CN108084252A - 一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法，其将通过含羟基、氨基或巯基的咪唑啉酮类似物键合于固相载体。本发明可以直接从发酵液或细胞裂解液中一步纯化链霉亲和素，样品纯度高大于95％，载量大于10mg/ml，同时方法简单，成本低，可大规模生产，也可以多次重复使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体是一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法。
背景技术
链霉亲和素(Streptavidin)是一种来自于链霉菌的四聚体蛋白质，它具有高效结合生物素(Biotin)的能力，解离常数达到了10-14，是目前已知的最强的生物分子间的相互作用之一。链霉亲和素和生物素之间的相互作用，被广泛地用于核酸检测、单分子成像、蛋白质相互作用、临床诊断等许多方面，是生物技术关键性的一种研究手段。
链霉亲和素与亲和素相似，能与生物素特异性结合，但是与亲和素相比，链霉亲和素等电点低，不含糖基，其非特异性结合远比亲和素低，尤其在免疫组织化学和DNA分子杂交检测中，几乎无背景显色。更为关键的是：亲和素主要依靠蛋清提取，而链霉亲和素可以在大肠杆菌中进行高效基因重组表达。重组的链霉亲和素可以进行各种突变改造，获得具有不同性质的重组蛋白，例如，改变底物结合特性，获得只有单一亚基有结合功能的mono-streptavidin，获得可以结合特定肽段的streptactin蛋白，获得可以特异性结合硝酸纤维素的NC-Streptavidin，获得可以耐受胰酶降解的稳定链霉亲和素(stableStreptavidin),或者可以利用分选酶 (Sortase)催化做定向偶联的链霉亲和素。因为上述原因，目前链霉亲和素已经取代了亲和素，获得了广泛的应用，每年市场需求量都在增长。
目前，进口重组链霉亲和素的价格居高不下，1公斤的价格超过1000 万。国内已经有多家公司实现了各种链霉亲和素突变体的重组高效表达。但是由于纯化方法的差异，国产产品在活力、纯度、批次稳定性方面和世界最高质量产品有较大差异。目前链霉亲和素纯化有两种，一种是经典方法包括硫酸铵沉淀、离子交换层析，结晶等流程。另一种是亲和层析法，使用2-亚氨基生物素亲和填料，在pH在10-11范围内，两者结合紧密， pH降至4时链霉亲和素被洗脱下来。两种方法相比，亲和层析法效率更高，可以一步纯化获得99％的纯度。这种方法纯化的链霉亲和素比活力更高，稳定性更好，批次质量更可控。
亲和层析法纯化链霉亲和素使用的亲和填料，过去依赖于进口，主要的供应商是sigma公司。这种填料的进口价格极其昂贵，并且使用寿命有限。用于规模化生产，成本不可控。常州天地人和生物科技有限公司在国内率先实现了2-亚氨基生物素亲和填料的国产化。但由于使用的配基2- 亚氨基生物素需要以生物素为原料，经过多步化学反应而得，终产物得率低，使得国产填料也成本较高，不利于工业大生产应用。
因此，迫切需要筛选一种低成本的亲和配基，用于链霉亲和素纯化专用的亲和层析填料的制备。降低链霉亲和素，这种重要的蛋白质的生产成本，提高产品的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种新型链霉亲和素纯化填料，其特征在于：将通过含羟基、氨基或巯基的咪唑啉酮类似物键合于固相载体，配体的具有如下化学结构式：
其中：N≥1，R1＝-OH、-NH2、-NHR、-SH或-COOH，R2＝H、烷基、芳烃基或杂环基，R3＝H、烷基、芳烃基或杂环基。
2、根据权利要求1所述的一种新型链霉亲和素纯化填料，其特征在于：所述固相载体为聚合物微球、琼脂糖凝胶、磁性微球和多孔板表面载体。
3、根据权利要求2所述的一种新型链霉亲和素纯化填料的制备方法，其特征在于：其合成步骤如下：
1)填料活化：反应体系中琼脂糖凝胶微球占30％-50％、环氧氯丙烷占5-20％、1-2M NaOH,反应温度为20-40度，反应时间2-6小时。
2)配体偶联：在步骤1反应后的体系中加入50mg/ml咪唑啉酮类化合物的配体、0.1M Na2CO3，pH调至8-10，反应温度20-50度，反应时间8-24 小时。
3)封闭反应：在步骤2反应后的体系中加入1M乙醇胺，pH调至8.5，温度在25-40度反应1小时，然后用去离子水清洗，即得到纯化链酶亲和素的亲和吸附填料。
4、根据权利要求3所述的一种新型链霉亲和素纯化填料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的咪唑啉酮类化合物为1-(2-氨基乙基)-2- 咪唑啉酮或1-氨基咪唑烷酮。
本发明一种新型链霉亲和素纯化填料使用结果显示：
1、本发明可以直接从发酵液或细胞裂解液中一步纯化链霉亲和素，减少了样品的处理；同时本发明属于异性亲和配体，属于亲和纯化，所以样品纯度高大于95％，载量大于10mg/ml。
2、本发明方法简单，成本低，可大规模生产。
3、本发明再生性能好，经过洗脱液和平衡液清洗后，可以多次重复使用。
附图说明
图1为使用本发明实验后的电泳试验图；
图2为本发明重复实验载量变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1)填料活化：琼脂糖凝胶smartarose 4FF 100ml，加入85ml 1M NaOH， 2mg/ml硼氢化钠溶液，15ml环氧氯丙烷，,反应温度30度，反应时间2 小时。
2)配体偶联：将步骤1反应后的体系用去离子水清洗后加入5g咪唑啉酮，100ml0.1M Na2CO3,pH10，反应温度40度，反应时间24小时。去离子水清洗，收集填料。
3)封闭反应：在步骤2反应后的体系中加入1M乙醇胺，pH调至8.5，温度在30度反应1小时，然后用去离子水清洗，即得到纯化链酶亲和素的亲和吸附填料。
实施例2：
1)填料活化：琼脂糖凝胶smartarose 4FF 100ml，加入80ml 1M NaOH，2mg/ml硼氢化钠溶液，20ml环氧氯丙烷，,反应温度37度，反应时间2 小时。
2)配体偶联：将步骤1反应后的体系用去离子水清洗后加入1-氨基咪唑烷酮，100ml 0.1M Na2CO3,pH9.5，反应温度40度，反应时间24小时。
3)封闭反应：在步骤2反应后的体系中加入1M乙醇胺，pH调至8.5，温度在37度反应1小时，然后用去离子水清洗，即得到纯化链酶亲和素的亲和吸附填料。
实施例3：
1)填料活化：琼脂糖凝胶smartarose 4FF 100ml，加入90ml 2M NaOH， 2mg/ml硼氢化钠溶液，10ml环氧氯丙烷，,反应温度37度，反应时间3 小时。
2)配体偶联：将步骤1反应后的体系用去离子水清洗后加入5g1-(2- 氨基乙基)-2-咪唑啉酮，100ml 0.1M Na2CO3,pH10，反应温度40度，反应时间24小时。
3)封闭反应：在步骤2反应后的体系中加入1M乙醇胺，pH调至8.5，温度在37度反应1小时，然后用去离子水清洗，即得到纯化链酶亲和素的亲和吸附填料3。
实验1：可溶性链霉亲和素纯化
1)称取10g链酶亲和素菌体，超声破碎后取上清；
2)平衡液：50mM硼酸，0.5M NaCl，pH11.0，洗脱液50mM NaAc，pH4.0。
3)使用实施例1生产的填料进行纯化，平衡液平衡5倍柱体积，将 1)中上清上样，平衡液洗杂至无紫外吸收，然后用洗脱液洗脱。通过紫外和电泳检测填料对链酶亲和素的载量为20mg/ml,纯度大于95％。
如图1所示，这是用实验1得到的产品电泳图，3洗脱是纯化出的产品、1是原样、2是流穿蛋白，从该图可以看出，1、2原样和流穿蛋白很杂，而3洗脱纯度很高，从而证明本发明纯化后的产品纯化效果较好，纯度大于95％。
实验2：链霉素包涵体纯化
1)称取10g链酶亲和素菌体，超声破碎后取沉淀；
2)然后用10ml 6M盐酸胍溶解，透析到1L1XPBS中复性；
3)然后用实施例2生产填料纯化链酶亲和，平衡液平衡5倍柱体积，将2)中透析后样品上样，平衡液洗杂至无紫外吸收，然后用洗脱液洗脱。通过紫外和电泳检测填料对链酶亲和素的载量为15mg/ml,纯度大于95％。
实验3：重复实验
1)再生：试验用后的填料用洗脱液清洗5倍体积，再用平衡液清洗和5倍柱体积。
2)再生后的填料重复实验1，结合载量几乎无变化，再生效果好，填料可以重复使用。
如图2所示，本发明制备的填料经过再生后可以重复使用十次以上，载量基本无变化。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (4)
1.一种新型链霉亲和素纯化填料，其特征在于：将通过含羟基、氨基或巯基的咪唑啉酮类似物键合于固相载体，配体的具有如下化学结构式：
其中：n≥1，R1＝-OH、-NH2、-NHR、-SH或-COOH，R2＝H、烷基、芳烃基或杂环基，R3＝H、烷基、芳烃基或杂环基。
2.根据权利要求1所述的一种新型链霉亲和素纯化填料，其特征在于：所述固相载体为聚合物微球、琼脂糖凝胶、磁性微球和多孔板表面载体。
3.根据权利要求2所述的一种新型链霉亲和素纯化填料的制备方法，其特征在于：其合成步骤如下：
1)填料活化：反应体系中琼脂糖凝胶微球占30％-50％、环氧氯丙烷占5-20％、1-2MNaOH,反应温度为20-40度，反应时间2-6小时。
2)配体偶联：在步骤1反应后的体系中加入50mg/ml咪唑啉酮类化合物的配体、0.1MNa2CO3，pH调至8-10，反应温度20-50度，反应时间8-24小时。
3)封闭反应：在步骤2反应后的体系中加入1M乙醇胺，pH调至8.5，温度在25-40度反应1小时，然后用去离子水清洗，即得到纯化链酶亲和素的亲和吸附填料。
4.根据权利要求3所述的一种新型链霉亲和素纯化填料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的咪唑啉酮类化合物为1-(2-氨基乙基)-2-咪唑啉酮或1-氨基咪唑烷酮。
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