CN105543179A

CN105543179A - 一种高滴度基因i型猪乙型脑炎病毒毒株及其用途

Info

Publication number: CN105543179A
Application number: CN201511031054.5A
Authority: CN
Inventors: 曹三杰; 文心田; 伍锐; 岳辉喜; 黄小波; 文翼平; 袁磊; 刘瀚扬; 刘洪明; 田耕
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-05-04

Abstract

本发明涉及一种基因I型乙型脑炎病毒毒株，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC？NO:V201526的毒株。本发明还公开了一种基因Ⅰ型乙型脑炎疫苗。本发明基因I型乙型脑炎病毒毒株，其生长滴度高，抗原性强，用其制备的疫苗产生的抗体效价高，保护力强，同时，安全性好，临床应用前景良好。

Description

一种高滴度基因I型猪乙型脑炎病毒毒株及其用途

技术领域

本发明涉及一种高滴度基因I型猪乙型脑炎病毒毒株及其用途。

背景技术

乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JEV)引起一种重要的人兽共患传染病。猪、牛、马等多种动物易感，库蚊是JEV的主要传播媒介，多发生于蚊虫较多的夏秋季节。猪是乙脑病毒重要的储存宿主与扩增宿主，乙脑带毒猪是乙型脑炎的主要传染源，猪对于该病的流行必不可少，是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，对猪的致死率不高，但对整个生猪养殖造成严重的损失。主要是能够起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎，公猪辜丸急性炎症反应或不育。

JEV可分为5个基因型，即基因I、II、III、IV、V型。1949-1987年间，我国流行的优势基因型是基因III型JEV。2001年，我国首次从上海郊区猪场采集的蚊虫中分离到基因I型JEV，随后基因I型JEV分离株所占比率逐年增加，目前我国呈现JEV基因I型和III型病毒共同流行状态，并正在形成以基因I型为优势基因型的趋势。目前预防猪乙型脑炎的疫苗都是基因Ⅲ型病毒疫苗，然而，由于I型和Ⅲ型JEV的基因型和抗原表位有部分不同，基因Ⅲ型病毒疫苗其对部分基因Ⅰ型病毒没有保护力(参见Xiao-LingPan，“EmergenceofGenotypeIofJapaneseEncephalitisVirusastheDominantGenotypeinAsia”，JOURNALOFVIROLOGY,Oct.2011,p.9847–9853Vol.85,No.19)。

因此，制备基因Ⅰ型猪乙型脑炎疫苗显得尤为重要，然而，由于现有基因Ⅰ型JEV的抗原性不好、生长滴度不高，无法制备得到免疫保护效果较佳的疫苗，如，用JEVYADX201202株的保护率最高不超过50％，难以实际应用，这也是至今未见基因Ⅰ型猪乙型脑炎疫苗上市的重要原因。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高滴度的基因I型乙型脑炎病毒毒株以及一种基因Ⅰ型乙型脑炎疫苗。

本发明提供的基因I型乙型脑炎病毒毒株，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO:V201526的毒株。

本发明猪乙型脑炎病毒SCYA201201株(分类命名)，于2015年10月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCCNO:V201526。

本发明还提供了前述基因I型乙型脑炎病毒毒株在制备预防乙型脑炎的药物或疫苗中的用途。

优选地，所述药物或者疫苗是预防基因I型乙型脑炎的药物或者疫苗。

优选地，所述药物或者疫苗是预防猪乙型脑炎的药物或者疫苗。

优选地，所述预防猪乙型脑炎的药物或者疫苗是腹腔给药的药物或者疫苗。

本发明还提供了基因Ⅰ型乙型脑炎疫苗，它含有致免疫有效量的灭活的基因I型乙型脑炎病毒毒株，以及及药学上可接受的辅料或载体。

优选地，所述毒株是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO:V201526的毒株。

优选地，所述致免疫有效量不低于10⁷PFU/ml；优选地，所述致免疫有效量为10⁷～10⁹PFU/ml；进一步优选地，所述致免疫有效量为10⁸PFU/ml。

优选地，所述辅料为免疫佐剂。进一步优选地，所述免疫佐剂为ISA206佐剂。

本发明还提供了前述疫苗在制备预防乙型脑炎的药物中的用途。

优选地，所述药物是预防基因I型乙型脑炎的药物。

优选地，所述药物是预防猪乙型脑炎的药物。

优选地，所述预防猪乙型脑炎的药物是腹腔给药的药物。

本发明新的基因I型乙型脑炎病毒毒株，其生长滴度高，抗原性强，用其制备的疫苗产生的抗体效价高，保护力强，保护率为60-80％，同时，安全性好，本发明首次成功制备了基因I型乙型脑炎疫苗，可以有效保护预防基因I型乙型脑炎的发展，代表了一种新的技术发展趋势，应用前景良好。

以下通过具体实施方式进一步说明本发明的有益效果，但不应理解为是对本发明的限制，凡是基于本发明的技术基本思想所做的其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术方案均属于本发明的范围。

附图说明

图1接种后小鼠(右)和对照小鼠(左)

图2a、b感染后的BHK-21细胞出现CPE(100×)，c为空白对照

图3琼扩结果

图4间接免疫荧光结果(200×)

图5段重叠PCR产物

图6核苷酸序列对比结果

图7进化树

具体实施方式

实验材料

1试验材料

1.2主要试剂

DMEM细胞培养基(GIBCO)，新生牛血清NBCS(GIBCO)，青链霉素(10000U/mLPenicillin,10000μg/mLStreptomycin)(GIBCO)，裂解液Trizol，小量RNA抽提试剂盒，DNAMakerIII，GoldView(天根生化科技(北京)有限公司)，GoatAnti-RabbitIgG，Cy3Conjugated(康为世纪)。

1.3主要试剂的配制：

DMEM培养基：DMEM粉剂(10.4g)、2.2gNaHCO₃、4.7gHEPES溶于300mL灭菌后冷却至室温的超纯水中，加入双抗(10000U/mLPenicillin,10000μg/mLStreptomycin)1mL，补充超纯水定容至1L，静置过夜充分溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

生长液：90mLDMEM培养基+10mLNBCS。

维持液：90mLDMEM培养基+1.8mLNBCS。

间接免疫荧光试验涉及试剂的配制：10％甲醛/PBS(固定液)，0.5％TritonX-100/PBS(通透液)，2％BSA/PBS(封闭液)，PBS、PBST(洗涤液)。

1.4主要仪器设备

BIO-RADC1000^TMThermalCyclerPCR仪，BIO-RADPowerPac^TMBasic电泳仪，BIO-RADMini-Sub○RCellGT电泳槽，ThermoFormaSeriesIIWaterJacketCO₂Incubator恒温培养箱，Thermo1300SeriesA2生物安全柜，ThermoForma900Series超低温冰箱，NiconECLIPSETS100倒置显微镜，数显恒温水浴锅，NickonECLIPSETE2000-U型荧光倒置显微镜，BIO-RADMolecularImagerGelDoc^TMXR+凝胶成像系统，SW-CJ-1F超净工作台(苏州市华宇净化设备有限公司)，ThermoLEGENDMICRO17R离心机，ThermoBIOFUGESTRATOSCentrifuge离心机，DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)。

实施例1本发明毒株的分离鉴定

一、病毒的分离

1样品的采集

依据四川地区乙脑流行的季节规律及蚊媒传播的特点，参考流行病学调查结果，在7～10月份使用紫外捕蚊器从各地猪场采集蚊子样品：每天晚7点前安置捕蚊器，次日早8点取回，将蚊子从捕蚊器中取出，装入标记信息的样品袋，置于-20℃冰箱暂时保存。采集到的流产死胎，收集其脑组织及脑脊液，于-80℃超低温冰箱保存。

2样品的处理

蚊子样品处理：将于-20℃冰箱暂时保存的样品取出，挑除其他昆虫，约100只成为一批，去腿翅，用加了双抗的PBS清洗一遍后转移到预冷的研钵中，加入维持液5～10mL，反复研细匀浆。将研磨液吸入预冷的1.5mL离心管，配平，于4℃，12000rpm，离心20min，用0.22μm的滤器滤过上清液，滤过液分装后置于-80℃冰箱保存。流产死胎脑组织的处理：取冻存的样品一块，置于预冷的研钵中剪碎，同蚊子样品处理方法加入维持液研磨后离心并过滤，分装后置于-80℃冰箱冻存。

3病毒的分离培养

3.1乳鼠脑内接种

试验选择3～5日龄的健康乳鼠，用无菌50μL微量注射器脑内接种阳性样品处理液，每份样品接种一窝，每只乳鼠脑内接种20μL，对照组注射等量维持液，每天观察2次，逐日观察。接种后48h内死亡的乳鼠视作非特异死亡弃去。接种5d后解剖取其脑组织，经同样的研磨、过滤处理后，按上述接种方式和剂量继续盲传。观察期内出现神经症状的乳鼠取其脑组织，处理后接种BHK-21细胞。

3.2细胞培养

取发病鼠脑处理后的样品液lmL接种于均匀铺满单层BHK-21细胞的培养瓶中，其中一瓶加入1mL维持液作为对照，37℃环境吸附1h，然后补充加入维持液5mL，置37℃，CO₂恒温培养箱培养，间隔12h观察一次，连续观察6d，然后将细胞培养物冻融1次，移液管反复吹打后移到50mL离心管中，4℃，5000rpm，离心10min，吸取上清，用0.22μm的滤器滤过，滤过后作为病毒液，分装后取部分继续盲传，剩余置于-80℃冰箱保存。

通过上述方法，分离得到SCYA201201株毒株。

二、病毒的鉴定

将分离得到SCYA201201株毒株，采用如下方法鉴定：

1病毒核酸类型及理化性质测定

1.1病毒核酸类型的鉴定

长满单层的BHK-21细胞，分别加入病毒稀释液，置5％CO₂培养箱37℃吸附1h之后，弃去病毒液，试验组加入5mL含有5-溴脱氧尿核苷(BUDR)的维持液(50μg/mL)，对照组加同量维持液置CO₂培养箱37℃恒温培养，逐日观察并判定试验结果。

1.2脂溶剂敏感性试验

取常规收毒的病毒液，按20％比例加入乙醚，对照加入等体积DMEM细胞培养基。两管置4℃感作，期间不时振荡，24h后待乙醚完全挥发掉之后，滴定处理组和对照组病毒液的感染力，比对照组降低2个对数及以上，为对乙醚敏感。

按4.8％比例加氯仿，4℃条件下振荡10min充分混匀，随后5000rpm离心5min，吸取上清测病毒感染力，对照病毒液内按4.8％的比例加入DMEM，同法处理和测定，判断标准同乙醚组试验。

1.3胰蛋白酶敏感试验

取病毒液500μL，加入无血清DMEM稀释的1％胰蛋白酶溶液0.5mL，混匀，置37℃感作lh；加入NBCS4mL，吹打混匀；以等体积无胰酶的无血清DMEM培养基作为对照，滴定两组病毒感染力。试验组的感染滴度比对照组降低2个对数以上乃至完全灭活者，证明该病毒对胰酶敏感，降低不到一个对数者，为抗胰蛋白酶病毒。

1.4耐酸性试验

分别将1mL病毒液装到两支10mL离心管中，以0.1mol/LHCl将其中一管病毒液pH值调节至3.0，另一管作为对照加入等量PBS，室温条件下感作1h，然后用5.6％NaHCO₃溶液将做酸化处理的病毒液调回pH7.0，对照加入等量PBS。2个样分别接BHK-21细胞，测定感染力。

1.5耐热性试验

将病毒液等量分装于离心管中，设50、60、70、80℃水浴1h，50℃水浴中水浴5、10、15、30、60、180min，100℃水浴2、3min，分别测定感染力判断病毒对不同温度和处理时间的耐受能力。

2琼扩试验

琼脂糖溶于PBS置于微波炉中加热制成1％的胶，将溶化的1％琼脂倒入培养皿内，制成厚度约3mm的琼脂糖胶板，待胶板冷却，用打孔器在胶板上打梅花样7孔，打孔后在酒精灯火焰上均匀迅速的来回几次封住孔底。点样时中央孔为兔抗JEV高免血清，周围六孔为1:1，1:2，1:4，1:8稀释的病毒液(鼠脑研磨收毒)，设阴性(疫苗稀释用稀释液)与疫苗阳性对照，50μL/孔点样结束后，将其平稳放入湿盒，37℃温箱保存，24h之后观察结果。

3间接免疫荧光试验

长势良好形态典型的BHK-21细胞1瓶常规消化，吹散后补生长液至24mL混匀，1mL/孔加入24孔细胞培养板中培养24h，待细胞长成均匀的单层。

吸出生长液，按照病毒液与维持液1:10比例稀释病毒后，按每孔1mL加入稀释后的病毒液，对照孔加入等量的维持液，继续培养72h。

接毒72h后，PBS1mL/孔洗涤3次，加入固定液覆盖细胞，4℃静置过夜。

弃固定液，PBS1mL/孔震荡洗涤3次，每次2min，通透液覆盖细胞表面，4℃静置24h。

弃通透液，PBS1mL/孔震荡洗涤3次，每次2min，封闭液覆盖标本表面4℃孵育过夜。

弃封闭液，PBST1mL/孔震荡洗涤3次，每次2min，兔抗JEV高免血清200倍稀释后依次加入培养孔，覆盖细胞表面，4℃孵育过夜。

弃一抗，PBST1mL/孔震荡洗涤3次，每次5min，GoatAnti-RabbitIgG,Cy3Conjugated荧光二抗1:200以PBS避光稀释，200μL/孔覆盖细胞表面，室温避光静置1h。

PBST1mL/孔避光震荡洗涤3次，每次5min。暗室内荧光显微镜镜检。

4、基因型

4.1病毒增殖

按照常规接毒方法接种病毒并收获病毒液。

4.2引物设计

参考GenBank中收录的多株基因I型日本脑炎病毒的基因序列，根据DNAMAN软件的基因相似性分析结果，以HEN0701为设计模板序列，利用PrimerPremier5.0软件设计了8对测序引物，引物信息见表1。

表1引物信息

4.3RNA提取

按照RNAsimpleTotalRNAKit说明书步骤操作，具体步骤如下：

①取250μl病毒液于1.5ml离心管中，加入750μl裂解液，充分混匀后室温放置5min。

②加入200μl氯仿，剧烈震荡后室温静置3min，4℃，12000r/min离心10min。

③取上清液加入等体积的无水乙醇，用枪头轻轻混匀后加入吸附柱中，4℃，12000r/min离心1min，弃废液。

④向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000r/min离心1min，弃废液。

⑤向吸附柱中加入700μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000r/min离心1min，弃废液。

⑥向吸附柱中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000r/min离心1min，弃废液。

⑦4℃，12000r/min空离2min。

⑧将吸附柱盖子打开，晾干5min后放入新的1.5ml离心管中。

⑨向晾干后的吸附柱中加入50μlRNaseFreeddH₂O，室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min。

⑩1.5ml离心管中收集的液体即为病毒总RNA。

4.4RT-PCR反应

反转录参照TaKaRaPrimeScript^TMRT-PCRKit说明书进行2步反转录：

PCR反应使用宝生物PrimeSTARMax进行扩增，体系如下：

表2PCR反应体系

反应程序：98℃3min；98℃10s，60℃15s，72℃60s，35个循环；72℃10min；12℃保存。

反应结束后将产物加入2％琼脂糖凝胶中，85V电压电泳25min后于凝胶成像系统紫外光下观察扩增结果。

4.5目的片段的回收

参照E.Z.N.A.GelExtractionKit(OMEGA)胶回收试剂盒的使用说明操作

4.6平末端片段加A

胶回收产物进行平末端加A，参照宝生物TakaraDNAA-tailingKit，进行目的片段与T载体的连接反应，取PCR鉴定结果为阳性克隆的菌液，按照E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI(OMEGA)质粒抽提试剂盒的操作说明提取质粒，达到测序标准即可送生工生物工程(上海)股份有限公司做序列测定。

4.7测序结果分析

4.7.1序列拼接及相似度分析

2组8片段序列测序完成后，利用DNAStar中的SeqMan将序列进行拼接，利用MegAlign对拼接完成的序列信息和GenBank中的分离株进行序列比对，对编码区核酸相似度、编码蛋白质氨基酸序列相似度进行分析，并对E基因编码的氨基酸序列进行相似度分析。

4.7.2进化分析

利用MEGA4.0，以一株DENV作为外群，对SCYA201201株与GenBank中的来自多个JEV流行国家的36株JEV进行基于prM基因序列(456-695位核苷酸)的进化分析；对31株JEV和SCYA201201株进行基于E基因的进化分析，并绘制进化树。

三、结果

1病毒分离结果

1.1接种乳鼠结果

如图1所示，流产胎儿处理样品在接种鼠脑第3代，接种第4d观察到乳鼠出现离群拒乳的现象，并间歇性发生四肢不自主的颤抖痉挛，继续观察乳鼠麻痹直至死亡。乳鼠(图a右)死亡前与对照乳鼠(图a左)相比，体格明显偏小，体重较轻，无活动力；剖检发现接种样品乳鼠(图b右)脑硬膜下血管较对照乳鼠(图b左)充血明显。

1.2细胞培养结果

如图2所示，出现症状的乳鼠脑组织处理液接种单层BHK-21细胞，接种4-5d后细胞大范围内出现膨大变圆、折光度增强、脱落等现象，细胞单层溃散，细胞之间出现无细胞贴附空白区，CPE明显，且在细胞上传代时稳定出现。

2病毒鉴定结果

2.1病毒核酸类型及理化性质测定结果

结果显示：JEVSCYA201201在细胞上的增殖不受5’-BUDR的影响；对乙醚，氯仿脂溶剂敏感；在pH0条件下失去感染力；经胰蛋白酶处理感染力明显下降；50℃加热60min、100℃加热3min均可使之灭活。

2.2琼扩试验结果

如图3所示，用鼠脑研磨后收取的病毒液做琼扩，稀释到4倍时可见清晰沉淀线，病毒液8倍稀释时沉淀线模糊，阳性对照有明显沉淀线，阴性无沉淀线。

2.3间接免疫荧光试验结果

如图4所示，两株病毒接种BHK-21接种72小时后，间接免疫荧光试验结果显示，BHK-21的胞浆内出现特异性的荧光，细胞核和细胞间隙呈背景黑色，空白对照组观察不到荧光，只有背景黑色。

2.4基因型鉴定

2.4.1SCYA201201株cDNA的8段PCR扩增结果

如图5所示，以JEV1-JEV8为引物，cDNA为模板，以分段重叠的方式扩增出JEV基因组全长的基因，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为DNAMarker，可见与预期片段大小1765bp、1330bp、1613bp、1625bp、1503bp、1542bp、1442bp、840bp相符的高亮条带。

2.4.3编码区核苷酸序列和编码氨基酸序列分析

如图6所示，将SCYA201201株CDS及氨基酸序列，与GenBank发布的来自不同国家和地区、不同来源的I型和III型JEV毒株进行相似性比对，结果显示：SCYA201201株CDS核苷酸与其中的I型JEV的核苷酸相似度介于97.7％～99.2％，与III型JEV的核苷酸相似度介于88.2％～88.7％；推导所得的氨基酸序列与I型JEV的氨基酸相似度介于98.3％～99.7％，与III型JEV的氨基酸相似度介于97.7％～98.3％

4结论

本发明分离得到SCYA201201株毒株，对其核酸类型、脂溶剂敏感性、胰蛋白酶敏感性、耐受性、耐热性试验对其理化性质进行研究验证，证明其皆为RNA病毒，乙醚、氯仿脂溶剂、胰蛋白酶敏感，对酸和高温敏感，符合JEV的特性；采用琼扩试验、间接免疫荧光、中和试验对其进行检测，其血清学反应均表现与JEV抗血清阳性反应；通过基因型鉴定其与I型JEV的核苷酸相似度介于97.7％～99.2％，与III型JEV的核苷酸相似度介于88.2％～88.7％。

综上，本发明分离得到了一株新的病毒株，并将其鉴定为I型JEV(I型乙型脑炎病毒)，命名为猪乙型脑炎病毒SCYA201201株，并于2015年10月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO:V201526。

实施例2本发明疫苗的制备

一、制备方法

取实施例1得到的保藏号为CCTCCNO:V201526的基因I型乙型脑炎病毒毒SCYA201201株，按照如下方法制备本发明疫苗：

1、猪乙型脑炎病毒灭活原液的制备：

(1)按常规方法传代BHK-21细胞，待细胞铺满80％细胞瓶后，弃去营养液后用PBS清洗细胞，取猪乙型脑炎病毒接种到单层细胞，吸附1h后弃去病毒液，加入含2％小牛血清的维持液37℃培养。

(2)细胞出现80％以上的细胞病变(CPE)时，反复冻融3次，12000r/m离心10min，收集病毒悬液，-20℃保存。

(3)病毒PFU测定用维持液将猪乙型脑炎病毒做10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，分别接种生长良好的BHK-21细胞单层的96孔细胞培养板上(接种前弃去培养液)，每个稀释度做8孔，每孔100μl。同时设正常细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱中培养4日，按Reed-Muench法计算PFU，结果滴度为10^9.34PFU/ml。

(4)测定病毒滴度不低于10⁸PFU/ml后，按照病毒液量0.5％加入甲醛，置37℃灭活48h，每隔6h摇匀5min。

2.疫苗成品的制备：

将病毒液稀释成10^7.3PFU/ml、10^8.3PFU/ml和10^9.3PFU/ml共3个稀释度，等体积取ISA206佐剂与灭活病毒液；油相和液相加热至31℃；将佐剂350r/min，预乳化5min；然后将水相缓慢加入到油相中，以350r/min，乳化5min，乳化结束后室温静置1h后分装，4℃保存，疫苗成品病毒滴度分别为10^7.0PFU/ml、10^8.0PFU/ml和10^9.0PFU/ml。

二、本发明疫苗的性质检测

(1)剂型测试：取上述疫苗滴于水中，液滴应呈云雾状扩散。

(2)稳定性测试：取上述所有疫苗各10ml于离心管，3000rpm离心15min不能出现分层，管底析出的水相小于0.5ml。

(3)粘稠度测定：用1mL吸管(出口内径为1.2mm)吸取疫苗lmL，在25℃室温下，令其垂直流出，记录流出0.4mL所用的时间，疫苗粘度应在4.0s/0.4mL-5.8s/0.4mL之间。

(4)无菌检验:按中国兽药典规定的方法检验，应无细菌生长。

(5)安全性检验：取体重2月龄仔猪5头，各耳根肌肉注射4ml，观察14d所有仔猪均无不良反应。

(6)效力检验：用4周龄健康仔猪，各耳根肌肉注射疫苗2ml，14d后同等剂量加强免疫一次。同时设置阴性对照组。免疫28d后采血，测定血清乙型脑炎病毒中和抗体，抗体效价≥1:32。

试验结果说明，本发明SCYA201201株基因I型乙型脑炎病毒的生长滴度高，抗原性强，用其制备的疫苗产生的抗体效价高，同时，安全性好，无不良反应。

以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：

试验例1本发明疫苗的仔猪安全性试验

按实施例2的制备方法制备出病毒滴度为10⁹PFU/ml的本发明疫苗，按照如下方法检测其安全性：

1、实验方法

1.1单剂量重复接种的安全性对仔猪肌肉接种2.0ml/头，每组5头，间隔2周加强免疫1次，另设5头猪作为非免疫对照，观察试验猪的临床症状，共观察2周。

1.2一次超剂量接种的安全性对仔猪肌肉接种4.0ml/头(2头份)，每组5头，另设5头猪作为非免疫对照，观察试验猪的临床症状，共观察2周。

2.实验结果

2.1单剂量重复接种的安全性将制备的灭活疫苗肌肉接种仔猪2.0ml/头，间隔2周加强免疫1次，结果表明，灭活疫苗对仔猪安全，接种后无不良反应，精神、食欲等均正常，接种部位无红肿、溃烂等局部反应。

2.2一次超剂量接种的安全性对仔猪分别肌肉接种4.0ml/头，观察试验猪的临床症状，结果表明，灭活疫苗对后仔猪安全，接种后无不良反应，精神、食欲等均正常，接种部位无红肿、溃烂等局部反应。

结果表明，本灭活疫苗在灭活前滴度为10⁹PFU/ml的情况下，对仔猪是安全的，无副作用。

实验例2本发明疫苗的小鼠攻毒保护实验

1、实验方法

选取3周龄的雌性SPF级昆明鼠，按实施例2的制备方法制备出病毒滴度分别为10⁷PFU/ml、10⁸PFU/ml和10⁹PFU/ml共3个稀释度的本发明疫苗，分别腹腔注射0.3ml本发明疫苗以及商品化鼠脑灭活苗(HW1株，基因Ⅲ型，灭活前毒价≥2.5×10^7.0LD₅₀/ml，购自武汉中博生物科技有限公司)，同时设置阴性对照和空白对照，第一次免疫后7d同等剂量加强免疫1次，加强免疫7d后除空白对照组外各小鼠选用强毒(JEVDX1株，基因Ⅰ型)以100LD50(25μL)脑内攻毒，连续观察14d，记录小鼠死亡情况，计算疫苗保护率。

2、实验结果

表1：灭活疫苗小鼠攻毒保护试验结果

从表1可以看出：

市售的基因Ⅲ型疫苗在高滴度的情况下，其保护率仅60％。

本发明基因I型灭活疫苗在灭活前滴度不低于10⁷PFU/ml时，保护率高达60～80％，在滴度为10⁷～10⁹PFU/ml的情况下，保护率高达80％，在滴度为10⁸PFU/ml时，保护率高，且病毒含量相对较低。

试验结果说明，本发明疫苗的保护率高，保护效果好，优于市售的疫苗。

实验例3本发明疫苗的仔猪免疫试验

1、实验方法

选取4周龄健康仔猪，筛选出血清中和抗体阴性仔猪用于免疫试验。分别耳根肌肉注射2ml本发明实施例2制备的基因Ⅰ型猪乙型脑炎灭活疫苗(病毒滴度为10⁸PFU/ml)以及商品化鼠脑灭活苗(HW1株，基因Ⅲ型，灭活前毒价≥2.5×10^7.0LD₅₀/ml，购自武汉中博生物科技有限公司)，同时设置阴性对照，每组5头。首免14d后同等剂量加强免疫一次，免疫剂量与首免相同。免疫28d后采血检测所有仔猪血清中和抗体效价。

仔猪免疫疫苗28d后，采用蚀斑减少试验(PRNT)测定每头猪的血清JEV中和抗体。

2、实验结果

在二免两周后基因Ⅰ型猪乙型脑炎灭活疫苗、商品化鼠脑灭活苗都能使仔猪产生一定中和抗体，免疫商品化基因Ⅲ型乙型脑炎灭活苗的仔猪中和抗体效价为1:17.6，而本发明免疫基因Ⅰ型猪乙型脑炎灭活疫苗的仔猪中和抗体效价高达1:38.8，显著高于商品化的基因Ⅲ型乙型脑炎灭活疫苗(P＜0.05)。

实验结果说明，本发明疫苗产生的抗体滴度高，保护效果好，优于市售的疫苗。

综上，本发明提供了一种新的I型乙型脑炎病毒毒株，其生长滴度高，抗原性强，用其制备的疫苗产生的抗体效价高，保护力强，同时，安全性好，临床应用前景良好。

Claims

1.一种基因I型乙型脑炎病毒毒株，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO:V201526的毒株。

2.权利要求1所述基因I型乙型脑炎病毒毒株在制备预防乙型脑炎的药物或疫苗中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物或疫苗是预防基因I型乙型脑炎的药物或疫苗；和/或，所述药物或者疫苗是预防猪乙型脑炎的药物或者疫苗。

4.一种基因Ⅰ型乙型脑炎疫苗，其特征在于：它含有致免疫有效量的灭活的基因I型乙型脑炎病毒毒株，以及及药学上可接受的辅料或载体。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述毒株是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO:V201526的毒株。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述致免疫有效量不低于10⁷PFU/ml；优选地，所述致免疫有效量为10⁷～10⁹PFU/ml；进一步优选地，所述致免疫有效量为10⁸PFU/ml。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的疫苗，其特征在于：所述辅料为免疫佐剂；优选地，所述免疫佐剂为ISA206佐剂。

8.权利要求4-7任意一项所述的疫苗在制备预防乙型脑炎的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物是预防基因I型乙型脑炎的药物；和/或，所述药物是预防猪乙型脑炎的药物。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征是：所述药物是腹腔给药的药物。