生素用於含有P.ehimensis NPUST-1之TSB培養基，進行抗菌活性測定以及測量抑菌圈的大小。
結果如表4所示，除了抗生素Ampicillinm與磺胺劑Sulfadimethoxine對P.ehimensisNPUST-1無抑制效果外，其他測試藥物對P.ehimensis-NPUST-1有抑制作用，於培養基上分別呈現直徑大小不等明顯的抑菌環。由此得知，NPUST-1雖對大部分抗生素仍無抗藥性，但對抗生素Ampicillinm與磺胺劑Sulfadimethoxine已產生抗性，用於水產養殖產業上做為生物防治時，可共同使用而不會使NPUST-1喪失其功效。
Figure 107103899-A0305-02-0023-5
〔NPUST-1提升斑馬魚免疫基因表現之效果〕
以斑馬魚為試驗對象，評估NPUST-1作為益生菌提升免疫基因表現之效果。其詳細步驟如下所述。
使用中央研究院斑馬魚中心的斑馬魚AB strain為受試對象。將每缸15隻斑馬魚飼養於20L獨立缸中，平均體重為0.61±0.04g。餵食實驗分成3缸控制組、3缸餵食含有1×106CFU/g以及3缸餵食含有1×107CFU/g，每日所餵食的飼料量為魚體重的2%，並分兩個時段餵食。環境的部分 每日以吸虹管清潔魚缸、定期更換白棉以及控管光照時間(14小時光照/10小時黑暗)。餵食1個月後，進行後續的免疫基因表現量分析。
分析的組織為斑馬魚的腸道以及全身，將魚隻的腸道取出浸泡於含有1ml TriPure的2ml微量離心管中，而剩餘的全身以解剖剪刀剪碎後，放入含有4ml TriPure的15ml離心管中，萃取組織RNA。將組織放置於TriPure中，使用均質機加以均質，之後加入200μl Chloroform，上下輕微搖晃30秒，隨後放置於冰上5分鐘。等待組織碎塊沉澱後在4℃的環境下以12000rpm離心15分鐘讓樣品分層，離心完後將透明的上清液取出，放置於新的1.7ml微量離心管中，並加入500μl的Isopropanol混合，之後在室溫下靜置10分鐘等待RNA沉澱下來，10分鐘後在4℃的環境下以12000rpm離心10分鐘，將RNA離心至微量離心管底部，之後將上清液去除掉以75%酒精清洗，再以12000rpm離心10分鐘去除大部分酒精後，放置於桌上靜置，等待酒精完全蒸發，之後再加入20μl 0.1% DEPC水回溶RNA，隨後以超微量分光光度計檢測RNA濃度，檢測完後，使用Bio-Rad IscriptTMcDNA Synthesis kit將RNA轉為cDNA放置於-20℃中保存，之後以表5所列各基因之引子，進行即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)檢測免疫基因的表現量。
Figure 107103899-A0305-02-0024-6
Figure 107103899-A0305-02-0025-7
分析結果如圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17及表5所示，斑馬魚腸道組織中Interleukin(IL)-1β、IL-6、IL-10、Cyclooxygenase(COX)-2b、Toll-like receptor(TLR)-9、補體C3b與溶菌酶表現量顯著提高，且斑馬魚全身之IL-6、Tumor necrosis factor(TNF)-α、COX-2b、TLR-4、TLR-9、補體C3b與溶菌酶之表現量也顯著提升，由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食斑馬魚後，具有提升免疫基因表現之效果。
〔NPUST-1提升斑馬魚感染病菌後之存活率之效果〕
藉由斑馬魚感染親水性產氣單胞菌實驗，評估將NPUST-1做為益生菌餵食斑馬魚後，是否可以提高感染後魚體的存活率。其詳細步驟如下所述。
此實驗將斑馬魚分為空白組、對照組、實驗組1以及實驗組2，共4個組別，其中，實驗組1餵食1×106CFU/g的含NPUST-1飼料，實驗組2餵食1×107CFU/g的含NPUST-1飼料。每個組別分別設置3缸，而每一缸以獨立外掛式過濾器飼養15隻斑馬魚，將斑馬魚餵食1個月之後，進行感染實驗。將斑馬魚餵食一個月後，以30G注射針頭施打10μl樣品至斑馬魚的腹腔，其中，空白組施打樣品為PBS，對照組以及實驗組為1×106CFU/ml的病原菌親水性產氣單胞菌。接著，飼養與觀察魚隻狀況1個星期，並記錄魚隻死亡率。
結果如圖18所示，PBS控制組存活率為100%，控制組存活率為22.2%，106CFU/g實驗組存活率為30.5%，而107CFU/g實驗組存活率為44.4%，餵食含有107CFU/g的NPUST-1飼料提升了20%的存活率。由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食斑馬魚，能夠有效提高感染後魚體的存活率。
〔NPUST-1提升吳郭魚免疫基因表現之效果〕
以吳郭魚為試驗對象，評估NPUST-1作為益生菌提升免疫基因表現之效果。其詳細步驟如下所述。
以國立台灣海洋大學水產養殖學系龔紘毅老師實驗室所繁殖之吳郭魚為受試對象。將吳郭魚飼養於10L魚缸中，每缸飼養20隻魚，平均體重為0.27±0.02g，餵食實驗分成3缸控制組、3缸餵食1×106CFU/g NPUST-1飼料組以及3缸餵食1×107CFU/g NPUST-1飼料組，每日分為兩個時段餵食，所餵食的飼料量為魚體重的5%，並於餵食實驗開始後的每一週均重新測量體重，並調整相對應之飼料量。待餵食2個後，進行後續的免疫基因表現量分析。
此步驟將分析的部位為吳郭魚的頭腎以及腸道。將吳郭魚飼養2個月後，將魚隻的頭腎以及腸道取出，並分別浸泡於含有1ml TriPure的2ml微量離心管中，萃取組織RNA。將取出的組織放置於TriPure中，使用均質機加以均質，之後加入200μl Chloroform，上下輕微搖晃30秒，隨後放置於冰上5分鐘。等待組織碎塊沉澱後在4℃的環境下以12000rpm離心15分鐘讓樣品分層，離心完後將透明的上清液取出，放置於新的1.7ml微量離心管中，並加入500μl的Isopropanol混合，之後在室溫下靜置10分鐘等待RNA沉澱下來，10分鐘後在4℃的環境下以12000rpm離心10分鐘，將RNA離心至微量離心管底部，之後將上清液去除掉以75%酒精清洗，再以12000rpm離心10分鐘去除大部分酒精後，放置於桌上靜置，等待酒精完全蒸發，之後再加入20μl 0.1%DEPC水回溶RNA，隨後以超微量分光光度計檢測RNA濃度，檢測完後使用Bio-Rad IscriptTM cDNA Synthesis kit將RNA轉為cDNA放置於-20℃中保存，之後以表6所列各基因之引子進行即時聚合酶鏈鎖反應檢測免疫基因TNF-α及TGF-β(Transforming growth factor beta)的表現量。
Figure 107103899-A0305-02-0027-8
Figure 107103899-A0305-02-0028-9
分析結果如圖19及表6所示，吳郭魚脾臟與頭腎中TNF-α以及TGF-β表現量顯著提高，由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食吳郭魚後，具有提升免疫基因表現之效果。
〔NPUST-1提升吳郭魚感染病菌後之存活率之效果〕
藉由吳郭魚感染親水性產氣單胞菌實驗，評估將NPUST-1做為益生菌餵食吳郭魚後，是否可以提高感染後魚體的存活率。其詳細步驟如下所述。
將吳郭魚分為空白組、對照組、實驗組1以及實驗組2，共4個組別，其中，實驗組1餵食1×106CFU/g的含NPUST-1飼料；實驗組2餵食1×107CFU/g的含NPUST-1飼料，對照組餵食不含NPUST-1的飼料。每個組別分別設置3缸，並以循環養殖設備分別飼養15隻吳郭魚。將吳郭魚餵食一個月後，以30G注射針頭施打20μl樣品至吳郭魚的泄殖腔，其中，空白組施打樣品為PBS，對照組以及實驗組為4×107CFU/ml的病原菌親水性產氣單胞菌。接著，飼養與觀察魚隻狀況1個星期，並記錄魚隻死亡率。
結果如圖20所示，結果顯示PBS控制組存活率為100%，控制組為16.1%，1×106CFU/g實驗組為50.5%，1×107CFU/g實驗組為38.5%。由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食吳郭魚，能夠有效提高感染後魚體的存活率。
〔NPUST-1提升吳郭魚巨噬細胞免疫反應之效果〕
巨噬細胞在魚類的免疫系統中扮演重要功能，因此進一步抽取前述「NPUST-1提升吳郭魚免疫基因表現之效果」評估試驗中受試吳郭魚的巨噬細胞，檢測餵食含NPUST-1飼料的吳郭魚在下述魚類免疫調節之主要指標的表現：超氧化物歧化酶(SOD)的產生、吞噬細胞活性、呼吸爆與血液中溶菌酶的含量。巨噬細胞的分離步驟，及各指標的檢測步驟如下所述。
巨噬細胞分離：以不同濃度的Percoll藉由離心將巨噬細胞分離。首先，將飼養後吳郭魚的頭腎取出，以1倍PBS pH(7.6)沖洗後，置於2ml微量離心管中，再加入1ml 1倍PBS pH(7.6)，以均質機均質後置於冰上。Percoll使用的濃度為28/51%(V/V)，先將28%以及51%的Percoll分別配置好，之後先加入2ml 28%的Percoll至15ml離心管中，接著，再使用注射針頭將51%的Percoll從15ml離心管的底部緩慢注入，讓28%的Percoll完整覆於51%的Percoll的上方，形成層次。其後，從上方緩慢加入200~500μl的頭腎樣品，最後再以1ml微量吸管吸取1ml 1倍PBS pH(7.6)緩慢加入壓於樣品的上方，保持51%Percoll-28%Percoll 1-頭腎樣品-PBS的分明層次。接著，將離心管放置於離心機中，以400×g在4℃下離心30分鐘，離心結束之後，巨噬細胞會夾在兩種濃度的Percoll中間。將中間霧濁層的巨噬細胞以微量吸管取出放置於1.7ml微量離心管中，置於冰上保持低溫的狀態，並以血球計數板計數，將巨噬細胞稀釋成1×106cell/ml，以利於後續實驗的進行。
超氧化物歧化酶(SOD)分析：首先吸取200μl濃度為1×106cell/ml之巨噬細胞懸浮液放置於1.7ml微量離心管中。將200μl巨噬細胞懸 浮液加入500μl的HBSS混合均勻，放置於離心機中以400×g在4℃的環境下離心20分鐘，之後去除上清液並重複加入500μl的HBSS以及離心，此步驟需重覆進行三次，用以清洗巨噬細胞。將清洗完的巨噬細胞加入150μl 1×PBS pH 7.8懸浮，以超音波細胞粉碎機將細胞打破，放置於離心機中以1500×g在4℃的環境下離心10分鐘，將上清液取出後以Bio rad蛋白濃度測定套組測定樣品蛋白濃度，吸取100μl上清液至1.7ml微量離心管中再依序加入250μl 0.15M Phosphatebuffer、75μl 0.13M Methionine、75μl 1mM Na2EDTA、75μl 0.63mM NBT以及150μl 7.5μM核黃素(Riboflavin)，之後放置於25℃培養箱中光照反應10分鐘，反應結束後吸取200μl至96孔盤中以分光光度計測定吸光值OD560nm以及測定樣品吸光值。
超氧化物歧化酶(SOD)
公式：(Blank-Sample)/(Blank/2)×6/Protein(mg)
SOD活性單位(U)：單位時間抑制50%硝基四氮唑藍(Nitroblue tetrazolium/NBT)還原之酵素量
吞噬細胞活性(PA)分析：此實驗需要在無菌操作台內進行，在操作螢光乳珠的時候需要全程避光。在實驗開始前需要先配置螢光乳珠以及碘化物(PI)。配置螢光乳珠是先取15ml L-15培養液於15ml離心管中之後加入0.4μl螢光乳珠，而碘化物以滅菌過的無菌水配置，其濃度為1mg/ml。首先先取300μl巨噬細胞樣品加入至12孔細胞培養盤中，靜置1個小時讓巨噬細胞吸附在孔洞中，之後將上清液倒除再加入300μl L-15培養液重覆清洗3次，清洗完後加入300μl配置好的螢光乳珠，隨後以鋁箔紙將12孔細胞培養盤包起來靜置2個小時，等待反應結束後，加入300μl PBS清洗一次將多數未攝取的螢光乳珠清除，再加入300μl 1%甲醛固定30分鐘，反應過後以300μl PBS清洗2至3次將殘留甲醛清洗掉，再加入300μl碘化物染色10分鐘，染色過後以300μl PBS沖洗兩次，清洗完後放置於Olympus IX 50螢光顯微鏡下觀察巨噬細胞吞噬情形。
免疫分析之呼吸爆(O 2 - )分析：此實驗分別控制組以及實驗組，先將吸取100μl 0.2%Poly-L-Lysine於96孔盤中放置30分鐘，之後再加入100μl巨噬細胞樣品，放置於離心機中以300×g離心20分鐘，去除上清液後控制組加入100μl MCBSS；實驗組加入100μl Zymosan後靜置30分鐘，反應結束後將上清液去除，以100μl MCHBSS重覆清洗3次，之後加入100μl 0.3%NTB染色30分鐘，30分鐘後加入100μl 100%甲醇終止反應，輕微搖晃後將上清液去除，再以100μl 70%甲醇重覆清洗3次，清洗過後將上清液去除，放置於桌面風乾約20至30分鐘，等待風乾後再加入120μl 2M KOH以及140μl DMSO，靜置2分鐘後以分光光度計測定吸光值OD630nm。
溶菌酶活性分析：此步驟是以25G注射針頭自吳郭魚的尾柄採取血液樣品，將抽取出來的血液放置1.7ml微量離心管中，將離心管斜躺放置於4℃冰箱中24小時，等待血漿與血球分離。在實驗開始前需先行配置0.05M Sodiumphosphate buffer，之後以0.05M Sodiumphosphate buffer配置1.6mg/ml溶菌酶以及0.2mg/ml Mcicrococcus luteus菌液，先將溶菌酶作為標準品進行實驗測試，將溶菌酶稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8以及1.6mg/ml，各吸取10μl放置於96孔盤中，再加入200μl M.luteus菌液混合，放置於分光光度計下以OD530nm測定反應1分鐘以及反應6分鐘的數 值，藉由OD值的變化來判斷溶菌酶的活性，將測出來的數值做出標準曲線，用以推判後續實驗樣品中溶菌酶的量。標準曲線做完後再開始測定血液樣品，將放置於4℃冰箱中24小時的血液樣品取出，放置於離心機中以3000Xg在4℃的環境下離心5分鐘，之後將上層的血漿吸出放置於新的1.7ml微量離心管中，放置於冰上接著進行溶菌酶分析的實驗，或者保存於-80℃冰箱中。將血漿取出後重覆進行上述的步驟，將血漿樣品吸取10μl放置於96孔盤中，再加入200μl M.luteus菌液混合，放置於分光光度計下以OD530nm測定反應1分鐘以及反應6分鐘的數值，藉由OD值的變化來判斷血漿中溶菌酶的活性，以及利用標準曲線推算血漿中溶菌酶的含量。
結果如圖21所示，NPUST1 106CFU/g與NPUST1 107CFU/g吞噬細胞活性、呼吸爆以及溶菌酶活性均有提高的現象，在SOD的部分只有餵食P.ehimensisNPUST1 107CFU/g有提升的現象。在。由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食吳郭魚，具有提升巨噬細胞免疫反應之效果。
〔NPUST-1促進吳郭魚成長之效果〕
對「NPUST-1提升吳郭魚免疫基因表現之效果」中的各組別吳郭魚，測定體成長、飼料轉換率及飼料效益，評估NPUST-1促進吳郭魚成長之效果。其詳細步驟如下所述。
開始餵食吳郭魚前，先將魚的體重紀錄起來作為初始體重(WI)，之後每星期重新測量一次體重並依照體重調整飼料量，此實驗持續2個月後再記錄最後一次魚的體重作為最終體重(WF)，之後將所有餵食的飼料量加總起來作為總進食量(F)，代入下述公式計算出體重增長(WG)、飼料轉換率(Feed conversion ratio/FCR)、飼料效益(Feed efficiency ratio/ FER)以及特殊成長率(SGR)等。
公式： WG=WF-WI
FCR=F/WF-WI
FER=WF-WI/F
SGR=(WF-WI)/餵養時間×100
結果如表7所示，餵食含有106CFU/g與107CFU/g NPUST-1之飼料，吳郭魚之體重增長(WG)分別為47.46±1.85g與50.01±0.48g，顯著高於未餵食對照組的29.63±0.46g；飼料轉換率(FCR)分別為1.1與1.08，相較於未餵食P.ehimensis NPUST-1之控制組的1.39顯著良好；飼料效益(Fernandes CF)分別為0.91與0.92，相較於未餵食P.ehimensis NPUST-1之對照組的0.72顯著較高。由此得知，將NPUST-1做為益生菌餵食吳郭魚後，可促進魚體成長並提升飼料效率。
Figure 107103899-A0305-02-0033-10
【產業利用可能性】
本發明的NPUST-1菌株，作為益生菌餵食水產養殖生物，可提高免疫調節與抵抗疾病感染，降低養殖生物死亡率。
另一方面，由於本發明的NPUST-1菌株所產之細菌素 Peocin，對於多種養殖病原菌、食源性與臨床性抗藥性病源菌具有抗菌效果，可將該細菌素添加於水產飼料中，抵抗疾病感染並降低養殖生物死亡率。同時，該細菌素純化為抗菌蛋白後，在各種環境下都具有良好的保存性，可作為天然抗菌劑添加於食品或化妝品中，提升產品之保存時間。此外，由於該經純化之抗菌蛋白對於已含有抗藥性之MRSA致病菌株具有抗菌功能，在醫藥產業上可以進一步開發，作為蛋白藥物，替代抗生素治療抗藥性致病菌感染。上述此等技術手段，未曾見諸於本技術領域之發明中，誠屬創新之發明。
上述所使用的用語及說明，係用以說明本發明的實施形態，但本發明並非限定於此。只要係不脫離本發明申請專利範圍，具備本發明之技術特徵而有修飾變化者，亦包含在本專利所保護範圍內。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】：台灣新竹食品工業
發展研究所、民國106年11月14日、BCRC 910802。
<110> 國立屏東科技大學
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<400> 1
Figure 107103899-A0305-02-0035-11
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-1 beta PCR引子
<300>
<308> GenBank AY340959
<400> 2
Figure 107103899-A0305-02-0036-12
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-1 beta PCR引子
<300>
<308> GenBank AY340959
<400> 3
Figure 107103899-A0305-02-0036-13
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-6 PCR引子
<300>
<308> GenBank JN698962
<400> 4
Figure 107103899-A0305-02-0036-14
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-6 PCR引子
<300>
<308> GenBank JN698962
<400> 5
Figure 107103899-A0305-02-0037-15
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-10 PCR引子
<300>
<308> GenBank BC163031
<400> 6
Figure 107103899-A0305-02-0037-16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-10 PCR引子
<300>
<308> GenBank BC163031
<400> 7
Figure 107103899-A0305-02-0037-17
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-15 PCR引子
<300>
<308> GenBank BC162843
<400> 8
Figure 107103899-A0305-02-0038-18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-15 PCR引子
<300>
<308> GenBank BC162843
<400> 9
Figure 107103899-A0305-02-0038-19
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-21 PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001128574
<400> 10
Figure 107103899-A0305-02-0038-20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interleukin-21 PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001128574
<400> 11
Figure 107103899-A0305-02-0039-21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Tumor necrosis factor-alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank BC165066
<400> 12
Figure 107103899-A0305-02-0039-22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Tumor necrosis factor-alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank BC165066
<400> 13
Figure 107103899-A0305-02-0039-23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interferon-gamma PCR引子
<300>
<308> GenBank AB126869
<400> 14
Figure 107103899-A0305-02-0040-24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Interferon-gamma PCR引子
<300>
<308> GenBank AB126869
<400> 15
Figure 107103899-A0305-02-0040-25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Nuclear factor-kB PCR引子
<300>
<308> GenBank AY163838
<400> 16
Figure 107103899-A0305-02-0040-26
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Nuclear factor-kB PCR引子
<300>
<308> GenBank AY163838
<400> 17
Figure 107103899-A0305-02-0041-27
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Cyclooxygenase-2 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_153657
<400> 18
Figure 107103899-A0305-02-0041-28
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Cyclooxygenase-2 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_153657
<400> 19
Figure 107103899-A0305-02-0041-29
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Cyclooxygenase-2 beta PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001025504
<400> 20
Figure 107103899-A0305-02-0042-30
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Cyclooxygenase-2 beta PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001025504
<400> 21
Figure 107103899-A0305-02-0042-31
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Complement component c3b PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_131243
<400> 22
Figure 107103899-A0305-02-0042-32
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚complement component c3b PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_131243
<400> 23
Figure 107103899-A0305-02-0042-33
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Lysozyme PCR引子
<300>
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<400> 24
Figure 107103899-A0305-02-0043-34
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Lysozyme PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_139180
<400> 25
Figure 107103899-A0305-02-0043-35
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-1 PCR引子
<300>
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<400> 26
Figure 107103899-A0305-02-0043-36
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-1 PCR引子
<300>
<308> GenBank AY389444
<400> 27
Figure 107103899-A0305-02-0044-37
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-3 PCR引子
<300>
<308> GenBank AY616582
<400> 28
Figure 107103899-A0305-02-0044-38
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-3 PCR引子
<300>
<308> GenBank AY616582
<400> 29
Figure 107103899-A0305-02-0044-39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-4 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank EU551724
<400> 30
Figure 107103899-A0305-02-0045-40
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-4 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank EU551724
<400> 31
Figure 107103899-A0305-02-0045-41
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-9 PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001130594
<400> 32
Figure 107103899-A0305-02-0045-42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Toll-like receptor-9 PCR引子
<300>
<308> GenBank NM_001130594
<400> 33
Figure 107103899-A0305-02-0046-43
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚MX PCR引子
<300>
<308> GenBank AF533769
<400> 34
Figure 107103899-A0305-02-0046-44
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚MX PCR引子
<300>
<308> GenBank AF533769
<400> 35
Figure 107103899-A0305-02-0046-45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Elongation factor 1 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank AY422992
<400> 36
Figure 107103899-A0305-02-0047-46
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑馬魚Elongation factor 1 alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank AY422992
<400> 37
Figure 107103899-A0305-02-0047-47
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 吳郭魚Tumor necrosis factor-alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank AY428948.1
<400> 38
Figure 107103899-A0305-02-0047-48
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 吳郭魚Tumor necrosis factor-alpha PCR引子
<300>
<308> GenBank AY428948.1
<400> 39
Figure 107103899-A0305-02-0048-49
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 吳郭魚Transforming growth factor-beta PCR引子
<300>
<308> GenBank XM_003459454.2
<400> 40
Figure 107103899-A0305-02-0048-50
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 吳郭魚Transforming growth factor-beta PCR引子
<300>
<308> GenBank XM_003459454.2
<400> 41
Figure 107103899-A0305-02-0048-51

Claims (6)

  1. 一種可促進水產養殖生物之成長及免疫反應的類芽孢桿菌菌株NPUST-1，經鑑定為一愛媛類芽孢桿菌菌株(Paenibacillus ehimensis)，其係寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存日期為民國2017年11月14日，寄存編號為BCRC910802。
  2. 一種如申請專利範圍第1項所記載之菌株用於作為益生菌餵食水產養殖生物之用途。
  3. 一種可抗菌的抗菌蛋白用於作為食品或化妝品中的天然抗菌劑之用途，其特徵係前述抗菌蛋白為類芽孢桿菌菌株(寄存編號為BCRC910802)所生產之飢餓/停滯期DNA保護蛋白，具有胺基酸序列SEQ ID NO：1，且前述抗菌蛋白在30℃至121℃及pH2~10下抗菌活性仍穩定。
  4. 一種可抗菌的抗菌蛋白用於製造替代抗生素治療具抗藥性病原菌之感染之蛋白藥物的用途，其特徵係前述抗菌蛋白為類芽孢桿菌菌株(寄存編號為BCRC910802)所生產之飢餓/停滯期DNA保護蛋白，具有胺基酸序列SEQ ID NO：1，且前述抗菌蛋白在30℃至121℃及pH2~10下抗菌活性仍穩定。
  5. 一種水產養殖生物飼料，其特徵係其飼料配方含有申請專利範圍第1項所記載之類芽孢桿菌菌株。
  6. 如申請專利範圍第8項所記載之水產養殖生物飼料，其中，其係用於增加水產養殖生物感染親水性產氣單胞菌後之存活率。
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NCBI accession no.: WP_025850494 (01-oct-2015) Huang et. al., "Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7" BMC Microbiology 2013, 13:87 Romero et. al., "Antibiotics in Aquaculture – Use, Abuse and Alternatives" Health and Environment in Aquaculture. ISBN 978-953-51-0497-1. Published online 11, April, 2012 王曦, Grady et al., "爱媛类芽孢杆菌南京分离株的鉴定及其体内外的抑菌活性" 南京农业大学碩士論文 2009 *
Romero et. al., "Antibiotics in Aquaculture – Use, Abuse and Alternatives" Health and Environment in Aquaculture. ISBN 978-953-51-0497-1. Published online 11, April, 2012
王曦, Grady et al., "爱媛类芽孢杆菌南京分离株的鉴定及其体内外的抑菌活性" 南京农业大学碩士論文 2009

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