CN107722121A - 蜜蜂幼虫芽孢杆菌plmp多抗及其在免疫层析纸的应用 - Google Patents

蜜蜂幼虫芽孢杆菌plmp多抗及其在免疫层析纸的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗及其在免疫层析纸的应用，针对现有技术中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测方法耗时较长，操作技术要求较高，不利于现场快速检测的问题，通过PLMP基因扩增、原核表达载体pGEX‑4T‑1‑PLMP的构建、PLMP重组蛋白的诱导表达及纯化、PLMP多克隆抗体的制备等步骤制备PLMP多抗，构建的PLMP重组蛋白效率高，分离纯化方法简单，周期短并将其应用在胶体金免疫层析纸的制备中，得到的免疫层析纸特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100%，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为105 CFU/mL和106 CFU/mL。

Description

蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗及其在免疫层析纸的应用
技术领域
本发明主要涉及分子生物学技术领域，具体地说，本发明涉及多克隆抗体制备的技术领域。
背景技术
美洲幼虫腐臭病(American foulbrood，AFB)，是由幼虫芽孢杆菌(Paenibaciluslarvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫及蜂蛹的一种急性、烈性传染病。此病危害严重，毁灭性强且只感染蜜蜂幼虫，在感染前期，幼虫体色由正常的珍珠白变为棕黄、褐色甚至黑褐色，房盖凹陷，潮湿色暗；在感染后期，幼虫死亡后的尸体能拉出2cm-3cm的细丝，散发鱼腥臭味，最后以黑褐色的鳞片状物紧贴在巢房壁。P.larvae芽孢抵抗力强，能抵抗热、化学物质，在高温干燥等恶劣环境下能存活多年。该病一旦发生极易造成蜂群衰弱及蜂群死亡。该病最初于英国发生，后传至欧美，现遍及全世界，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。中国是养蜂大国，也是最大的蜂产品生产和出口国，该病对我国养蜂业的发展以及蜂产品质量已造成严重影响。
目前对AFB的鉴定方法主要包括病原的分离鉴定和PCR方法，尚未见关于采用免疫学方法进行检测AFB的报道。幼虫芽孢杆菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶，研究表明，这些蛋白酶为含锌的金属蛋白酶(Paenibacilus larvae metaloproteases，PLMP)，参与幼虫退化，为了进一步研究幼虫芽孢杆菌的免疫学检测，需要制备病原抗体，利用病原多克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。制备蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗及开发检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金试纸条有助于幼虫芽孢杆菌快速、准确的检测。
发明内容
为了解决现有技术中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测方法耗时较长，操作技术要求较高，不利于现场快速检测的问题，本发明旨在于提供蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗的制备及其免疫层析纸，建立一种准确、灵敏、利于现场快速检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的方法。
本发明通过以下技术方案实现的:
本发明具体提供蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗，具体采用以下技术步骤制备获得：
(1)PLMP基因扩增:
根据GenBank公布的幼虫芽孢杆菌核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物，并在引物的5'端分别加BamH I和EcoR I酶切位点识别序列，将幼虫芽孢杆菌阳性菌液DNA作为模板，进行PCR扩增，后回收目的片段备用。
(2)原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP的构建：
将上述PCR产物经胶回收纯化后与T载体连接，连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞中，经培养基培养,摇菌复苏，复苏后离心弃上清液，菌泥混匀后培养12h；挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后摇菌培养，提取重组质粒；取pGEX-4T-1质粒和重组质粒分别用EcoRI和BamHI进行双酶切，酶切后用T4连接酶连接后转化至E.coliBL21感受态细胞，PCR筛选出阳性菌落后，挑取单个菌落培育。
(3)PLMP重组蛋白的诱导表达及纯化:
将重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至培养基中，摇菌条件下培养至OD600nm达到0.4-0.6之间，加入终浓度为0.2mmol/L-1mmol/L的IPTG，在37℃200rpm摇菌诱导，诱导时间为1h-8h，对重组蛋白采用切胶法纯化。
(4)PLMP多克隆抗体的制备：
取纯化的PLMP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对家兔背部皮下多点注射免疫；经四次免疫后，颈动脉采血，收集血清保存。
同时，本发明提供上述蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗在检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的免疫层析纸中的应用，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，其中金标垫上含有胶体金标记的PLMP多抗，硝酸纤维素膜上有用PLMP多抗预包被的检测线(T线)，用羊抗兔IgG溶液预包被的质控线(C线)。
进一步，本发明提供上述检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫层析纸的制备方法，具体采用以下技术步骤：
(1)制备胶体金标记的PLMP多抗：吸取10mL胶体金溶液于已经酸洗、硅化处理好的离心管中，置于涡旋振荡器上，调至1500r/min，逐滴加入0.2mol/L的K2CO3溶液150μL，同时振荡混匀以调至pH9.0，逐滴加入240μg的PLMP蛋白多克隆抗体，1500r/min振荡混匀10min，随后加入10％的BSA使其终浓度为1％，振荡混匀后静置30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，1000r/min离心10min后取上清液，上清液置于4℃，5000r/min离心10min，将上清液和沉淀分开，收集沉淀，上清液再置于4℃,10000r/min离心30min，收集两次沉淀即是纯化标记好的胶体金抗体复合物，取体积为最初未经纯化的金标记抗体溶液体积的1/10为胶体金重悬液用量，将其加入至两次收集的沉淀中，重悬沉淀即为纯化好的金标抗体，于4℃保存。
(2)金标垫的制备：用干净的剪刀将金标垫裁剪成0.7cm×10cm大小的长条，将裁剪好的金标垫浸泡在金标垫处理液中30min，4℃过夜干燥，将已经纯化好的金标抗体溶液均匀滴于处理好的金标垫上，悬空平放，于室温下自然干燥，除去多余水分，而后置于4℃风干，密封保存。
(3)检测线和质控线的制备：取两块经酸洗硅化处理过的玻璃片，移液器吸取PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗均匀涂于玻璃片的侧面，涂完后玻璃片侧面印于NC膜上，检测线与质控线间隔0.5cm，将PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，包被之后于室温自然干燥。
(4)试纸条组装：将底板裁剪成宽为3.2cm/条，先将硝酸纤维素膜底面粘贴于底板上，经抗体包被后的金标垫裁剪为6.0cm×0.7cm压硝酸纤维素膜2mm平铺粘贴在底板上，剪样品垫6.0cm×1.8cm压金标垫2mm粘贴在底板上，剪吸水垫6.0cm×1.7cm压硝酸纤维素膜2mm粘贴在底板上，在金标垫与样品垫连接处用衔接胶带粘住，压紧各层，用剪刀将组装好的试纸条裁切呈宽为3mm的小条，密封干燥置于4℃保存。
进而，本发明还提供上述检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫层析纸在检测蜂蜜、蜂蜡、成蜂和菌液中幼虫芽孢杆菌的应用方法，具体采用以下技术步骤：
(1)样品前处理：
(a)蜂蜜：取5g蜂蜜充分溶解于40mL去离子水中，吸取100μL溶液，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。
(b)蜂蜡或成蜂：将蜂蜡或成蜂放入破壁管中，加入适当的双蒸水，固定在破壁仪上，进行破碎。破碎后取上清100μL进行检测。
(c)菌液：无需处理，直接取100μL菌液样品，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。
(2)用胶体金层析试纸条检测：
将所取液体滴到样品垫上，室温下作用10-15min。
(3)结果判定
(a)阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。
(b)阴性：检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。
(c)失效：如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试纸条失效。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果:
(1)本发明构建的PLMP重组蛋白效率高，分离纯化方法简单，成本低，周期短。
(2)本发明提供的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100％，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为105CFU/mL和106CFU/mL。
附图说明
图1显示为本发明实施例中PLMP基因PCR鉴定结果。其中M为DNA标准DL2000；1为：PLMP基因PCR产物。
图2显示为pGEX-4T-1-PLMP双酶切鉴定结果。其中M为DNA标准DL5000；1为pGEX-4T-1-PLMP质粒双酶切产物；2为pGEX-4T-1质粒。
图3显示为pGEX-4T-1-PLMP PCR鉴定结果。其中M为DNA标准DL2000；1为阴性对照；2为pGEX-4T-1-PLMP PCR产物。
图4显示为不同浓度IPTG对幼虫芽孢杆菌PLMP重组蛋白诱导表达的影响。其中M为蛋白分子质量标准；1为pGEX-4T-1-PLMP转化菌未诱导的上清液；2～6为：37℃下pGEX-4T-1-PLMP转化菌IPTG终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的上清液；7为pGEX-4T-1-PLMP转化菌未诱导的沉淀；8～12为：37℃下pGEX-4T-1-PLMP转化菌IPTG终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的沉淀。
图5显示为诱导时间对幼虫芽孢杆菌PLMP重组蛋白诱导表达的影响。其中M：蛋白分子质量标准；1～9:37℃下0.8mmol/LIPTG诱导pGEX-4T-1-PLMP时间为0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。
图6显示为PLMP重组蛋白的纯化及定量。其中M为蛋白分子质量标准；1～7为BSA标准蛋白浓度为2000ug/mL、1500ug/mL、1000ug/mL、750ug/mL、500ug/mL、250ug/mL、100ug/mL；8为纯化后的PLMP重组蛋白。
图7显示为检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫层析试纸模式图。
图8显示为胶体金免疫层析试纸条的结果判断示意图。
图9显示为试纸条特异性测试结果。其中试纸条1为幼虫芽孢杆菌菌液，试纸条2为蜂房链球菌菌液，试纸条3为蜜蜂败血杆菌菌液，试纸条4为蜜蜂哈夫尼肠杆菌菌液，试纸条5为双蒸水。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明采用的幼虫芽孢杆菌冻干粉，E.coliBL21(DE3)及原核表达质粒pGEX-4T-1，由新疆伊犁出入境检验检疫局综合实验室保存；DH5ɑ感受态细胞，购自鼎国生物技术有限公司；试验动物、10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA胶回收试剂盒、T载体、BamHI、EcoRI限制性内切酶、质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记的羊抗兔IgG二抗、TMB底物溶液、胶体金溶液、四氯金酸，过滤样品垫、胶体金垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(Millipore135)、PVC底板、塑料卡、衔接胶带及DAB显色液均自常规渠道购买。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：PLMP基因的扩增
1、引物设计
根据GenBank公布的幼虫芽孢杆菌核苷酸序列(CP003355.1)，利用PrimerPremier 5.0设计一对特异性引物，引物的5'端分别加BamHI和Eco RI酶切位点识别序列。引物序列如下：
Met-F：5'-CGCGGATCCAATGAAGAAGGAGAGAT-3'；
Met-R：5'-CCGGAATTCTTATTTGACTCCAACGGC-3'。
2、PLMP基因的PCR扩增
用幼虫芽孢杆菌阳性菌液DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCRbuffer 3μL、MgCl22.5μL、dNTPs 2.5μL、Taq酶(5U)0.25μL、上下游引物各1μL、模板2μL，加ddH2O补足至25μL。反应条件为：95℃预变性10min，93℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min。
3、PCR产物的回收与纯化
PCR反应产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后使用紫外仪观察，切取含有目的条带的基因片段凝胶，将切取的凝胶装入2.0mL离心管后，按胶回收试剂盒进行操作回收，对PCR产物进行鉴定，结果见附图1。
实施例二：重组表达载体的构建
1、目的片段的连接、转化
目的片段与T载体连接：取T载体1μL加入PCR产物4μL，用移液器吹打混匀后，25℃连接20min。连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞中，经液体无抗性LB培养基37℃，200rpm摇菌复苏。复苏后4000rpm离心3min～5min，弃上清液，菌液混匀后均匀涂于Amp+LB平板上，37℃倒置平板培养过夜。挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后摇菌培养37℃12h～16h，准备提取重组质粒。
2、PLMP重组质粒的提取
吸取1mL的PLMP重组菌液于1.5mL离心管，12000rpm离心1min，弃上清液，收集菌液沉淀；再吸取1mL菌液重复该过程，共三次。加入250μL SolutionⅠ混合液于上述收集菌液沉淀的离心管内，用移液器反复吹打离心管内的沉淀，使其完全混匀；而后加入同体积SolutionⅡ慢速轻柔颠倒离心管混匀4～6次，裂解反应不超过5min。加入350μL SolutionⅢ后温和倒置数次，使离心管内形成白色絮状物。12000rpm离心10min，留上清，弃去白色沉淀。将上清液加入结合柱中，于室温下12000rpm离心1min，倒去收集管下方滤液；500μLHB溶液加至上述结合柱中，室温下12000rpm离心1min，倒去收集管下方滤液。吸取700μLDNA洗液加至柱中，室温下12000rpm离心1min，倒去收集管中的滤液；此过程重复一次。将结合柱放入收集管中，上述转速离心3min，倒去滤液；再将结合柱装于EP管，打开管盖，于室温静置5min。取1.5mL离心管，将结合柱放于离心管中，吸取30μL洗脱液加入吸附膜中间，室温静置3min后12000rpm离心1min；离心管中收集质粒，置-20℃冰箱贮存备用。
3、pGEX-4T-1表达质粒的提取
实验室保存的pGEX-4T-1的大肠杆菌菌液，在超净台内，用灭菌后的接种环蘸取划线接种于LB含Amp平板培养基中，37℃过夜培养。用10μL移液枪头从平板培养基上挑取一个已含有pGEX-4T-1的大肠杆菌菌落，接种于10mL LB液体Amp培养基中，200rpm，37℃12h～16h摇菌培养。吸取1mL的菌液，提取质粒pGEX-4T-1。
4、两种质粒的双酶切鉴定
分别将提取的pGEX-4T-1质粒和PLMP重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，反应体系如下：10×Buffer 2.5μL、表达质粒(pGEX-4T-1)/PLMP重组质粒5.0μL、EcoR I 0.5μL、BamH I 0.5μL、ddH2O 16.5μL移液器混匀体系后，37℃金属干浴酶切20min，电泳后分别进行胶回收。
5、pGEX-4T-1-PLMP重组质粒的构建
pGEX-4T-1质粒和PLMP重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后用T4连接酶连接后转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，PCR筛选出阳性菌落。连接反应体系：10×T4 DNA ligaseBuffer1μL、双酶切后回收的pGEX-4T-12μL、双酶切后回收的PLMP目的片段6μL、T4DNAligase 1μL转化步骤：将上述液体加入100μL离心管后混匀，经16℃水浴连接过夜后，轻轻加入E.coliBL21(DE3)感受态细胞混匀，将离心管冰上放置30min，42℃热休克90s，立即于冰上冰浴2min。在超净台内，将连接产物加入到含有900μL LB液体培养基(无抗性)的离心管内，用移液器吹打混匀后倾斜放置在摇床内，200rpm，37℃培养1h。4000rpm离心3min，弃去800μL上清液，将剩余菌液混匀后，涂布于LB Amp平板上，37℃，倒置平板培养过夜；单一菌落经PCR鉴定为阳性菌落后，再挑取单个菌落加于10mL LB Amp液体培养基中，200rpm，37℃摇菌培养12h-16h，重组原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP菌液鉴定及双酶切鉴定均获得大小约为1200bp的扩增片段，见附图2和附图3。
重组阳性菌液进行测序鉴定，测序结果与GenBank(CP003355.1)公布的序列同源性达99％。说明已成功构建pGEX-4T-1-PLMP原核表达载体。
实施例三：重组蛋白的诱导表达及纯化
用10uL移液器枪头扎取重组质粒pGEX-4T-1-PLMP的BL21菌接种于10mL LB液体培养基(含Amp)中，37℃，200rpm 12-16h培养。吸取过夜培养物300μL接种至30mL LB液体培养基(含Amp)中，37℃，200rpm，振荡培养至菌液OD600nm＝0.4～0.6。取1mL上述菌液加至离心管中，10000rpm，离心1min，收集菌体作为未诱导菌，而后加入IPTG至余下菌液中，使IPTG终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm诱导表达8h。4℃，10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。加入2mL 1×PBS(PH＝7.4)溶液吹打悬浮菌沉淀，4℃，10000rpm离心10min，弃上清，此过程重复3次。在菌体沉淀中加入2mL的PBS，置于冰上，超声破碎8min(超声5s停止8s)，4℃1000rpm离心5min。将上清液与沉淀分离，进行SDS-PAGE分析。菌体沉淀用1mL PBS重悬，取上清液与沉淀悬液各50μL，加入等体积的2×SDS-PAGE，置金属浴中100℃煮样，10min后经10000rpm离心5min。将上述煮沸处理好的上清液及沉淀悬液样品，分别加样至SDS-PAGE凝胶中，80V电泳45min左右，再改为120V电泳40min。电泳后的凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色10min，再用脱色液脱色。
1、重组蛋白的筛选
将未诱导、诱导的含重组表达质粒的菌液经破碎后，取上清、沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，比较蛋白是否表达，以及形式和表达量，筛选出可溶性且表达量较多的蛋白。
蛋白样品处理步骤：菌体沉淀用1mLPBS重悬，取上清液与沉淀悬液各50μL。加入等体积的2×SDS-PAGE，吹打混匀后置100℃金属浴中，煮样10min后经10000rpm离心5min。4℃放置备用。
表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测方法：洗净电泳槽及制胶用玻璃板，组装、固定玻璃板。待凝胶干后，将煮沸处理好的上清液及沉淀悬液样品，分别加样至SDS-PAGE凝胶中。打开电源，先经80V电泳，待各样品迁移至分离胶时再改为120V电泳跑样。待样品接近分离胶底部时，停止电泳，凝胶用考马斯亮蓝染色液染色10min，再用脱色液脱色。
2、重组蛋白诱导表达条件的优化
(1)最佳诱导浓度的确定
将300μL重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至Amp+LB液体培养基中，37℃200rpm,摇菌条件下培养至OD600nm达到0.4～0.6之间，分别加入终浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的IPTG。在37℃200rpm摇菌诱导8h，经重组蛋白SDS-PAGE检测，结果见附图4。
根据图4SDS-PAGE条带大小示，IPTG终浓度为0.8mmol/L时，重组蛋白诱导表达量最大，且重组蛋白存于菌液沉淀中，确定最佳诱导浓度为0.8mmol/L。
(2)最佳诱导时间的确定
将300μL重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至30mL的Amp+LB液体培养基中，37℃200rpm振摇条件下培养至OD600nm达到0.6左右，加入0.8mmol/L IPTG，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h，经重组蛋白SDS-PAGE检测，结果见附图5。
根据图5SDS-PAGE条带大小示，诱导表达5h时，重组蛋白表达量最大，确定最佳诱导时间为5h。
3、重组蛋白的纯化
采用切胶法纯化。以最优条件诱导、表达目的蛋白，收集目的蛋白，制备5％的浓缩胶和12％分离胶，组装好玻璃板后，吸取5mL分离胶液体加入玻璃板内，用无水乙醇封胶；待分离胶凝固后，弃去无水乙醇，再加入2mL的浓缩胶并用无水乙醇封胶。待SDS-PAGE凝胶凝固后，将500μL可溶性蛋白加入同等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，置100℃金属浴中煮15min，10000rpm离心10min。制好的蛋白样品加入胶板内进行电泳，电泳完成后进行切胶纯化，轻轻取下SDS-PAGE凝胶，放入-20℃预冷的0.25mol/L KCl溶液中。待出现白色条带时，对照蛋白marker将目的蛋白带切下，将凝胶条用液氮冷冻研磨。充分研磨后将凝胶粉末装入1.5mL离心管中，加入适量1×PBS溶液，重悬混匀，-80℃反复冻融3次，12000rpm离心10min，纯化的重组蛋白即为离心后的上清液。SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化效果，测定其浓度均为1.0mg/mL。
4、重组蛋白的定量
按照BSA试剂盒对纯化后的蛋白进行定量。将BSA试剂盒中的标准样品，根据说明书方法，分别稀释到2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL。将纯化后的蛋白与上述不同浓度的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，重组蛋白的条带与标准样品条带比对后即可得出重组蛋白含量，结果见附图6。
实施例四：PLMP多克隆抗体的制备
取2mg纯化的PLMP蛋白(1mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对新西兰兔背部皮下多点注射免疫。首免后15天，取1mg纯化的PLMP蛋白(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对兔进行加强免疫。此后每隔7天用同量的乳化液对兔再免疫，共3次；最后一次免疫7天后，颈动脉采血，将血液37℃温育2h后4℃静置过夜，最后4000rpm离心10min，收集血清并分装，于-20℃保存。
实施例五：PLMP多抗的纯化
1、血清预处理
用干净的注射器抽取6mL兔血清，用0.45μm滤膜过滤。
2、辛酸沉淀非IgG蛋白
取50mL高压灭菌后的离心管，加入24mL的乙酸缓冲液和6mL经0.45μm滤膜过滤后的兔血清，振荡混匀，用1mol/L NaOH将其pH调至4.5。加入正辛酸2.25mL，于室温中搅拌30min，10000rpm离心20min后，弃去沉淀。注射器吸取剩余液体部分，用0.45μm滤膜过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L的PBS溶液(PH＝7.4)，再用1mol/LNaOH将pH调至7.4，置冰浴中进行后续实验。
3、硫酸铵沉淀IgG
冰浴环境下，向上述溶液中加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌混匀30min，然后静置2h。4℃，10000rpm离心20min，弃去上清。剩余沉淀用0.0l mol/LPBS溶液溶解。沉淀溶解后，装入透析袋中，先用ddH2O透析2h，再用0.01mol/LPBS于4℃透析过夜，期间每4h更换透析液。最后4℃，10000rpm离心10min，收集上清。
实施例六：金标垫的制备
1、胶体金最适pH值的确定
本试验以加入0.2mol/L K2CO3的量为标准。取10个1.5mL的离心管并标记好号码，在各个离心管中分别加入1mL的胶体金溶液。向各个离心管中分别加入一定量的0.2mol/L的K2CO3充分混匀(如表3-2所示)，随后向各管中加入30μg经纯化的多克隆抗体，再次混匀，于室温静置30min。向每个离心管中缓慢加入20μL10％NaCl溶液，充分混匀后室温静置2小时。观察10个离心管的颜色变化及有无沉淀聚集的黑色颗粒出现。选择开始无聚集的那一管的K2CO3溶液的加入量，则为本试验中胶体金最适0.2mol/L的K2CO3的加入量，即最适pH值。用精确pH试纸确定其数值，结果如表1。
表1：胶体金标记抗体最适pH的测定
按照表1所排顺序观察可见，第1-3管有不同程度的变蓝聚沉现象，第4-9管的颜色呈透明酒红色，第4管的比第10管(对照)稍微深一些，说明胶体金与多抗的吸附较好，故而选用第4管所对应0.2mol/LK2CO3量。使用精密pH试纸检测，加入0.2mol/LK2CO3的量为20μL时，胶体金溶液的pH值为9.0。因此，胶体金标记的最佳pH值为9.0。
2、抗体最佳标记量的确定
取10个经高压灭菌后的1.5mL离心管，每管加1.0mL胶体金溶液。根据3.1.8.1中确定的胶体金最适pH值，向各个离心管中分别加入5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg的PLMP多克隆抗体(如表2所示)，充分混匀，室温静置10min。向每个离心管中缓慢加入10％NaCl 20μl，混匀，静置30min，观察各管的颜色变化。以胶体金溶液的颜色不发生改变的多抗加入量为稳定胶体金的最低用量，在此基础上再增加20％的多抗量，即为1mL胶体金溶液的最佳抗体标记量。
表2：胶体金标记抗体最适量的测定
将胶体金调至pH为9.0，用0.01mol/L的PBS(pH 7.4)稀释多抗至0.2mg/mL。抗体含量少的管中，出现变蓝的聚沉现象，而加入抗体达到或超过最低稳定量时，离心管中溶液保持红色不变，如图3-8所示。按照表2所排顺序观察可见，第5管的抗体量为最低抗体加入量为25μg/mL，为了稳定胶体金抗体需在此基础上再增加20％做为最佳标记量。所以抗体的最佳标金量是30μg/mL。
3、金标抗体溶液的制备
吸取10mL胶体金溶液于已经酸洗、硅化处理好的离心管中，置于涡旋振荡器上，调至1500r/min，逐滴加入0.2mol/L的K2CO3溶液150μL，同时振荡混匀以调至pH 9.0，逐滴加入240μg的PLMP蛋白多克隆抗体，1500r/min振荡混匀10min，随后加入10％的BSA使其终浓度为1％，振荡混匀后静置30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，1000r/min离心10min后取上清液，上清液置于4℃，5000r/min离心10min，将上清液和沉淀分开，收集沉淀，上清液再置于4℃,10000r/min离心30min，收集两次沉淀即是纯化标记好的胶体金抗体复合物，取体积为最初未经纯化的金标记抗体溶液体积的1/10为胶体金重悬液用量，将其加入至两次收集的沉淀中，重悬沉淀即为纯化好的金标抗体，于4℃保存。
4、金标垫的制备
用干净的剪刀将金标垫裁剪成0.7cm×10cm大小的长条，将裁剪好的金标垫浸泡在金标垫处理液中30min，4℃过夜干燥，将已经纯化好的金标抗体溶液均匀滴于处理好的金标垫上，悬空平放，于室温下自然干燥，除去多余水分，而后置于4℃风干，密封保存。
实施例七：检测线和质控线的制备
1、检测线包被抗体浓度的确定
在检测线的NC膜上，分别滴加用PBS稀释的浓度为0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL的1μLPLMP多抗，在质控线的NC膜上，滴加用PBS稀释的浓度为1.0mg/mL的羊抗兔IgG抗体1.0μL。用10μg/mL纯化的PLMP蛋白进行检测，观察检测线显色情况，确定包被抗体的最佳浓度。
当C线包被1.5μL浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG抗体时，将PLMP蛋白多抗设8个浓度梯度，用PLMP蛋白进行检测，观察可见，当其浓度由1.0mg/mL稀释至0.4mg/mL时颜色变浅，当其浓度由1.2mg/mL到1.8mg/mL时，颜色逐渐变深。故选择浓度为1.2mg/mL的PLMP蛋白多抗为T线最佳抗体包被浓度。
2、检测线包被抗体体积的确定
在确定检测线包被抗体的浓度的基础上，在检测线的NC膜上，分别滴加0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL、2.0μL的PLMP多抗。用PLMP蛋白进行检测，结果显示，1.5μLPLMP蛋白多抗为T线最佳抗体包被体积。
3、质控线最佳包被条件的确定
(1)质控线包被抗体浓度的确定
在已确定的检测线最佳条件下，将经PBS稀释的浓度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL的羊抗兔IgG抗体，各取1.0μl滴加于质控线的NC膜上。用PLMP蛋白进行检测，确定包被抗体的最佳浓度。
(2)质控线包被抗体体积的确定
将羊抗兔IgG抗体，分别按0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL、2.0μL的体积包被于质控线的NC膜上。用PLMP蛋白进行检测，确定包被抗体的最佳体积。
将羊抗兔IgG抗体按比例稀释后包被C线，进行试纸条检测，结果显示，C线包被浓度为1.0mg/mL，抗体体积为1.5μL时，检测效果最佳。
4、硝酸纤维素膜的预处理
取两块经酸洗硅化处理过的玻璃片，移液器吸取PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗均匀涂于玻璃片的侧面，涂完后玻璃片侧面印于NC膜上，检测线与质控线间隔0.5cm，将PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，包被之后于室温自然干燥。
实施例八：试纸条组装
将底板裁剪成宽为3.2cm/条，先将硝酸纤维素膜底面粘贴于底板上，经抗体包被后的金标垫裁剪为6.0cm×0.7cm压硝酸纤维素膜2mm平铺粘贴在底板上，剪样品垫6.0cm×1.8cm压金标垫2mm粘贴在底板上，剪吸水垫6.0cm×1.7cm压硝酸纤维素膜2mm粘贴在底板上，在金标垫与样品垫连接处用衔接胶带粘住，压紧各层，用剪刀将组装好的试纸条裁切呈宽为3mm的小条，密封干燥置于4℃保存，胶体金免疫层析试纸条模式图如附图7所示。
实施例九：检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸的应用方法
(1)样品前处理：
(a)蜂蜜：取5g蜂蜜充分溶解于40mL去离子水中，吸取100μL溶液，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。
(b)蜂蜡或成蜂：将蜂蜡或成蜂放入破壁管中，加入适当的双蒸水，固定在破壁仪上，进行破碎。破碎后取上清100μL进行检测。
(c)菌液：无需处理，直接取100μL菌液样品，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。
(2)用胶体金层析试纸条检测：
将所取液体滴到样品垫上，室温下作用10-15min。
(3)结果判定
(a)阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。
(b)阴性：检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。
(c)失效：如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试纸条失效。如附图8所示胶体金免疫层析试纸条的结果判断。
实施例十：试纸条性能的测试
1、试纸条特异性的测试
分别将100μL的蜂房链球菌菌液、蜜蜂败血杆菌菌液、蜜蜂哈夫尼肠杆菌菌液、双蒸水滴至胶体金试纸条的加样垫上，l0min后结果如附图9所示，即检测幼虫芽孢杆菌阳性菌液样品的试纸条T线和C线明显出现了红线，结果正确；阴性样品均只在质控线C线出现了红色，结果正确。
2、试纸条敏感性的测试
用同一批制备的胶体金试纸条，将幼虫芽孢杆菌菌液按108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL的稀释后进行检测，观察可见，1-2号试纸条T线在10-15min之内未出现红线，3-6号试纸条T线在10-15min之内出现红色。由此确定试纸条对PLMP蛋白的检出限为105CFU/mL，可用于蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测。
3、试纸条稳定性的测试
将幼虫芽孢杆菌阳性菌液用置于4℃和室温保存的试纸条检测，分别将7d、15d、30d、60d、90d进行数据整理，结果如表3所示，试纸条置于4℃可保存3个月；室温保存至少1个月。
表3：试纸条稳定性试验结果
注：“++++”表示显色明显，条带清晰；“+++”表示显色明显，条带清晰但颜色稍变淡；“++”表示T线颜色变淡，但检测结果准确；“+”表示T、C线颜色均变淡，但检测样品的阴阳性准确。
4、试纸条重复性的测试
用不同批次的试纸条分别检测幼虫芽孢杆菌阳性及阴性菌液，进行批间重复性试验。另外用同一批次的试纸条检测上述菌液，进行批内重复性试验。得到的结果一致，说明重复性较好。
5、临床样品的检测
本试验利用SN/T 1681-2011中PCR方法及研制的幼虫芽孢杆菌胶体金试纸对伊犁新源县10个蜂场采集到的40份蜜蜂幼虫、52份蜂蜜、22份蜂蜡及243只成蜂进行检测，结果如表4所示，特异度达到100％。
表4：临床样品检测结果
检测方法 阳性样品 阴性样品 阳性率
PCR 0 357 0
胶体金试纸条 0 357 0
6、人工模拟污染样品的检测
分别取1mL经双蒸水稀释的蜂蜜、经研磨的幼虫及蜂蜡，与1mL浓度分别为109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL的幼虫芽孢杆菌菌液，充分混合，制备成人工模拟的污染样品。用本研究制备的胶体金试纸条对上述样品进行检测，应用本研究中制备的胶体金试纸条分别对处理后加入不同浓度的幼虫芽孢杆菌菌液进行人工模拟污染样品检测，结果显示蜂蜜最低检出幼虫芽孢杆菌浓度为106CFU/mL，蜜蜂幼虫最低检出幼虫芽孢杆菌浓度为105CFU/mL，蜂蜡最低检出幼虫芽孢杆菌浓度为105CFU/mL。
综上所述，本发明构建的PLMP重组蛋白效率高，分离纯化方法简单，成本低，周期短；此外，本发明提供的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100％，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为105CFU/mL和106CFU/mL。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (5)

1.蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗的制备，其特征在于，具体采用以下技术步骤制备获得：
(1)PLMP基因扩增:
根据GenBank公布的幼虫芽孢杆菌核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物，并在引物的5'端分别加BamH I和EcoR I酶切位点识别序列，将幼虫芽孢杆菌阳性菌液DNA作为模板，进行PCR扩增，后回收目的片段备用；
(2)原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP的构建：
将上述PCR产物经胶回收纯化后与T载体连接，连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞中，经培养基培养,摇菌复苏，复苏后离心弃上清液，菌泥混匀后培养12h；挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后摇菌培养，提取重组质粒；取pGEX-4T-1质粒和重组质粒分别用EcoR I和BamHI进行双酶切，酶切后用T4连接酶连接后转化至E.coliBL21感受态细胞，PCR筛选出阳性菌落后，挑取单个菌落培育；
(3)PLMP重组蛋白的诱导表达及纯化:
将重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至培养基中，摇菌条件下培养至OD600nm达到0.4-0.6之间，加入终浓度为0.2mmol/L-1mmol/L的IPTG，在37℃200rpm摇菌诱导，诱导时间为1h-8h，对重组蛋白采用切胶法纯化；
(4)PLMP多克隆抗体的制备：
取纯化的PLMP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对家兔背部皮下多点注射免疫；经四次免疫后，颈动脉采血，收集血清保存。
2.检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的免疫层析纸，其特征在于，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述的金标垫上含有胶体金标记的PLMP多抗，硝酸纤维素膜上有用PLMP多抗预包被的检测线，用羊抗兔IgG溶液预包被的质控线。
3.如权利要求2所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的免疫层析纸的制备方法，其特征在于，具体采用以下技术步骤：
(1)制备胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体：吸取10mL胶体金溶液于已经酸洗、硅化处理好的离心管中，置于涡旋振荡器上，调至1500r/min，逐滴加入0.2mol/L的K2CO3溶液150μL，同时振荡混匀以调至pH 9.0，逐滴加入240μg的PLMP蛋白多克隆抗体，1500r/min振荡混匀10min，随后加入10％的BSA使其终浓度为1％，振荡混匀后静置30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，1000r/min离心10min后取上清液，上清液置于4℃，5000r/min离心10min，将上清液和沉淀分开，收集沉淀，上清液再置于4℃,10000r/min离心30min，收集两次沉淀即是纯化标记好的胶体金抗体复合物，取体积为最初未经纯化的金标记抗体溶液体积的1/10为胶体金重悬液用量，将其加入至两次收集的沉淀中，重悬沉淀即为纯化好的金标抗体，于4℃保存；
(2)金标垫的制备：用干净的剪刀将金标垫裁剪成0.7cm×10cm大小的长条，将裁剪好的金标垫浸泡在金标垫处理液中30min，4℃过夜干燥，将已经纯化好的金标抗体溶液均匀滴于处理好的金标垫上，悬空平放，于室温下自然干燥，除去多余水分，而后置于4℃风干，密封保存；
(3)检测线和质控线的制备：取两块经酸洗硅化处理过的玻璃片，移液器吸取PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗均匀涂于玻璃片的侧面，涂完后玻璃片侧面印于NC膜上，检测线与质控线间隔0.5cm，将PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，包被之后于室温自然干燥；
(4)试纸条组装：将底板裁剪成宽为3.2cm/条，先将硝酸纤维素膜底面粘贴于底板上，经抗体包被后的金标垫裁剪为6.0cm×0.7cm压硝酸纤维素膜2mm平铺粘贴在底板上，剪样品垫6.0cm×1.8cm压金标垫2mm粘贴在底板上，剪吸水垫6.0cm×1.7cm压硝酸纤维素膜2mm粘贴在底板上，在金标垫与样品垫连接处用衔接胶带粘住，压紧各层，用剪刀将组装好的试纸条裁切呈宽为3mm的小条，密封干燥置于4℃保存。
4.如权利要求2所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸在检测蜂蜜、蜂蜡、成蜂和菌液中幼虫芽孢杆菌的应用。
5.如权利要求4所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸在检测蜂蜜、蜂蜡、成蜂和菌液中幼虫芽孢杆菌的应用，其特征在于，具体采用以下技术步骤：
(1)样品前处理：
(a)蜂蜜：取5g蜂蜜充分溶解于40mL去离子水中，吸取100μL溶液，滴加到试纸条样品垫上，进行检测；
(b)蜂蜡或成蜂：将蜂蜡或成蜂放入破壁管中，加入适当的双蒸水，固定在破壁仪上，进行破碎。破碎后取上清100μL进行检测；
(c)菌液：无需处理，直接取100μL菌液样品，滴加到试纸条样品垫上，进行检测；
(2)用胶体金层析试纸条检测：
将所取液体滴到样品垫上，室温下作用10-15min；
(3)结果判定：
(a)阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在；
(b)阴性：检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在；
(c)失效：如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试纸条失效。
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