CN104356238B - 一种重组蛋白a亲和配基的定点固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组蛋白A亲和配基的定点固定化方法。该方法是通过基因工程手段将FGE识别基因序列插入到编码目的蛋白质的基因序列末端，构建该目的蛋白质的表达载体，再将目的蛋白质与FGE在大肠杆菌中共表达，实现目的蛋白质的胞内醛基催化转化。再通过介质表面的酰肼基团与蛋白质表面醛基的选择性反应实现定点固定化。本发明的方法能够将目的重组蛋白从细胞破碎上清中直接固定，条件温和，步骤简单，大大减少固定化的时间与成本。

Description

一种重组蛋白A亲和配基的定点固定化方法

技术领域

本发明属于蛋白质固定化领域，涉及一种蛋白质亲和配基的定点固定化方法，尤其涉及一种重组蛋白A亲和配基的定点固定化方法。

背景技术

近些年来，单克隆抗体类药物发展迅猛，从1986年美国FDA批准第一个抗体类药物上市至2013年，已经有38个抗体类药物成功上市。目前，在20种销售额超过20亿美元的生物药物中，单抗药物占8种，并呈现逐年上升的趋势。除了已经上市的单抗药物外，还有大量的单抗处于临床研究中，这些单抗药物治疗疾病类型主要涉及恶性肿瘤、类风湿关节炎等自身免疫性疾病及器官移植后的排斥反应等，由于单抗药物针对特异性的疾病靶点，因此与化疗药物相比，治疗效果更为显著，副作用更低，临床应用前景十分广阔。

目前抗体类药物在应用过程中存在的主要问题是售价昂贵，每支抗体类药物往往售价在万元以上，导致使用人群受限。这种情况发生的原因是抗体的生产过程复杂，生产成本高。其生产成本主要集中在分离纯化模块，该模块约占总生产成本的60％～70％，其中，用于抗体分离的基因重组蛋白A亲和吸附填料售价昂贵是导致分离成本高的重要原因。目前美国GE公司蛋白A亲和吸附填料的售价每升高于10万元人民币，使用30个循环就需要更换填料，抗体分离纯化的费用主要集中于此。由于几乎所有的单克隆抗体都需要采用蛋白A亲和色谱柱捕获粗料液中的抗体组分，随着单抗产业规模日益扩大，其对蛋白A色谱基质的性能将有更高的要求，提高蛋白A亲和色谱柱的性能、降低生产成本对于降低抗体类药物的价格至关重要。

蛋白A亲和色谱填料的制备成本与蛋白A售价及蛋白A与基质偶联后其活性损失密切相关。蛋白A(protein A)为金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，具有5个能够与抗体Fc段特异性结合的结构域，作为亲和色谱的配基具有特异性识别和捕捉抗体的能力。目前亲和色谱所用蛋白A均采用基因工程方法生产，一般采用重组肠杆菌发酵生产，在经过细胞破碎、柱层析等一系列分离纯化步骤后才能获得高纯度的基因重组蛋白A，生产过程复杂，成本较高。目前每克基因重组蛋 白A的售价为500-700美元，主要生产成本集中在柱层析精分离段，每升蛋白A色谱填料需要15-20克的基因重组蛋白A，高的生产成本导致基因重组蛋白A售价昂贵，使得蛋白A亲和吸附填料的售价居高不下。此外，蛋白A与基质的化学偶联方式往往会导致固定化到固相色谱基质上的蛋白A不同程度的丧失其结合抗体的能力。传统的固定化方法主要利用蛋白A表面的氨基与固相基质表面的化学基团(如醛基或N-羟基琥珀酰亚胺)进行化学交联，但蛋白A表面含有多个氨基，这就造成蛋白A的随机多点固定化，使蛋白A朝向不固定，部分活性位点丧失功能，固定化单位蛋白A能力的降低导致蛋白A亲和色谱填料对抗体吸附容量降低。为了提高固定化蛋白A的抗体结合能力，目前商品化的蛋白A亲和色谱填料主要采用基因重组时在蛋白A的C末端加上1～3个半胱氨酸，由于蛋白A本身不含有巯基，可以利用巯基与载体表面基团(如琥珀酰亚胺)反应实现固定化，此方法能够实现蛋白A末端的定点固定化，提高了单位固定化蛋白A的抗体吸附量。但由于巯基的存在，需要提供还原反应环境以防止形成二硫键造成的蛋白A之间的聚集，使得反应条件的控制变得非常重要。同时，末端巯基这种固定化方式仅适用于蛋白A这种蛋白质序列中不含有半胱氨酸及二硫键的特殊蛋白质，对于含有二硫键的蛋白质，还原的固定化条件会导致蛋白质配基自身二硫键的破坏，使其还原为巯基而参与反应，不仅会导致多点连接，也会破坏蛋白质配基的三维构象从而降低其与目标物的结合能力。因此，寻找新的蛋白质表达方式及定点固定化方法对于降低亲和色谱填料的成本并提高其性能至关重要。而探索蛋白A表达方式及定点固定化方法对于降低抗体类药物的售价至为关键。

甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine generating enzyme,FGE)是一种能够将蛋白质特定序列上的半胱氨酸催化为甲酰甘氨酸的酶。该酶于2003年在硫酸酯酶的转录后活化机制中被发现(Dierks T,et al.Cell,2003,113(4):435-444)该酶的功能主要体现在：在生物体内，FGE能够催化Ⅰ型硫酸酯酶上13个或6个保守氨基酸序列中的半胱氨酸变成甲酰甘氨酸，使其在这种非同寻常的翻译后或翻译中修饰中衍生出一个醛基，这一特性对于硫酸酯的进一步代谢至关重要。目前，还没有FGE应用于蛋白A或其他蛋白质分离或固定化系统中的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有以蛋白质为配基的亲和色谱填料存在的关键原料 蛋白质类配基生产成本高、末端巯基定点固定化所用的还原环境会破坏蛋白质自身的二硫键，同时蛋白质自身的巯基同样会参与反应从而影响定点固定化效果等共性问题，提供了一种蛋白质亲和配基的定点固定化方法，该方法无需精细纯化重组蛋白质，从粗料液中直接定点固定化蛋白质配基。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种蛋白质亲和配基的定点固定化方法，包括以下步骤：

(1)蛋白质基因序列末端加入SEQ ID NO.1所示的基因序列，得到的基因序列连接入表达载体I中，得目的蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)得到的目的蛋白表达载体和连接入FGE蛋白基因序列的表达载体II同时转化至宿主细胞，诱导蛋白表达；

(3)收集菌体，破碎菌体后离心，得细胞上清液；

(4)将步骤(3)得到的细胞上清液和带有活性酰肼基或氧氨基的固相色谱基质混合，加入催化剂，在pH 4～7、25～40℃下反应12～14小时，其中所述的催化剂为苯胺或苯胺衍生物。

在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的蛋白质基因序列末端为5’末端或3’末端。

在上述所有技术方案中，在步骤(1)中所述的蛋白质基因序列优选为编码蛋白A的基因序列。编码蛋白A的基因序列优选采用在全长基因中去掉编码信号肽及膜结合域后的，包括A、B、C、D、E五个抗体Fc段结合域的基因序列，基因全长为888bp，由SEQ ID NO.2所示。

在上述所有技术方案中，所述的表达载体I和表达载体II的抗生素抗性不同。其中载体I优选卡那霉素抗性，载体II优选氨苄霉素抗性；所述的表达载体Ⅰ优选pET28a，表达载体Ⅱ优选pBAD。表达载体I和表达载体II的抗生素抗性不同，当培养基中含有一定浓度的两种抗生素时，有利于防止两种质粒的丢失，因为丢失了其中一种或两种质粒的菌体会被培养基中的抗生素杀死。

在上述所有技术方案中，步骤(2)中所述的宿主细胞优选为大肠杆菌菌株，大肠杆菌菌株优选BL21(DE3)。

在上述所有技术方案中，在步骤(4)中所述的细胞上清液和带有活性酰肼基团的固相色谱基质的体积比为1:1～1:3；所述的催化剂在反应体系中的浓度为50～100mM，优选为100mM。步骤(4)的反应中加入苯胺或苯胺衍生物作为 催化剂提高反应速率，其中，pH优选4.0，反应温度优选37℃，催化剂优选苯胺。

在上述所有技术方案中，在步骤(4)中所述的固相色谱基质为琼脂糖凝胶、硅胶和有机聚合物微球。在本发明中对所述琼脂糖凝胶、硅胶以及有机聚合物微球的粒径、浓度等不予具体限定，可以使用本领域常使用的适用于分离蛋白质以及单克隆抗体的所述固相色谱基质的粒径、浓度范围内适当选择使用。所述有机聚合物微球优选采用聚苯乙烯微球、聚乙烯醇微球等。

在本发明的技术方案中，在步骤(2)中所述的诱导蛋白表达，可以根据载体的诱导体系，选用常规方法诱导。表达载体I和表达载体II的蛋白诱导表达体系可以相同，也可以不同。但本发明优选采用蛋白诱导表达体系不同的表达载体I和表达载体II，且可以首先诱导表达载体II中的FGE蛋白，继而诱导表达载体I中的目的蛋白，这样有利于控制FGE的表达量以降低对目的蛋白表达的影响，而且先表达FGE能使后续表达的目的蛋白都得到催化，提高醛基的转化效率。表达载体Ⅰ为pET28a，表达载体Ⅱ为pBAD时，步骤(2)中所述的诱导蛋白表达的方法为：同时转化入目的蛋白表达载体和连接入FGE蛋白基因序列的表达载体II后的宿主细胞，先在30～38℃下加入阿拉伯糖诱导FGE蛋白的表达，优选37℃，表达时间控制在1～5小时，优选2小时、再将温度降至18～30℃，优选20℃，加入IPTG再诱导蛋白A表达12～16小时。

本发明中，所述的蛋白质基因序列是指编码该蛋白质的核苷酸序列。如蛋白A基因序列是指编码蛋白A的核苷酸序列。

本发明的上述的制备方法制备得到醛基化标签蛋白定点固定化的亲和色谱填料，该亲和色谱填料可以应用于血浆中抗体的分离纯化，经一次分离，每毫升获得纯度达到90％的抗体10～15mg。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

1.本发明将FGE与带有其催化反应特定序列的目的蛋白共表达，使目的蛋白在表达过程中实现定点醛基化修饰，该醛基不能与蛋白质上的氨基发生稳定的希夫碱反应，仅能和特定的酰肼基或氧氨基形成稳定的化学键，利用这一特点实现了细胞破碎上清液中带醛基标签的目的蛋白(如蛋白A)的直接定点固定化，该方法省去了在蛋白A生产中占成本主导地位的分离纯化步骤，显著降低了蛋白A亲和色谱填料的生产成本，对降低抗体类药物的售价具有重要意义。

2.本发明选择蛋白质配基上唯一的醛基在温和的反应条件下实现了定向固定化，避免了现有末端巯基定向固定化方法所用的还原环境破坏蛋白质自身的二硫键，同时蛋白质自身的巯基同样会参与反应从而影响定点固定化效果等缺陷，提高了单位固定化蛋白质配基的吸附效率。

附图说明

图1为蛋白A胞内醛基化修饰程度检测SDS-PAGE电泳图。其中，图1A为SDS-PAGE电泳凝胶的考马斯亮蓝染色结果；图1B为SDS-PAGE电泳凝胶的荧光成像结果。图1A和图1B中，泳道M：蛋白质标准分子量，泳道1：不含FGE识别序列的高纯度蛋白A与荧光分子反应后的上清液；泳道2：FGE与携带FGE识别序列蛋白A共表达的细胞破碎上清；泳道3：FGE与携带FGE识别序列蛋白A共表达的细胞破碎上清液与荧光分子反应后的上清液；泳道4：单表达携带FGE识别序列蛋白A的细胞破碎上清；泳道5：单表达携带FGE识别序列蛋白A的细胞破碎上清与荧光分子反应后的上清液。

图2为固定化蛋白A的纯度检测SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：细胞破碎上清液，泳道2：不使用催化剂固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道3：使用100mM苯胺催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道4：使用10mM对苯二胺催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道5:使用5mM 3,5-二氨基苯甲酸催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清。

图3为利用醛基化标签蛋白A定点固定化亲和色谱填料分离人血清免疫球蛋白的结果数据。其中，图3A为分离色谱图，其中：1：流穿液色谱峰；2：1M NaCl洗脱液色谱峰；3：pH2.5柠檬酸洗脱液色谱峰。图3B为各色谱峰收集液的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道S：人血清；泳道1：流穿液；泳道2：1M NaCl清洗的洗脱液；泳道3：pH 2.5柠檬酸洗脱液。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1.定点醛基化修饰蛋白A的制备

1.载体的构建和转化筛选：

蛋白A基因序列：蛋白A的全长基因中去掉信号肽及膜结合域，将A、B、C、D、E五个抗体Fc段结合域的基因序列作为蛋白A的基因序列，全长为888bp，如SEQ ID NO.2所示。

通过两轮PCR扩增，将如SEQ ID NO.1所示的FGE识别的特定序列插入到蛋白A基因序列的5’末端，具体方法为：

(1)所用引物名称以及其序列如表1，划线部分为酶切位点。

表1.引物名称以及其序列

(2)PCR

第一轮PCR：蛋白A基因序列通过Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点连接在pET23a质粒中，得质粒pET23a-PA，以质粒pET23a-PA为模板，CTF128F01和CTF128R01分别作为上游引物和下游引物，按照宝生物工程(大连)公司的HS DNA Polymerase试剂盒所述的步骤进行第一轮PCR扩增反应，反应体系为50μL，体系组成如下：

反应条件：98℃预变性5min，然后按照以下参数循环30次：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。将上述PCR产物命名为CTF128-PCR产物Ⅰ，进行1％琼脂糖凝胶电泳后，对其进行切胶回收， 回收后的产物(CTF128-PCR产物Ⅰ)作为第二轮PCR的模板。

第二轮PCR：以CTF128-PCR产物Ⅰ为模板，CTF128F02和CTF128R01分别作为上游引物和下游引物，进行PCR扩增反应，反应体系为50μL，体系组成如下：

反应条件：98℃预变性5min，然后按照以下参数循环30次：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。将上述PCR产物命名为CTF128-PCR产物Ⅱ(如SEQID NO.4)，进行1％琼脂糖凝胶电泳后，对其切胶回收，然后用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后与pET28a连接。得连接有醛基化标签蛋白A基因的表达载体Ⅰ(简称载体Ⅰ)。

将来源于结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的FGE基因序列(GeneID：888346，SEQ ID NO.3所示)与具有氨苄青霉素抗性的pBAD载体相连接，得连接有FGE蛋白基因的载体Ⅱ(简称载体Ⅱ)。将载体Ⅰ与载体Ⅱ同时转入至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，筛选阳性克隆，得到了含有上述两种载体的基因工程表达菌株。

2.诱导表达：将1中得到的菌株接种于含有氨苄青霉素与卡那霉素的LB培养基中，37℃下培养至菌体密度到OD₆₀₀＝1.0，加入0.02％阿拉伯糖诱导FGE表达2小时，通过SDS-PAGE对全菌蛋白进行电泳分析，37℃、诱导2小时有利于基因重组菌的生长及FGE的表达。诱导FGE表达2小时后降低培养温度到18～30℃，同时加入0.25mM IPTG诱导蛋白A表达14小时，由于FGE的催化发生在蛋白质的翻译过程中，所以蛋白A的表达以及折叠速率对FGE的催化效率影响较大，低温能够降低蛋白A的表达与折叠速率，延长FGE与其识别序列的接触时间，显著提高醛基转化率。通过对比在不同温度下蛋白A的表达量与 醛基转化效率，确定在20℃下诱导蛋白A表达能够更好的结果。

3.蛋白A胞内醛基化修饰程度的检测：在5L发酵罐中将共表达菌株在37℃、LB培养基中培养到菌体密度到OD₆₀₀＝1.0，加入0.02％阿拉伯糖诱导FGE表达2小时，将温度降低到20℃，0.25mM IPTG诱导蛋白A表达14小时，离心收集上述菌体，加入裂解缓冲液(25mM PBS，pH 7.0,60mM NaCl)充分重悬，在冰水浴中进行超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，得到含有醛基化蛋白A的上清液。向细胞破碎上清液中加入过量的含有酰肼的荧光黄(luciferyellow CH)分子对醛基标签蛋白进行标记，在37℃反应6小时以上，膜洗滤除去未反应的荧光分子单体，通过对SDS-PAGE电泳(图1)的考马斯亮蓝电泳图(图1A)和荧光电泳图(图1B)的比对，检测目的蛋白的醛基化修饰程度。从图1中可以看出：荧光标记的FGE与携带FGE识别序列蛋白A共表达菌体的细胞破碎上清液(图1A泳道3)和荧光标记的单表达携带FGE识别序列蛋白A的菌体细胞破碎上清液(图1A泳道5)均有荧光标记蛋白A条带出现，图1B泳道3的蛋白A条带的宽度与图1A同一泳道的相当，荧光很强，说明在共表达体系中，FGE对蛋白A携带的FGE识别位点具有较高的醛基化催化效率。泳道5的电泳结果说明，大肠杆菌中含有少量的类FGE活性蛋白，仍具有催化单表达携带FGE识别序列蛋白A的能力，同时，处于图1A、B上方亮度较弱的条带为宿主蛋白与荧光分子反应后产生的。在对照实验中(泳道1)，不含有FGE识别序列的天然蛋白A并没有荧光，这表明蛋白A不会非特异性结合荧光分子。虽然大肠杆菌含有内源性的类FGE活性蛋白，但是识别序列来源于结核分枝杆菌具有保守性，单表达含有FGE识别序列的蛋白A，其醛基转化率较低，而通过与FGE共表达，醛基转化率显著增加。

实施例2.表面酰肼功能化琼脂糖凝胶微球的制备：

带有活性酰肼基团的固相色谱基质制备方法包括采用环氧氯丙烷活化、加入双氨基试剂环氧开环，进一步加入双醛基试剂形成带有活性醛基的色谱基质，最后利用双酰肼试剂与色谱基质上醛基反应，形成带有活性酰肼基团的固相色谱基质。其中双氨基试剂优选二氨丙基亚胺，双醛基试剂优选戊二醛，双酰肼试剂优选己二酸二酰肼。具体方法如下：

(1)环氧氯丙烷活化：取10mL Sepharose CL-4B，用单蒸水清洗3-5次，抽干放置于50mL的三角瓶。加入1mL环氧氯丙烷、6mL DMSO和2mol/L的 NaOH溶液4mL，封口后放入摇床(38℃，170rpm)反应2h。先后用50％丙酮洗5次、丙酮洗5次、单蒸水清洗10次，得到经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶。

(2)连接二氨丙基亚胺：取活化后的琼脂糖凝胶10mL，加入5mL二氨丙基亚胺和10mL水，用1mol/L NaOH调节pH＝13，封口后放入摇床(50℃，170rpm)反应2h。反应结束后依次用单蒸水抽滤清洗5次和硼酸缓冲液(0.15mol/L，pH 8.2)抽滤清洗3次。

(3)连接戊二醛：取步骤(2)中反应、清洗得到的琼脂糖凝胶10mL，加入4mL 50％戊二醛和10mL硼酸缓冲液(0.15mol/L，pH 8.2)，封口后放入摇床(30℃，170rpm)反应2h。反应结束后用1mol/L醋酸溶液、单蒸水和硼酸缓冲液抽滤清洗。

(4)连接己二酸二酰肼：称取0.35g己二酸酰肼溶于10mL硼酸缓冲液，与步骤(3)中反应、清洗得到的琼脂糖凝胶10mL混合，封口后放入摇床(30℃，170rpm)反应2h。反应结束后用单蒸水清洗，获得的酰肼功能化琼脂糖凝胶于4℃保存在20％乙醇溶液中。

实施例3.醛基蛋白A的直接定点固定化

取4mL实施例2中的酰肼功能化琼脂糖凝胶，分为四等份，每份1mL，分别加入1mL实施例1中的细胞破碎上清，为了考察不同催化剂对酰肼与醛基反应的催化效果，分别向反应体系中加入100mM苯胺、10mM对苯二胺、5mM3,5-二氨基苯甲酸作为催化剂，加入PBS作为对照，37℃反应12小时后离心收集固相基质，用含有1M NaCl的PBS洗涤固相基质3次，洗去非特异性结合的蛋白。得到定点固定化蛋白A的色谱基质，在4℃下保存在含有0.02％叠氮钠的PBS溶液中。进一步采用200mM的盐酸羟胺，在pH 7.0且含有100mM苯胺的条件下反应切断酰肼与醛基，切下固定化的蛋白并进行电泳分析，结果如图2所示。图2所示，通过灰度扫描估测凝胶上蛋白A的固定量和纯度，图2中：泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：细胞破碎上清液，泳道2：不使用催化剂固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道3：使用100mM苯胺催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道4：使用10mM对苯二胺催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清；泳道5:使用5mM 3,5-二氨基苯甲酸催化固定化后的盐酸羟胺洗脱上清。结果表明：仅有苯胺(泳道3)作为催化剂的体系在凝胶上固定化蛋白A 的量最多，纯度也较高。针对在不同浓度的苯胺的催化效率进行优化，以100mM作为最优苯胺浓度，能够实现最高固载量，同时不损坏蛋白A的活性。

实施例4.醛基固定化蛋白A琼脂糖凝胶从人血清中分离人免疫球蛋白(hIgG)

取1mL实施例3中的醛基固定化蛋白A琼脂糖凝胶装入内径为6.6mm的玻璃层析柱，将层析柱、恒流蠕动泵、紫外检测器连接，紫外检测器检测信号设定在280nm。用5～10倍柱体积的平衡缓冲液(10mM PBS，pH 7.4，154mM NaCl)冲洗吸附柱。取新鲜人血清2mL缓慢上样，接着用平衡缓冲液冲洗直到280nm吸光值回归基线并稳定为止，再用2～4倍柱体积的清洗缓冲液(10mM PBS，pH 7.4，1M NaCl)清洗吸附柱，收集清洗峰，最后用2～4倍柱体积的洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH 2.5)洗脱，收集洗脱峰，将对应色谱峰收集样品通过SDS-PAGE电泳分析其组成，具体结果如图3B所示，其中，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道S：人血清；泳道1：流穿液；泳道2：1M NaCl清洗的洗脱液；泳道3：pH2.5柠檬酸洗脱液。图3A为各收集洗脱峰的分离色谱图，其中：1：流穿液色谱峰；2：1M NaCl洗脱液色谱峰；3：pH2.5柠檬酸洗脱液色谱峰。从图3可以看出，醛基固定化蛋白A琼脂糖凝胶对血清中的杂蛋白有一定的非特异吸附，这主要源于琼脂糖凝胶表面仍然残余少量未反应的酰肼，但通过含1M NaCl的PBS缓冲液冲洗，绝大部分已经获得洗脱，利用pH 2.5的柠檬酸洗脱可获得纯度达到90％以上的抗体。这说明，采用醛基蛋白A直接定点固定化的方式制备的亲和色谱填料可以用于抗体的分离纯化，由于该方法省去了蛋白A配基的精分离纯化步骤，必将显著降低抗体类药物的生产成本，具有良好的应用前景。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种蛋白质亲和配基的定点固定化方法，其特征在于，该定点固定化方法包括如下步骤：

(1)蛋白质基因序列末端加入SEQ ID NO.1所示的基因序列，得到的基因序列连接入表达载体I中，得目的蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)得到的目的蛋白表达载体和连接入FGE蛋白质基因序列的表达载体II同时转化至宿主细胞，诱导蛋白表达；

(3)收集菌体，破碎菌体后离心，得细胞上清液；

(4)将步骤(3)得到的细胞上清液和带有活性酰肼基或氧氨基的固相色谱基质混合，加入催化剂，在pH 7、25～40℃下反应12～14小时，其中所述的催化剂为苯胺；

在步骤(1)中所述的蛋白质基因序列为编码蛋白A的基因序列；

在步骤(4)中所述的细胞上清液和带有活性酰肼基或氧氨基的固相色谱基质的体积比为1:1～1:3；所述的催化剂在反应体系中的浓度为50～100mM。

2.根据权利要求1所述的定点固定化方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的蛋白质基因序列末端为5’末端或3’末端。

3.根据权利要求1所述的定点固定化方法，其特征在于，所述的表达载体I和表达载体II的抗生素抗性不同。

4.根据权利要求1所述的定点固定化方法，其特征在于，所述的表达载体I和表达载体II的蛋白诱导表达系统不同。

5.根据权利要求1所述的定点固定化方法，其特征在于，所述的表达载体I为pET28a，表达载体Ⅱ为pBAD。

6.根据权利要求1所述的定点固定化方法，其特征在于，在步骤(4)中所述的固相色谱基质为琼脂糖凝胶、硅胶和有机聚合物微球。