CN107254449B - 一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法 - Google Patents

一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。所述方法采用了连续流离心、中空纤维澄清过滤、超滤浓缩、分子筛纯化工艺，最大限度的增加了病毒的回收率，降低了杂蛋白的含量。本发明制备的猪伪狂犬病毒浓缩液、纯化抗原尤其适用于制备疫苗，相较于现有技术生产的猪伪狂犬病灭活疫苗而言，安全性更高，均一性更好，免疫效果更好，从根本上减少了疫苗的副反应。

Description

一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。
背景技术
伪狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。猪是伪狂犬病的唯一自然宿主，对其危害大。可致妊娠母猪流产，产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，病死率100％。成年猪多呈隐性感染。病猪、带毒猪及带毒鼠类是本病的主要传染源。猪既是本病的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。伪狂犬病的传播和蔓延，给养殖业造成了巨大损失。
本病目前无特效治疗药物，对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清，对未发病受威胁猪进行紧急免疫接种。本病以预防为主，疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施，目前国内外已研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗都能在一定程度上减轻或防治伪狂犬病的临床症状，从而减少造成的经济损失。
目前，我国商品化的猪伪狂犬病病毒疫苗主要是基因缺失活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯净性，灭活工艺及佐剂等因素的影响。常规工艺生产的猪伪狂犬病毒灭活疫苗在临床应用中有一定的副反应，主要与病毒抗原中所含的抗原外成分有关。这些成分包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。以传统灭活全病毒作为抗原的纯化工艺主要以自然沉降、离心、膜包浓缩等工艺为主，生产的疫苗中有效抗原含量增加，同时有害物质残留量浓度也升高，导致疫苗产品存在安全性隐患。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量的基本途径。
中空纤维膜过滤技术是料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，同时有助于杂蛋白的透过和去除。
分子筛凝胶层析是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品在凝胶内运动时，由于分子量不同在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行"绕道"运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
(1)取纯悬浮BHK细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液，连续流离心取上清作为待澄清样品；
(2)将步骤(1)所得待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤，得到病毒澄清液；
(3)将步骤(2)所得病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
(4)将步骤(3)所得病毒浓缩液利用分子筛凝胶层析柱层析，收集洗脱后的第一个洗脱峰，所得洗脱液即为高纯度的猪伪狂犬病毒。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的孔径为0.45μm～0.65μm，更为优选地，所述中空纤维柱的孔径为0.45μm。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱澄清过滤的具体操作为：首先用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理，再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗，直至pH为6.8～7.2，然后用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱，最后将猪伪狂犬病毒待澄清样品通过中空纤维柱澄清过滤，收集透过端液体，得到病毒澄清液。所述猪伪狂犬病毒待澄清样品通过中空纤维柱澄清过滤的过程为：先透过60％～70％待澄清样品，然后补加体积与剩余样品体积相同的0.01mol/L PBS溶液，继续透过，待透过样品的体积等于加入的PBS溶液体积后，再补加体积与剩余样品体积相同的0.01mol/L PBS溶液，如此洗滤多次后，直至残渣不能透过，结束澄清过滤过程。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱澄清过滤时采用的TMP在2.0～3.0psi，进液端流速控制在60～80L/min。
上述方案中，步骤(3)所述中空纤维柱的孔径为500KD～750KD。更为优选地，所述中空纤维柱的孔径为500KD。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的型号为：CFP-5-D-55A；步骤(3)所述中空纤维柱的型号为：UFP-500-E-55；步骤(2)和步骤(3)中所述中空纤维柱的设备型号为VERSAFlux 120。
上述方案中，步骤(3)所述中空纤维柱超滤浓缩的过程为：首先用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理，再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗，直至pH为6.8～7.2，然后用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱，最后将病毒澄清液通过中空纤维柱超滤浓缩，收集浓缩后的液体，得到病毒浓缩液。所述病毒澄清液通过中空纤维柱超滤浓缩的过程为：(1)维持TMP在10.0～15.0psi持续透过，待样品体积浓缩至起始体积的1/8～1/10(v/v)时，补加0.01mol/L PBS溶液进行第一次洗滤，待样品体积浓缩至起始体积的1/16～1/20(v/v)时，补加与样品等体积的0.01mol/L PBS溶液进行第二次洗滤，至样品再次浓缩至起始体积的1/16～1/20(v/v)时，结束浓缩，收集浓缩后的液体；(2)用起始病毒澄清液1/16～1/20(v/v)体积的0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维，收集洗膜液；(3)将步骤(1)所得浓缩后的液体与步骤(2)所得洗膜液混合后，即为8～10倍浓缩的病毒浓缩液。
上述方案中，步骤(4)所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose 4FF琼脂糖凝胶层析填料；所述分子筛凝胶层析柱的型号为BPG450/1000 Column。
上述方案中，步骤(4)所述分子筛凝胶层析柱层析的过程为：用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对分子筛凝胶层析柱冲洗2个柱体积，再用无菌水冲洗直至pH为7.2，随后用0.01mol/L PBS溶液平衡分子筛凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在15～16ms/cm)，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤(3)所得病毒浓缩液上样，上样结束后，用洗脱液洗脱，待UV280值开始回升时，开始收集洗脱液，至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液。
上述方案中，所述分子筛凝胶层析柱层析时，病毒浓缩液上样的线性流速为45～100cm/h，压力小于2.5bar，上样量控制在10％～15％(v/v)柱体积，洗脱液为0.01mol/LPBS溶液。
本发明的有益效果：
(1)本发明解决了猪伪狂犬病毒难以实现高纯度下大规模生产的技术难题，通过中空纤维柱的澄清过滤处理、中空纤维柱的超滤浓缩纯化处理及Sepharose 4FF分子筛凝胶层析纯化处理，实现了大规模(500L～1000L)高效生产制备高纯度猪伪狂犬病毒，猪伪狂犬病毒的病毒回收率可达99.74％，杂蛋白去除率高达97％，有效抗原含量高达95.3％。
(2)本发明将中空纤维澄清过滤、中空纤维浓缩纯化和分子筛凝胶层析纯化整合并应用在猪伪狂犬病毒纯化领域，根据猪伪狂犬病毒的特性，采用特定型号/孔径的中空纤维澄清过滤预处理，选择合适型号/孔径的中空纤维柱进行超滤浓缩，最后采用特定填料组分的分子筛凝胶层析进一步纯化，在有效去除杂质的同时减少抗原流失，提高了处理效率、蛋白回收率或/和病毒回收率。
(3)本发明所述方法操作简单、成本低、处理效率高，并适合工业化大规模生产。经过纯化所得猪伪狂犬病毒的纯度高，在后期疫苗配制过程中，大大减少了抗原的使用量，既节约了成本，又从根本上解决了疫苗副反应的问题，因此，具有良好的推广前景。
(4)本发明所述猪伪狂犬病毒液纯化工艺，杂蛋白去除率高达97％，有效抗原含量高达95.3％，使由杂蛋白引起的疫苗副反应降至更低，提高了疫苗安全性的同时保持了良好的免疫原性；由于猪伪狂犬病灭活疫苗接种对象为猪群，高质量的产品大大降低接种猪群的副反应，同时为养殖户带来较高的社会效益和经济效益。
(5)本发明所述方法在相同的实验条件下，匹配相应的罐体和管道，可以进行工艺的线性放大，生产规模可以扩大到2000L、3000L、5000L，均具有可操作性。
附图说明
图1为分子筛凝胶层析柱层析纯化图谱。
图2为不同上样量的蛋白纯化图谱，其中A为上样量5％，B为上样量10％，C为上样量15％。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，所用仪器如下：
用于澄清过滤的中空纤维柱型号为：CFP-5-D-55A。
用于超滤浓缩的中空纤维柱型号为：UFP-500-E-55。
中空纤维柱澄清过滤和超滤浓缩过程中空纤维柱设备型号为VERSAFlux 120。
分子筛凝胶层析柱型号为：BPG450/1000 Column。
分子筛凝胶层析柱填料为：Sepharose 4FF凝胶层析填料。
上述仪器均购自GE公司。
所用试剂如下：300L猪伪狂犬病毒液，108.0TCID50/ml，由本公司生产部提供；
对每步所得产物分别通过A280检测蛋白含量，通过TCID50检测病毒滴度。
所述流速公式v＝1.56πr2ml/min中，r表示层析柱半径。
实施例1
一、中空纤维柱澄清工艺
1系统预处理
1.1将0.2μm、0.45μm、0.65μm中空纤维柱分别安装到中空纤维柱控制设备中，接通相应的管道，组装完毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱10min。
1.2系统完整性检测
压力保持法检测系统的完整性。
1.3系统的处理
清洗及灭菌：用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环灭菌处理30min，然后用无菌注射用水对系统进行清洗，洗去残余的碱溶液，直至pH为7.0；
1.4水通量的检测
用无菌注射用水在规定的泵速下透过，计算相应温度下中空纤维柱的水通量。
1.5中空纤维柱平衡
用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱5min。
2待澄清样品的澄清过滤过程
2.1取纯悬浮BHK细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液300L，连续流离心取上清作为待澄清的样品280L；
2.2将待澄清抗原分别通过0.2～0.65μm中空纤维柱，样品在纤维柱内循环5min后，泵速控制在40～50％(进液端流速在60～80L/min)，打开透过端，维持TMP(跨膜压)1.5～2.0psi，循环流速为78L/min，收集透过端液体；待收集透过端液体体积为200L，以1.5L/min流速连续补加80L0.01mol/L PBS溶液，继续透过，待透过样品的体积等于加入的PBS溶液体积后，再补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液，如此洗滤三次后，至残渣不能透过结束澄清过程，透过端收集的抗原500L即为病毒澄清液。
表1 猪伪狂犬病毒澄清过滤效果评价
Figure BDA0001340932770000061
表1结果表明，不同孔径的中空纤维柱对猪伪狂犬病毒的澄清效果差异显著。0.65μm的杂蛋白去除效果是最好的，但也导致病毒回收率的下降；0.2μm孔径病毒回收率是最好的，但是处理效率却是最差的。综合处理效率、杂蛋白去除率和病毒回收率三个指标，0.45μm孔径的中空纤维柱是最理想的选择。在中空纤维澄清过滤过程中，样品前期处理的澄清度越好，中空纤维柱的处理效率越高，中空纤维柱的澄清效果也直接影响了抗原浓缩的效率。
实施例2
一、中空纤维柱超滤浓缩工艺
1系统预处理
1.1将300KD、500KD、750KD中空纤维柱分别安装到中空纤维柱控制设备中，接通相
应的管道，组装完毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱10min。
1.2系统完整性检测
压力保持法检测系统的完整性。
1.3系统的处理
清洗及灭菌：用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环灭菌处理30min。然后用无菌注射用水对系统进行清洗，洗去残余的碱溶液，直至PH为7.0。
1.4水通量的检测
用无菌注射用水在规定的泵速下透过，计算相应温度下中空纤维柱的水通量。
1.5中空纤维柱平衡
用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱5min。
2病毒澄清液超滤浓缩过程
将待澄清抗原500L通过中空纤维柱，样品在纤维柱内循环5min后，打开透过端，维持TMP 14psi，循环流速为3.0L/min，透过端液体为废液，将样品进行10倍浓缩，待样品浓缩至30L，补加0.01mol/L PBS溶液30L洗滤第1次；待样品浓缩至30L，补加0.01mol/L PBS溶液30L洗滤第2次；至样品浓缩至14L，收集20倍浓缩液。加入14L 0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维10min，收集洗膜液。20倍浓缩液和洗膜液混合后即为10倍浓缩样28L。
表2 中空纤维超滤浓缩效果评价
Figure BDA0001340932770000071
表2结果表明，不同孔径的中空纤维柱对猪伪狂犬病毒的超滤浓缩的效果不尽相同。750KD中空纤维柱的杂蛋白去除效果是最好的，但病毒回收率较低；300KD孔径的空纤维柱病毒回收率最好，但是处理效率最差。从综合处理效率、杂蛋白去除率和病毒回收率三个指标，500KD孔径的中空纤维柱是超滤浓缩中最合适的孔径。
实施例3分子筛凝胶层析工艺
1系统预处理
1.1将4FF分子筛预装柱安装到位，测柱效。
1.2用无菌0.5mol/L NaOH处理分子筛凝胶层析柱2个柱体积(CV)，再用无菌注射水清洗至PH7.0，然后用0.01mol/L PBS溶液平衡离子交换柱至电导率柱前后一致(柱前和柱后电导率在15.69ms/cm)，PH稳定在7.0，紫外UV280基线平稳。
2纯化过程
将浓缩后病毒样上样，设定上样线性流速为30cm/h，压力控制小于2.0bar。上样量为5％、10％、15％柱体积，上样结束后，用0.01mol/L PBS溶液开始洗脱蛋白，待UV280值开始起峰时收集洗脱后样品，待目的蛋白峰结束UV280值下降至最低或者数值开始增加时停止收集第一洗脱峰洗脱样品。继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。收集的洗脱样品即为猪伪狂犬病毒纯化后样。
表3 猪伪狂犬病毒纯化效果评价
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 TCID<sub>50</sub>/0.1ml 病毒回收率
病毒液原样 11214 - 7.89 -
5％上样量 401 99.74％ 7.29 99.00％
10％上样量 1546 97.40％ 7.38 98.70％
15％上样量 1935 97.10％ 7.35 98.20％
*采用A280方法检测蛋白浓度及TCID50检测病毒毒价。
上表结果显示，5％上样量杂蛋白去除率高达99.74％，病毒回收率也高达99％。增加上样量杂蛋白去除率下降，病毒回收率同时下降。在大规模生产中10％～15％的上样量更加合适。
实施例4
一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
(1)抗原连续流离心取上清300L，即为待澄清样品；
(2)中空纤维柱澄清过滤：与实施例1方法相同，将300L待澄清的样品经0.45μm中空纤维柱处理，得澄清后样品450L；
(3)中空纤维柱超滤浓缩：与实施例2方法相同，将澄清后样品450L，经500KD中空纤维柱浓缩至35L，得浓缩后样品35L；
(4)分子筛凝胶层析：与实施例3方法相同，将浓缩后样品35L，以30％柱体积(33L)上样，收集洗脱后的第一个洗脱峰。
实施例5
一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
(1)抗原连续流离心取上清400L，即为待澄清样品；
(2)中空纤维柱澄清过滤：与实施例1方法相同，将400L待澄清的样品经0.65μm中空纤维柱处理，得澄清后样品600L；
(3)中空纤维柱超滤浓缩：与实施例2方法相同，将澄清后样品600L，经750KD中空纤维柱浓缩至40L，得浓缩后样品40L；
(4)分子筛凝胶层析：与实施例3方法相同，将浓缩后样品40L，以15％柱体积(16L)上样，收集洗脱后的第一个洗脱峰，共需三次上样完成纯化。
实施例6
一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
(1)抗原连续流离心取上清500L，即为待澄清样品；
(2)中空纤维柱澄清过滤：与实施例1方法相同，将500L待澄清的样品经0.45μm中空纤维柱处理，得澄清后样品750L；
(3)中空纤维柱超滤浓缩：与实施例2方法相同，将澄清后样品750L，经500KD中空纤维柱浓缩至50L，得浓缩后样品50L；
(4)分子筛凝胶层析：与实施例3方法相同，将浓缩后样品50L，以15％柱体积(16L)上样，收集洗脱后的第一个洗脱峰，共需三次上样完成纯化。
表4 实施例4～6纯化所得猪伪狂犬病毒的效果评价
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 TCID<sub>50</sub>/0.1ml 病毒回收率
实施例4 1645 92.10％ 7.89 84.50％
实施例5 1578 93.10％ 7.29 75.10％
实施例6 2005 95.00％ 7.38 95.00％
表4结果显示，猪伪狂犬病毒经过0.45μm中空纤维柱澄清过滤后，再经500KD超滤浓缩，经4FF凝胶层析以15％上样量纯化后，病毒回收率可达95％，杂蛋白去除率高达95％。这样的工艺组合在生产规模下更具有优势，既提高生产效率，又提高产品质量。
在实施例的基础上，采用相同的实验方法，匹配相应的罐体和管道，可以将生产规模扩大为2000L、3000L、5000L。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取纯悬浮BHK细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液，连续流离心取上清作为待澄清样品；
（2）将步骤（1）所得待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤，得到病毒澄清液，所述中空纤维柱的孔径为0.45μm~0.65μm，所述待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过60%~70%待澄清样品，然后补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液，继续透过，待透过样品的体积等于加入的PBS溶液体积后，再补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液，如此洗滤多次后，至残渣不能透过，收集透过端液体，得到病毒澄清液；
（3）将步骤（2）所得病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩，得到病毒浓缩液，所述中空纤维柱的孔径为500KD~750 KD，所述病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩的具体操作过程为：①维持跨膜压在10~15psi、循环流速为30 ~50L/min持续透过，待样品体积浓缩至起始体积的1/8~1/10时，补加0.01mol/L PBS溶液进行第一次洗滤，待样品体积浓缩至起始体积的1/16~1/20时，补加与样品等体积的0.01mol/L PBS溶液进行第二次洗滤，至样品再次浓缩至起始体积的1/16~1/20时，结束浓缩，收集浓缩后的液体；②用病毒澄清液起始体积1/16~1/20的0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维，收集洗膜液；③将步骤①所得浓缩后的液体与步骤②所得洗膜液混合后，即为8~10倍浓缩的病毒浓缩液；
（4）将步骤（3）所得病毒浓缩液利用分子筛凝胶层析柱层析，收集洗脱后的第一个洗脱峰，所得洗脱液即为高纯度猪伪狂犬病毒，所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose 4FF琼脂糖凝胶层析填料。
2.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2.0~3.0psi，进液端流速为60~80L/min。
3.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱层析时，病毒浓缩液上样的线性流速为45~100cm/h，压力小于2.5bar，上样量控制在10%~15%柱体积，洗脱采用的洗脱液为0.01mol/L PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱层析的具体操作过程为：用0.5mol/L NaOH溶液对分子筛凝胶层析柱冲洗，再用无菌水冲洗直至pH为7.2，随后用0.01mol/L PBS溶液平衡分子筛凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤（3）所得病毒浓缩液上样，上样结束后，用洗脱液洗脱，待UV280值开始回升时，开始收集洗脱液，至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液。
5.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱的型号为：CFP-5-D-55A；步骤（3）所述中空纤维柱的型号为：UFP-500-E-55，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱的型号为BPG450/1000 Column。
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