CN101602805A - 用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质及其制备方法 - Google Patents
用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质及其制备方法。该琼脂糖亲和介质是以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化剂活化后，偶联作为配基的手足口病疫苗，其中的琼脂糖凝胶选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL－6B、琼脂糖CL－4B、琼脂糖6B、琼脂糖4B中的一种。本发明所提供的琼脂糖亲和介质可用于纯化手足口病免疫球蛋白，具有介质选择性好，特异性强；机械强度高、利于工业放大的优点，此外，其制备工艺简单，易于放大。采用本发明制备的介质纯化手足口病免疫球蛋白，纯化方法简单易行，分离效果好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质及其制备方法和用途。
背景技术
手足口病是由EV71等肠道病毒所引起，因起病之初手、脚部位多有细小而质地较硬的疹子和溃疡性口腔炎症而得名。该病以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可以并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。人手足口病免疫球蛋白是以低温乙醇蛋白分离法或经批准的其它分离法提取，并经病毒灭活处理的特异性免疫球蛋白，用于防治手足口病。静脉注射人手足口病免疫球蛋白能有效地抑制炎症的发生，对EV71引起的中枢神经系统感染有一定的疗效，曾在1998年中国台湾和2000年澳大利亚的EV71流行中得到广泛应用。
从人血浆中分离免疫球蛋白，经典方法是E.J.Cohn教授于1946年创立的低温乙醇沉淀法，通过控制pH值、温度、蛋白浓度、离子强度和乙醇浓度来逐级沉淀血浆中的不同蛋白质。目前，手足口病免疫球蛋白的分离纯化就是采用低温乙醇沉淀法。但是，低温乙醇沉淀法的分离精度有限，只能获得多种免疫球蛋白的混合产品，产品的效价较低，常常无法达到治疗手足口病的要求。因此，急需发展一种特异性、高分离精度纯化手足口病免疫球蛋白的分离方法，将低温乙醇沉淀法制备的免疫球蛋白产品进一步纯化，提高产品的效价，从而获得高比活的合格产品。
亲和层析是利用了生命现象中生物分子之间非常特异的相互作用，进行分离纯化的方法。而利用琼脂糖作为载体，以生物活性分子为配基，利用配基与目标产物的生物学特异性，提纯目标产物已广泛应用于生物产品的纯化生产中。自从1967年Axen等人发表用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功制备固定化酶后，亲和层析在20世纪70年代有了惊人的发展，目前已得到广泛应用。例如，陈嫚等人(刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用，北京理工大学学报，2005，25(2)：172)报道了用交联琼脂糖为载体，三聚氯氰为活化剂，刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基，制备亲和层析介质的方法，用制备的亲和层析介质吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase，r-PA)，解吸附完全，不影响活性。马学华等人(亲和层析法提取纯化人心肌肌钙蛋白I，哈尔滨医科大学学报，2008，42(3)：258)报道了将兔骨骼肌肌钙蛋白C(sTnC)与经溴化氰活化的Sepharose 4B凝胶偶联，制成sTnC亲和层析介质，从人心肌经匀浆、离心后的上清液中提纯人心肌肌钙蛋白I(cTn I)，提纯的cTn I可被cTn I单克隆抗体特异性识别。
根据抗体与抗原之间高度特异性可逆结合作用，可以建立相应的亲和层析方法，这种亲和层析方法具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点。制备以手足口病疫苗为配基的手足口病免疫球蛋白亲和介质，能够从低比活的血浆组分中特异性的吸附手足口病免疫球蛋白，从而得到合格产品，有效利用血浆资源。
发明内容
本发明利用抗原抗体之间能够特异性相互作用，制备以手足口病疫苗为配基的手足口病免疫球蛋白亲和介质，能够从低比活的血浆组分中特异性的吸附手足口病免疫球蛋白。
因此，本发明的目的在于，提供一种用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质。
本发明的另一个目的在于，提供上述琼脂糖亲和介质的制备方法及其用途。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质，具有以下结构：
其中，
代表琼脂糖凝胶；R为-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-；A为手足口病疫苗；O为氧原子。
优选地，所述琼脂糖凝胶选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B和琼脂糖4B中的一种或多种。
另一方面，本发明提供制备所述琼脂糖亲和介质的方法，其是以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化剂活化后，偶联作为配基的手足口病疫苗。
优选地，所述方法包括下述步骤：1)琼脂糖凝胶的活化：在琼脂糖凝胶中分别加入环氧活化剂、氢氧化钠溶液及催化剂硼氢化钠，其中凝胶的质量份数(g)为1份，环氧活化剂的体积份数(ml)为1～3份，氢氧化钠溶液的体积份数(ml)为1～3份，硼氢化钠的质量份数(mg)为15份，在20～60℃下搅拌反应2～10小时，反应结束后，清洗，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；2)手足口病疫苗的偶联：将步骤1)所得到的环氧活化的琼脂糖凝胶加入反应瓶内，加入pH为碱性的手足口病疫苗溶液，其中环氧活化的琼脂糖凝胶(g)与手足口病疫苗溶液(ml)的配比为1～1∶1～10，在25～40℃水浴中振荡4～24小时；优选地，所述手足口病疫苗溶液的pH为8.0～14.0。
优选地，所述步骤2)还包括封闭处理的步骤：将偶联手足口病疫苗的琼脂糖凝胶抽滤，去离子水洗涤，加入pH 11.0的0.5～2mol/L的乙醇胺在25～40℃下振荡反应4～10小时；更优选地，经封闭处理的凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干。
优选地，所述琼脂糖凝胶为选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B和琼脂糖4B中的一种或多种。
优选地，所述环氧活化剂为环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、乙二醇双缩水甘油醚、1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或一缩二乙二醇双缩水甘油醚。
又一方面，本发明提供上述琼脂糖亲和介质在制备手足口病免疫球蛋白中的用途。
再一方面，本发明提供上述琼脂糖亲和介质制备手足口病免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
1)制备含有手足口病免疫球蛋白血浆样品；
2)使用琼脂糖亲和介质纯化吸附步骤1)得到的血浆样品：优选地，所述吸附条件为pH6.0～8.0的10～50mM中性缓冲液；
3)洗脱步骤2)中琼脂糖亲和介质吸附的血浆样品中的免疫球蛋白；优选地，所述洗脱条件为pH 2.0～5.0的酸性缓冲液。
优选地，上述方法还包括使用超滤、离子交换层析和/或凝胶过滤层析进一步纯化步骤3)中所洗脱的血浆样品中的免疫球蛋白。
综上所述，本发明提供了一种制备工艺安全、能够有效纯化手足口病免疫球蛋白并适合大规模生产的亲和介质，将低比活的低温乙醇沉淀组分的比活提高，达到合格产品的要求。本发明所提供的琼脂糖亲和介质，结构式如式I所示，是以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化后与手足口病疫苗偶联，制得以手足口病疫苗为配基的琼脂糖亲和介质；
式I
其中，
代表琼脂糖凝胶；R为-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-；A为手足口病疫苗。
本发明所提供的琼脂糖亲和介质的制备方法，还可以采用以下技术方案来实现：
1)活化：向100.0g琼脂糖凝胶中加入200ml环氧活化剂、100ml氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在20～60℃下搅拌反应2～10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶。所述的琼脂糖凝胶为选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B或琼脂糖4B中的一种。所述的环氧活化剂为环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、乙二醇双缩水甘油醚、1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或一缩二乙二醇双缩水甘油醚中的一种。所述的氢氧化钠溶液浓度为0.5～4mol/L。
2)偶联：100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入反应瓶内，加入pH调为碱性的手足口病疫苗溶液，25～40℃水浴中振荡4～24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺25～40℃下振荡反应4～10小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到手足口病疫苗配基亲和介质；所述的疫苗溶液pH为8.0～14.0。
本发明提供的上述琼脂糖亲和介质制备反应式如下(以环氧活化剂为1，4-丁二醇-二缩水甘油醚为例)：
(1)活化
(2)偶联
本发明提供的琼脂糖亲和介质可用于纯化手足口病免疫球蛋白，纯化时手足口病免疫球蛋白的吸附条件为pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液，洗脱条件为pH为2～5的酸性缓冲液。使用原料为(但不局限于)含有手足口病免疫球蛋白的血浆经低温乙醇沉淀或其他方法纯化后得到含有手足口病免疫球蛋白的组分。亲和层析得到的产品可以通过选用的超滤、离子交换层析或凝胶过滤层析进行进一步纯化或精制。
与现有技术相比，本发明提供的琼脂糖亲和介质及其制备方法及其在纯化手足口病免疫球蛋白中的用途，具有以下优点：
(1)琼脂糖亲和介质选择性好，特异性强。作为亲和配基的手足口病疫苗，能与手足口病免疫球蛋白特异性结合，能从低比活的原料中选择性的吸附手足口病免疫球蛋白，从而特异性的纯化手足口病免疫球蛋白，得到高比活的产品。
(2)琼脂糖亲和介质机械强度高、利于工业放大。本发明制备亲和介质的原料即琼脂糖6FF和琼脂糖4FF是半刚性琼脂糖凝胶，这种介质具有良好的亲水性，与活性蛋白有优良的生物相容性，易于保持生物活性，同时具有高流速、高分子排阻极限和良好的机械强度等特点，使用过程中最高流速可达600～800cm/小时，因而得到的介质机械强度高、通透性好，可以满足规模化生产的需要。
(3)琼脂糖亲和介质的制备工艺简单，易于放大。采用本发明制备的亲和介质纯化手足口病免疫球蛋白，纯化方法简单易行，分离效果好。以含有手足口病免疫球蛋白的血浆低温沉淀组分为原料进行亲和层析，抗体活性收率30％以上，纯化倍数在100以上。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入100ml pH 8.0手足口病疫苗(华兰生物有限公司)溶液，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例2
取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的4M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在60℃下搅拌反应4小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入200ml pH 14.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例3
取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在60℃下搅拌反应4小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入500ml pH 8.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例4
取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的4M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入1000ml pH 14.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例5
取洗净抽干的琼脂糖4FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入100ml pH 8.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的破伤风疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例6
取洗净抽干的琼脂糖4FF凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的4M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在60℃下搅拌反应4小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入200ml pH 14.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例7
取洗净抽干的琼脂糖CL-6B凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入500ml pH 8.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例8
取洗净抽干的琼脂糖CL-4B凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml的0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入1000ml pH8手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例9
取洗净抽干的琼脂糖6B凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml 0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入100ml pH 8.0的手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例10
取洗净抽干的琼脂糖4B凝胶(GE healthcare公司)100.0g，倒入1L三口烧瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、100ml0.5M氢氧化钠溶液及1.5g硼氢化钠，在25℃下搅拌反应10小时，反应结束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶剂，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；取100g环氧活化的琼脂糖凝胶用水洗涤后，抽干，加入1L三口烧瓶内，加入1000ml pH 8.0手足口病疫苗溶液(华兰生物有限公司)，37℃水浴中振荡24小时；抽滤，去离子水洗涤，加入1mol/L乙醇胺37℃下振荡反应4小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干，即得到本发明的手足口病疫苗配基亲和介质，保存于20％乙醇中。
实施例11亲和层析实验
取实施例1制备好的手足口病免疫球蛋白亲和介质10ml装入层析柱(Φ1.6cm×5cm)内。用100ml的Buffer A(pH7.0的10mM磷酸盐缓冲液)平衡后，将含手足口病免疫球蛋白的低温乙醇法血浆组分(效价1∶64)加到柱上，上样流速1ml/min。全部样品进柱后，用Buffer A洗去未被吸收的蛋白，收集穿透峰P0。待穿透峰结束后用Buffer B(1M乙酸溶液)洗脱，收集手足口病免疫球蛋白活性峰P1。各组分蛋白浓度和抗体活性分别采用Braford法(参见张龙翔等主编《生化实验方法和技术》第三章附3)和血清中和法(参见中国药典2005版附录IX I)检测。层析过程的抗体活性回收率和纯化倍数分别按下式计算，所得到的结果如表1所示。
表1血浆组分亲和层析纯化结果
| 实验编号 | 活性回收率(％) | 纯化倍数 |
| 1 | 30.5 | 103 |
| 2 | 31.3 | 116 |
Claims (10)
1、一种用于纯化手足口病免疫球蛋白的琼脂糖亲和介质，其特征在于，所述琼脂糖亲和介质具有以下结构：
其中，代表琼脂糖凝胶；R为-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-；A为手足口病疫苗；O为氧原子。
2、如权利要求1所述的琼脂糖亲和介质，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B、琼脂糖4B中的一种或多种。
3、制备权利要求1或2所述的琼脂糖亲和介质的方法，其特征在于，所述方法是以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化剂活化后，偶联作为配基的手足口病疫苗。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
1)琼脂糖凝胶的活化：在琼脂糖凝胶中分别加入环氧活化剂、氢氧化钠溶液及硼氢化钠，其中凝胶的质量份数(g)为1份，环氧活化剂的体积份数(ml)为1～3份，氢氧化钠溶液的体积份数(ml)为1～3份，硼氢化钠的质量份数(mg)为15份，在20～60℃下搅拌反应2～10小时，清洗，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；
2)手足口病疫苗的偶联：将步骤1)所得到的环氧活化的琼脂糖凝胶加入反应瓶内，加入pH为碱性的手足口病疫苗溶液，其中环氧活化的琼脂糖凝胶(g)与手足口病疫苗溶液(ml)的配比为1～1∶1～10，在25～40℃水浴中振荡4～24小时；优选地，所述手足口病疫苗溶液的pH为8.0～14.0。
5、如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)还包括封闭的步骤：将偶联手足口病疫苗的琼脂糖凝胶抽滤，去离子水洗涤，加入pH 11.0的0.5～2mol/L的乙醇胺在25～40℃下振荡反应4～10小时；凝胶依次用去离子水、0.1M pH 4.0含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水和0.1M pH 8.0含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液洗涤，水洗后抽干。
6、如权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为选自琼脂糖6FF、琼脂糖4FF、琼脂糖CL-6B、琼脂糖CL-4B、琼脂糖6B、琼脂糖4B中的一种或多种。
7、如权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述环氧活化剂为环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、乙二醇双缩水甘油醚、1，4-丁二醇-二缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或一缩二乙二醇双缩水甘油醚。
8、权利要求1或2所述的琼脂糖亲和介质在制备手足口病免疫球蛋白中的用途。
9、权利要求1或2所述的琼脂糖亲和介质制备手足口病免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
1)含有手足口病免疫球蛋白血浆样品的制备；
2)使用琼脂糖亲和介质纯化吸附步骤1)多得到的血浆样品：优选地，所述吸附条件为pH 6.0～8.0的10～50mM中性缓冲液；
3)洗脱步骤2)中琼脂糖亲和介质吸附的血浆样品中的免疫球蛋白；优选地，所述洗脱条件为pH 2.0～5.0的酸性缓冲液。
10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括使用超滤、离子交换层析或凝胶过滤层析进一步纯化步骤3)中所洗脱的血浆样品中的免疫球蛋白。
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