CN107267466B - 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疫苗技术领域,具体涉及一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。所述方法包括:制备猪伪狂犬病(XF‑1株)病毒液;采用连续流离心、中空纤维柱澄清过滤、中空纤维柱超滤浓缩、及Sepharose 4FF分子筛凝胶层析纯化处理后得到纯化猪伪狂犬病毒;再向纯化的猪伪狂犬病毒中加入终浓度为0.4%(v/v)的甲醛溶液,于37℃条件下灭活48h,然后与201佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。本发明所述的猪伪狂犬病灭活疫苗对市场所流行的高致病性变异伪狂犬病能起到很好的保护效果。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域,具体涉及一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪该是本病的天然宿主和贮存者,该病以发热、奇痒、脑脊髓炎和严重的繁殖障碍为主要特征。从2011年以来,全国多省份使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场,母猪出现产弱仔猪、死胎、木乃伊、流产;后备母猪和空怀母猪常出现返情、屡配不孕或不发情的情况;公猪感染后常出现睾丸萎缩,性功能下降失去种用能力;新仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬病的临床症状;育肥猪表现为呼吸道症状和增重滞缓,给养猪业造成较大的经济损失。因此,更多怀疑当前伪狂犬流行毒株是否发生变异,从而导致疫苗保护失效。这种猜测随后也被得到证实。华中农大、中国农大、南京农大、中国动物疫病控制中心等通过多项实验研究表明,新发生伪狂犬病是由新的毒株引起的。华中农业大学动物疫病诊断中心将全国各省份发病猪病料中分离的伪狂犬野毒进行基因测序,结果表明,当前分离的流行毒株在TK、gB、gE、gC等基因发生了多个碱基的标志性突变和连续性缺失,这些突变和缺失有可能是导致当前猪伪狂犬再次流行的一个重要原因。目前商品化疫苗免疫产生的抗体对目前流行毒株的中和能力较差。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状,猪场母猪、仔猪、育肥猪大量死亡,给该病的防控提出新的难题,同时对当今的养猪业也造成严重的经济损失。
预防该疾病最行之有效的办法是接种疫苗。目前,市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数为猪伪狂犬病常规灭活疫苗和弱毒疫苗。但由于流行毒株不断发生变异,与市售疫苗在免疫原性方面存在差异,导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。因此,需要研究开发针对目前变异伪狂犬病毒的疫苗,是解决目前流行猪伪狂犬病的最佳途径。
目前商品化猪伪狂犬病病毒疫苗主要采用转瓶培养工艺,如将伪狂犬病病毒接入已经贴壁的传代细胞或原代细胞,培养一段时间后收获病毒液。如专利申请CN101695573A。在悬浮培养方面,有利用微载体进行生物反应器培养伪狂犬病病毒的报道。如专利申请CN101695572A和CN102038946A。但是上述方法,工艺复杂,污染风险大或均需借助价格昂贵的微载体才能进行细胞悬浮培养,生产成本相对较高;借助微载体培养时,需使用胰酶消化,消化后细胞利用率低,生产工艺复杂,不利于较大规模培养。也有公开报道纯悬浮培养猪伪狂犬病毒,如专利CN 105727277A。我国在3000L以上大规模培养方面,由于悬浮工艺技术难度大还停留在理论上。加上国外对大规模培养工艺技术垄断或禁止出口相关技术,这为我国在大规模培养工艺技术方面增加难度系数。因此研制一种工艺简单稳定、超大规模培养、并能制备高含量猪伪狂犬病病毒的生产方法具有十分重要的意义。
另外,我国常规生产纯化工艺主要通过抗原离心,死端过滤,膜包浓缩等方式生产猪伪狂犬病毒灭活疫苗。常规工艺生产的猪伪狂犬病灭活疫苗,在临床应用中有一定的副反应,主要原因就是病毒抗原中除有效抗原外还有其他成分。这些成分包括:病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA;培养基残留如小牛血清;灭活剂残留等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应,而且会大大降低疫苗的免疫效果。
以灭活病毒作为抗原的纯化工艺主要以自然沉降、连续流离心、中空纤维澄清、膜包浓缩工艺为主。传统的转瓶培养抗原结合常规的生产工艺,生产的猪伪狂犬病毒灭活疫苗中有效抗原含量增加,同时有害物质残留量浓度也升高,从而导致疫苗产品存在副反应大,免疫效果不佳等不利影响。因此,对灭活疫苗而言,提高抗原纯度,对制品的安全性、免疫效果都有非常重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,目的在于提供一种适用于3000L生物反应器大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。
为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法,包括如下步骤:
(1)猪伪狂犬病病毒XF-1株的制备:利用生物反应器培养BHK-21 细胞悬液,然后接种猪伪狂犬病病毒,培养一段时间后,收获猪伪狂犬病病毒液;
(2)猪伪狂犬病病毒的纯化:将猪伪狂犬病病毒液连续流离心,吸取上清并利用中空纤维柱澄清过滤;再利用中空纤维柱超滤浓缩;最后利用分子筛凝胶层析柱对病毒浓缩液进行纯化,收集第一个洗脱峰对应的洗脱液,即为高纯度的猪伪狂犬病毒液;
(3)将高纯度的猪伪狂犬病毒灭活,经检验合格后,再与疫苗佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。
上述方案中,所述猪伪狂犬病病毒株为XF-1株,该毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏,地址:中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:V201654,该菌株已经在发明专利中公开(发明专利的名称:一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株及制备方法和应用,申请号:201610979825.1,公开号: 106497890A)。
上述方案中,步骤(1)所述猪伪狂犬病病毒的制备,利用生物反应器培养BHK-21细胞悬液,当细胞密度为2.0×106~5.0×106个/mL,细胞活力≥ 93%时,接种猪伪狂犬病毒XF-1株,接种剂量为3‰~8‰(v/v);当BHK-21细胞密度低于 1.0×106个/mL 或细胞活力≤ 20% 时,收获猪伪狂犬病病毒液。
上述方案中,步骤(2)所述用于澄清过滤的中空纤维柱的孔径为0.45μm~0.65μm;所述用于超滤浓缩的中空纤维柱的孔径为500KD~750 KD;所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose 4FF琼脂糖凝胶层析填料。
上述方案中,步骤(2)中所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2~3psi,进液端流速为60~80L/min;所述中空纤维柱超滤浓缩的时采用的跨膜压为10~15psi,循环流速为30~50L/min;所述利用分子筛凝胶层析柱层析时,病毒浓缩液上样的线性流速为45~100cm/h,压力小于2.5bar,上样量控制在10%~15%柱体积,洗脱采用的洗脱剂为0.01mol/LPBS溶液。
上述方案中,步骤(2)所述利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作为:首先用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理,再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗,直至pH为6.8~7.2,然后用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱,最后将猪伪狂犬病毒待澄清液通过中空纤维柱澄清过滤,收集透过端液体,得到病毒澄清液。所述猪伪狂犬病毒待澄清液通过中空纤维柱澄清过滤的过程为:先透过60%~70%待澄清上清液,然后补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/L PBS溶液,继续透过,待透过液体的体积等于加入的PBS溶液体积后,再补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/L PBS溶液,如此洗滤多次后,至残渣不能透过,收集透过端液体,得到病毒澄清液。
上述方案中,步骤(2)所述中空纤维柱超滤浓缩的过程为:首先用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理,再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗,直至pH为6.8~7.2,然后用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱,最后将病毒澄清液通过中空纤维柱超滤浓缩,收集浓缩后的液体,得到病毒浓缩液。所述病毒澄清液通过中空纤维柱超滤浓缩的过程为:(1)维持跨膜压在10~15psi持续透过,待病毒澄清液体积浓缩至起始体积的1/8~1/10时,补加0.01mol/L PBS溶液进行第一次洗滤,待病毒澄清液体积浓缩至起始体积的1/16~1/20时,补加与病毒澄清液等体积的0.01mol/L PBS溶液进行第二次洗滤,至再次浓缩至起始体积的1/16~1/20时,结束浓缩,收集浓缩后的液体;(2)用病毒澄清液起始体积1/16~1/20的0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维,收集洗膜液;(3)所得浓缩后的液体与所得洗膜液混合后,即为8~10倍浓缩的病毒浓缩液。
上述方案中,步骤(2)所述分子筛凝胶层析柱层析的过程为:用0.5mol/L NaOH溶液对分子筛凝胶层析柱冲洗,再用无菌水冲洗直至pH为7.2,随后用0.01mol/L PBS溶液平衡分子筛凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致,pH稳定在7.0,紫外检测UV280基线平稳;然后将所得病毒浓缩液上样,上样结束后,用0.01mol/L PBS溶液洗脱,待UV280值开始回升时,开始收集洗脱液,至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液。
上述方案中,步骤(3)中所述疫苗佐剂为兽医学可接受的水性佐剂,包括但不限于铝盐系列佐剂、Montanide IMS 系列佐剂、MONTANIDETM ISA系列佐剂、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂。所述Montanide IMS系列佐剂包括1313VG、251C VG、2215VG;所述MONTANIDETM ISA系列佐剂为ISA 206 R 或ISA 201;所述细胞因子类佐剂包括白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12),干扰素(IFN-γ、IFN-α、IFN-β) 等;所述核酸及其衍生物类佐剂包括免疫刺激序列DNA(CpG DNA) 或CpG 寡聚脱氧核苷酸等。优选地,所述疫苗佐剂为MONTANIDETM ISA 201。
上述方案中,步骤(3)制备所得猪伪狂犬病灭活疫苗为水包油包水型灭活疫苗。
本发明的有益效果:
(1)本发明采用生物反应器(3000L)大规模纯悬浮培养猪伪狂犬病病毒(XF-1株),减少了人力、物力的投入,降低了生产成本 ;减少生产次数,减少批间差;产品质量稳定,纯化后的病毒纯度高,用于制备灭活疫苗可大大提高疫苗质量,降低了由疫苗带来的副反应,降低了疫苗风险成本,提高产品在市场的竞争力;
(2)本发明通过中空纤维柱的澄清过滤处理、中空纤维柱的超滤浓缩纯化处理及Sepharose 4FF分子筛凝胶层析纯化处理,实现了大规模(3000L)高效纯化生产制备高纯度猪伪狂犬病毒,猪伪狂犬病毒的病毒回收率可达99.74%,杂蛋白去除率高达97%,有效抗原含量高达95.3%。
(3)本发明改进了猪伪狂犬病毒液下游纯化工艺,杂蛋白去除率高达97%,有效抗原含量高达95.3%,将引起疫苗副反应的杂质水平降至更低,提高了安全性的同时保持了疫苗良好的免疫原性;由于猪伪狂犬病毒疫苗接种对象为猪群,高质量的产品必将大大降低接种猪群的副反应程度和概率,成为养殖户和科研人员所欢迎的产品,能产生较高的社会效益和经济效益。
(4)本发明所述的方法生产猪伪狂犬病灭活疫苗能对市场流行的高致病性变异伪狂犬毒株能起到很好的保护效果,养殖场免疫后能降低伪狂犬病造成的经济损失。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所述“每头份”或“/ 头份”是指每头猪每次所用疫苗剂量。未作特别说明之处,在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/ 头份”均为2ml。
以下实施例中,所用仪器如下:
中空纤维柱澄清过滤过程中中空纤维柱孔径为0.45μm,型号为:CFP-5-D-55A。
中空纤维柱澄清过滤和超滤浓缩过程中空纤维柱设备型号为VERSAFlux 120。
中空纤维柱超滤浓缩过程中空纤维柱孔径为500KD,型号为:UFP-500-E-55。
分子筛凝胶层析柱型号为:BPG450/1000 Column。
分子筛凝胶层析柱填料为:Sepharose 4FF凝胶层析填料。
上述仪器均购自GE 公司。
乳化机型号:IKA公司RW20D,德国。
MONTANIDETM ISA 201佐剂购自法国SIPPEC公司,用 0.22 微米滤器过滤备用。
对每步所得产物分别通过A280检测蛋白含量,通过TCID50检测病毒滴度。
所述流速公式v=1 .56πr2ml/min中,r表示层析柱半径。
实施例1 规模化生产制备猪伪狂犬病病毒(XF-1株)
将300L浓度为4.0~10.0×106 个/ml的BHK-21 细胞悬液,接种于650L生物反应器中,加入含0.5 %~2%(v/v)新生牛血清的BHK-21培养基350L,控制细胞培养温度36℃~37℃,pH 6.5~7.5,搅拌转速80rpm~150rpm,溶解氧浓度30%~60%,反应器参数设定四路气体,分别为洁净空气、氧气、氮气和 CO2,根据培养时间、细胞密度和pH值,设定不同气体参数范围。当培养 24 小时后,用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力观察。悬浮培养2天后,需按生物反应器内培养物总体积5%(v/v)补充新BHK-21培养基。细胞培养3天,密度达到4.0~10.0×106 个/ml,获得BHK-21 细胞悬液。
将上述BHK-21 细胞悬液接种于已有2000L BHK-21培养基的3000L生物反应器中,控制细胞培养温度36℃~37℃,pH 6.5~7.5,搅拌转速80rpm~150rpm,溶解氧浓度40%~60%,反应器参数设定四路气体,分别为洁净空气、氧气、氮气和 CO2,根据培养时间、细胞密度和pH值,设定不同气体参数范围。悬浮培养2天后,按生物反应器内培养物的总体积5%(v/v)补充新BHK-21培养基,至细胞密度达到2.0~5.0×106个/ml,按照总体积6‰(v/v)接种猪伪狂犬病病毒XF-1株,反应器 pH 设定 7.2,其它保持不变,从接毒培养的第 24 小时起每小时进行细胞计数及活力观察,当活细胞密度低于 1.0×106个/ml 或细胞活力≤ 20% 时,收获猪伪狂犬病病毒液。
实施例2 猪伪狂犬病病毒液的纯化
一、中空纤维柱澄清工艺
1 系统预处理
1.1 将0.45μm中空纤维柱安装到中空纤维柱控制设备中,接通相应的管道,组装完毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱30min。
1.2 系统完整性检测
压力保持法检测系统的完整性。
1.3 系统的处理
清洗及灭菌:用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环灭菌处理30min,然后用无菌注射用水对系统进行清洗,洗去残余的碱溶液,直至pH为7.0;
1.4 水通量的检测
用无菌注射用水在规定的泵速下透过,计算相应温度下中空纤维柱的水通量。
1.5 中空纤维柱平衡
用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱20min。
2 待澄清样品的澄清过滤过程
2.1 取纯悬浮BHK-21细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液500L,在4℃冷库中自然沉降48h后通过连续流离心,吸取上清作为待澄清的样品480L。
2.2 将待澄清抗原通过0.45μm中空纤维柱,样品在纤维柱内循环5min后,泵速控制在40~50%(进液端流速在60~80L/min),打开透过端,维持TMP(跨膜压)2.0~3.0psi,循环流速为75L/min,收集透过端液体;待收集透过端液体体积为350L,以3L/min流速连续补加0.01mol/L PBS溶液,继续透过,待透过样品的体积等于加入的PBS溶液体积后,再补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液,如此洗滤三次后,至残渣不能透过结束澄清过程,透过端收集的抗原800L即为病毒澄清液。
二、中空纤维柱超滤浓缩工艺
1系统预处理
1.1将500KD中空纤维柱安装到中空纤维柱控制设备中,接通相应的管道,组装完
毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱30min。
1.2系统完整性检测
压力保持法检测系统的完整性。
1.3 系统的处理
清洗及灭菌:用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环灭菌处理30min。然后用无菌
注射用水对系统进行清洗,洗去残余的碱溶液,直至pH为7.0;
1.4水通量的检测
用无菌注射用水在规定的泵速下透过,计算相应温度下中空纤维柱的水通量。
1.5中空纤维柱平衡
用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱20min。
2 病毒澄清液超滤浓缩过程
将澄清后抗原800L通过中空纤维柱,样品在纤维柱内循环5min后,打开透过端,维
持TMP 10~15psi,循环流速为40L/min,透过端液体为废液,将样品进行10倍浓缩,待样品浓缩至100L,补加0.01mol/L PBS溶液100L洗滤第1次;待样品浓缩至50L,补加0.01mol/L PBS溶液50L洗滤第2次;至样品浓缩至25L,收集20倍浓缩液。加入25L 0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维10min,收集洗膜液。20倍浓缩液和洗膜液混合后即为10倍浓缩样50L。
三、分子筛凝胶层析工艺
1系统预处理
1.1 将4FF分子筛层析柱安装到位,测柱效。
1.2 用无菌0.5mol/L NaOH处理分子筛凝胶层析柱2个柱体积(CV),再用无菌注射水清洗至PH7.0,然后用0.01mol/L PBS溶液平衡离子交换柱至电导率柱前后一致(柱前和柱后电导率在15.69ms/cm),pH稳定在7.0,紫外UV280基线平稳。
2 纯化过程
将浓缩后病毒样上样,设定上样线性流速为30cm/h,压力控制小于2.5bar。上样量为5%、10%、15%柱体积,上样结束后,用0.01mol/L PBS溶液开始洗脱蛋白,待UV280值开始起峰时收集洗脱后样品,待目的蛋白峰结束UV280值下降至最低或者数值开始增加时停止收集第一洗脱峰洗脱样品。继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。收集的洗脱样品即为猪伪狂犬病毒纯化后样。
四、猪伪狂犬病毒液纯化效果评价
采用A280方法检测总蛋白浓度及TCID50检测病毒毒价,表1结果显示,分子筛凝胶层析工艺中以5%上样量的蛋白去除率高达99.54%,病毒回收率也高达98.60%;增加上样量杂蛋白去除率下降,病毒回收率同时下降;但在实际大规模生产过程中为提高工作效率,一般10%~15%的上样量更加合适。
表1 猪伪狂犬病毒纯化效果评价
实施例3 猪伪狂犬病灭活疫苗的制备
猪伪狂犬病病毒(XF-1株)纯化后抗原毒价在108.0 TCID50/ml以上,加入终浓度为0.4%(v/v)的甲醛溶液37℃灭活48h,按现行《中国兽药典》附录进行相关检验合格后,4℃存放备用。
将检验合格的猪伪狂犬病病毒(XF-1株)按配苗要求稀释后,分别与MONTANIDETMISA 201佐剂,按照质量比1:1(g/g)进行乳化,搅拌转速为500rpm/min,乳化时间为30min。最终猪伪狂犬病灭活疫苗中的抗原含量为106.0 TCID50/头份、107.0 TCID50/头份和107.5TCID50/头份,乳化完成后分装、检验。检验按照《中国兽药典》附录进行,经检验合格后4℃保存备用,即得猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)。用于本发明实施例。
对照疫苗的制备(粗制苗):将实施例1制备的猪伪狂犬病病毒液(未纯化抗原),加入终浓度为0.4%的甲醛溶液37℃灭活48h,按现行《中国兽药典》附录进行相关检验合格后,与ISA 201佐剂进行乳化。其中佐剂与抗原按照质量比为1:1(g/g),搅拌转速为500rpm/min,持续搅拌30min。最终该疫苗产品中抗原含量为107.5 TCID50/头份,用于本发明实施例。
实施例4 疫苗的安全性检验
1 材料与方法
1.1 试验动物:市场购买武汉某猪场21~25日龄的仔猪,进行主要病原和相关抗体检测,选猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪,共计25头。
1.2 试验方法:将试验猪随机分为5组,每组5头仔猪。其中组1为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为106.0 TCID50/头份);其中组2为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.0 TCID50/头份);其中组3为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份);组4为粗制疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份)对照组。组5为空白对照组。免疫组每头猪颈部肌肉注射2头份,空白对照组不注射。观察14天并记录试验结果。
2 试验结果 抗原经过纯化后制备的疫苗各组都5/5健活,且无不良反应。粗制苗其中有2头体温升高、精神沉郁、厌食。由此可见,疫苗纯化后更具有良好的安全性。(详见表2 )
表2 疫苗安全性试验结果
实施例5 疫苗的抗体消长规律试验
1 材料与方法
1.1 试验动物:市场购买武汉某猪场21~25日龄的仔猪,对主要病原和相关抗体进行检测,选猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪,共计30头。
1.2 猪伪狂犬病特异性阳性血清:中和效价为1:256,由武汉科前生物股份有限公司制备。
1.3 试验用疫苗:实施例2制备的3种不同抗原含量的猪伪狂犬病灭活疫苗(纯化苗);实施例2制备的对照猪伪狂犬病灭活疫苗(粗制苗);进口Bartha-K61株灭活疫苗,批号:0J70-1。 市场购买西班牙海博莱生物大药厂。
2 试验方法
将试验猪随机分为6 组,每组5头仔猪。分组情况如下:组1为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为106.0 TCID50/头份);组2为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.0 TCID50/头份);组3为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份);组4为粗制疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份)对照组;组5为进口Bartha-K61株灭活疫苗,批号:0J70-1;组6为空白对照。
各免疫组颈部肌肉注射1头份/头。免疫后,分别14天、35天、56天、77天采血分离血清。检测猪伪狂犬抗体和猪伪狂犬病毒中和抗体效价,计算转阳率,同时检测各免疫组在不同免疫时间平均中和抗体。
3 试验结果
3.1 猪伪狂犬病灭活疫苗平均抗体消长规律对比试验结果(见表3),从表3抗体结果可以看出,在相同病毒抗原含量下,纯化后疫苗组3和未纯化疫苗组4有明显差异,组3平均抗体水平高于组4。不同病毒含量的纯化疫苗相比,组2和组3平均抗体水平差异不显著,但和组1相比差异显著,说明组1疫苗中的抗原含量偏低未达到免疫效果。纯化抗原疫苗和市场苗相比,纯化后疫苗组2和组3平均抗体明显好于市场苗。
表3 猪伪狂犬病灭活疫苗平均抗体消长规律对比试验结果
3.2 不同免疫时间各免疫组中和抗体检测试验结果(见表4)。从表4结果可以看出,在免疫35天后,所有疫苗转阳率都合格。各组疫苗免疫14天后转阳率达到50%以上。免疫35天后,除第1组外,其他各免疫组平均中和抗体基本无显著差异,转阳率为100%。组2和组3试验对比发现,组3的中和抗体水平不如组2好,说明当疫苗中的有效抗原含量达到一定量后,再增加有效抗原,免疫效果并没有明显提升,差异不显著。
在本实施例中,作为疫苗效力判断的中和抗体试验而言,组2和组3之间没有显著差异。虽然此测试具有一定客观性及中和抗体检测结果与预计结果相关,所以中和抗体检测可作为疫苗效力判断的最佳参数之一。
表4 免疫不同时间中和抗体检测试验结果
实施例6 猪伪狂犬病灭活苗的免疫原性试验
1.材料与方法
1.1 试验动物:对武汉某猪场进行主要病原和相关抗体检测,选用21~25日龄的猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原阴性猪和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)仔猪35头。
1.2 试验方法:将试验猪随机分为6组,每组5头仔猪。分组情况如下:组1为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为106.0 TCID50/头份);组2为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.0 TCID50/头份);组3为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份);组4为对照组粗制疫苗(有效病毒含量为107.5 TCID50/头份);组5为空白对照攻毒组;组6为严谨性阴性对照组。
其中,组1、组2、组3进行一次免疫,每头猪颈部肌肉注射1头份,组4进行两次免疫,每头猪颈部肌肉注射1头份。在免疫21天后,组4按照相同剂量二免。由于组4疫苗需两次免疫,所以组1、组2、组3疫苗免疫组较组4疫苗免疫组推迟一周免疫接种。
在免疫35天后采血,分离血清,进行中和指数测定。对所有仔猪进行滴鼻攻毒,攻毒剂量1ml/头。攻毒毒株为猪伪狂犬病毒(XF-1株),病毒液毒价为107.5TCID50/ 0.1ml。攻毒后隔离饲养,自由采食。每天观察实验猪发病症状(如精神萎靡,食欲不振,发热,神经症状,呼吸道症状与死亡等),对死亡猪系统解剖后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织。观察14天并记录体温、呼吸系统、消化系统、神经系统的临床反应。根据仔猪发病判断标准得出攻毒结果。分析攻毒保护率与免疫剂量、免疫次数之间相关性,分析攻毒保护率与抗体水平之间的相关性。
1.3 攻毒后仔猪发病判断标准
(1)呼吸或消化系统临床症状 打喷嚏、鼻有分泌物、呼吸困难;拉稀、呕吐。
(2)体温反应 体温≥40.5℃,至少持续2天。
(3)神经系统临床症状 痉挛、流涎、倒地划水、极度烦躁等典型临床症状。
(4)死亡。
符合以上第(3)、第(4)项或同时符合第(1)、第(2)项,即可判断为发病。
2.试验结果
2.1 免疫后抗体水平测定:在二免后猪伪狂犬变异株(XF-1株)gB抗体和中和抗体明显高于其他免疫组,而gE抗体所有免疫组都为阴性。非免疫组gB、gE、中和抗体都为阴性。
2.2 攻毒后临床症状:由表5可知,在攻毒后第5组全部发病,其中3头死亡,而免疫组中除第1组有1头体温有发热外,其他各免疫组体温升高不超过1天均表现。其中,第2组2头、第3组2头、第4组1头实验猪出现发热(>41℃),精神沉郁,咳嗽,呼吸困难,神经症状与死亡等临床表现,而第1组实验猪精神状态良好,未见任何异常现象,攻毒保护率达100%。
表5 免疫后攻毒保护试验结果
注:*表示各疫苗组在攻毒后体温达到或超过40.5℃2天数以上的百分比
从试验结果可以看出,组2为实施例2所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(有效病毒含量为107.0 TCID50/头份)保护效果最好。可以说明,疫苗中的有效抗原经过纯化后有效病毒含量为107.0 TCID50/头份就可以达到未纯化的有效病毒含量为107.5 TCID50/头份的免疫效果,甚至还要好。另外,抗原经过纯化后免疫一次就可以达到未纯化抗原二次免疫的保护效果。
3. 讨论
本研究总共评价了4种猪伪狂犬病灭活疫苗,分别是3种不同抗原含量纯化苗和1个粗制苗。从疫苗的安全性试验结果(实施例4)看,抗原经过纯化后安全性更好。从免疫攻毒效果看,组2(有效病毒含量为107.0 TCID50/头份)疫苗效果最好。组2和组3相比,组3抗原含量高于组2,但攻毒保护效果相当,甚至组2略高于组3,组1最差。分析表明组2和组3两组之间攻毒保护的差异不显著。同时说明疫苗中的有效抗原含量达到一定含量后,再增加有效抗原,免疫效果不会明显提升,差异不显著。抗原纯化苗和粗制苗相比,粗制苗需二次免疫,纯化苗一次免疫可以达到粗制苗二次免疫的效果。
在三组不同抗原含量疫苗免疫组中,组2 (有效病毒含量为107.0 TCID50/头份) 的保护水平最高。在所有实验组中,组2都有最佳结果。攻毒对照组在进行强毒攻击后,5头发病,其中死亡3头。免疫组除个别仔猪有轻微体温反应外,均无其他临床表现。由此说明本疫苗有良好的保护效果。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)猪伪狂犬病病毒的制备:利用生物反应器培养BHK-21 细胞悬液,然后接种猪伪狂犬病病毒,培养一段时间后,收获猪伪狂犬病病毒液;所述猪伪狂犬病病毒株为XF-1株,该毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏,地址:中国,武汉,武汉大学,保藏编号为:CCTCC NO:V201654;
(2)猪伪狂犬病病毒的纯化:将猪伪狂犬病病毒液连续流离心,取上清并利用中空纤维柱澄清过滤后;再利用中空纤维柱对病毒进行超滤浓缩;最后利用分子筛凝胶层析柱对病毒进行纯化,收集第一个洗脱峰对应的洗脱液,即为高纯度猪伪狂犬病毒液;
所述用于澄清过滤中空纤维柱的孔径为0.45μm~0.65μm;所述用于超滤浓缩中空纤维柱的孔径为500KD~750KD;所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose 4FF琼脂糖凝胶层析填料;
所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2.0~3.0psi,进液端流速为60~80L/min;所述中空纤维柱超滤浓缩的时采用的跨膜压为10~15 psi,循环流速为30L/min~50L/min;所述利用分子筛凝胶层析柱层析时,病毒浓缩液上样的线性流速为45~100cm/h,压力小于2.5bar,上样量控制在10%~15%柱体积,洗脱采用的洗脱剂为0.01mol/L PBS;
所述利用中空纤维柱澄清过滤的过程为:先透过60%~70%待澄清上清液,然后补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/L PBS溶液,继续透过,待透过液体的体积等于加入的PBS溶液体积后,再补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/L PBS溶液,如此洗滤多次后,至残渣不能透过,收集透过端液体,得到病毒澄清液;
所述利用中空纤维柱对病毒进行超滤浓缩的过程为:(i)维持跨膜压在10~15psi持续透过,待病毒澄清液体积浓缩至起始体积的1/8~1/10时,补加0.01mol/L PBS溶液进行第一次洗滤,待病毒澄清液体积浓缩至起始体积的1/16~1/20时,补加与病毒澄清液等体积的0.01mol/L PBS溶液进行第二次洗滤,至再次浓缩至起始体积的1/16~1/20时,结束浓缩,收集浓缩后的液体;(ii)用病毒澄清液起始体积1/16~1/20的0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维柱,收集洗膜液;(iii)将浓缩后的病毒液与洗膜液混合,即为8~10倍浓缩的病毒浓缩液;
(3)将步骤(2)所得高纯度的猪伪狂犬病毒液灭活,经检验合格后,再与疫苗佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤(1)所述猪伪狂犬病病毒液的制备,利用生物反应器培养BHK-21 细胞悬液,当细胞密度为2.0×106~5.0×106个/mL,细胞活力≥ 93%时,接种猪伪狂犬病毒XF-1株;当BHK-21细胞密度低于 1.0×106/mL 或细胞活力≤ 20% 时,收获猪伪狂犬病病毒液。
3.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤(2)中所述利用分子筛凝胶层析柱对病毒进行纯化的过程为:用0.5mol/L NaOH溶液对分子筛凝胶层析柱冲洗,再用无菌水冲洗直至pH为7.2,随后用0.01mol/L PBS溶液平衡分子筛凝胶层析柱,最终使柱前柱后电导率一致,pH稳定在7.0,紫外检测UV280基线平稳;然后将病毒浓缩液上样纯化,上样结束后,进行洗脱,待UV280值开始回升时,开始收集洗脱液,至第一个洗脱峰结束后停止收集洗脱液。
4.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤(3)中所述疫苗佐剂为兽医学可接受的水性佐剂,包括铝盐系列佐剂、Montanide IMS 系列佐剂、MONTANIDETM ISA系列佐剂、免疫刺激复合物、核酸及其衍生物类佐剂、细胞因子类佐剂和卵磷脂类佐剂。
5.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病毒灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤(3)所述乳化制备所得猪伪狂犬病灭活疫苗为水包油包水型灭活疫苗。
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