CN117430672A - 一种新型抗菌肽及其药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定性高、安全性好、抗菌作用好、序列更短的抗菌肽及其药物组合物,可以治疗和缓解包括酒渣鼻、青少年痤疮、特应性皮炎、生殖器疣和外阴上皮内瘤变、炎症反应、炎症反应综合征等,所述抗菌多肽包含氨基酸序列Ac‑SRMKKWAKIIEKWRKWH‑NH2。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域,具体涉及一种抗菌肽及其应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体在长期进化过程中为适应环境而产生的免疫活性分子,具有抗菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生虫等功能,在机体的天然免疫防御系统中发挥着重要的作用,也被称为“宿主防御肽”(host defence peptides,HDPs)。抗菌肽通常由12–50个氨基酸残基组成,其中绝大部分是阳离子短肽,电荷携带量在+2–+9之间,带有+2–+4电荷的抗菌肽最为丰富(Rodríguez AA,Otero-González A,Ghattas M,Discovery,optimization,and clinical application of naturalantimicrobial peptides.Biomedicines,2021,9(10):1381.Yount NY,Bayer AS,XiongYQ,Yeaman MR.Advances in antimicrobial peptide immunobiology.Biopolymers,2006,84(5):435-458.)。抗菌肽表面携带大量正电荷原因在于,抗菌肽与细菌细胞膜的初始相互作用主要是通过抗菌肽表面的阳离子残基与细菌细胞膜上阴离子的静电作用来实现。另外,也含有少量阴离子抗菌肽,但阴离子抗菌肽抗菌活性远低于阳离子抗菌肽,且阴离子抗菌肽在先天性免疫中的作用还尚未完全了解,因此对于抗菌肽的研究主要集中于阳离子抗菌肽(Teixeira V,Feio MJ,Bastos M.Role of lipids in the interaction ofantimicrobial peptides with membranes.Progress in Lipid Research,2012,51(2):149-177)。结构上,抗菌肽具有α-螺旋、β-折叠、延伸/随机卷曲等三种构型,这些结构具有两亲性或具有转变成两亲性的能力,使抗菌肽能溶于水和富含脂质的环境中(Lazzaro BP,Zasloff M,Rolff J.Antimicrobial peptides:application informed byevolution.Science,2020,368(6490):eaau5480.),从而可以粘附到细菌细胞膜表面并发挥膜溶解作用。抗菌肽的分子量也较小,通常小于10kDa,小的分子量有助于抗菌肽在宿主细胞中快速扩散和分泌,激发对病原微生物的即时防御。迄今为止,抗菌肽数据库(Antimicrobial peptide database,APD)中存储了3000多个AMP,涵盖了抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和其他功能。
近几十年来,抗生素的滥用已导致细菌耐药性问题成为公共卫生危机。根据疾病控制和预防中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)的最新调查,抗生素耐药性每年在世界各地导致数百万种疾病,估计到2050年,因抗生素耐药性导致的死亡人数将达到数千万。与传统抗生素相比,抗菌肽应用优势主要包括:(1)选择性毒性,病原体与宿主之间细胞膜组成的差异是抗菌肽靶向特异性的基础,使得抗菌肽可以特异性入侵病原体(Zhang QY,Yan ZB,Meng YM,Hong XY,Shao G,Ma JJ,Cheng XR,Liu J,Kang J,FuCY.Antimicrobial peptides:mechanism of action,activity and clinicalpotential.Military Medical Research,2021,8(1):48.);(2)作用迅速,抗菌肽杀灭目标细菌所需的时间比目标细菌倍增时间短得多(Brogden KA.Antimicrobial peptides:poreformers or metabolic inhibitors in bacteria?Nature Reviews Microbiology,2005,3(3):238-250.);(3)有效杀灭持留菌,持留菌是细菌群体中可耐受致死剂量抗生素及其他压力环境而存活的细菌亚群,是未发生遗传性突变、代谢活性低下且不会被抗菌药物杀伤的细菌细胞(Liu XL,Yang WX,Ma YL,Wang D,Chen H.Research progress in theformation mechanism and treatment of persister.Chinese Journal of InfectionControl,2020,19(2):184-188.(in Chinese))。由于抗菌肽的作用靶点通常在细胞膜上,不依赖于细胞代谢活性,故有利于杀灭持留菌(Defraine V,Schuermans J,Grymonprez B,Govers SK,Aertsen A,Fauvart M,Michiels J,Lavigne R,Briers Y.Efficacy ofartilysin art-175against resistant and persistent Acinetobacterbaumannii.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2016,60(6):3480-3488.);(4)广谱性,除了常见的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,抗菌肽对病毒、原生动物和真菌等也有效(Yeung ATY,Gellatly SL,Hancock REW.Multifunctional cationic host defencepeptides and their clinical applications.Cellular and Molecular LifeSciences:CMLS,2011,68(13):2161-2176.)。(5)不易产生耐药性,抗菌肽作用于高度保守的细胞膜,几乎不能被细菌修饰而产生耐药性;其次,抗菌肽半衰期短,很难在环境中积累而诱导细菌产生耐药性;另外,抗菌肽作用时间短,与抗生素相比,抗菌肽中间治疗浓度范围小于抗生素,中间治疗浓度范围越小,越不易诱导耐药性产生。目前,抗菌肽在食品、农业、医药等领域均有一定的应用并取得了良好的效果。不仅如此,抗菌肽在临床上也有一定的应用,如indolicidin的合成类似物Omiganan,在治疗真菌感染方面有很大潜力,可用于治疗酒渣鼻、青少年痤疮、特应性皮炎、生殖器疣和外阴上皮内瘤变( D,Wajda A,Czechowicz P,Nowicka J,/> M,Neubauer D,Kamysz W.The antimicrobialactivity of omiganan alone and in combination against Candida isolated fromvulvovaginal candidiasis and bloodstreaminfections.Antibiotics:Basel,Switzerland,2021,10(8):1001.)。
尽管抗菌肽应用前景光明,但也存在许多问题,主要体现在三个方面。(1)药代动力学方面:抗菌肽由于具有红细胞溶血性、口服生物利用度低、对胃肠道蛋白酶降解敏感等问题,导致大多数抗菌肽不能采用口服方式给药;而通过静脉注射等全身给药方式,由于血浆中蛋白水解酶能使抗菌肽快速降解,机体肝脏、肾脏的快速清除作用导致抗菌肽半衰期短,故抗菌肽仅限于局部外用给药。(2)抗菌活性方面:尽管抗菌肽具有广谱抗菌作用,但与传统抗生素相比,抗菌肽抗菌活力相对较低。即达到相同抗菌效果时,抗菌肽使用浓度可能更高(Chen X,Zhang M,Zhou CH,Kallenbach NR,Ren DC.Control of bacterialpersister cells by Trp/Arg-containingantimicrobial peptides.Applied andEnvironmental Microbiology,2011,77(14):4878-4885.),而高浓度的抗菌肽会增加宿主红细胞的溶血性。(3)药物生产加工方面:与传统小分子治疗药物相比,抗菌肽序列较长,往往具有较高的生产制造成本,尤其是富含二硫化物的抗菌肽,一定程度上限制了抗菌肽在临床上的生产与使用。
目前针对抗菌肽存在的问题现已提出许多解决策略,如对抗菌肽进行化学修饰以提高稳定性、替换抗菌肽氨基酸序列提高抗菌活性、内溶素融合抗菌肽降低细胞毒性、设计短线性抗菌肽可降低成本。但基于上述的抗菌肽的优化策略,其改进效果并不能同时达到好的效果,后期又提出一种人工智能的研发方式,即建立预测模型来估计抗菌肽分子性质,以用于候选筛选,通常使用手动选择或自动学习的成分、结构、物理化学特征集来构建预测模型;候选的抗菌肽通常是通过对合理的子序列进行组合计数,然后从现有的分子库中随机选择或修改而获得。同时通过将抗菌肽氨基酸残基以字符串形式表示,以对抗菌肽氨基酸序列数据集进行机器学习/深度学习训练和分析,从而得以高效识别新型抗菌肽氨基酸序列。
同时,也有许多研究工作者综合微生物及蛋白多肽的相关知识,制定了许多策略来设计基于天然模板肽的抗菌剂。与天然的AMP相比,经过修饰设计合成出的AMP表现出更为优秀抗菌的效果及生物相容性。具体来说,首先,在前人对天然AMP性质归纳总结的基础之上,针对性的增加正电荷和疏水氨基酸的比率,从而提高抗菌活性。其次,调整多肽的二级结构。大多数AMP在水溶液中具有无序结构,进入膜环境后,它们与磷脂生物分子相互作用,形成高度稳定的二级结构,这对抗菌活性具有重要意义。因此,二级结构是AMP和膜之间相互作用的基本元素,折叠成规则的二级结构有助于AMP插入细菌膜。第三,AMP两亲性的调节。两亲性是指分子骨架另一侧的疏水和亲水残基的空间分离程度。通常,两亲性通过疏水矩进行量化,疏水矩是归一化螺旋中单个疏水氨基酸的矢量和,两亲性α-螺旋是最常见的构象,肽链的主链围绕中心轴呈规则螺旋上升,每3-4个氨基酸残基螺旋一次。两亲性α-螺旋肽的亲水表面和带负电的细菌膜成分发挥静电效应,肽的疏水表面插入膜中,从而增加膜的渗透性。通常可以通过删除、替换或向序列中添加氨基酸来修改AMP,以形成完美的两亲结构。然而,研究发现,尽管具有完美两亲结构的AMP具有最佳活性,但其细胞毒性也增加,表明这种完美两亲结构非选择性地增加了膜的破坏。
虽然各种各样的多肽设计优化技术已经取得了一些成就,但AMP本身仍然存在一些缺点,例如毒性高、毒理学不明确、临床试验稳定性不成熟,这已成为应用的最大障碍。此外,以前的大多数研究也仅仅侧重于将天然AMP进行一个简单的裁剪或修饰以获得更强的性能,但往往忽略了肽序列本身的固有结构和性能,导致大多数AMP的不良性能无法从根本上解决,适合实际应用的抗菌模板很少。
前期研究中将斑马鱼的卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv)的氨基端和羧基端分别切去后发现,羧基端的194个氨基酸仍然具有抑菌活性,而氨基端的55个氨基酸序列(Pt6)的抑菌活性完全消失。将羧基端的氨基酸按比例缩短,最终发现羧基端的55个氨基酸仍然具有抑菌活性,命名为卵黄高磷蛋白衍生多肽(Pt5)(Wang SHWang YMa J,Ding YCZhang SC:Phosvitin Plays aCritical Role in theImmunity of Zebrafish Embryos via Actingas a Pattern Recognition Receptor and anAntimicrobial EffectorJournalofBiological Chemistry2011286(25):22653-22664)。由于卵黄高磷蛋白衍生多肽(Pt5)从卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)中的卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv)衍生而来,其大多数的抗菌蛋白具有两亲的分子特性,一般净正电荷在2到9之间,并且具有很高比例的疏水氨基酸(Manchekar MRichardson PE,Forte TM.Datta GSegrest JPDashti N:Apolipoproteinbcontaining lipoprotein particle assembly-Lipid capacity ofthenascent lipoprotein particle Journal ofBiological Chemistry 2004279(38):39757-39766)。后续的研究发现Pt5不仅具有抑菌功能,还对嗜水气单胞杆菌感染的斑马鱼具有一定的保护作用(Ding YCLiu XMBu LZLi HYZhangSC:Antimicrobial-immunomodulatory activities Of zebrafish phosvitin-derived peptidePt5.Peptides 201237(2):309-313.)。
综上,天然AMPs大多存在生物活性弱、毒性高、稳定性低等一系列问题,这是由于其自身的作用机理的局限性导致的,所以,大部分的AMPs都无法直接实际生产应用。本发明通过现有技术及前期的研究发现,对抗菌肽进行活性位点筛选和检测,随后以该活性为点位序列为模板进行修饰改造获得的抗菌肽,创造性的解决了抗菌肽的实际应用难题。
发明内容
本发明用氨基酸截短表达的方法,将卵黄高磷蛋白Pv的羧基端和氨基端分别除去,获得具有活性位点的抗菌肽,以筛选检测后的活性位点序列为模板进行设计改造,最终筛选得到稳定性高、安全性好、抗菌作用好、序列更短的抗菌肽。基于此,完成了如下发明。
第一方面,本发明提供一种新型抗菌多肽,所述抗菌多肽包含氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2。
进一步所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2可以有1个和/或几个氨基酸的替换,替换后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,替换的氨基酸为1-5个,优选1-3个,更优选有1个氨基酸的替换。替换的氨基酸可以是连续替换和/或间隔替换。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2在羧基端和/或氨基端增加1个和/或几个氨基酸,增长的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,增加的氨基酸为1-30个,优选1-20个,更优选增加1-10个氨基酸。增加的氨基酸可以是集中在羧基端或是集中在氨基端或是同时在羧基端和氨基端增加。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2有1-5个氨基酸的增加或减少,优选是1-3个氨基酸的增加和/或减少,进一步优选1个氨基酸的增加和/或减少,增加或减少的氨基酸可以集中或分散在所述氨基酸序列的任意位置,改变后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2或其突变序列(如上所述发生的氨基酸替换、增加或减少后的氨基酸序列)的空间构型为α-螺旋、β-折叠和/或延伸/随机卷曲等构型。
第二方面,本发明提供一种抗菌多肽,所述抗菌多肽包含与氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2具有90-100%同源性的氨基酸序列,称为Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2的同源序列,所述同源序列的空间构型为α-螺旋、β-折叠和/或延伸/随机卷曲等构型。
第三方面,本发明提供一种抗菌药物组合物,所述抗菌药物组合物含有本发明第一方面的抗菌多肽和/或本发明第二方面的抗菌多肽,以及药学上可接受的辅料。
在一具体实施方式中,本发明的抗菌药物组合物中仅含有本发明第一方面的抗菌多肽活性成分,其中抗菌多肽包含氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2。
进一步所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2可以有1个和/或几个氨基酸的替换,替换后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,替换的氨基酸为1-5个,优选1-3个,更优选有1个氨基酸的替换。替换的氨基酸可以是连续替换和/或间隔替换。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2在羧基端和/或氨基端增加1个和/或几个氨基酸,增长的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,增加的氨基酸为1-30个,优选1-20个,更优选增加1-10个氨基酸。增加的氨基酸可以是集中在羧基端或是集中在氨基端或是同时在羧基端和氨基端增加。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2有1-5个氨基酸的增加或减少,优选是1-3个氨基酸的增加和/或减少,进一步优选1个氨基酸的增加和/或减少,增加或减少的氨基酸可以集中或分散在所述氨基酸序列的任意位置,改变后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2或其突变序列(如上所述发生的氨基酸替换、增加或减少后的氨基酸序列)的空间构型为α-螺旋、β-折叠和/或延伸/随机卷曲等构型。
在另一具体实施方式中,本发明的抗菌药物组合物中仅含有本发明第二方面的抗菌多肽活性成分,其中抗菌多肽包含与氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2具有90-100%同源性的氨基酸序列,称为Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2的同源序列,所述同源序列的空间构型为α-螺旋、β-折叠和/或延伸/随机卷曲等构型。
在另一具体实施方式中,本发明的抗菌药物组合物中同时含有本发明第一方面所述的抗菌多肽和第二方面所述的抗菌多肽作为活性成分。
在另一具体实施方式中,本发明的抗菌药物组合物中还含有不同于本发明第一方面所述的抗菌多肽和第二方面所述的抗菌多肽的其它活性成分,所述其它活性成分可以为抗生素、免疫调节剂、矿物质、微量元素和/或维生素等。
进一步,本发明的抗菌药物组合物可以制备为注射剂、口服剂、冻干粉针剂等剂型。
第四方面,本发明提供一种核酸分子,所述核酸分子编码抗菌多肽,所述抗菌多肽包含氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2。
进一步所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2可以有1个和/或几个氨基酸的替换,替换后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,替换的氨基酸为1-5个,优选1-3个,更优选有1个氨基酸的替换。替换的氨基酸可以是连续替换和/或间隔替换。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2在羧基端和/或氨基端增加1个和/或几个氨基酸,增长的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。更进一步,增加的氨基酸为1-30个,优选1-20个,更优选增加1-10个氨基酸。增加的氨基酸可以是集中在羧基端或是集中在氨基端或是同时在羧基端和氨基端增加。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2有1-5个氨基酸的增加或减少,优选是1-3个氨基酸的增加和/或减少,进一步优选1个氨基酸的增加和/或减少,增加或减少的氨基酸可以集中或分散在所述氨基酸序列的任意位置,改变后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
进一步,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2或其突变序列(如上所述发生的氨基酸替换、增加或减少后的氨基酸序列)的空间构型为α-螺旋、β-折叠和/或延伸/随机卷曲等构型。
更进一步,所述核酸分子编码抗菌多肽,所述抗菌多肽包含与氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2具有90-100%同源性的氨基酸序列。
第五方面,本发明提供一种宿主细胞,所述宿主细胞能够表达本发明所述的抗菌多肽。
第六方面,本发明提供抗菌多肽的用途,所述用途用于治疗细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、衣原体感染性疾病、真菌感染性疾病、支原体感染性疾病、立克次体感染性疾病,例如酒渣鼻、青少年痤疮、特应性皮炎、生殖器疣和外阴上皮内瘤变、炎症反应、炎症反应综合征。
附图说明
图1.E.coli抗菌活性检测
图2.S.aureus抗菌活性检测
图3.AC-SH-17对体外培养的哺乳动物细胞的毒性实验
图4.细胞的炎性反应检测
图5.Ac-SH-17对LPS致脓毒症小鼠存活率的影响
具体实施方式
定义和通用技术
除非本文另作定义,否则结合本发明使用的科技术语应当具有本领域普通技术人员通常所了解的意义。一般来说,与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交学结合使用的命名法及其技术是本领域中众所周知并日常用的那些。
术语“多肽”涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”,并且是指由通过酰胺键(还被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指含有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链,并且不是指特定长度的产物。本发明的多肽可具有约10-30个或10-20个氨基酸大小,多肽可具有限定的空间结构,但是它们不必具有这种结构。本发明的一种实施例中抗菌肽采用人工化学合成的方法获得抗菌肽,对其羧基末端进行酰胺化处理。
卵黄蛋白原(Vg)是存在于卵生动物的非哺乳类性成熟动物血液中的一种蛋白,它属于大的转运脂蛋白超家族,作为卵黄蛋白的前体,几乎存在于所有的卵生动物中,包括鱼类,两栖类,爬行类,鸟类,大多数的无脊椎动物。卵黄蛋白原一般是外源合成,通过血液循环转运到卵巢中。
卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv)是在卵母细胞中,由天冬氨酸蛋白酶家族的组织蛋白酶D通过水解Vg而形成的,而Pv不仅具有保守的丝氨酸结构域还具有较高的含磷量,是目前已知的含磷量最高的天然蛋白质之一。在鸡、非洲爪蟾和硬骨鱼中,Pv可以含有高达50%的丝氨酸残基,这些丝氨酸残基可以与磷酸盐以共价键的方式链接,与钙离子以离子键的形式链接,从而使Pv具有转运磷酸盐及钙离子的能力。
本文所述术语“药物组合物”通过混合本发明的抗菌多肽和药学上可接受的载体来制备,所述载体为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者通常是无毒的,配制用于以液体形式、固体形式、气溶胶形式或其它口服摄入形式。在某些方面,本发明中提供的药物组合物可以用于治疗受试者的疾病的方法,其中所述方法包括向受试者施用:抗菌多肽、位点突变的抗菌多肽、同源序列的抗菌多肽、多肽衍生物或其药物组合物。
本发明药物组合物的受试者包括人和非人动物,例如哺乳动物,如小鼠,大鼠,豚鼠,狗,猫,兔,牛,马,绵羊,山羊和猪、鸟类,鱼类,爬行动物,水陆两栖动物等。所述术语还包括细胞和微生物;在一种实施例中,受试者选自细胞;选自小鼠成纤维细胞(L929)、冻细胞和人红细胞(RBC)。
可在本文中互换使用的术语“施用”是指本发明公开内容的抗菌多肽、位点突变的抗菌多肽、同源序列的抗菌多肽、多肽衍生物或其药物组合物足以改善被治疗疾病的一种或多种症状的量及给药方式。
抑菌活性:是指抗菌药抑制或杀灭病原微生物的能力,能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。以杀灭细菌为评定标准时,使活菌总数减少99%或99.5%以上,称为最小杀菌浓度(minimalbactericidal concentration,MBC)。在本发明实施例中,检测抗菌肽Ac-SH-17的抑菌能力,采用的是最小抑菌浓度。
如本文所用术语“病症或疾病”包括酒渣鼻、青少年痤疮、特应性皮炎、生殖器疣和外阴上皮内瘤变、炎症反应综合征等。
本发明实施例中所用材料革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌为:革兰氏阴性菌大肠杆菌菌株Escherichia coli 25922(ATCC 25922,E.coli 25922)、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌菌株Staphylococcus aureus 25923(ATCC 25923,S.aureus 25923)。
革兰氏阳性菌抗菌肽采用人工化学合成的方法获得抗菌肽,对其羧基末端进行酰胺化处理,合成产物纯度大于95%。合成的改造抗菌肽质检合格后,溶解于1%(v/v)的三氟乙醇(2,2,2-trifluoroethanol,TFE)中,配置为终浓度1mg/mL的母液,分装后储存于-20℃冰箱。
本发明实施例中所用试剂为:LB营养肉汤、DMSO(solarbio牌)、DMEM营养液(GIBCO)、胎牛血清(Hyclone)、1.8ml冻存管、0.25%胰酶(GIBCO)、PBS、10%胎牛血清的DMEM营养液、DMSO、MTT、胰酶。
本发明实施例所需仪器包括:4ml无菌离心管、摇床(培养条件37℃、150r/min)、水浴锅,离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、超净工作台、96孔板、水浴恒温振荡器、酶标仪等。
实施例1Ac-SH-17多肽的合成
1、选用取代度为0.5mmol左右的氨基树脂,树脂放入反应管中,加DCM(15ml/g),振荡30min。
2、接第一个氨基酸:通过沙芯抽滤掉溶剂,加入3倍摩尔过量的氨基酸,加入DMF溶解,再加入10倍摩尔过量的DIEA,,振荡60min。用甲醇封闭。
3、脱保护:去掉DMF,加20%哌啶DMF溶液(15ml/g),5min,去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g),15min。
4、检测:抽掉哌啶溶液,取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入检测试剂检测,105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
5、洗:DMF(10ml/g)两次,DCM(10ml/g)两次,DMF(10ml/g)两次
6、缩合:保护氨基酸三倍过量,HBTU三倍过量,均用尽量少DMF溶解,加入反应管,立刻加入DIEA十倍过量,反应30min。
重复操作,从右到左依次连接Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2序列中的氨基酸,脱除最后一个氨基酸Fmoc保护基。
7、从树脂上切割多肽:配制切割液(10ml/g)TFA 95%;水1%;EDT 2%;TIS2%,切割时间:120min。
8、吹干洗涤:将裂解液用氮气尽量吹干,用乙醚洗六次,然后常温挥干。
9、分析提纯:用高效液相色谱将粗品提纯。
10、冻干:收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩,冻干成粉末。
实施例2:改造肽Ac-SH-17抑菌活性的检测
2.1液体抑菌法定性分析改造肽的抑菌活性
准备8只4ml无菌离心管并编号1-8,在2-8号无菌离心管中加入1.5ml无菌营养肉汤,再取已配好的样品加入离心管1号和2号中,混匀2号离心管,再从2号离心管中吸出1.5mL到3号离心管,混匀3号离心管,再从3号离心管中吸出1.5mL到4号离心管,……最后从7号离心管中吸出1.5mL液体弃去,这样1-7号离心管中就含有质量浓度倍减的样品,8号作为阴性对照组,1号作为阳性对照组。最后,每个离心管中接入备用菌液1.5mL。每个样品做3个平行。立即取100μl置于酶标仪中测定其OD540,并记录为OD 0h。然后置于37℃恒温培养箱中培养,每间隔1h取100μl,测各离心管的OD540。根据吸光度变化情况可得细菌生长情况,确定多肽的抑菌活性和最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)。
2.2酶标仪比浊法定量分析改造肽的抑菌活性
1、菌液准备
用LB营养肉汤稀释菌液,将菌液调整至浓度为104CFU/mL。
2、多肽复性
用LB营养肉汤溶解多肽,并加入1%的三氟乙醇复性0.5h。
3、孵育培养
准备8只4ml无菌离心管并编号1-8,在2-8号无菌离心管中加入1.5ml无菌营养肉汤,再取已配好的样品加入离心管1号和2号中,混匀2号离心管,再从2号离心管中吸出1.5mL到3号离心管,混匀3号离心管,再从3号离心管中吸出1.5mL到4号离心管,最后从7号离心管中吸出1.5mL液体弃去,这样1-7号离心管中就含有质量浓度倍减的样品,8号作为阴性对照组,1号作为阳性对照组。最后,每个离心管中接入备用菌液1.5mL。每个样品做3个平行。立即取100μl置于酶标仪中测定其OD540,并记录为OD 0h。然后置于37℃恒温培养箱中培养,每间隔1h取100μl,测一次各离心管的OD540。
实施例3:Ac-SH-17的细胞毒性及溶血性分析
3.1细胞毒性实验
1、配溶液(5mg/ml MTT):称15mgMTT溶于3ml PBS中,在超净台中用0.22μm滤膜过滤,4℃避光保存(用锡箔纸包住);
2、称取材料各20mg、紫外灭菌24h、将材料溶于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,制成含样品浓度为5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml 5个浓度梯度的培养液;
3、接种细胞:L929生长旺盛的细胞消化下来,细胞悬液调整为104个/ml,细胞滴板,96孔板3块,每孔加100μl细胞悬液,CO2培养箱中培养24h,细胞贴壁;
4、加试样
空白对照组:PBS,无细胞
试样对照组:含材料的培养液培养细胞
阴性对照组:不含材料的培养液培养细胞
阳性对照组:含0.5%苯酚培养液
每组设3-5个平行样
5、吸弃96孔板中原培养液,分别加实验组,空白,正常对照组100μl/孔,每组3-5个平行样,24h、48h、72h三块板,在CO2培养箱中培养;
6、细胞形态观察,MTT法测OD值
分别于48h、72h、96h取出细胞板,在倒置显微镜下观察细胞形态,记录并拍照,弱光条件下,每孔弃原液,加100μl培养液,20μL MTT,37℃,CO2培养箱中孵育4-5小时,吸弃原液,加DMSO 150μl,振荡器上混匀8分钟,酶标仪490nm处测OD值,计算细胞相对增值率(RGR),并进行细胞毒性评价
RGR(%)=(实验组OD-空白组OD)/(正常组OD-空白组OD)*100%
3.2溶血性实验
使用人红细胞(RBC)检测Ac-SH-17的溶血活性。所有受试者均提供书面知情同意书。将获得的健康人血液置于EDTA抗凝剂管中。通过离心收集红细胞,并将其悬浮在PBS中,使其浓度达到4%(v/v)。将200μl红细胞悬浮液的等分部分与200μl不同浓度(12.5、25、50、100和200μg/ml)的Ac-SH-17溶液混合。37℃孵育后将混合物离心1小时,收集上清液并添加到96孔板中。将与PBS、BSA溶液(100μg/ml)或0.1%Triton X-100溶液孵育的红细胞分别用作空白对照、阴性对照和阳性对照。在微板读取器下,在540nm处测量吸光度。每组实验设置三个平行样,重复至少三次实验,结果使用two-way ANOVA方法进行显著性差异分析,以p<0.05为具有显著性差异。
表3.1溶血性分析Hemolytic activity of polypeptide
由表3.1可知,与阳性对照组相比,Ac-SH-17不具有显著溶血作用。因此可以认为Ac-SH-17对哺乳动物血细胞无溶血活性。
实施例4:抗菌肽抗炎实验
NO是可扩散的、膜透性的小分子,由NOS氧化L-精氨酸的过程中的得到的。在生物体内NO与许多生理反应有关。NO在高浓度时具有细胞毒性,在哺乳动物细胞免疫中有抗菌和杀虫的作用。但是在低浓度时,可以起信号作用可以正向调控和负向调控先天性免疫和获得性免疫。所以,通过检测细胞释放的NO浓度可以检测细胞的炎症反应。
以RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系为实验材料,培养于含有FBS(10%),青霉素链霉素双抗(100U/ml)的DMEM高糖培养基中。至细胞状态稳定,形状饱满,边缘透亮时用于实验。
4.1细胞处理
1、去除细胞中的培养基,使用常温的PBS轻轻吹洗两次以除去多余培养基。后加入0.25%的胰酶消化3min,轻轻拍打培养瓶使细胞脱落,再加入培养基终止消化作用。反复吹打使细胞均匀。
2、取一全新无菌6孔板(Corning,货号3516),向每孔中加入2ml细胞悬浊液,轻轻摇晃六孔板使细胞均匀铺满板中。后将6孔板置于37℃培养箱中孵育4h,使细胞充分贴壁,并达到密度为1.5×106cells/ml。
3、4h后取出6孔板,吸出培养基,后用PBS溶液清洗两次,再加入Opti-MEM培养基继续培养6h,以去除血清中特定成分对LPS的作用。
4、将细胞随机分为8组,分别为:(a)对照组:正常培养细胞组;(b)LPS处理组:用终浓度1μg/ml的LPS处理的细胞组;(c)BSA组:用10M的BSA处理的细胞组;(d)多肽组:用不同浓度的抗菌肽处理的细胞组;(e)LPS和BSA组:用终浓度1μg/ml的LPS和10M的BSA处理的细胞组;(f)LPS和多肽组:用终浓度1μg/ml的LPS和不同浓度的抗菌肽处理的细胞组。
5、向含有LPS的处理组中加入4μLLPS使体系内LPS的终浓度为1μg/ml,向对应细胞组加入PBS、BSA,放回培养箱中继续培养24h以引发炎症反应。期间注意观察细胞的状态,若细胞出现触角则有可能发生活化,此时细胞炎症因子的分泌情况较为复杂,不适宜继续进行实验。
6、将处理完毕的细胞从培养箱中取出,取上清液转移至新的无菌试管中,保存于-20℃冰箱待进行后续实验。
4.2本实验根据总一氧化氮含量测定试剂盒中所提供的方法检测NO,并加以改进,具体方法如下:
1、样品处理:将上清液分别用超滤管常温离心14000g,5min去蛋白,保留下层清液用于后续的测定。
2、稀释标准品:将1ml灭菌的ddH2O加入KNO2干粉中配成10mM的溶液,混合均匀后稀释成2、5、10、20、50μmol/L的标准品溶液备用。
3、试剂的准备:
A.加约1ml灭菌的ddH2O至5mgNADPH中,颠倒混匀溶解后,再用ddH2O定容至3ml,配成2mMNADPH,除立即使用的部分外其余NADPH溶液必须立即分装后于-80℃保存;
B.分别分装FAD,LDH,Nitratereductase后保存于-80℃备用;
C.Nitratereductase在临用前取出,其余各种试剂在溶解后置于冰浴上。GriessReagentI和GriessReagentII在使用前需平衡至室温;
4、检测NO:
A.取样品或标准品30μl于96孔板中,每个样品3个重复。
B.分别加2.5μl的NADPH,5μlFAD,2.5μlNitratereductase于样品中,充分混合均匀,加样过程中注意避免毛吸现象。37℃孵育15min,或者室温(20-30℃)孵育40min。
C.分别加入5μlLDABuffer,5μlLDH于样品中,充分混匀。37℃孵育5min,或者室温(20-30℃)孵育20min。
D.依次加入25μlGriessReagentI和GriessReagentII,混合均匀后室温(20-30℃)孵育10min。然后测定540nm处的吸光度,记录读数。
5、制作标准曲线并计算样品中一氧化氮的浓度。
实施例5抗菌肽抗脓毒血症实验
脓毒症(sepsis)是指由感染因素所致的全身炎症反应综合征。通过向模型大鼠的腹腔内注射大鼠粪便匀浆的方法建立肠源性脓毒症大鼠模型,后通过腹腔注射抗菌肽,观察小鼠在10-48h内的存活率,以此来评价抗菌肽对于小鼠脓毒血症的治疗情况。
5.1对实验动物进行分组。
将60只SD大鼠采用随机数表法分为6组,分别为模型组1、模型组2、模型组3、模型组4、模型组5和空白组,每组各有10只大鼠。对这6组大鼠依次进行称重和编号。
5.2进行内毒素血症大鼠模型的复制.
5.3进行粪便匀浆上清液的制备。
对这60只SD大鼠进行1周的适应性饲养后,收集其新鲜成形的粪便。对大鼠粪便进行称量后,向其中加入适量的生理盐水,然后将该混合物置于匀浆机中进行充分的研磨,制备成浓度为10%的大鼠粪便匀浆。按3000转/min的转速对大鼠粪便匀浆进行5min的离心处理,得到上清液,然后用注射器吸取适量的上清液备用。
5.4进行大鼠模型的制备。
在进行造模前,使1-5组模型组大鼠禁食12h,然后按1ml/200g的剂量向其腹腔内注射浓度为10%的大鼠粪便匀浆上清液。在注射完成后,观察这5组大鼠的体征及表现。这5组大鼠若出现蜷缩、少动、精神萎靡、毛发不荣、寒颤、鼻周有明显血痕等体征,则表示造模成功。将造模成功的大鼠作为本次的研究对象。
将模型鼠随机分为两组,模型组与给药组。给药组在造模成功后进行腹腔注射抗菌肽(80μM)0.5ml,各组给相同量的水及饲料,分笼饲养。观察所有小鼠的活动及摄食情况。
实施例6:细胞系及其培养
本研究用小鼠上皮样成纤维细胞L929细胞作为实验材料,于含10%FBS的DMEM培养基中进行培养,培养环境设定为37℃,4%CO2。
6.1细胞的复苏
1、从液氮罐中取出冻存管,迅速放入37℃水浴(1-2min溶解)
2、加入培养液(1ml冻存液细胞+4ml新鲜培养液),移于培养瓶,置恒温培养
3、倒置显微镜观察到小黑点悬浮
6.2细胞的传代
1、培养液(含悬浮的细胞):用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中;
2、贴壁部分:用1mlPBS洗细胞,吸出PBS放入到第1步装有培养液的离心管中收集
3、培养瓶加入胰酶1ml,放入培养箱静置消化;
4、消化时间跟据细胞特性有所不同,显微镜下看到细胞明显收缩变圆,侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化,全程不要拍打培养瓶;
5、用3ml含血清的培养基终止消化,将消化下来的细胞悬液吹散细胞后收集到第1步的离心管;
6、将离心管在1200rpm(约250g)3min离心,离心完毕弃掉上清,加入新的培养基重悬,按实际情况分瓶,放入培养箱培养
6.3细胞的冻存
1、超净台紫外灭菌30分钟,通风10分钟,培养液、胰酶、PBS在37℃预热,仪器及冻存管高温高压灭菌
2、将细胞洗脱下
吸出细胞培养瓶中液体—3mlPBS洗一遍—吸出—3ml0.25%胰酶消化3分钟—2ml消化液终止消化—反复吹打洗脱下细胞—1000g3min离心—1.2ml冻存液悬浮沉淀的细胞—放入冻存管中—封口—4℃冰箱30min—-20℃冰箱1h—-80℃冰箱过夜—液氮罐保存
实施例7:实验结果
如图1、2所示,针对2种药物敏感型菌株,改造后的抗菌肽Ac-SH-17具有抑菌活性,其抑菌活性从图3中结果可以看出,在20μM时多肽AC-SH-17未出现明显的毒害损伤作用,故此可以推定,AC-SH-17对体外培养的哺乳动物正常组织细胞不具有显著毒性。
图4中在用1μg/ml的LPS刺激诱导细胞炎性反应后,其NO的释放浓度达到12μM(M),后期添加不同浓度的抗菌肽发现,当抗菌肽浓度达到80μM时,其对于NO的释放进行了显著抑制,NO的释放浓度与空白对照之间基本持平。所以得到结论,抗菌肽在一定的浓度条件下,能够有效抑制细胞的炎性反应。
图5在相同条件下饲养小鼠48h后发现,相对于模型组,给药组在24h内能够显著提高脓毒血症小鼠的生存率。因此可以认为,抗菌肽Ac-SH-17对于脓毒血症具有良好的治疗抑制作用。
Claims (10)
1.一种新型抗菌多肽,所述抗菌多肽包含氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2。
2.如权利要求1所述的新型抗菌多肽,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2可以有1个和/或几个氨基酸的替换,替换后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
3.如权利要求1所述的新型抗菌多肽,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2在羧基端和/或氨基端增加1个和/或几个氨基酸,增长的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
4.如权利要求1所述的新型抗菌多肽,所述氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2有1-5个氨基酸的增加或减少,增加或减少的氨基酸可以集中或分散在所述氨基酸序列的任意位置,改变后的氨基酸序列的抗菌活性并没有明显降低、或保持相当的抗菌活性、或具有明显增强的抗菌活性。
5.一种新型抗菌多肽,所述抗菌多肽包含与氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2具有90-100%同源性的氨基酸序列。
6.一种抗菌药物组合物,所述抗菌药物组合物含有权利要求1-5任一项或多项所述的抗菌多肽,以及药学上可接受的辅料。
7.一种抗菌药物组合物,所述抗菌药物组合物中还含有不同于权利要求1-5任一项或多项所述的抗菌多肽的其它活性成分,所述其它活性成分可以为抗生素、免疫调节剂、矿物质、微量元素和/或维生素。
8.一种核酸分子,所述核酸分子编码抗菌多肽,所述抗菌多肽包含氨基酸序列Ac-SRMKKWAKIIEKWRKWH-NH2。
9.一种宿主细胞,所述宿主细胞能够表达权利要求1-5任一项或多项所述的抗菌多肽。
10.权利要求1-5任一项所述的抗菌多肽在制备治疗微生物感染性疾病的药物中的用途,所述微生物感染性疾病包括细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、衣原体感染性疾病、真菌感染性疾病、支原体感染性疾病和/或立克次体感染性疾病。
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