CN111705040A - 去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，具体操作为：取已污染支原体的伪狂犬病种毒，接种小鼠脑部，接种后48h～72h，取发病死亡小鼠脑组织无菌研磨后，分离伪狂犬病病毒，在适宜细胞上用蚀斑试验进行病毒纯化，挑选约0.5mm蚀斑5～8个接种适宜单层细胞进行培养，将收获的病毒液进行鉴别检验、病毒含量检验、支原体检验，确认获得的病毒为伪狂犬病病毒，病毒含量≥108.0TCID50/ml，无支原体污染。本发明可以有效去除伪狂犬病病毒液中的支原体，经各项检验，纯化后的伪狂犬病病毒培养滴度高、安全和免疫原性均良好。

Description

去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法。
技术背景
猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病，其主要临床特征为成年猪呈隐性感染，妊娠母猪发生流产、死胎及呼吸道症状。低日龄仔猪感染后常出现发热、拉稀，并伴随明显的神经症状和呼吸困难。本病在猪群中传播快、仔猪死亡率高，是猪场面临的重大传染病之一。我国是伪狂犬病流行广泛的国家，目前已有多个省(市、区)报道本病发生，已经造成巨大的经济损失。在伪狂犬病防制中，疫苗起着重要作用。
支原体又称霉形体，是介于细菌和病毒之间的一种原核生物，大小约0.2～0.3μm。在《中国兽药典》中有明文规定，疫苗制品中应无支原体污染。而控制疫苗中的支原体污染，最关键的是从源头控制，制备疫苗的种毒绝不允许有支原体，如种毒存在支原体，那么会影响后期的生产毒种、疫苗抗原，会导致成品疫苗支原体污染，浪费生产成本，造成极为严重的后果。因此，去除疫苗种毒中的支原体是极其重要的，也是伪狂犬疫苗生产企业及科研人员极力解决的关键问题。
我们目前所知道的去除支原体的方法一般为物理的过滤方法，即采用0.1μm和0.22μm的滤膜过滤，来去除病毒液中的支原体。但伪狂犬病病毒粒子为100～150纳米，采用太小的滤膜过滤时，会导致病毒粒子也被过滤掉，而采用孔径稍大的滤膜又不能有效过滤掉支原体，效果也是差强人意，不具有实际应用的价值。
因此，为保证伪狂犬病病毒液、毒种不被支原体污染，从而确保疫苗质量，发明一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法显得刻不容缓。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)小鼠接种：在隔离饲养的清洁级小鼠脑部注射伪狂犬病疫苗种毒，接种后48h～72h，取发病死亡小鼠脑组织无菌研磨，分离伪狂犬病病毒；
(2)用细胞维持液将分离的伪狂犬病病毒液稀释，接种4个已长成细胞单层的平皿；经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，置于含5％二氧化碳培养箱内培养；48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养24～48小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次；
(3)病毒纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑，按1％V/V接种已成长单层的健康细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融若干次，取样鉴定；
(4)纯化病毒进行如下检验：
①用阳性血清中和试验法进行鉴别检验，病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均应不产生CPE；
②进行病毒含量检验，每毫升病毒含量应≥107.0TCID50；
③按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，符合规定。
作为优选方案，所述步骤(1)中的清洁级小鼠为体重16～22g昆明小鼠。
进一步地，所述步骤(1)中的伪狂犬病种毒的病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml。
更进一步地，所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。
更进一步地，所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。
更进一步地，所述步骤(2)中的伪狂犬病病毒液稀释的病毒含量为10TCID50～50TCID50。
更进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)中的培养伪狂犬病病毒的细胞为猪睾丸细胞、BHK-21细胞、Vero细胞或鸡胚成纤维细胞中任一种。
更进一步地，所述步骤(3)中病毒接种比例V/V为1～3％，冻融次数为1～2次。
上述最为优选选的方案，即一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，包括以下步骤：
(1)接种小鼠：取16～22g清洁级昆明小鼠4只，脑部注射已污染支原体的伪狂犬病种毒病毒液，免疫48h～72h后取死亡小鼠脑组织无菌研磨，分离伪狂犬病病毒。
(2)蚀斑克隆：用细胞维持液将伪狂犬毒种病毒液稀释成每0.1ml含10TCID50，接种4个长成细胞单层的平皿(直径9cm)，每个平皿接种0.1ml病毒液。经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，待凝固后翻转平皿，置于含5％二氧化碳培养箱内培养。48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养24～48小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次。
(3)病毒培养：病毒克隆纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑5～8个，按2％(V/V)接种已成长单层的适宜细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融1次，取样鉴定。
(4)取样鉴定：
①病毒含量：将上述克隆毒种用含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度，分别接种于已长成良好单层(弃去细胞培养液)的96孔适宜细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔。置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察5日，观察细胞病变(CPE)，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量应
≥107.0TCID50，正常细胞对照孔应不产生CPE。
②鉴别检验：用含2％的新生牛血清DMEM细胞培养液稀释成每0.1ml含有200TCID50的病毒悬液。将病毒悬液与猪伪狂犬病病毒特异性阳性血清等量混匀，置37℃水浴中和作用1小时后，接种于已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔适宜细胞培养板，每孔0.1ml，接种6孔，同时设正常细胞对照和病毒对照各2孔。置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察5日，病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均应不产生CPE。
③纯净性检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，应符合规定。
按本发明所述方法，可以彻底去除伪狂犬病毒种中的支原体，去除支原体后的种毒经鉴别检验，确定为伪狂犬病病毒，且无外源病毒污染、能在细胞内正常增殖。与现有技术相比有了突破性进展。
附图说明
图1为本发明的主要技术路线图。
图2为液体培养法检测结果。
其中：“+”为阳性对照；“—”为阴性对照；样品1#为人工感染猪鼻支原体的伪狂犬 病病毒液；样品2#为按本发明方法清除支原体后重新获得的伪狂犬病病毒液。
图3为阳性对照猪鼻支原体在固体培养基上生长出的“煎蛋状”菌落。
图4为人工感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液在固体培养基上生长出的“煎蛋状”菌落。
图5为液体培养法检测结果。
其中：“—”为阴性对照；“+”为阳性对照；样品1#为人工感染猪鼻支原体的伪狂犬 病病毒液；样品2#为按本发明方法清除支原体后重新获得的伪狂犬病病毒液。
图6为阳性对照猪鼻支原体在固体培养基上生长出的“煎蛋状”菌落。
图7为人工感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液在固体培养基上生长出的“煎蛋状”菌落。
具体实施方式：
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1用本发明方法去除伪狂犬病X毒种中的支原体
试验材料：
伪狂犬毒种：猪伪狂犬病病毒X，F3代，基础毒种。
支原体毒种：猪鼻支原体，为《中国兽药典》规定兽用生物制品质控使用的支原体阳性参照菌株，购自中国兽医药品监察所。
小鼠：16～22g昆明小鼠2只。
细胞：猪睾丸细胞(ST)。
支原体培养基：购自中国兽医药品监察所。
1试验方法
1.1人工模拟支原体污染将猪鼻支原体阳性质控菌株复壮后，接入伪狂犬病X毒种中，即人工模拟种毒遭受支原体污染。
1.2接种小鼠小鼠脑部接种污染支原体的伪狂犬病X毒种病毒液，接种2只小鼠，各0.05ml。
1.3病毒分离上述小鼠约接种48h～72h后死亡，将死亡小鼠解剖，取脑组织加PBS研磨后混合制成悬液，以3000r/min离心15分钟，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，检测其病毒含量，于4℃保存备用，记为CF1代。
1.4蚀斑克隆用细胞维持液将伪狂犬毒种病毒液稀释成每0.1ml含10TCID50，接种4个长成ST细胞单层的平皿(直径9cm)，每个平皿接种0.1ml。经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，待凝固后翻转平皿，置于含5％二氧化碳培养箱内培养。48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养24小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次。
1.5病毒培养病毒克隆纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑5个，按2％(V/V)接种已成长单层的ST细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融1次，取样鉴定。
1.6克隆培养样品鉴定
支原体检验按《中国兽药典》中支原体检验方法检验克隆纯化后的病毒液中有无支原体生长。
按《猪伪狂犬病疫苗X制造及检验规程》对克隆纯化后的病毒液进行病毒含量、鉴别检验、无菌检验、外源病毒检验、安全性和免疫原性检验。
1.7试验结果
1.7.1支原体检验结果按《中国兽药典》检验人工模拟感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液和采用本发明方法去除支原体后的伪狂犬病病毒液，阳性对照为猪鼻支原体，阴性对照为支原体培养基，其中由图2、图3和图4结果可知，人工模拟感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液和阳性对照均有支原体生长，阴性对照和采用本发明方法去除支原体后的伪狂犬病病毒液无支原体生长，说明本发明方法已去除伪狂犬毒种中的支原体。结果见表1。
表1支原体检验结果
Figure BDA0002542832160000071
1.7.2按《猪伪狂犬病疫苗X制造及检验规程》对克隆纯化后的病毒液进行病毒含量、鉴别检验、无菌检验、外源病毒检验、安全性和免疫原性检验，各检验结果均符合规定，重新获得的毒种安全性和免疫原性均良好，说明本发明方法未影响毒种的安全性和免疫原性。结果见表2。
表2去除支原体后伪狂犬种毒的各项检验结果
Figure BDA0002542832160000072
实施例2用本发明方法去除猪伪狂犬病X毒种中的支原体
试验材料：
伪狂犬毒种：猪伪狂犬病病毒X，F7代，基础毒种。
支原体毒种：猪鼻支原体，为《中国兽药典》明文规定兽用生物制品质控使用的支原体阳性参照菌株，购自中国兽医药品监察所。
小鼠：16～20g昆明小鼠8只。
细胞：乳仓鼠肾细胞(BHK-21)。
支原体培养基：购自中国兽医药品监察所。
1试验方法
1.1人工模拟支原体污染将猪鼻支原体阳性质控菌株复壮后，接入猪伪狂犬病X毒种中，即人工模拟种毒遭受支原体污染。
1.2接种小鼠小鼠脑部接种污染支原体的猪伪狂犬病X毒种病毒液，接种2只小鼠，各接种0.02ml，。
1.3病毒分离上述小鼠接种72h后死亡，将死亡小鼠解剖，取脑组织加PBS研磨后混合制成悬液，以3000r/min离心15分钟，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，检测病毒含量后于4℃保存备用，记为CF1代。
1.4蚀斑克隆用细胞维持液将伪狂犬毒种病毒液稀释成每0.1ml含20TCID50，接种4个长成BHK-21细胞单层的平皿(直径9cm)，每个平皿接种0.1ml。经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，待凝固后翻转平皿，置于含5％二氧化碳培养箱内培养。48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养48小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次。
1.5病毒培养病毒克隆纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑8个，按1％(V/V)接种已成长单层的BHK-21细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融1次，取样鉴定。
1.6克隆培养样品鉴定
支原体检验按《中国兽药典》中支原体检验方法检验克隆纯化后的病毒液中有无支原体生长。
按《猪伪狂犬病疫苗X制造及检验规程》对克隆纯化后的病毒液进行病毒含量、鉴别检验、无菌检验、外源病毒检验、安全性和免疫原性检验。
1.7试验结果
1.7.1支原体检验结果按《中国兽药典》检验人工模拟感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液和采用本发明方法去除支原体后的伪狂犬病病毒液，阳性对照为猪鼻支原体，阴性对照为支原体培养基，其中由图5、图6和图7结果可知，人工模拟感染猪鼻支原体的伪狂犬病病毒液和阳性对照均有支原体生长，阴性对照和采用本发明方法去除支原体后的伪狂犬病病毒液无支原体生长，说明本发明方法已去除伪狂犬毒种中的支原体。结果见表1。
表1支原体检验结果
Figure BDA0002542832160000091
按《猪伪狂犬病疫苗X制造及检验规程》对克隆纯化后的病毒液进行病毒含量、鉴别检验、无菌检验、外源病毒检验、安全性和免疫原性检验结果。结果见表2。
表2去除支原体后伪狂犬种毒的各项检验结果
Figure BDA0002542832160000101
试验结果表明，本发明方法可以清除伪狂犬病疫苗种毒中的支原体，清除支原体后的种毒按照《猪伪狂犬病疫苗X制造及检验规程》相关标准进行检查，结果显示，种毒在细胞内的增殖能力、安全性、免疫原性方面均良好，且无外源病毒污染。说明该发明方法未对伪狂犬毒种的生物学活性、安全性和免疫原性造成影响，可以用于后续疫苗生产。

Claims (8)

1.一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)小鼠接种：在隔离饲养的清洁级小鼠脑部注射伪狂犬病疫苗种毒，接种后48h～72h，取发病死亡小鼠脑组织无菌研磨，分离伪狂犬病病毒；
(2)用细胞维持液将分离的伪狂犬病病毒液稀释，接种4个已长成细胞单层的平皿；经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，置于含5％二氧化碳培养箱内培养；48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养24～48小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次；
(3)病毒纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑，按1％V/V接种已成长单层的健康细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融若干次，取样鉴定；
(4)纯化病毒进行如下检验：
①用阳性血清中和试验法进行鉴别检验，病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均应不产生CPE；
②进行病毒含量检验，每毫升病毒含量应≥107.0TCID50；
③按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，符合规定。
2.根据权利要求1所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的清洁级小鼠为体重16～22g昆明小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的伪狂犬病种毒的病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml。
4.根据权利要求1或2所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。
5.根据权利要求3所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。
6.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的伪狂犬病病毒液稀释的病毒含量为10TCID50～50TCID50。
7.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(3)中的培养伪狂犬病病毒的细胞为猪睾丸细胞、BHK-21细胞、Vero细胞或鸡胚成纤维细胞中任一种。
8.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中病毒接种比例V/V为1～3％，冻融次数为1～2次。
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