CN112625127A - 抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，涉及一种抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体为利用灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌为抗原免疫产蛋鸡，收集所述免疫蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。本发明分离、纯化得到纯度较高的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，该抗体具有较强的中和蜜蜂幼虫芽孢杆菌活性，能够应用于制备预防及治疗蜜蜂幼虫芽孢杆菌感染引起的蜜蜂疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用。
背景技术
蜜蜂幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)是一种引起美洲幼虫腐烂病(AFB)的革兰氏阳性蜜蜂致病菌。AFB是一种可以引起蜜蜂幼虫和蜂蛹的急性、高死亡率的传染病，其只发生于蜜蜂的幼虫，幼蜂一旦感染后，如果没有适当的治疗，感染的蜜蜂很快就会死亡，而且还会扩散到整个蜂群，导致整个蜂群死亡，甚至会感染其他没有接触的蜂群。蜜蜂幼虫芽孢杆菌对西方蜜蜂1日龄幼虫的致病力很高，对2日龄幼虫的致病力大为降低，3日龄以上的幼虫与成蜂则不感染。东方蜜蜂对本病具有抗性。蜜蜂幼虫芽孢杆菌通常只有孢子期具有感染力，在一定条件下产生的芽孢有7层结构包围，这种特殊结构使得蜜蜂幼虫芽孢杆菌的芽孢具有特别强的生命力，对热、化学消毒剂等有极强的抵抗力，在高温干燥等恶劣环境中至少能存活35年。芽孢随饲料被蜜蜂幼虫摄入后，约1日后在幼虫肠(胃)内萌发，然后穿过胃壁进入体腔，在蜜蜂血淋巴及组织内大量繁殖。染病症状表现为体表颜色有原来的白色逐渐变成黑色，身体脱水，体表有微小的鳞片状物，最后干枯，紧贴在蜂巢房壁上。
现有技术对于AFB的防治，主要以抗生素为主，包括土霉素、氯霉素、羟四环素等。但随着抗生素的管制日趋严格，抗生素的使用受到越来越多的限制。目前对于AFB并无核准使用的防治药剂，蜂场主要通过如更换巢脾、消毒蜂具、烧毁掩埋染病蜂群等措施预防该病的大面积爆发。但对于已经染病的蜂群，缺乏有效的应对手段。
卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk,IgY)是从经抗原免疫的禽类所产卵中分离的具有特异性的蛋白。目前，卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加剂，正在引起人们的关注。卵黄抗体的优势主要体现在：通过与抗原特异性结合，发挥抗菌和抗病毒作用；不会产生药物残留；生产技术较为成熟，产量高；可以减少对动物的应激，提高动物的福利。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，但在蜜蜂相关疾病治疗方面的应用却未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
本发明的再一目的在于提供上述卵黄抗体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述卵黄抗体的应用。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，所述卵黄抗体为利用灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原免疫产蛋鸡，收集所述免疫蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，所述卵黄抗体有包括以下步骤的方法制备得到：
(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活，作为抗原；
(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；
(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，步骤(1)中，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌1～4×108CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原。
具体的，接种蜜蜂幼虫芽孢杆菌于营养琼脂培养基，30℃～40℃倒置培养12h后，其中37℃长势最好，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基中，在37℃，150～250rpm条件下，摇床振荡培养2～12h后，最终选择培养条件为37℃，180rpm下培养8h。调节营养肉汤培养基中的蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为1-4×108CFU/mL，最佳菌量为2×108CFU/mL，离心去上清后用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后4℃灭活48h，即得到灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌抗原。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，步骤(3)中，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
具体的，免疫鸡蛋用酒精将蛋壳擦拭干净后破壳分离卵黄，然后加入冷却水稀释10倍。用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜，去脂。次日解冻，将卵黄稀释液转入离心管中，10000r/min，4℃，离心10min，取上清液即为水溶性组分(WSF)并测量体积。将分离出的卵黄抗体使用硫酸铵沉淀法进行纯化。根据测量的WSF体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液至终饱和度为55％，避免局部盐度过高而造成蛋白质变性，置于磁力搅拌器上搅拌混匀。10000r/min，4℃离心15min，弃上清液，加入适量PBS溶液重悬，重复上述步骤再次缓慢加入33％的硫酸铵溶液，搅拌混匀后，4℃静置过夜，10,000r/min，4℃离心15min，弃上清液。加入少量PBS溶液重悬，转移入透析袋中。透析袋使用前应在透析液中浸泡，并确定透析袋不漏方可使用。将装有蛋白溶液的透析袋置于透析液中，4℃充分透析，每12h更换透析液一次。待透析完成后，使用0.22μm的过滤器过滤除菌，最终获得的IgY溶液，分装存于-20℃冰箱中备用。将过滤后的卵黄抗体液在-80℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体冻干粉。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵灭活，作为抗原；
(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；
(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌1～4×108CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗原。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
根据本发明具体实施方式的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
本发明抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体在预防和治疗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵引起疾病方面的应用，本发明可用于由蜜蜂幼虫芽孢杆菌引起的疾病的预防和治疗，并可用于开发蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测试剂盒和免疫诊断。
本发明还提供一种抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体效价检测方法，采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的效价，具体包括如下步骤：以2×108CFU/mL蜜蜂幼虫芽孢杆菌包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤5次，后加入含1％BSA的封闭液，37℃封闭4h。洗涤5次后加入倍比稀释的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，同时设置空白对照和阴性对照，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入TMB显色液，37℃避光显色10min。然后2M H2SO4终止反应后用酶标仪读取450nm的OD值。待测样品与阴性对照吸光值比值大于2.1判定为阳性，最大阳性稀释度为抗体效价。
优选的，PBST洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1：5000-8000的比例混合得到，最佳体积比例是1：5000。
本发明的有益效果：
(1)本发明的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体由蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活后免疫蛋鸡而得，无需采血，可以减少对动物的应激，提高动物的福利，抗体产量高；本发明的卵黄抗体具有特异性强，效价高的特点，可用于防治蜜蜂幼虫芽孢杆菌引起的疾病；
(2)本发明选择棒状纳米氢氧化铝为佐剂，棒状纳米氢氧化铝的规格介于纳米和微米尺寸之间，有效负载蜜蜂幼虫芽孢杆菌大分子抗原。棒状纳米氢氧化铝与蜜蜂幼虫芽孢杆菌抗原乳化后首次免疫产蛋鸡，可以快速激活母鸡的免疫应答，从而提高蜜蜂幼虫芽孢杆菌抗原的免疫原性，得到的卵黄抗体效价高、纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异性卵黄抗体的非还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测结果，泳道M：国产蛋白Marker；泳道1：等电点离心后收集卵黄抗体上清液；泳道2：蜜蜂幼虫芽孢杆菌全菌裂解蛋白；泳道3-9：盐析纯化IgY不同稀释浓度；
图2为抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体饲喂保护实验生存曲线图，其中A为无抗体组，B为非特异性卵黄抗体组，C为土霉素组，D为特异性抗体组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，通过制备蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活菌抗原免疫蛋鸡，收集高免疫鸡蛋进行分离和纯化，并进行蛋白浓度检测和SDS-PAGE检蛋白条带判断纯度，间接ELISA检测抗体效价，体外抑菌试验和野外试验确定效果，最终获得高效、高纯度的卵黄抗体。
实施例1制备抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体
1.1培养蜜蜂幼虫芽孢杆菌并灭活制备抗原
接种蜜蜂幼虫芽孢杆菌于营养琼脂培养基，37℃倒置培养12h后，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基中，在37℃，180rpm条件下，摇床振荡培养8h后，调节营养肉汤培养基中的蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/ml，离心去上清后用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/ml的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后4℃灭活48h，即得到灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌抗原。
1.2免疫蛋鸡并收集鸡蛋
将蛋鸡进行初次免疫和2～3次加强免疫。
初次免疫步骤为：将灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌加入等量的棒状纳米氢氧化铝为佐剂充分乳化后对母鸡进行注射免疫；
加强免疫步骤为：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌抗原加入等量的弗氏不完全佐剂(或市售的常规氢氧化铝佐剂)，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔14天，完成免疫后第10天开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存。
1.3蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活作为疫苗免疫产前母鸡
实验动物：50只130日龄雌性罗曼蛋鸡，随机分为5组，包括4个实验组和1个对照组，每组10只。单次免疫抗原体积为100uL，分别第0d、14d、28d胸部肌肉注射。
实验组1：每只鸡胸部肌肉免疫100uL蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌体抗原疫苗；
实验组2：每只鸡胸部肌肉免疫100uL蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌体抗原+棒状纳米铝佐剂疫苗；
实验组3：每只鸡胸部肌肉免疫100uL蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌体抗原+普通铝佐剂疫苗；
实验组4：每只鸡胸部肌肉免疫100uL蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌体抗原+弗氏佐剂疫苗；
对照组1：每只鸡胸部肌肉免疫100uL生理盐水。
首免后的早期(第7天)采集首免母鸡血清，采用公认的ELISA法检测抗体滴度的结果见表1。
表1免疫结果对比数据
结果如表1所示，在首免后的早期(第7天)，生理盐水组、普通铝佐剂和弗氏佐剂组三个组抗体滴度分别是0.02、90.0、126.0，而本发明的采用棒状纳米氢氧化铝辅佐的蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原所产生的抗体滴度达264.0，从而能更有效地引起机体产生免疫反应，产生更多的保护性抗体。
1.4分离纯化卵黄抗体
用酒精将蛋壳擦拭干净后破壳分离卵黄，然后加入冷却水稀释10倍。用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜，去脂。次日解冻，将卵黄稀释液转入离心管中，10,000r/min，4℃，离心10min，取上清液即为水溶性组分(WSF)并测量体积。
将分离出的卵黄抗体使用硫酸铵沉淀法进行纯化。根据测量的WSF体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液至终饱和度为55％，避免局部盐度过高而造成蛋白质变性，置于磁力搅拌器上搅拌混匀。10,000r/min，4℃离心15min，弃上清液，加入适量PBS溶液重悬，重复上述步骤再次缓慢加入33％的硫酸铵溶液，搅拌混匀后，4℃静置过夜，10,000r/min，4℃离心15min，弃上清液。加入少量PBS溶液重悬，转移入透析袋中。透析袋使用前应在透析液中浸泡，并确定透析袋不漏方可使用。将装有蛋白溶液的透析袋置于透析液中，4℃充分透析，每12h更换透析液一次。待透析完成后，使用0.22μm的过滤器过滤除菌，最终获得的IgY溶液，分装存于-20℃冰箱中备用。将过滤后的卵黄抗体液在-80℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体冻干粉。
实施例2抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的鉴定
2.1浓度测定和纯度测定
卵黄抗体冻干粉用PBS溶解后，用BSA试剂盒测定浓度，测得蛋白浓度为13.426mg/ml，总蛋白量约180mg，在正常范围内。取蛋白液15μl与等量2×loading Buffer混匀后沸水浴10min，进行12％还原性SDS-PAGE电泳。
结果如图1所示，重链、轻链分别位于66KD，28KD条带处，总分子量约为180KD。
2.2间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测效价
以2×108CFU/ml蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活菌抗原包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤5次，后加入含1％BSA的封闭液，37℃封闭4h。洗涤5次后加入倍比稀释的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，同时设置空白对照和阴性对照，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入TMB显色液，37℃避光显色10min。然后2M H2SO4终止反应后用酶标仪读取450nm的OD值。待测样品与阴性对照吸光值比值大于2.1判定为阳性，最大阳性稀释度为抗体效价。
本发明制备的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体效价为120000。
2.3卵黄抗体IgY纯度的检测
用YMC-BioPro Q75阴离子交换填料和YMC-Pack Diol-200体积排阻色谱柱从蛋黄提取物中分离纯化IgY抗体。具体是：首先用YMC-BioPro Q75阴离子交换填料分离富集；然后用YMC-Pack Diol-200体积排阻色谱柱分离纯化，进一步用体积排阻色谱法分析获得的纯化物。
结果显示：从蛋黄粗提物中分离纯化得到的卵黄抗体IgY纯度达到99.0％。
实施例3体外抑菌实验
将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活后稀释至1×103CFU/ml，分别取150μL抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体和普通卵黄抗体液，加入等量菌液混合后置37℃结合20min，取100μL涂布营养琼脂平板，各设2个重复，37℃倒置培养24h后拍照计数。
抑菌实验表明：加入卵黄抗体的一组能明显抑制蜜蜂幼虫芽孢杆菌的生长，其菌量是加入普通卵黄抗体组的1/5-2/5。
实施例4抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体治疗AFB的效果
挑选400只蜜蜂幼虫随机分成8组，每组50只，按如下分组饲喂幼虫，每组1mL。
A组:用4×1010CFU/mL蜜蜂幼虫芽孢杆菌与0.9％无菌生理盐水等体积混合；
B组：用4×1010CFU/mL蜜蜂幼虫芽孢杆菌与普通卵黄抗体等体积混合；
C组：用4×1010CFU/mL蜜蜂幼虫芽孢杆菌与土霉素等体积混合；
D组：用4×1010CFU/mL蜜蜂幼虫芽孢杆菌与抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体等体积混合；
E组：蜜蜂沙门氏菌攻毒后饲喂抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体；
F组：蜜蜂副伤寒杆菌攻毒后饲喂抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体；
G组：蜜蜂螺旋菌攻毒后饲喂抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体；
H组：黄曲霉菌攻毒后饲喂抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
以上各组进行常规饲养，观察统计死亡情况。
其中，特异性IgY是指蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异性卵黄抗体，由本发明的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体冻干粉用PBS，蜂粮稀释至实验浓度后使用；非特异性IgY是指蜜蜂幼虫芽孢杆菌非特异性卵黄抗体，由市售的普通鸡蛋中提取得到。结果见图2、表2。
结果如图2所示，饲喂3天内，组A和组B的蜜蜂幼虫出现大量死亡，而组C和组D在7天内几乎没有出现死亡情况，其中特异性IgY组在14天后存活48只，保护率为96％。
表2饲喂保护试验
由表2结果可知，将特异性IgY粉，通过饲喂方式给患病蜜蜂施用后，症状明显减轻，死亡率显著降低，说明抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体对由蜜蜂幼虫芽孢杆菌引起病症具有良好的保护作用。
用蜜蜂沙门氏菌、蜜蜂副伤寒杆菌、蜜蜂螺旋菌、黄曲霉菌对蜜蜂进行攻毒后，再饲喂特异性IgY粉，蜜蜂的死亡率与组A、组B的死亡率基本相同，说明抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体具有良好的特异性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为利用灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵为抗原免疫产蛋鸡，收集所述产蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。
2.根据权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体有包括以下步骤的方法制备得到：
(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活，作为抗原；
(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；
(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(1)中，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌量1～4×108CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原。
4.根据权利要求2所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(3)中，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
5.根据权利要求4所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
6.权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活，作为抗原；
(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；
(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。
7.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌量1～4×108CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×108CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原。
8.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
9.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。
10.权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体在预防和治疗蜜蜂幼虫芽孢杆菌引起疾病方面的应用。
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2021
- 2021-01-12 CN CN202110037194.2A patent/CN112625127A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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