CN1144597C - 转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本方法是取转基因抗菌蛹蛆原料，冷冻粉碎裂制成匀浆，按比例加蒸馏水搅拌放入加层锅升温，使蛋白变性，降温抽滤除去蛋白，滤液用微孔滤膜除去残渣至透明液体，经两次超滤浓缩再除去大、小分子，最后过层析柱，使其药液抗菌肽活性蛋白纯度达95%，经各项指标检定符合兽用基因生物药品和抗菌肽饮料添加剂的要求。取代兽用抗菌素对动物感染性疾病的治疗和常用抗菌素饲料添加剂，减少动物体内存留抗菌素的残留量对动物给人类的危害。因为抗菌肽它不但抗菌谱广，疗效确实，无抗药性和无毒副作用，而且分子量小，无过敏原，能耐热，性能稳定，易于贮藏，用量小，以微克计算，可作用于多种途径。

Description

转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用

所属领域

本发明涉及利用转基因蝇蛆提取抗菌肽属于基因工程生产抗菌肽药品和生物饲料添加剂的技术领域，特别是从转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用。

技术背景

在自然界，苍蝇是传播疾病的重要媒介害虫，能给人、畜传染多种疾病，但自身并不染病。苍蝇对恶劣环境具有极强的适应能力和有效的防御机制。大量研究证实，任何病菌在苍蝇体内的存活最多不超过7天，而只要有万分之一浓度的苍蝇抗菌物质，就可以杀死多种病菌，其效力是目前人类已发现的任何一种抗菌素所无法比拟的。在目前和少病原菌对已有抗生素逐渐产生耐药性，而新的抗生素发现又极为困难，苍蝇抗菌肽不乏是抗菌素的最佳选择。苍蝇的抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以成为新一代不会在人、畜体内形成抗药性的超级抗生素药物。

兽用抗菌肽和动物饲料添加剂，它不仅关系到动物疾病防治和动物体本身和群体健康繁育去获得更大的经济效益和环境效益外，更重大的是社会效益，关系着人类的健康。对它的要求应当把它与人类要求看作同等重要或放在同等位置来认识和处理。因为它关系着人类食品结构的改变和人类健康的切身问题。

美国的马盖宁制药公司于1987年开始致力于Magainin的商业性研制，马盖字(一种蛙皮肽)作为人用药。2000年批准上市后，当年销售额即达10亿美元。“马盖字”商品的问世，它不仅为人类新一代抗菌素打开大门，而且也为动物抗菌素开拓了广扩的前景。

现代研究证实，抗菌肽广泛存在于动物(昆虫)，植物和微生物中，采用纯化方法难以获得大量的抗菌肽。我们将人工合成的一种外源性抗菌肽，采用基因工程方法实现转基因家蝇繁育蝇蛆获取抗菌肽为工厂化生产高含量抗菌肽奠定了坚实基础。

发明内容

本发明的目的是利用现代技术手段，转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用，包括抗菌肽饲料添加剂。

转基因抗菌肽是一种新型的兽医生物制品，它是用生物技术包括上游技术(转基因抗菌肽工程蝇的构建)，涉及目的基因合成、纯化、测序、克隆、电转移技术导入受精卵；中游技术家蝇繁育、工程蝇筛选、蝇蛆诱导、收集、贮存；下游技术涉及到目标蛋白纯化、工艺放大、质量检测与检定，使其产品安全性、有效性、稳定性和时效性融为一体。

转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，收集蝇蛆→蝇蛆抗菌肽含量测试→低温深冻、贮存原料→低温粉碎、制成超微匀浆→抽提去除杂质→分离纯化→鉴定各项指标→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分装。

一、转基因抗菌肽家蝇与相关基因药物生产方法之比较。

从基因的发现到转基因小鼠的问世，几乎经过了一个世纪，确实说明了影响深远的基础研究成果转化为应用技术的不容易。可是，一旦获得首创性突破，就会呈现迅猛发展趋势。自从“巨鼠”出世以后，转基因技术的研究犹如雨后春笋，国内外竞相研究，幻想与成果此起彼伏，不断出现，形成了科学幻想与现实同行之趋势。

转基因动物作为一门只有十几年历史的高新技术成果，既具有深远的理论研究价值，以具有重大的应用价值。在转基因动物的实际应用方面，涉及生物医学、农牧业和药物产业等诸多方面，其价值之大，作用面之广已越来越被人们所认识。在基因药物质三个发展阶段中，其表达系统的层次是不一样的，即从原核细胞(细菌等)、真核细胞(人类或哺乳动物细胞)、再到个体，转基因动物是一种个体表达系统，也是最复杂、最具有前景的生物表达系统。目前对三种基因药物生产方式之比较，转基因药物成本和制药成本是最低的，而转基因蝇蛆抗菌肽又是转基因药物之中最低的。因此蕴含着巨大的经济效益。

二、抗菌肽基因合成与克隆

抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是昆虫等动物产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，研究发现它有广谱抗细菌、抗病毒的功能，对真菌、原虫也有作用，甚至有抗肿瘤活性。由于抗菌肽有重要的临床作用价值，其研究进展十分迅速，其中许多抗菌肽的cDNA已被克隆测序。用基因工程手段将抗菌肽基因导入动植物体内进行表达，可望用抗菌肽杀死侵入机体内的病原，建立高效抗病的转基因动植物，也可采用融合表达方式在E.coli-1的氨基酸序列，兼顾鱼类、昆虫和大肠杆菌偏爱的密码子，设计其基因序列，加上适宜基因工程操作的酶切位，经人工合成2条分别为92bp和91bp的寡聚核苷酸片段，互寂链延伸反应，EcoRI酶切，将完整的Shiva-1基因反向克隆至Puc18载体，经PCR检测和序列分析，正确的克隆了抗菌肽Shiva-1基因，为E.coli融合表达及转基因蝇蛆抗菌肽提供了关键技术环节。

三、用转基因技术及抗菌肽基因导入家蝇受精卵

以抗菌肽Shiva-1基因为基靶基因，利用BAEKON6000型基因转移仪进行了家蝇转基因是将收集家蝇(Musca Domcstica)新产受精卵(1-1.5小时内)，在脉冲电压(Amplitude)1500V、脉冲时间(Bvrust Time)1500ms、脉冲数(Number of Pluscs)1000、脉冲宽度(Pulse Width)100us、周期(Cycle)50、距离(Distance)2mm、PH值6.0-8.0及离子浓度为0.001-0.01μmol/L缓冲液等条件下，将10μg/ml环状质粒DNA与家蝇卵混合后进行转移，取转移后人工孵化24-36小时的家蝇幼虫，提取染色体DNA，通过PCR特异片段扩增及Southern检测，证明抗菌肽Shiva-1基因在家蝇染色体上实现了整合，而且遗传至子代。应用本方法建立的电转移条件对家蝇进行基因转移，成活率在20-40％之间，外源基因在成活家蝇的整合率在10％左右，同时本法具有操作简便、快速等特点。只要十几分钟就能完成数百枚卵的基因导入。

四、转基因抗菌肽家蝇蝇蛆的饲养

将转基因抗菌肽幼蛆接种放入已配合好的蝇蛆饲料中，饲料配方按麦麸、奶粉、白糖、米粉、豆饼粉，使配料松软透气，也可适度增加酵母及蛋白质的含量，以利幼蛆的生长与发育。先将配好的饲料置于饲养盒(框)中，厚度以不超过4-5公分为好，后用接种小铲将孵化盒中所孵化出的一龄幼蛆(种子)铲出并慢慢放入饲养盒中的饲料上，接种量不可过密，也不能过稀。

幼虫(蛆)在饲养盒中吃饲料时，一般是自上而下，若饲养盒中的培养物要注意温度、湿度和PH值以及室内光线和通气。要随时检查，温度、湿度和PH值，饲料及蝇蛆的密度，及时调整方最佳状态。

幼蛆从卵孵化出，体长约2毫米，24-36小时幼蛆进行第一次蜕皮，再经过一次蜕皮成为老熟幼虫，此时体长可达12-14毫米，整个幼虫期为5-8天。

成熟的老熟幼虫(蛆)即停止取食，改变趋向，静止化蛹。饲养人员可及时给予这样的环境使之化蛹保种。同时，大量成蛆(老熟幼虫)分离出来加入适度缓冲液，降低含氧量，并超声波方法进行诱导之后，贮存于低温冷冻作为产品原料或商品贮存备用。

种蝇培养：要在严密隔离下，取原种在良种繁育室中繁育，至少选取1000对或1000对以上的优良个体混合接种作为原种和原种：三级扩繁根据种性对原原种从形态学上逐个选择，以保证种的纯度。为保证种群遗传稳定性，种群大小应保持在1000对或1000对以上，留种时采用多家系混合接种。原原种的下一级为原种，原种的种群大小可根据生产的规模而定，在原种生产过程中应不断淘汰不良个体。原种的下一下为生产种。种蝇培养过程中，防止自然界中野生种混入。

成虫饲养采用笼养法：原种蛹在羽化之前，以消毒剂如1-2％的次氯酸钠、8-15％的次氯酸钙等灭菌20-40分钟，洗涤后羽化。适宜饲养温度为25-32度相对湿度为70-90％，每日需有5小时以上自然光照或人工光照。每一培养周期完成后，洗涤所有器具，对饲养工具和饲养室进行常规灭菌。

幼早饲养是将成虫产的卵采用开放式皿养法。饲养室常规灭菌对幼虫饲料时行跟踪检测，分析饲料中的重金属含量，以决定饮料的取舍，饮料中铅、汞、铬含量不得超过2ug/g；镉、砷的含量不得超过0.2ug/g。适宜饲养温度为25-30度，可在暗处饲养。

生产的蝇蛆必须洁净，不携带致病菌，幼虫表皮重金属含量低，可作为保健食品，药品和医用材料的原料。成蝇种群纯度高、生命力旺盛。

五、工厂化高效转基因抗菌肽蝇蛆养殖

1、建立太阳能塑料大棚温室。参照现代农业设计和制药GMP要求，人流物流分开，有计算机调控各种参数，规模以日产1-5吨为宜。

2、设计制造蝇蛆规模化机械化养殖和蝇蛆与饲料混合分离机。

3、建立稳定蝇蛆饲料加工厂和小型奶牛场，用鲜奶取代奶粉以获更好效益。

4、要有专职人员饲养转基因抗菌肽蝇蛆工程家蝇，以保证蝇蛆有抗菌肽高含量高活性稳定的质量。

六、从转基因抗菌肽蝇蛆制备兽用抗菌肽药品和饲料添加剂的方法

从转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用抗菌肽药品和饲料添加剂的工艺可人分为转基因抗菌肽蝇蛆原料的贮藏、蝇蛆抗菌肽粗品提取、精品纯化，分装灯检与包装。

1、蝇蛆原料要求与贮藏：原料要从工厂化无菌饲养转基因家蝇的蝇蛆低温库保存中领取。要有转基因抗菌肽蝇蛆、重金属和相关卫生指标的检定报告。若用抗菌肽蝇蛆蛋白饲料可将蝇蛆干燥粉碎包装备用。

2、粗品提取：冷冻的转基因抗菌肽蝇蛆用绞肉机绞碎，再用胶体磨碎磨制成匀浆，倒入大罐内，按匀浆量1∶1加入蒸馏水置入加层升温锅，使温度加热至100度，持续20分钟，用输液泵把药液输入滤槽内进行过滤，再将药液放入水槽冷却，微孔滤膜过滤除去残渣，药液为抗菌肽粗品，置于2-8度保存。若用于饲料添加剂，将粗品药液用冷冻喷雾干燥包装即有应用。

3、精制纯品：取微孔滤膜除去残渣的抗菌肽药液再用5000分子量超滤膜超滤除5000以上大分子，然后用3000分子量超滤膜除3000以下小分子，浓缩最后过层析柱，分离得到的半成品原液其抗菌肽纯度达95％。也可将加热或温后的匀浆，用大容量低温离心收集上清液，将上清液加入硫酸铵沉淀，离心分离收集沉淀，然后在沉淀中加入缓冲液溶解，离心分离收集上清液，上清液经G-25脱盐、DEAE离子交换柱、phenyl疏水层析过柱、S-100凝胶层析柱分离得到合格的半成品原液，纯度也可达95％。

4、分装、灯检及包装

将检定合格的半成品原液加入赋型剂以及保护剂按生产所需规格稀释，稀释液经过筒式过滤器除菌，经过热源质、无菌试验合格后，经过分装机装入西立瓶，进行轧盖、灯检。抽样做成品检定，经过成品检定合格后可包装入库。

七、兽用抗菌肽药品理化性质及质量检定

基因抗菌肽药品是利用转基因抗菌肽家蝇受精卵工程技术构建的工程家蝇繁育出的蝇蛆提取纯化而成的。兽医临床上主要用于治疗感染性疾病代替抗菌素，对动物感染真菌、病毒也有很好的治疗作用。抗菌肽饲料添加剂也主要代替抗菌素添加剂避免动物体内残留量对人类的危害。

按照WHO《保证DNA重组技术药品质量的指导原则》和国家新药的要求，结合本品的生产工艺特点，参考国内外兽医药典及国内外企业相关标准，对兽用基因抗菌肽的性化和质量进行检定。目前兽药之方标准不明确，主要参照人用药标准进行。

1、性质鉴别

DNA重组药物质量控制，可利用制品的分子量、电荷、等电点、氨基酸组成和疏水性等化学物理性质，采用现代分析手段，如聚丙烯酰胺凝胶电沪、等电聚焦、排阴色谱、反相色谱、离子交换色谱。肽图分析、氨基酸分析、紫外光谱、园二色散等其它光谱技术进行严格分析鉴定。本项目据国内现有条件参照国外标准，暂定三项鉴别试验：

1)还原型SDS-PAGE法测定迁移率，样品迁移率应与对照品一致，以证实基因药物与天然药物分子量大小一致。从一个测面反映二者的同质性，用SDS-PAGE(还原法)。

2)RP-HPLC法测定保留时间，本标准采用BP的方法，以含有正丙醇的Tris缓冲液作为流动相，该法能鉴别带甲硫氨酸的与无甲硫氨酸的重组基因人抗菌肽。样品保留时间应与对照品一致(＝2％)以证实二者在疏水性方面具有同质性。用鉴别与相关蛋白测定方法。

3)肽图谱

本标准采用BP的方法，用胰蛋白酶裂解样品与照品，采用RP-HPLC法分离裂解的片段，在214mm波长处检测，从肽图谱上可以鉴别基因药物与天然药物在蛋白质一级结构上是否具有同质性。因为肽图说对第一蛋白质来说都是特征的、专一的。因制剂中非抗菌肽成份影响肽图分析，与对照图谱一致。用胰肽图谱方法之质量检定。

2、质量检定

(1)宿主蛋白

由于转基因药物临床时间短，宿主蛋白是否其有危害性还难以在短期内观察到，因此还需要控制其含量。本标准采用斑点免疫分析法，其检测灵敏充达2ng。检查国内各批原料中含宿主全民所有制不得过30ng/mgpro，制剂可不做此检查。用宿主蛋白测定方法。

(2)残余DNA

作为外源DNA，被认为是具有潜在致癌性杂质。WHO要求每项剂量药品中残余DNA含量应＜100pg。本标准采用非放射性地高辛标记DNA作控针，并与待测样品中的同源DNA序列进行分子杂交，用免疫学法显色，通过比较样品与标准DNA的显色程度，来检查样品中残余DNA的量。该法灵敏度可达1pg。BP标准中未规定其限量，故本标准规定同WHO的要求，制剂不做此项检查，用残余DNA含量测方法。

(3)相关蛋白

主要指氧化抗菌肽及其它相关抗菌肽，这些成份多不具有抗菌肽的生物活性，其过量存在将大大影响抗菌肽的疗效。BP标准规定，总相关蛋白，原料中应＜10％，故暂订为不得过10％，用鉴别与相关蛋白测定方法。

(4)高分子蛋白

主要指二聚和多聚抗菌肽，它们不具有生物活性，产品中其含量高时将极大影响药品的疗效。本标准采用和BP的方法(HPSEC法)，检测国内产品，其高分子蛋白量均＜4％，故本标准暂订为原料与制剂中含量高分子蛋白应＜4％。用高分子蛋白与含量测定方法。

(5)脱氨组份

抗菌肽分子含有的Asn和Gln，在一事实上条件下会脱去氨基，表现为等电点降低。本标准采用等电聚焦电脉检查原料与制剂中的脱氨组份。目前所测国内试验正式产品均未检出脱氨组份。BP中采用此方法，仅作鉴别，Kabi企业标准用此法，并规定脱氨组分应＜10％，因此本标准暂订＜10％，用等电聚焦法。

(6)活性测定

用的平四琼脂糖孔穴扩散法进行了改进，命名检测敏感性提高2.2-3.8倍，抗菌肽含量为0.1ug时即可观察到有明显的抑菌圈子。薄层平板法可保证琼脂糖厚度一致，从而提高检查结果和稳定性，同时由原来的半定量发展为定量测定。用薄层平板琼脂糖孔穴扩散法。

(7)纯度

本标准采用银染法非还原SDS-PAGE法，BP标准不用此法，USP标准草案及国外企业均采用此法，故本标准用薄层扫措电脉胶片，按归一化法计算主要成份相对百分含量，规定纯度为98％。用SDS-PAGE(非还原型)方法。

(8)基因药物半成品无菌、内毒素等均应符合注射剂要求。

4、含量测定

(1)基因抗菌肽含量目前BP、EP和USSP标准草案及国个企业标准均采用HPSEC法测定抗菌肽含量，已无生物效价测定项目。所用色谱条件基本一致。制剂以ug/瓶标示。本标准依据BP的方法，并以“马盖字”(蛙抗菌肽)样为对照，测定原料与制剂中抗菌肽单体含量。参照USP草案，本标准暂订制剂中抗菌肽的含量应为标示量的90-11％。

(2)总蛋白含量的测定：总蛋白测定采用了USP标准草案和“马盖字”样品标定所用方法，即紫外吸收系数法，该法具有简便、快速、准确的特点。取本品，用水配成1mg/ml的深液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在适度nm的波长和适度nm的波长处检测吸收度，按吸收系数(EL％C)为0.8，以下式计算即得。

八、基因兽用抗菌肽药物指标控制要点

抗菌肽饲料添加剂纯品主要是活性和效价测定，其他项目不作要求，抗菌肽蝇蛆蛋白饲料添加剂，主要是测定抗菌肽含量50000单位/KG分装。

下述项目与指标参照人药标准，制出符合基因兽用生物药品质量要求。Lowos检测蛋白含量             1.65         外观检查             微色液体SDS-PAGE电泳纯度测定          ＞95         PH值                  6.55HPLC纯度测定                  100          无菌试验              合格SDS-PAGE电脉分子量测定        3300         热原质检定(家免法)    合格等电聚焦电泳等电点测定        5.5          内毒素试验(鱼试剂法)  ＜kc/n特异性及纯度检测(免疫印迹法)  阳性         安全试验              合格残余DNA检测                   ＜10pg/mg    稳定性试验            合格宿主蛋白含量测定         ＜510pg/mg全自动紫外全波段扫描     276.9效价测定                 4.72肽图谱测定               合格N端氨基酸序列    与理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性测定             50ug/ml

本发明的特点：规模大，适用于产业化生产；工艺流程短、简便，可连续操作；收率高，抗菌肽回收率可达70％；纯度好，活性抗菌肽蛋白纯度可达95％；各环节质控指标严，产品合格率可达到95％。

(一)基因兽用抗菌肽代替抗菌素药物的必要性——目前抗菌素存在的主要问题：

抗菌素是指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年青霉素应用于人和动物临床到现在抗生素已达上千种。经常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。大致可分以下几类：

1、B-内酰胺类青霉素和头孢菌素类的分子结构中含有B-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类(thienamycins)、单内酰环类(monobactams)，B-内酰酶抑制剂(B-lactamade inhibitors)等。

2、氨基糖甙类，包括在链霉素、庆大霉素、卡娜霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素等。

3、四不素类，包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。

4、氯霉素类，包括氯霉素、甲砚霉素等。

5、大环内脂类，临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、殚迪霉素、交沙霉素等。

6、作用于G+细菌的共它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。

7、作用于G菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。

8、抗真菌抗生素如灰黄霉素。

9、抗肿瘤抗生素如丝霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。

10、具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。

以上十类抗生素约几百种，如何合理选择动物用药和饲料添加剂实属难题。耐药细菌的急剧增长。一般来说，所有抗生素在应用过程中都可能出现的不良反应。这些不良反应在动物体内过程与疗效关系都难判定。如B-内酰胺类的致敏性；氨基糖甙类的耳毒性，五环内脂抗生素在动物上应用量大，面广、品种多、更新快、各类药品之间相互作用关系复杂，因此抗菌药物在应用中发生副作用及耐药性仍然逐年增加。这些问题的发生，主要由抗生素本身决定的。所有抗生素选用很难，兽用抗菌素应用于动物，在畜体内存有大量残留量，给人类带来潜在的危害是不可估量的，急需用换代产品来替代抗生素的应用。

(二)基因兽用抗菌肽药物和饲料添加剂的有效性和安全生

1、抗菌肽的抗感染作用：抗菌肽的主要作用和生物学效应在它的名称上已有体现，研究发现不同来源的抗菌肽均具有广谱抗菌作用。对革兰氏阳性菌和阴性菌均有杀伤作用。实验证实对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、念珠球菌、绿脓杆菌、结核杆菌、肺炎克雷氏菌、粘质沙雷氏菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、粪链球菌都有很好的抗菌效果。对治疗创伤、烧伤等细菌感染和败血症休克有很好的治疗作用，对病毒、真菌、原虫也有杀伤和抑制作用。

2、抗菌肽遗传毒理学实验安全。

经用Ames试验、啮齿动物微核试验和睾丸细胞染色体畸变试验，证明抗菌肽的遗传毒理学效应安全可靠，测试抗菌肽对小鼠无蓄积毒性。不存在潜在的危害性。

(三)抗菌肽的作用机理

抗菌肽具有广谱杀菌作用，包括对革兰氏阴性细菌和革兰低阳性细菌，尤其对耐药菌株有明显抑杀作用。另外，对某些真菌如粗糙链孢霉、绿色术霉、大刀镰孢等有显著效果。关于抗菌肽的杀菌机制。Christensen等以脂双层为模型详细描述了抗菌肽作用于膜的过程。首先是抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面，在后疏水尾巴插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜的构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成了离子通道，造成物质泄露和细菌死亡。1996年，Lockey利用电子显微镜和免疫胶体金技术观察到天蚕素(cecropin(A结合到大肠杆菌(r.)膜上，形成一个9.6nm直径的病灶，形成的孔洞直径4.2nm，也洞导致细胞内容物外泄，细菌死亡。Juvvadi通过对天蚕素A和蜂素素(melittin)杂合体的抗菌作用研究，推测抗菌肽的抗菌作用的第一步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间的相互作用，接着是与膜上碳氢化合物的相互相作用，然后肽分子的疏水，螺旋插入膜上，聚合形成孔道，导致内容物外泄，细菌死亡。1997年，Silvestro研究发现天蚕素A在低浓度时可改变脂质体的膜电化学离子梯度，同样浓度下也可改变革兰氏阴性菌的膜离子梯度，但在更高浓度下才会引起细胞内容物的释放。所以天蚕素A是通过改变膜离子梯度来杀死细菌的。而1998年，Park却发现蛙的一种抗菌肽BuforinII与昆虫抗菌肽的抗菌机理不同，没有裂解细胞膜，而是穿过膜，结合到DNA、RNA上，快速导致细菌死亡。目前，化学合成的抗真菌药物副作用较大，而抗菌肽的毒副作用小，且具有热稳定、抗菌谱广等特点。但目前抗菌肽抑杀真菌的作用机理研究较少。Cavallarin发现位于Cecropin衍生物N末端，螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关。1998年，Lee用激光共聚焦显微镜观察真菌受抗菌肽作用后，细胞膜上也有洞形成，用流式细胞仪检测，对荧光敏感性增强。

(四)兽用基因抗菌肽的使用方式

注射用基因兽用抗菌肽系采用转基因蝇蛆工程技术生产，结构与天然抗菌肽一致、高纯度的液体制品，具有显著广谱抗菌作用，同时还有抗病毒，抗真菌等功能。

适应症：本品主要用于治疗各类感染性疾病，对革兰氏细菌和金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌结核菌等有很好的治疗作用。也可用病毒和真菌感染，对肿瘤也有一定的治疗作用。

用法和用量：供皮下或肌肉注射。每天一次，动物种类不同，剂量不同时，犬每次50ug/ml，猪、羊是犬3-5倍，马牛大动物是犬的10倍。剂量和治疗时间也可视具体情况在兽医的指导下适当调整。

不良反应：患畜注射本品一般无不良反应。

注意事项：本品溶解时如有浑浊沉淀、包装瓶如有损坏以及过期失效者不得使用。

规格：本品为水剂，每支包装含基因抗菌肽50ug/ml、100ug/ml。

有效期：本品自生产之日起四年内有效。

储存：自然温度避光保存。

抗菌肽饲料添加剂纯度，按5000活性单位/KG添加。抗菌肽蝇蛆蛋白质饲料按饲料抗菌肽含量调配全量饲料。以每公斤饲料5000活性单位计。

具体实施方式

实施例1：

从冷冻库中提取转基因抗菌肽蝇蛆的合格原料10公斤，将冻块分割绞碎制成匀浆，加10公斤蒸馏水水搅拌，升温100度持续20分钟，降温除去变性蛋白及残渣，两次超滤浓缩，过层析柱，置于2-8度低温保存，供兽用抗菌肽药品用。

实施例2：

从转基因抗菌肽家蝇工厂化无菌饲养场冷冻库取回转基因抗菌肽蝇蛆，新鲜原料100公斤，用绞肉机绞碎，放入大型胶体研麻成匀浆，再加入100公斤蒸馏水搅拌置入加层升温锅，升温至100度持续20分钟，降温用输液泵过滤除去变性蛋白，再用微孔滤膜除去残渣，冷冻喷雾干燥，检测活性蛋白，供饲料添加剂配制用。

实施例3：

从转基因抗菌肽家蝇工厂取回新鲜转基因抗菌肽蝇蛆置于粮食种子干燥机，温度一般超过50度，干燥，然手用200目粉碎机粉碎为粉末，测试抗菌肽活性蛋白，使每公斤含抗菌肽为5000活性单位，为抗菌肽蝇蛆蛋白饲料。

Claims (4)

1、转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，收集转基因抗菌家蝇蝇蛆→蝇蛆抗菌肽含量测试→-40℃——-20℃低温深冻贮存→-20℃低温粉碎、制成超微匀浆→抽提去除杂质→分离纯化→鉴定各项指标→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分析。

2、根据权利要求1所述的转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，从冷冻库中提取转基因抗菌肽蝇蛆的合格原料10公斤，将冻块分割绞碎制成匀浆，加10公斤蒸馏水搅拌，升温100度持续20分钟，降温至30-40℃除去变性蛋白及残渣，两次超滤浓缩，过层析注，置于2-8度低温保存，供兽用抗菌肽药品用。

3、根据权利要求1所述的转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，从转基因抗菌肽家蝇工厂化无菌饲养场冷冻库取回转基因抗菌肽蝇蛆，新鲜原料100公斤，用绞肉机绞碎，放入大型胶体研磨成匀浆，再加入100公斤蒸馏水搅拌置入加层升温锅，升温至100度持续20分钟，降温用输液泵过滤除去变性蛋白，再用微孔滤膜除去残渣，冷冻喷雾干燥，检测活性蛋白，供饲料添加剂配制用。

4、根据权利要求1所述的转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，从转基因抗菌肽家蝇工厂取回新鲜转基因抗菌肽蝇蛆置于粮食种子干燥机，温度一般超过50度，干燥，然手用200目粉碎机粉碎为粉末，测试抗菌肽活性蛋白，使每公斤含抗菌肽为5000活性单位，为抗菌肽蝇蛆蛋白饲料。