CN111808771A - 蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉、制备方法及其应用，涉及蜜蜂的病害防治技术领域，将蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉混合，经冷冻干燥，取得含有蛋白质、脂肪、碳水化合物水、灰分、微量元素、维生素和氨基酸的培养粉，该培养粉含有幼虫芽孢杆菌生长所需的营养物质，可用于蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室分离培养，方便操作，培养周期仅须1～3天，利于对蜜蜂是否携带美洲幼虫病的快速判定，利于人们及时采取防治措施。
Description
技术领域
本发明涉及蜜蜂的病害防治技术领域。
背景技术
蜜蜂(Apis mellifera L.)是重要的经济昆虫，蜜蜂作为传粉媒介的重要组成部分，是全球生物多样性的重要因素。同时，蜜蜂生产出的蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆、蜂胶等等蜂产品也是重要的保健食品和化工原料。因此，养蜂业不仅是现代畜牧业的一个重要分支，更是现代农业的一个重要组成部分。
然而，目前在全世界范围(包括中国)蜜蜂的种群数量逐年递减。在引起蜜蜂种群锐减的诸多因素中，病原体对抗生素产生耐药性，是导致蜂群疾病防控失败的主要原因。随着抗生素类药物的长期使用，蜂群耐药性病菌不断出现，药物抗性问题日显突出。
美洲幼虫病(American Foulbrood，AFB，美洲蜂幼虫腐臭病)，又称美幼病，是目前危害蜜蜂幼虫生长发育的主要细菌性疾病，该病危害极大，有极高的传染性。该病由幼虫芽孢杆菌引起，幼虫芽孢杆菌对外界不良环境有很强的抵抗力，是养蜂生产上的一种恶性传染性疾病，在世界各地均有发生，主要感染西方蜜蜂的幼虫，导致蜂群的群势急剧下降，严重时会造成全群覆灭，通常在蜂群确诊该病后需要就地焚烧处理，防止疾病扩散。
过去人们一直认为AFB是感染性疾病，只有做好防疫工作就能避免其感染，然而事实不是这样，一些养蜂几十年的老蜂农饲养的蜜蜂也有发病的蜂群，说明从表面上看起来非常健康正常的蜂群自身也可能携带芽孢杆菌。因此如果能快速且简单地培养分离出芽孢杆菌，对鉴定蜂群是否携带芽孢杆菌，并及时采取措施至关重要。
AFB的病原是幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)，属于一种革兰氏阳性细菌。蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌的敏感性随着日龄的增长而降低，在每个感染的幼虫体内能产生数以亿计的、具有感染能力的孢子，由于该孢子对热和化学物质有极强的抵抗力(可存活长达35年之久)，导致AFB感染后，幼虫残骸的鳞片、蜂箱、产品和设备都是潜在的污染源，AFB的早期诊断有助于防止进一步传播，但是，针对AFB病的病原的培养极其困难，其芽孢杆菌的培养营养要求极高，一般实验室很难培养成功。
由于AFB的病原幼虫芽孢杆菌在普通培养基上很难生长，其分离培养需特殊培养基，目前实验室诊断主要依赖针对幼虫芽孢杆菌的PCR检测技术，其它如利用硝酸盐反应、过氧化氢酶产生、生化诊断法以及牛乳诊断法等均只能作为辅助诊断AFB的手段。
人们采用实验室的PCR检测方法，即将含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP作为培养基，对已发现有临床症状的蜜蜂样本进行培养，通常须要2周时间才能在培养基中分离出AFB的幼虫芽孢杆菌，也就是说这种培养鉴定的周期较长，并且培养基的制备方法复杂，不易操作。
再有，如通过临床症状来诊断AFB，为时已晚。通过研究发现，一些养蜂几十年的老蜂农饲养的蜜蜂也有发病的蜂群，说明从表面上看起来非常健康正常的蜂群自身也可能携带芽孢杆菌。待到临床症状被人们发现，后果已不堪设想了。
发明内容
本发明第一目的是提出一种易于操作、培养周期短的蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉。
本发明上述培养粉中各成分的质量百分数为：蛋白质30～50％，脂肪10～20％，碳水化合物10～20％，水5～10％，灰分0.5～1.0％，微量元素0.1～0.5％，维生素和氨基酸。
本发明所述培养粉含有幼虫芽孢杆菌生长所需的营养物质，经试验证明，其可用于蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室分离培养，并具有培养周期只须1至3天的特点，其方便操作，利于对蜜蜂是否携带美洲幼虫病的快速判定，利于人们及时采取防治措施。
所述灰分包括分别占所述培养粉质量百分数为0.1～0.2％的镁、0.05～0.1％的磷、0.05～0.1％的钙、0.01～0.05％的锌、0.005～0.01％的铁。
镁、磷、钙等矿物质可以提高相关酶的活性，锌元素可以促进了芽孢杆菌的生长发育，而铁元素可以促进了芽孢杆菌的供养水平，所以这些物质的提供，有效地促进了芽孢杆菌的发育。
所述灰分还包括钾、钠、锰、碘。钾、钠等元素维持了细胞的电化学平衡，锰、碘等元素促进了芽孢杆菌的繁殖。
所述维生素主要由维生素A和维生素D组成，每克培养粉中维生素A含量为200～800国际单位，维生素D含量为400～1000国际单位。维生素A、D可能是芽孢杆菌生长发育所必须的维生素，提供的量远远超过了需要，可以对芽孢杆菌的发育起到了非常明显的促进作用。
本发明的第二目的是提出以上蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的制备方法。
实验室培养粉的制备方法是：将蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉混合，经冷冻干燥即得。混合时，蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉的投料质量分别占总投料质量的10～25％、20～50％、10～30％、10～25％。
本制备方法简单、方便，制成的培养粉富含蛋白质，还含有微量元素、维生素和氨基酸等成份。经过冷冻干燥后，产品可在-20～20℃条件下长期密封保存。
本发明的第三目的是提供上述培养粉在实验室在蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的培养中的应用。
将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉与液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基混合，在37℃条件下对蜜蜂样本进行培养。
以上培养周期短，时间仅需1～3天，就可以在培养基上生长出蜜蜂幼虫芽孢杆菌。
进一步地，先将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉溶于PBS中取得蜜蜂芽孢杆菌的培养液，再将蜜蜂芽孢杆菌的培养液与液体Luria-Bertarfi培养基混合，或者将蜜蜂芽孢杆菌的培养液与固体Luria-Bertarfi培养基混合。如直接将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉与液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基混合会出现沉淀的不良现象。
所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉和PBS的混合比为10g∶100ml。经过反复试验比较，该比例所培育的芽孢杆菌就已经非常利于其检测，并且培育浓度不高，且成本较低。
所述蜜蜂芽孢杆菌的培养液和液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基的混合体积比为5～20∶100。
经试验发现：蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为5％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，菌落数很少。蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为10％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，菌落数较多。蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为20％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，细菌生长旺盛，菌落聚集成团。
附图说明
图1为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
1、材料与方法：
1.1实验材料
1.1.1实验样本的采集
蜜蜂成虫及幼虫采集于当地转地放蜂的蜂场，在已经有临床症状的蜂群中，取成年有临床症状的蜜蜂及有临床症状的幼虫分别放入无菌的指型管中，置于冰上。同时，收取来自同一蜂场看起来是健康的蜂箱及巢脾的成年蜜蜂及幼虫带回，并置于-70℃冷冻保存。
1.1.2实验试剂及配置
制备萘啶酮酸母液：将0.1g萘啶酮酸溶于2mL、0.1N的NaOH中，并用0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释至100mL，再经孔径为0.22μM的一次性滤器过滤除菌，取得1000μg/mL萘啶酮酸母液。
制备哌啶酸母液：将0.2g哌啶酸溶于2mL、0.1N的NaOH中，然后用0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释至100mL，再经经孔径为0.22μM的一次性滤器过滤除菌，取得1000μg/mL哌啶酸母液。
制备MYPGP琼脂培养基：Mueller Hinton肉汤10g，酵母提取物15g，K2PO4 3g，葡萄糖2g，丙酮酸钠1g和琼脂20g(pH 7.1)，加入适量双蒸水定容到1000mL，高压灭菌，降温取得MYPGP琼脂培养基。
制备Luria-Bertani液体培养基：将酵母抽提物1g、胰化蛋白胨0.5g和氯化钠0.5g混合后，采用缓冲液调整pH值至7.2，加入适量双蒸水定容到100mL，高压灭菌，降温，取得Luria-Bertani液体培养基。
制备Luria-Bertarfi固体培养基：将酵母抽提物5g、胰化蛋白胨2.5g、氯化钠2.5g和琼脂10g混合后，采用缓冲液调整pH值至7.2，加入适量双蒸水定容到500mL，高压灭菌，降温，取得Luria-Bertarfi固体培养基。
1.1.3蜜蜂幼虫芽孢杆菌培养粉的制备
按下表具体配比，将蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉混合，每个组份合计质量为100％，经冷冻干燥，分别取得培养粉1、2、3、4、5、6、7、8、9，并将各培养粉分别包装密封后置于-20-20℃保存。
具体的培养粉制作配比表见下：
| 组分(wt.％) | 蜂王浆 | 雄蜂蛹粉 | 蛋白粉 | 蜂王幼虫粉 |
| 培养粉1 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 培养粉2 | 0 | 0 | 10 | 90 |
| 培养粉3 | 0 | 10 | 10 | 80 |
| 培养粉4 | 10 | 10 | 20 | 60 |
| 培养粉5 | 10 | 10 | 30 | 50 |
| 培养粉6 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 培养粉7 | 15 | 35 | 20 | 30 |
| 培养粉8 | 20 | 50 | 10 | 20 |
| 培养粉9 | 25 | 55 | 10 | 10 |
1.1.4实验仪器
南京优普环保设备有限公司的制水机；METTLERTOLEDO的电子天平；SHEL LAB水浴锅；5834型的冷冻离心机；Telstar LyoQuest的冻干机；GHX9160B-1培养箱；超低温冰箱；SW-CJ-2HD超净工作台。
1.2.实验方法
1.2.1蜜蜂样本的处理
将疑似或已经发病蜂群的幼虫采用PBS(幼虫和PBS的混合比为10g∶100ml)匀浆得悬浮液，然后在80℃下加热10min或95-96℃加热3～5min。
将已经发病蜂场的成年蜜蜂用PBS充分荡洗，所得到的样品分为三份，每份分别进行三种处理：不经加热处理；在80℃下热处理10min；在95℃下热处理3min。
将已经发病蜂场的成年蜜蜂用PBS充分荡洗，取出肠子，采用PBS(肠子和PBS的混合比为10g∶100ml)匀浆30sec。再将匀浆液通过滤纸过滤、离心，取沉淀再重新悬浮在PBS中。
1.2.2细菌的分离培养
1.2.2.1采用含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基培养
制备含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基：将以上制得的萘啶酮酸母液、哌啶酸母液和MYPGP琼脂培养基按购买时产品使用说明书要求混合，得到含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基。
将含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基分别涂抹于无菌培养盘上，再将经过1.2.1处理的样品分别涂抹于各个培养基上，在37℃、5％CO2条件下，培养3～5天后，在各份培养基上挑取单菌落再移入含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基中进行扩大培养。
1.2.2.2采用蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉培养
取上述1.1.3制成的9种蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉进行平行试验：
将培养粉溶于PBS(培养粉和PBS的混合比为10g∶100ml)，取得蜜蜂芽孢杆菌的培养液。
将蜜蜂芽孢杆菌的培养液和液体Luria-Bertarfi培养基分别按体积占比为0％、5％、10％、20％四种比例混合，分别取得四种培养液。
将蜜蜂芽孢杆菌的培养液和固体Luria-Bertarfi培养基分别按体积占比为0％、5％、10％、20％四种比例混合，也分别取得四种培养液。
将以上取得的八种培养液分别涂抹于无菌培养盘上，再将经过1.2.1处理的样品分别涂抹于各个培养基上，在37℃下培养1～3天。
结果发现：
不含蜜蜂芽孢杆菌的培养液的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上无细菌生长。
蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为5％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，菌落数很少。
蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为10％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，菌落数较多。
蜜蜂芽孢杆菌的培养液占比为20％的液体Luria-Bertarfi培养基和固体Luria-Bertarfi培养基上，细菌生长旺盛，菌落聚集成团。
并且，经过比较，当以蜂王浆含量10～25％、雄蜂蛹粉含量20～50％、蛋白粉含量10～30％和蜂王幼虫粉含量10～25％混合制备的培养芽孢杆菌效果比较好。
并对具有较好培养芽孢杆菌效果的各培养粉进行分析，各蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉中成分结果是：蛋白质30～50％，脂肪10～20％，碳水化合物10～20％，水5～10％，微量元素0.1～0.5％、每克培养粉中含维生素A200-800IU、维生素D400–1000IU，灰分：镁0.1～0.2％、磷0.05～0.1％、钙0.05～0.1％、锌0.01～0.05％、铁0.005～0.01％，还含有钾、钠、锰、碘、20多种氨基酸，多种活性酶和激素等物质。
以上结果说明：蜜蜂芽孢杆菌的培养粉中的确含有幼虫芽孢杆菌生长所需的物质，并且将其作为营养组分添加于普通LB培养基后，可以用于幼虫芽孢杆菌的实验室培养。
在各份培养基上挑取单菌落再移入与对应的相同的培养液中进行扩大培养。
通常幼虫芽孢杆菌单菌落小、规则、大多粗糙、扁平或凸起，呈白色至米色。
1.2.3细菌DNA的提取、扩增
对各个扩大培养后的单菌落DNA进行提取，方法如下：用灭菌牙签挑取各培养基上长出的单个菌落，将其悬浮在50μL蒸馏水中，加热至95℃维持15min，离心5min后，取1-5μL上清液用作PCR的模板。
PCR(50μL)反应体系，其中包括：1-5μL模板DNA；50pmol/L正向(AFB-F)和反向引物(AFB-R)；包括10nmol/L dNTPs、2mM MgCl2、1-2.5U的Taq聚合酶的Mix；ddH2O。
扩增条件：95℃预变性1min，93℃变性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后于72℃延伸5min。
1.2.4菌落PCR鉴定
对培养基上生长的细菌单克隆，进行菌落PCR鉴定：用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在约1100bp位置附近出现目的条带，见图1所示。
图1中泳道M为DL 2000DNA marker，泳道2为阴性对照，泳道1、3～8为细菌单菌落的PCR产物。
由菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图说明在1100bp附近，出现预期的特异扩增条带，经PCR鉴定说明以上实验室培养芽孢杆菌取得成功。
2、结论：
采用含有萘啶酮酸和哌啶酸的选择性MYPGP培养基对幼虫芽孢杆菌的培养周期长达3～5天，再经细菌分离与培养，以及后续对细菌的生化诊断，整个流程需要长达2周的检测时间。有时还培养不出来。
而采用本发明蜜蜂芽孢杆菌的培养粉与液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基相结合对幼虫芽孢杆菌的培养周期仅需1～3天，然后再利用特异性PCR引物，通过菌落PCR实现快速鉴定。本发明方法为蜂群赢得了宝贵的隔离和治疗时间。
同时，通过以上结果也提示，在无明显症状的蜂群中，成年蜜蜂也可能携带有幼虫芽孢杆菌病原。
Claims (9)
1.蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉，其特征在于所述培养粉中各成分的质量百分数为：蛋白质30～50%，脂肪10～20%，碳水化合物10～20%，水5～10%，灰分0.5～1.0%，微量元素0.1～0.5%，维生素和氨基酸。
2.根据权利要求1所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉，其特征在于所述灰分包括分别占所述培养粉质量百分数为0.1～0.2%的镁、0.05～0.1%的磷、0.05～0.1%的钙、0.01～0.05%的锌、0.005～0.01%的铁。
3.根据权利要求2所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉，其特征在于所述灰分还包括钾、钠、锰、碘。
4.根据权利要求1所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉，其特征在于所述维生素主要由维生素A和维生素D组成，每克培养粉中维生素A含量为200～800国际单位，维生素D含量为400～1000国际单位。
5.如权利要求1所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的制备方法，其特征在于将蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉混合，经冷冻干燥即得；混合时，蜂王浆、雄蜂蛹粉、蛋白粉和蜂王幼虫粉的投料质量分别占总投料质量的10～25%、20～50%、10～30%、10～25%。
6.如权利要求1所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的应用，其特征在于将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉与液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基混合，在37℃条件下对蜜蜂样本进行培养。
7.根据权利要求6所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的应用，其特征在于先将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉溶于PBS中取得蜜蜂芽孢杆菌的培养液，再将蜜蜂芽孢杆菌的培养液与液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基混合。
8.根据权利要求7所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的应用，其特征在于所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉和PBS的混合比为10g∶ 100ml。
9.根据权利要求8所述蜜蜂美洲幼虫芽孢杆菌的实验室培养粉的应用，其特征在于所述蜜蜂芽孢杆菌的培养液和液体Luria-Bertarfi培养基或固体Luria-Bertarfi培养基的混合体积比为5～20∶100。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201023 |