CN108384762A - 猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用 - Google Patents

猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用。本发明的猪α肠道冠状病毒核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了优化后的猪α肠道冠状病毒分离培养方法，优化了敏感细胞系和培养条件，让病毒更好的适应体外细胞，可使用病样样品直接接种Vero细胞；同时使病毒滴度明显提高，对猪α肠道冠状病毒后续的研究和工业化利用提供了更好基础条件。

Description

猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用。
背景技术
引起猪腹泻的猪冠状病毒病主要有猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪流行性腹泻(PEDV)。不同年龄和不同品种的猪均易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重，以水泻、呕吐和脱水为主要症状。2010年入冬以来，猪流行性腹泻病毒变异株开始在我国流行，并导致全国范围内的严重爆发，初生仔猪感染后死亡率达90％以上；随后，可导致仔猪腹泻的新型肠道冠状病毒Delta冠状病毒(PDCoV)也被发现；冠状病毒的高变异特性目前已经成为仔猪腹泻防控的难点，给养猪业造成巨大经济损失，对养猪业的发展形成严重威胁。
2017年初，广东部分猪场先后发生以新生仔猪严重腹泻、呕吐和脱水为主要特征的高度接触性传染病，主要表现为哺乳仔猪高发病率和高死亡率。技术人员通过实验室检测排除了常见猪腹泻相关病原感染，怀疑有新病毒株感染，亟待进一步鉴定和制定防治方案。
发明内容
鉴于此，本发明通过收集临床病料，筛选敏感细胞系、优化培养条件，成功分离到一株病毒，对分离的病毒进行生物学特性研究、分子进化分析及动物回归试验确证了此次引发个别猪场发生腹泻的病原是一种新型的猪肠道冠状病毒。通过全基因序列分析发现其同源性与蝙蝠α冠状病毒同源性最高，因此将其命名为猪α肠道冠状病毒 (Swine entericalphacoronavirus SeACoV)。本发明还通过建立 SeACoV体外培养条件，对分离到的病毒进行鉴定，此毒株的成功分离鉴定为该病的防控提供了突破口，为后续研究奠定了基础，其结果具有重要意义。
本发明技术方案如下：
一种猪α肠道冠状病毒SeACoV-GD02/2017,保藏号：CCTCC NO:V201801；保藏日期：2017年12月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉，武汉大学；其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述猪α肠道冠状病毒与蝙蝠肠道阿尔法冠状病毒 HKU2在全基因组核酸水平上的同源性为94.9％；与马铁菊头蝠阿尔法冠状病毒YN2012在全基因组核酸水平上的同源性为88.3％。
一种猪α肠道冠状病毒的分离培养方法，包括步骤：
(1)病料采集与处理；
(2)将步骤(1)中所得到病料进行传代培养；
(3)对步骤(2)培养所得产物进行筛选检测。
进一步的，所述步骤(2)传代培养时，采用Vero细胞，配合含胰蛋白酶的维持液。
进一步的，所述步骤(2)传代培养操作方法包括：将病料直接接种于经含胰蛋白酶的DMEM洗过的Vero细胞；在37℃的5％CO2条件下于含胰蛋白酶的吸附液中吸附；然后再于含胰蛋白酶的维持液中培养；重复上述操作进行传代培养。
进一步的，所述步骤(2)中胰蛋白酶的终浓度为6μg/mL。
进一步的，所述步骤(2)传代培养时，每次传代前，将上一代的细胞培养物反复冻融3次。
进一步的，所述猪α肠道冠状病毒在制备猪α肠道冠状病毒病的诊断试剂中的应用。
进一步的，所述猪α肠道冠状病毒在制备预防猪α肠道冠状病毒病的疫苗中的应用。
本发明有益效果：
通过对本发明成功分离得到的病毒进行生物学特性研究、分子进化分析及动物回归试验确证了此次引发个别猪场发生腹泻的病原是一种新型的猪肠道冠状病毒。通过全基因序列分析发现其同源性与蝙蝠α冠状病毒同源性最高，因此将其命名为猪α肠道冠状病毒(Swine enteric alphacoronavirus SeACoV)(SeACoV-GD02/2017)。通过建立SeACoV体外培养条件，对分离到的病毒进行鉴定，此毒株的成功分离鉴定为该病的防控提供了突破口，为后续研究奠定了基础，其结果具有重要意义。还可用于制备SeACoV感染的快速诊断试剂和疫苗研究。
SeACoV为新分离得的病毒株，但采用目前现有技术分离SeACoV 毒株的分离率极低，约20份样品能分离到1份，并且分离到的SeACoV 病毒含量很低，传代容易丢失病毒。对于新发现的病毒来说，如果尝试现有细胞分离技术得不到病毒一般就会放弃，这阻碍了对SeACoV 毒株后续的研究和工业化利用，所以分离中对于新病毒适应细胞是很关键的。本发明优化了敏感细胞系和培养条件，让病毒更好的适应体外细胞，可使用病样样品直接接种Vero细胞；同时使病毒滴度明显提高，比293细胞培养的病毒滴度高100倍，为后续制备高质量的疫苗提供了更好的基础条件。
附图说明
图1为Vero细胞图片(×100)。其中A为对照细胞：细胞未出现病变；B为感染病毒的Vero细胞：病料传3代，病变稳定，Vero 细胞感染病毒48小时细胞出现大量融合。
图2为电镜负染色可见100-120nm的球形或不规则形病毒颗粒。
图3为间接免疫荧光染色(×200)。其中A为阴性对照；B为 SeACoV-GD02/2017毒株感染的细胞。
图4为SeACoV-GD02/2017的全基因序列分析结果。
图5SeACoV-GD02/2017感染3日龄仔猪后的水样腹泻、肠壁变薄，内部充满大量黄色液体。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1猪α肠道冠状病毒的分离
1、病料采集与处理
选取发病仔猪的新鲜肠道，用玻璃研磨器研磨后用DMEM配成1： 10的悬液，震荡混合均匀，反复冻融3次，于8000r/min(转每分钟) 离心10min(分钟)，取上清，用0.22μm(微米)的滤器除菌，-70℃冰箱储存备用。
2、猪α肠道冠状病毒的分离传代培养
取6孔板上48h生长良好的Vero单层细胞，弃去培养液，用PBS 液清洗细胞单层2次，再用含6μg/mL胰酶的DMEM洗一遍，按照每孔加入200μL病料过滤液，并添加胰酶至终浓度6μg/mL，放置于 37℃的5％CO2吸附1h，其间轻摇2次，待吸附结束后，弃掉吸附液，加入PH值为7.2，含有终浓度6μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，37℃培养，逐日观察，以72h为一个传代周期。传代前将上一代的细胞培养物反复冻融3次，重复以上操作进行传代。整个传代过程期间，设置不接种病毒的含有相同浓度胰酶的细胞培养物作阴性对照。若无CPE，可继续传6代，将出现70％以上病变(病变细胞见图1)的细胞冻融一次，于8000r/min离心10min，取上清-70℃冰箱进行保存。
3、电镜鉴定
将接种病毒培养48h的细胞培养物收获后，反复冻融3次， 12000r/min 4℃离心30min，去除细胞碎片，吸取少量滴加到用碳膜覆盖的铜网上，待网上液滴将干时，再滴上pH6.1的磷钨酸溶液进行染色，一定时间后用滤纸吸去多余染液在透射电镜下观察，结果显示(见图2)，直径在100-120nm，呈球形或椭圆形，有的病毒粒子包膜上有棘突，符合冠状病毒的形态。
4、间接免疫荧光检测
取长成单层的96孔细胞板，需同时设立不接毒的细胞对照为阴性对照孔，接种病毒，24h后在显微镜下观察到病变，轻轻吸弃上清，用PBS轻轻洗涤3次。再用-20℃冷丙酮(丙酮：超纯水为4：1)每孔加200μL置于4℃固定15min。PBS洗涤3次，每次3min，然后将细胞单层用200μL 5％脱脂乳封闭30min，之后倒去脱脂乳，加入稀释的一抗(1:100)200μL，于37℃温箱内作用1小时，PBS洗涤3次，每次3min；滴加200μL FITC(异硫氰酸荧光索)标记的羊抗猪IgG二抗(1：1000稀释)，37℃作用30min，PBS洗涤3次，每次3min；避光加入200μl 1×PBS配制的DAPI(1:1000倍稀释)，室温避光孵育5min，弃去DAPI，用2ml 1×PBS清洗细胞2遍，每遍静置3min；最后用1：9的磷酸甘油封底，用倒置荧光显微镜观察结果。需设置阴性对照孔两个，一抗有发病时猪场发病猪血清和PEDV，TGEV及 PDCoV三种病毒的单抗。结果显示(见图3)，阴性对照孔和以PEDV， TGEV及PDCoV单抗为一抗的孔均为阴性，以发病猪血清作为一抗的孔都呈阳性反应，试验证明本发明分离到的病毒均在细胞浆中被染色，分离到的病毒能感染猪体且能在猪体内产生特异性抗体。
5、全基因基因序列测定
取分离到的病毒进行全基因组测序，利用DNAStar和Mege6.0软件对测序结果进行分析(见图4)，结果显示：分离到的病毒全长27,155nt，并与蝙蝠肠道阿尔法冠状病毒HKU2在全基因组核酸水平上的同源性为94.9％，与马铁菊头蝠阿尔法冠状病毒YN2012在全基因组核酸水平上的同源性为88.3％，因此将新分离到病毒命名为猪阿尔法肠道冠状病毒(SeACoV)。
6、动物回归试验
用分离到的病毒对3天龄仔猪口服感染，仔猪在感染病毒后约 24h表现出精神沉郁、水样腹泻、呕吐等症状，剖检结果同样显示肠壁变薄，内部充满大量黄色液体(如图5所示)，与猪场发病情况相似，实验表明细胞分离的SeACoV确实能够感染3日龄新生仔猪并引起严重腹泻和粪便排毒，是引起此次腹泻发生严重的病原。
实施例2细胞系对本发明猪α肠道冠状病毒分离培养的影响
本实验选用了ST细胞、Marc-145细胞、293细胞和Vero细胞对腹泻样品进行分离培养，培养方法和实施例1中的分离方法相同，使用的培养液也完全相同，结果仅有1份样品在Vero细胞上传到第三代出现明显的细胞融合现象，在293细胞上出现较轻微的细胞融合现象，在ST细胞和Marc-145细胞没有出现细胞病变，且PCR检测也为阴性；将用Vero细胞分离到的病毒培养液接种ST细胞和Marc-145 细胞也未见细胞病变，且PCR检测也为阴性。经测定293细胞培养物 TCID50仅为10-4.0/0.1mL，在Vero细胞上培养的病毒TCID50为 10-6.0/0.1mL。
实施例3胰蛋白酶浓度对本发明猪α肠道冠状病毒分离培养的影响
将分离到的病毒接种相同状态的Vero细胞，培养方法和实施例 1中的传代培养方法相同，维持液采用添加不同浓度的胰蛋白酶，浓度梯度分别为0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL和8μg/mL，结果显示：0μg/mL维持液的未出现可见病变，PCR检测也为阴性；含2μg/mL、4μg/mL和6μg/mL胰蛋白酶的维持液培养的病毒TCID50 分别为10-4.0/0.1mL、10-5.25/0.1mL和10-6.0/0.1mL；8μg/mL胰蛋白酶的维持液培养的平皿细胞在15h时全部拉网死亡，同添加8μg/mL胰蛋白酶的不接种病毒的细胞(阴性对照)状态一样。由此可以得出采用Vero细胞，且添加6μg/mL胰蛋白酶的维持液培养的猪α肠道冠状病毒病毒含量最高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用
<130> CNP201710447
<141> 2018-01-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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gtgcattttt aggttctttg ggtgatgttg cacattgttt agaggtattg cttaaggatg 3660
ctaagacagc caaagttact gttgaagtta cttgtgattg ttcatctaac ttcgaagaac 3720
ttagcggtgc tttctttagg tttttgcctc ttaagagtaa gtttgaatat ggtagttgct 3780
ttgcttgtca tggcactcgt tattatcgtg tgtgtggtat tgttggctct gcaatatttt 3840
cacagactct taagccattg gatttcaatg acctgatctg tgatgttgct agtgctagcg 3900
tctttcttgg tgatgattgt ggtcattatt taattaatga ctacgacaag agactatgtg 3960
tcgatggtat gggtgtttac aagattaagc ataacaccat tgacacaata gttgttaagg 4020
acgccgatat taagccttct actgtggcac cttttatcga gtactgtaat gtgaagttct 4080
accagggtga ttttaaagat cttgctggtt tgtctcatga ctttgtagtt aatgcagcaa 4140
attgcaactt ggcccacggt ggtggtgtag ctaaggctat agatcatcac actggtggca 4200
agttgcaaaa gctttccact tcttttgtta aaaggaacgg taaggttgca actggtgagt 4260
gtgttatgat tgatactggc aagttaaaag tccttaatgc agttggtccc cgtaagggca 4320
aggatgcaga gtctttatta aatactgttt acactaatat ctttgcgcgt aagggtgttc 4380
cccttatgcc tttgattagt tgtggtattt ttggctttga cattaaagac tcacttaggg 4440
cattcttgga tgcatgtggt gataggcacg ttaaatgctt tgtttattct gactctgaaa 4500
gggagtcagt tatgaagttc ttgacgacac cttttgagga acatgttgca cctattgaag 4560
aaatgcttga aacacctgtg gttgaaacaa caactgatgt tgtttctcca tttcacacta 4620
ttggttctca taagttttat gattgcaata gtgttgagcc tattttaggt ctaggtgtta 4680
agaacattgt tctcttcaca gaccaggtgt tgtctgttaa agatttcggt attgttgttg 4740
ataagtatct caatggcttg ttatctgaca tgtccaacaa gtatgttaat gatcataaag 4800
ctgttccttt tggtaacatt ttgtcacttg attgtggtgc ttttactgta gtggatgctg 4860
tgtcgccttt tgatggtgct agctttgaga agcagagtgg tcgtaccata cgtaaattgg 4920
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tctttgtgtt gggtgacaat ttttcatttt tagtgttaga taatgttaga cctttgtttg 5040
ataattatct taaacctaaa gatgttaaag ttaaggtcac agcggatggt cgcaatatca 5100
atgatgttat agtcacaact gcggaaacgt ttgatgcgca gttgggacct tctgctaatg 5160
gtgctgaatc acttgttggt gttgttccta ctccaacgga tggtggtaag gttgttaata 5220
cagtacctga tgtcaattgg agtaagcact ttggtttttc tgatgctgct gcatttgccg 5280
ttcttgacca tagcaagttt gcttttgatt ctgaagtagt tgatggtaag cgtgcacttg 5340
ctgattcaga taacaattgc tgggttaatg cgacttgttt agcattgcaa tttcttaaac 5400
ctacgtttaa atacgttggt tgggaggatt tgtggaacaa gttcgttaca ggtgatgttg 5460
ctggttttgt tcaccttctt tattatatag agggtgttga caaaggcgct aagggtgatg 5520
ttgagagcac attaagtaag cttgataagt atattgtatc tagtggttct gttactgttg 5580
aacgttctac attgtgcgat cgttgtaata gtacagttaa aactgttaca ggtgctatag 5640
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ggcgtgtgca agttatcggt gttaaaggtg acatcatttt actacacagc ggtagcttat 5760
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atgttggtga cattgttgca cataacattg cttacttttt cgtttggttg ctaactacac 6060
ttagcactct ttataggtgc tggcgtggtg gtaattttaa attattgtct agtatacctg 6120
aacgtagtgg tatagtgtta cgcaggagtt ttaaatataa ttttagagct ttgcgttcta 6180
atgtggctag taaacagaag tattgtctta tgtttgctaa gttgctatta ctactgtata 6240
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gcagtactgt tagaggttac gctagttccg actttgacaa gagtaagttt tgcaatggat 6360
ctttggtttg taagacttgt ctttttggct atcaggaact tagtgaattt caacatgtag 6420
gtgtggtctg gagctatgtg cgtgaacctc tttttgctag tgttttacca ctatgttact 6480
ttgctgttat tgcaattttt ggtggtgttg ttgagcggtt tgcattatgt tattttgctg 6540
cacaatttat taataatgtg ctcagctttt taaagttgca ggactccttt tggctagttc 6600
aacttgtccc ttttgacata tttggcgatg agatacttgt tatgtttttg tcatataagg 6660
ctatttgttt ctttaagcat gttgtttttg gttgtgacaa acctagttgc gttgcatgct 6720
gtaagagtgc taaacttaag aggattgcca tggataccat tgttaatggt tctaggcggt 6780
ctttttatgt taatgctaat ggtggtgcta agttatgtaa aaagcataac tttttctgtg 6840
tcgcttgtga ttcttatggt agtggtcata cttatattaa tgatcatatt gccaatgagt 6900
tacataatgt tactaagtta catgttaagc ctactggtcc tgcttttatt aatattgata 6960
gggttgagtt tagtgatgga ttttaccgca tcttttctgg tgacaaattt tggaaatata 7020
attttgatat tactgataaa aagttttctt gtaaagaagt acttaagaat tgtaatatct 7080
tagatgattt tattgtcttt gacaataatg gttcaaactt gtctcaggtt cagaatgcgt 7140
gtgtttatct ctcacaactt ctgtgtaagc ctattaagat tattgattct acactactgt 7200
cttcacttaa tgttgacttt aatggtgctt tgcataaggc atttttagat gtcttacata 7260
atagttttgg caaggatttt agttcttgta aaactatgca tgattgcaaa gagttgcttg 7320
agttagatgt tagtgatgat gattttatta aggttgtatc tgatgctcat cggtttgatg 7380
tgcttattac tgacacatcc tttaataatt tctgtacgtc ttatgccaaa ccagcagaga 7440
aattgtcctc ttttgatttg gcacattgta tgcgcagtgg tgctaaagtt gttaatcata 7500
atgtgcttat taaggaaaag atgcctattg tgtggaattg cgtggatttt gccaagcttt 7560
cagttgatgc tagaaaatac attgttaaaa ctgctaaggt taaaggtgta acttttctcc 7620
ttactgttaa taacaatgtt atggaaacta ccttaccttg tgttagtgtg ttgcaaaaac 7680
agggtgctgg taagctgtcc tctatgtgga aaaatttttg gtatgcatgt ggtgccattt 7740
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catcaaatag tgacaagtgt cctatagttg ttggtgctag tgattctgga cgtgttgtac 7980
ctggtgttgc atctgatgtt tatttgcttg gtaaaacgct tattttcaca cttaaaacag 8040
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tatttaattc tgcctgtact aacttagaag gacttggtgg cacacgcact tattgctata 8160
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attgctttat atgggatatt agttatgttg ttgcctattg cttgttggcg ccatggtggt 8760
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aggtctctac aactttgttt gagggtacta aatttgttgg cacatttgat gctgcatctg 8880
ttggtacctt tgttattgat gcacgttctt atgagcgtct tatcaatagc actagtatag 8940
agaagattaa acagtatgct agtactttta ataagtacaa atattacagt ggtagcgcta 9000
atgaggctga ttataggtgt gcttgttatg ctcatcttgc caaagctctt attgatttct 9060
caacaactag acaggacaca ttatacaccc caccaactgt tagtattaat tctactttgc 9120
aggctggtct taagaaaatg gcccaaccat ctggccttgt tgaaccatgt gtagttcgtg 9180
tctcatatgg taatacagta ctgaatggtg tttggcttga tgacaaggtt tattgcccta 9240
ggcatgtttt ggctagtgac actacagtta ctatagatta tgatgcagtt taccattcga 9300
tgagactgca taatttttct atttctaagg gtaatgtttt tcttggtgtt gtaggtgctg 9360
ttatgcaagg tgctaatctt gttattactg tgtcacaggc taatgttaac actccatcat 9420
atagttttag aactttgaaa gcaggtgagt gttttaacat tttagcttgt tatgatggta 9480
cacctgctgg tgtctatggt gttaatttga gaagcacaca tacaattaaa ggttcatttg 9540
ttaatggtgc ctgtggttca ccaggttttg ttatgaatgg tcataaagta gagtttgtct 9600
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tttatggtgg gtttgaagac caacctagta ttcagcttga gggtgttgca acccttatta 9720
ctgaaaatgt tatcgcattt ctgtatgccg ctctaattaa tggtgagcgt tggtggtgtt 9780
ccaatgaacg ttgcactatt gatagtttta atgagtgggc tcttggtaat ggttttacta 9840
atttagtgtc tggtgacggg ttctctatgt tggctgctaa gactggtgtt gatgtgtgtc 9900
aactcctttc agccatacag agacttgcca ctggtcttgg tggtaaaacg attctaggtt 9960
atgcttctct tacagatgaa tacacactta gtgaggttgt taggcaaatg tatggtgtta 10020
acatacagag cactaagact agtagtgctt tgaagaacct acttcttatg ggtttcttct 10080
ttctattgtt ttggtctgaa ttctttatgt attcaactat actgtggatt aatcctggct 10140
tgattacaac ctttttgggt ctttttgtaa tgttatctat gctgcttgct agttgtatca 10200
aacataaaat gctttttctt cagttatttt tgctcccatc tattattata gctgcttgct 10260
acaattttgc ttgggatatg gaagtaacta gaatgttggc tactcagttt gactaccatg 10320
tatcatttct taatatggat atacagggtg ctattaacat tattgtgtgt ttcattggta 10380
tatctttaca tacttataga tttttggaca cacaattgcg ttcttacagc acttatatat 10440
tatctatgtg cacagttctt tacacattct attatggcta tgactctttg agccttgcta 10500
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cccagtttat agtgccatac tgtcctggac ttatctcctt tgttggtgat attaaggctg 10620
tattggttat gtaccttgtc tttggatttg ttgcgactgt ttattttggc ttgctttatt 10680
ggcttaacag agtgcttaaa ttgactcttg gttgttatga ctttaaagta tcagctgctg 10740
aatttaagta tatggtcgcg aatggttata ctgcaccaag aggtcctttt gactctgtat 10800
tacttagtct cagactattg ggtgttggtg gccagaaaac tattaaggtt tctacagtgc 10860
agtctaaact tactgatctt aagtgtgcca atgttgtgct tttgggttgt cttaccaaca 10920
tgaatatcgc agctaatagt agagaatggt cttattgtgt taatttgcat aatgagatta 10980
accttactag tgaccctgaa gaggcccttg aaaaactttt ggcattagta gcatttttcc 11040
tatcaaagca acaaaacttt ggtgttgatg atttaataga ttcattcttt gaaaacagaa 11100
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aggctcgtat gaattacgag gatgctattg ctaatgatgc tgctcctact gttgttaagc 11220
agttgaagaa ggctatgaat actgcaaagg gtgagtttga ccacgaggct tcagttcaga 11280
agaagattca gcgtatggct gatgcggctg cagctcagat gtataaagat gctcgtgctg 11340
tggaccgtaa gtctaaagtt gttagtgcta tgcattcact gttgtttggt atgctccgta 11400
agcttgatat gtcttctatc aatcagctta tggagcttgc aaaggatggt tgcataccta 11460
tggctattat acctgctgct gcagctacaa aacttacagt tattacccct gatttggagt 11520
cctttagtaa aatacgtgtt gataataaca tttattatgc tggggctgca tggagtatta 11580
ctgatgttaa agatgctgat ggcagagttg tcattttgaa ggagattaat gctgacaaca 11640
aggacgcttt agtttggcca ttacatgtta cttgcgagcg tgttgttaaa ctccagaata 11700
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acctttatta tgttaagaat cttaacaatt tgcgtagagg tgctacttta ggctacatag 12000
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tcactctttg cgcttttgct gttgaccctg ctaaggccta tgttagtgct gttaaacagg 12120
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gccctgtaat ggtactgaac cagaacattg tgttcgtgct tttgacgttt ataacaagga 12540
tgtagcatgt attggtaaat ttttgaaggt taactgtgtt aggctcaaaa atttagataa 12600
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catgtgtttg ttacactgtt ctaattttaa cacactattt tctactacta tacctaatac 13380
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cggctaccat tttaagcagt tgggtttagt ctggaacaag gatattaata cccataattc 13500
tcgccttagt atgactgact tgttgcagtt tgttacagat cctggcttac ttatagcgtc 13560
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aaagggtgat gctgctgttg ctgattttga ctattatagg tacaacaagc ctactatgct 13800
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gaagtatttt gttaaaatag gaccatctca gcattgtgat tgtggtaaag aggctcgttg 17640
ctacaatagt gcgactcatg cgtactattg tttagcacac gcacttggtt gcgattattt 17700
gtacaacccc tttgttatag atatacagca atggggctat acagggtctc ttagcagtaa 17760
ccatcatgaa gtttgtaatg tgcaccgtaa tgagcatgtt gcttcaggtg acgctattat 17820
gactagatgt cttgcaattc atgattgttt tgtaaaaaat gttgactggt ctatcacata 17880
tccgtttatt gccaatgaga atgccattaa taagagtgga cgaatagttc agtctcatat 17940
tatgaaggct gccttgaagg tgtataatcc taaagctgtt catgacattg gaaatcctaa 18000
aggcatacgt tgtgttgcaa ctaatgtacc ttggtactgt tacgacaaac agcctattaa 18060
ttctaatgtt aagatgcttg agtatgatta tatgactcat ggacaattgg acggtatgtg 18120
cctattttgg aactgtaatg tagatatgta tcctgagttt tctattgtct gcaggtttga 18180
cacacgctgt agatcacatt tgtcactaga aggcgttaat ggtggtgcac tttatgtaaa 18240
caatcatgcc ttccacacac ctgcatacga caagcgtgcc tttgctaagc ttaagcccat 18300
gccatttttc ttttatgatg atggtgaatg tgatgtttca cagggacaga ttaattatgt 18360
gccacttcgt gctaccgtgt gtattactaa gtgtaatatt ggcggtgctg tttgtaagcg 18420
acacgctagt ctttataggg cttatgttga ggcttataat acttttactc agaatggttt 18480
taacatttgg tgtcccaaca gttttgatgt ttataattta tggcaaactc tagttgacac 18540
taatttgcag ggccttgaga acattgcata caatgttgtc aagaagggat cttttgttgg 18600
tgaaccaggt gagttgcctg tggcagttgt aaacgataga gtgtctgtta gggatggtgt 18660
tagtgataat gttatctttg ttaataagac ttcattacca accaatgttg catttgagct 18720
gtatgctaag cgcaaaattg gtcttacacc gccacttacc attctgaaaa atatgggtgt 18780
tgttgctaca catggtttcg tgttatggga ctatgatgct gacagaccct tttctaattt 18840
tactaaatct gtttgcaagt atacagactt tgatgaggac gtgtgtactt gctttgacaa 18900
tggcatacaa ggtgcatttg agaggtttac tttgtgtaag aatggtgtat taatctctaa 18960
tgtcgctatc aagaaattac gtggtatacg tttgaatttt ggttatttga acggtgttgc 19020
agttagtagt atcactgaag gtgagactac taagcctgtt gactggtata tctatcaacg 19080
caaagacggt tcatttgttg agcctgttga tggttactac tcacagggtc gtaatgctag 19140
tacattcttg ccacgttctc agatggaaaa agacttttta gaacttgaca ctggtttgtt 19200
tataagcaag tatggacttg aagactttaa ttttgagcac atcgtttatg gcgatgtctc 19260
aaaaactact cttggtggtc tacacttact tatatcacag gttcgtttag cacgtattgg 19320
tgttcttaag gttgaggact ttgttgactc agctgatgat acactacata gttgttccgt 19380
tacgtatgct aatgatccta gtagtaaatc cgtctgcacc tatatggata tacttttaga 19440
tgattttgtt gtgattctta agaatcttga tctttctgtg acgtctaaag tgcatgatgt 19500
cattgttgat tgtaaggctt ggcgctggat gctttggtgt aaagactcca aggttgccac 19560
tttctacccg cagttgcagt ctgctgagtg gaagtgtggt tacagcatgc caagccttta 19620
taaaatacag aatatgtgta tggatgcatg taatttgtat aattatggtg ctagtattaa 19680
gttgccagat ggtattatgt ttaacgttgt taaatatacc cagctgtgtc agtttcttaa 19740
taccactacc atgtgtgttc ctcataatat gcgtgtctta caccttggtg ctggctctga 19800
taagggtgta gcaccgggta cagctgtttt acgtagatgg ctccctgacg atgcaataat 19860
cgttgacaat gatgttaatg attatgtcag tgatgctgat tttagtataa caggtgattg 19920
tacacatgtt tatgttgaag acaaatttga cctacttata tcagatatgt atgatggaaa 19980
aattaagagc atcgatggtg acaatgtgtc taaagatgga tttttcactt atattaatgg 20040
atttatacgt gaaaaacttg cgcttggtgg cgctatggct gttaagatta ccgagtatag 20100
ttggaataaa caactttatg agattgcgca gaagtttgaa tattggacac tgttttgtac 20160
cagtgttaac acttcttctt ctgaagcttt ccttattggt attaactatc tcggtgactt 20220
ttctagtgct agtgttatag atggcaatgt tatgcatgcc aactatatat tttggcgcaa 20280
ttccactatt atgactatgt catataattc agttcttgat ctgtcaaaat ttaggtgtaa 20340
acataaagcg actgtcatta ttacacttaa agataaagac attactgata tggtgcttgg 20400
tctgattaaa aatggcaagt tgttgattcg caactcgcaa aaattattaa attttagcaa 20460
ccatcttgta acaactaaat gaaacttttt acagttttca cgcttttggc ctctattaga 20520
gtgctttatg gctgtgaatc cgttgatttt aatttgttta atacaatatt ttcaacacac 20580
agaggtttaa gtaataccac ctctgttatc actggtgctt acccttccac caataagtca 20640
gactggtctt gtaatacaag aactggtcat ttgagtggta gtggtttcgg cataggtttg 20700
tatgtacaga caccacgtga acaataccag tatggtggtt ctggtgcagg cggctatact 20760
atagctgttt cgcccattca cgttacgaat ttgacttggg agctatggat ccaccgtaaa 20820
tggggtgtta actcagttgt tactgttaga ttatgtaggt ggtggcagtt tatgagtttt 20880
aactctacta gccatgcagc agatgctggt cctactaatg catttgagtg tcttataaat 20940
ggttcctatc ctactcatcg taacactggt tatatgtttg gtgttacttg gtacaatgat 21000
ttagttagaa tagtttttcc acctactgtt cttgaaatgc agcttgatgg tttacagtgg 21060
gaacgtgtcc agtttaatag tcctgttaat gctggacatg ttactaggtt taacgtcgtt 21120
aaggacattt ctactgtttt ggttgaaact aacagtggtg gctctgtttt tagatattcg 21180
tattgtgctg atgggtttgt taacggtctg caatgtaagc ttagactatt tgatataccc 21240
cctggtgttt attctaatag tgaggttgaa tatcctacag cactatatac tgttgtacac 21300
aatatgtcag cctgtccaga gaggccagat agctattgtg gttctaattc gtgccctttt 21360
aagcgtgcag tgttttctaa ttgtattgtt aattatacta cctgggttaa tccagaccag 21420
cgtgattttc aacatttaat tttgcctaat ggcaagttta atccatttac tgagtgtaat 21480
gggttgaaca gaattgttga tggttgcgtt cctggtttcg ttcttagagt tggtcgtggt 21540
aaggctgtta acagaactat tgttacacct tatctcaagc cttatgaatg ttttgggtgg 21600
tcatggaatg acaaccagga tagtatttat gactggtgga ttgctgattt tgtctccact 21660
ggtgctttcg tttgtgagag taatcccgaa gctcctaaga ctggggtttg tgtgacatac 21720
actgtagaga aagttacttt tcagggtgtg ctgtatgaga gtaattttac tttcgcacag 21780
tattataacc tattgtatgt aggttctcaa cttaggtatg tgcgtatact cggtaaagtt 21840
tatgaagttt catcttgttt tgaggcttca tatgacgttt tataccgtaa caatcagtct 21900
tttgggttgc tttatagaag tttcgattgt aatcagcttc atattaaatc tgcacgtttt 21960
gtggaccgtt tattaccgtc tcataatggt actgctactg tattaggttg tttgtttaat 22020
gctagttacg cacctaatga caccatggta aattgcacta acccacttgg tgatgggttt 22080
tgtgctgatt tgctaggtaa tgtcgctgtt aggcgtatga cttttgaaaa gcacgacact 22140
acttacgtag cacctgttac taatgagagg tacacagaaa tgccattgga ccatcaatta 22200
attttgaccg aacagttttt gcaaactaca atgcctaagt tcagcgttag ttgcgagact 22260
tacatatgtg acgtaagtaa ggcgtgcaaa aatttgctat ttaggtatgg tggtttttgt 22320
caaaaagttg aggctgacat tcgtggtgca ggcattcttt tggacggtga tgttagtagt 22380
ttgtactcta ctattgctgc caaaactagt tccgttgtgc ccactactga tagattcaat 22440
gtttctcaat tctttttgcc taaaacgcgg tctagtgcca ataagtatga atctaggtct 22500
gctattgagg acttgttatt cagcaaaatt gaaactactg gcccaggctt ttacggtgac 22560
tattataact gtaagaaaaa tgctatacaa gaccttactt gtgctcagta ccataatggt 22620
atacttgtta taccacctat tatggatgct gagacgttag gcatgtatgg cgggattgct 22680
gctgcttctg taacgctagg catttttggt ggacaagctg gcatggccac atggtctgtt 22740
gctatggctg gacgtttaaa tgcactgggt gttgttcaga atgctctagt cgacgatgtc 22800
aataagcttg ctaacggctt taaccaattg acagcgagtg ttagtaagct tgctttgacc 22860
acttctagtg cattgcaggc cattcaggct gtcgttaacc agaatgctgc tcaagttgag 22920
tcactcgtta gtggtattac tgagaatttt ggtgctatta gcactaattt taaggttata 22980
tcacagcgtc ttgacaaact tgaagctgat gttcagatgg ataggcttat taatggcaga 23040
atgcatgtct tacagctttt tgtcactaac tacaagctaa aaattgctga gctgcgtaac 23100
acacatcgtt atgtgcaatc tcttattaat gaatgtgttt atgctcagag tttaagaaat 23160
ggtttttgcg gtcagggact acatgtactg tcacttatgc aaaatgcacc tagtggtata 23220
atgtttttcc actattcgct gatacctaac aacactatca ctgttaaaac cacaccaggt 23280
ctttgtgaga gtgatgaatt gggttctaag tgcattgttg ctaaggacgg cgtattagtc 23340
tctgctaatt taagttattg gcagtggtca ccgcgtaacc tttacaaacc agaaaatctg 23400
acttttgcta atgtcattgc cgtttcacgt ggtgctaatt acactacatt gaacaaaact 23460
tttgacatac ctgaattgaa tagtactttt cccattgagg aggagtttcg tgagtacttt 23520
cagaatatgt catctgagct gcaggtcttg aaaaatttga ctgctgatat gagcaagctt 23580
aacattagtg ctgaaattca gcttattaat gaaattgctc ataacgtctc taacatgcgc 23640
gttgaggttg agaaattcca gcgctatgtt aattatgtca aatgggcttg gtggcagtgg 23700
ctgcttatat ttattgctct aacattgcta gctggtctaa tgctttggtg ctgtcttgct 23760
actggatgtt gtggcatgtg tggttgttta gctgctacat gtgcatcatg ctgtgattgt 23820
agaggaacta aacttcaatc atacgagatt gaaaaggtcc acgtccaata atgtttggtg 23880
gacttttcca gttgacactt gagggtgtcg ttaactctac tattagagct gctaaacttg 23940
accctaatga cgaagctatt attagggaac aagtgcagcc tgctattaac ggtgccaata 24000
tgctgggcta tatgttgact agcatgtttg tgtggtactt tgcattgtac aagccttcaa 24060
caagacgtgg cagaattgct atgtttgttt ctaagttgct cgtaatcttt gcttacgtac 24120
ctattattgc ttactgtggc ggtgttgttg acagttgcat tatacttgtt gctgttgtaa 24180
gcagattact gtataccagt tattatgctt tttgttacag gagttttgct tttgttctct 24240
ttaatgcacc gacactgtgc ttcatcaacg gcaccgtttg tctctactct agaattacta 24300
aagtagctga ctatattgct ctctatggtg gtcaccatta tgtgaccatc gagacaactg 24360
ctgttgaatt tgcgcacaag gactcactct atgttgctat tagaggtaag aaggaattaa 24420
acctttactt atctaaagca atggaattgt ctgatggtgc gtatatttac ttatttacta 24480
acacaccttt tgttggtatc tataacgcta attttcagct gcaagaaact caactaaact 24540
atgtttctga agattgttga ggatgatggt ttgttcatca acacagtctt gtggctttta 24600
gtgttgatac ttgttctctt ggtggctagc actgttatta agctcataca gctatgtttt 24660
tcttgtcata ggcttatgag taataccata tacataccag tgtataatgc ttaccttgtt 24720
tacaagtctt atatggaagt tgaaccatgc cccataatta atgtctaaac taaacgatga 24780
ctgattctaa caacacggtc cctgtgaccg aagttttaga acattttaga aactggaact 24840
tcagctggaa tatcatactg acagtattta ttgcagtgct tcagtatggt aacatgaagt 24900
acagtttctt tctctatgga gttaagatgt taatcatgtg gctcctatgg cccttagtca 24960
ttgctctgag catttttaat gcctatgctg actttggtgt taattggtgg ttcttctcct 25020
tcagcattct gatgcttgtc ataacgctag ttctctggct tatgtacata attaatagtt 25080
ttaagcttta tcgcagaacg cgaacgtttt gggcatttaa ccccgaaaca gacgccattg 25140
ctgtcatttc agtctttggt agatcctact cgatacctat gccagtggca ccaacaggta 25200
ttactctgac gattttaagt ggaacactct ttttcgatgg catcagaatt gctactggtg 25260
tgcagcctgc acacttaccg caatttgtga ctgtcgccaa acctggcacg actataattt 25320
atactcgtgc ggggcgttcc cttaatgcaa gcaccaacac tggttgggct ttttatgtca 25380
gaagtaagca tggtgactat tctgctttat caaatagtag tgataacttg acagaaaatg 25440
acagattgct gcatttagtc taaactaaac gaatatggcc actgttaatt ggggtgacgc 25500
tgttgaacag gcggaatctc gtggtcgtaa aagaattcca ttgtcactct ttgcgccttt 25560
gcgtgttata gatggcaaaa acttttggaa tgtcatgcct agaaatggag ttccgacagg 25620
taaaggcact ccagatcaac agattggtta ttgggttgaa caaaaacgct ggcgaatgca 25680
aaaaggccaa cgtaaagatc agccttctaa ctggcacttt tattaccttg gtactggtcc 25740
tcacgcagat gctcctttca ggaaacggat tcagggtgtg cattgggtcg ctgttgacgg 25800
tgctaaaact agccccacag gtcttggtgt tcgcaatcgt aacaaagaac ctgctacacc 25860
tcagtttggg tttcaattac caccagacct gactgttgtt gatgttactt ctagaagtgc 25920
ttcacgttca cagtctcgtt ctcgcaatca aagtcaaagc cgcagtggtg ctcagacacc 25980
tcgtgctcaa cagccgtcac agtctgttga cattgttgct gcagttaaac aagctttggc 26040
agacttgggc atagcttcta gccagtccag gcctcaaagt ggtaaaaata cacccaaacc 26100
aagaagcaga gctgtctcac ctgcacctgc ccctaaaccg gctcgtaagc agatggacaa 26160
acctgaatgg aagcgtgttc ctaattctga ggaggacgtg cgtaaatgct ttggtcctcg 26220
ctcagtttct agaaattttg gtgacagtga cctcgttcag cacggtgttg aagctaagca 26280
ctttccaaca attgctgagt tgcttccgac acaagctgca ctagcctttg gtagtgaaat 26340
cacaaccaaa gagtctggtg aatttgtaga agtcacctat cactatgtaa tgaaggtccc 26400
caagactgat aaaaatctac ccagatttct tgagcaagtc tcggcttact ctaaacccag 26460
tcaaattagg agatctcaat ctcaacaaga cctaaatgct gatgccccag tgttcactcc 26520
ggcacctcca gctactccag tttcccaaaa tcctgctttt cttgaggagg aggttgagat 26580
ggtggatgag attattaatt agttcaacta aacatgaacc agcttatctt tttcctgtgt 26640
atgatgtgct gttatgctat tctttttgat tggcttttta atctcttctt ttacgcttgc 26700
caggtcaata cttggcagga gtttgctttc tcatgtaact ggagttggtc acttttcttt 26760
gaggacttca gtacctggtt taaatgcctt tctgttgttc ttattggtac tattgctgct 26820
gctagcttta tgtttgctga tttcgctgtt gaggtctttg acctctttga gcggtttttc 26880
atcaacgttg gcagattttg cagatttgtt tgacatacaa tccctagctt tgcttgtgga 26940
ttcagtctca tacacaatgg taagcacgta attatgctag tatgagtaga gtataattat 27000
attgagtcct atagaccaac gcagttaact acatgtctgg tgtggtggag taatcaaaga 27060
tccgcttgac gagcctatat ggaagagccg tcacacctcg tatgcaagtt tctgttagta 27120
gttgttaatt agttgattct ttgacagtga tacac 27155

Claims (9)

1.一种猪α肠道冠状病毒，保藏号：CCTCC NO:V201801，其特征在于，所述猪α肠道冠状病毒核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的猪α肠道冠状病毒，其特征在于，所述病毒与蝙蝠肠道阿尔法冠状病毒HKU2在全基因组核酸水平上的同源性为94.9％；所述病毒与马铁菊头蝠阿尔法冠状病毒YN2012在全基因组核酸水平上的同源性为88.3％。
3.一种猪α肠道冠状病毒的分离培养方法，其特征在于，包括步骤：
(1)病料采集与处理；
(2)将(1)中所得到病料进行传代培养。
4.根据权利要求3所述的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)传代培养时，采用的细胞系为Vero细胞，维持液为含胰蛋白酶的维持液。
5.根据权利要求4所述的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)传代培养操作方法包括：将病料直接接种于经含胰蛋白酶的DMEM洗过的Vero细胞；在37℃的5％CO2条件下于含胰蛋白酶的吸附液中吸附；然后再于含胰蛋白酶的维持液中培养；重复上述操作进行传代培养。
6.根据权利要求4或5所述的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中胰蛋白酶的终浓度为6μg/mL。
7.根据权利要求4或5所述的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)传代培养时，每次传代前，将上一代的细胞培养物反复冻融3次。
8.根据权利要求1或2所述的猪α肠道冠状病毒，或者权利要求3-7任意一项所述的分离培养方法所得到的猪α肠道冠状病毒，其特征在于，所述猪α肠道冠状病毒在制备猪α肠道冠状病毒病的诊断试剂中的应用。
9.根据权利要求1或2所述的猪α肠道冠状病毒，或者权利要求3-7任意一项所述的分离培养方法所得到的猪α肠道冠状病毒，其特征在于，所述猪α肠道冠状病毒在制备预防猪α肠道冠状病毒病的疫苗中的应用。
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