CN107108701A - 修饰的κ轻链‑结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含消化链球菌(Peptostreptococcus)蛋白L的突变结合结构域的κ轻链‑结合多肽，其中由SEQ ID NO:2‑6或12定义的，或与SEQ ID NO:2‑6或12具有至少95%或98%的序列同源性的亲本结构域的至少一个天冬酰胺残基，已经突变为另一个并非天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基。

Description

修饰的κ轻链-结合多肽
发明领域
本发明涉及亲和色谱领域，并且更特别地涉及包含蛋白L的κ轻链-结合结构域的多肽，其可用于许多类型的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的亲和色谱。本发明还涉及含有所述多肽的分离基质和使用这样的分离基质的分离方法。
发明背景
免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求，以及由此的价值，已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。
亲和色谱，通常在包含葡萄球菌蛋白A或其变体的基质上，通常被用作在完整免疫球蛋白分子的纯化中的关键步骤之一。蛋白A对免疫球蛋白的Fc链的高选择性结合提供一个对杂质和污染物具有很高的清除作用的通用步骤。
对于抗体片段，例如Fab、单链可变片段(scFv)、双-特异性T-细胞衔接子(BiTE)、结构域抗体等，其缺乏Fc链但具有1、3或4子类κ轻链，包含源自大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的蛋白L的基质(B Åkerström, L Björck: J. Biol.Chem. 264, 19740-19746, 1989；W Kastern et al: J. Biol. Chem. 267, 12820-12825, 1992；B H K Nilson et al: J. Biol. Chem. 267, 2234-2239, 1992和美国专利6,822,075)显示作为提供所需的高选择性的纯化平台的巨大前景。美国专利6,822,075中公开的蛋白L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1加上在N-末端的另外的AVEN序列。
SEQ ID NO: 1 (蛋白L)
KEETPETPETD SEEEVTIKAN LIFANGSTQT AEFKGTFEKA TSEAYAYADT LKKDNGEYTVDVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADALKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEATAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQTAEFKGTFAEA TAEAYRYADL LAKENGKYTA DLEDGGYTIN IRFAGKKVDEKPEE
蛋白L基质是可作为CaptoTM L从GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden (CaptoL data file 29-0100-08 AC, 2014)经商业获得的，并可被用来分离含κ轻链的蛋白例如完整抗体、Fab片段、scFv片段、结构域抗体等。由健康人产生的约75%的抗体具有κ轻链，并且许多治疗性单克隆抗体和抗体片段含有κ轻链。
任何生物处理色谱应用需要全面注意污染物的明确去除。这样的污染物可以是例如在色谱程序中吸附于固定相或基质的非-洗脱的分子，例如非-期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质除去这样的污染物通常在首次洗脱期望的产物后执行，以在后续使用之前再生基质。这样的除去通常涉及称为原位清洗(CIP)的程序，其中能够从固定相洗脱污染物的试剂被使用。一类常常与色谱介质一起使用的这样的试剂是在基质上通过的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是NaOH，并且理想的是以范围从0.05至最多例如1 M的浓度使用，这取决于污染的程度和性质。然而，与例如蛋白A比较，蛋白L是一种对碱相当敏感的蛋白并且在大量的周期后仅耐受至多约15mM NaOH。这意味着另外的、不太理想的清洁溶液，例如尿素或胍鎓盐，也可能必须使用，以确保足够的清洁。
一项广泛的研究较早地专注于基因工程蛋白A配体的开发，所述配体表现出耐碱性pH-值的改进能力。例如，WO2003/080655A1公开了具有特定的天冬酰胺突变的蛋白A结构域是比天然蛋白显著更加碱稳定的。
因此，本领域仍有获得含有蛋白L-衍生的配体的分离基质的需要，所述配体具有对碱性清洁程序的改进的稳定性。
发明概述
本发明的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用如在权利要求1中定义的多肽实现。
一个优点是碱稳定性比蛋白L和亲本多肽有改善。一个进一步的优点是本发明的多肽保持对蛋白L证实的对含κ轻链的蛋白的高选择性结合。
本发明的第二个方面是提供一种编码具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的核酸或载体。这用如在权利要求中定义的核酸或载体实现。
本发明的第三个方面是提供一种能够表达具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的表达系统。这用如在权利要求中定义的表达系统实现。
本发明的第四个方面是提供一种能够选择性地结合含κ轻链的蛋白并表现出改进的碱稳定性的分离基质。这用如在权利要求中定义的分离基质实现。
本发明的第五个方面是提供一种分离含κ轻链的蛋白的有效和经济的方法。这用如在权利要求中定义的方法实现。
本发明的更合适的实施方案在从属权利要求中描述。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用，并被理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“κ轻链-结合多肽”和“κ轻链-结合蛋白”在此分别指能够结合抗体的1、3或4子类κ轻链(也称为VκI、VκIII和VκIV，如在B H K Nilson et al: J. Biol. Chem. 267,2234-2239, 1992中)的多肽或蛋白，并包括例如蛋白L，及其已维持所述结合特性的任何变体、片段或融合蛋白。
术语“含κ轻链的蛋白”被用作“含免疫球蛋白κ轻链的蛋白”的同义词，并且在此意指包含从抗体衍生的1、3或4子类κ轻链(也称为VκI、VκIII和VκIV，如在B H K Nilson et al:J. Biol. Chem. 267, 2234-2239, 1992中)的蛋白，并包括含有1、3或4子类κ轻链的任何完整抗体、抗体片段、融合蛋白、缀合物或重组蛋白。
附图简述
图1显示如在US 6,822,075和W Kastern et al: J Biol. Chem. 267, 12820-12825,1992中描述的蛋白L的5个κ轻链-结合结构域的比对。
图2显示蛋白L的不同κ轻链-结合结构域的碱稳定性。
图3显示蛋白L的突变κ轻链-结合结构域的碱稳定性。
图4显示包含4个结构域的蛋白L配体的碱稳定性。
图5显示与蛋白L比较，蛋白L的突变二聚体、四聚体和六聚体κ轻链-结合结构域的碱稳定性。
实施方案的详细描述
一方面，本发明公开一种κ轻链-结合多肽，其包含大消化链球菌蛋白L的一个或多个结合结构域，或基本由大消化链球菌蛋白L的一个或多个结合结构域组成，其中这些结构域的每一个选自结构域2、结构域3和结构域4。结构域2可具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:12定义的氨基酸序列，或它可具有与SEQ ID NO:3或12至少90%，例如至少95%的序列同源性。SEQID NO: 12是SEQ ID NO: 3的变体，具有在第31位的丙氨酸。结构域3可具有由SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列，或它可具有与SEQ ID NO:4至少90%，例如至少95%的序列同源性。结构域4可具有由SEQ ID NO:5定义的氨基酸序列，或它可具有与SEQ ID NO:5至少90%，例如至少95%的序列同源性。
在多肽的一些实施方案中，每个结构域选自结构域3和结构域4，或每个结构域是结构域3。特别地，多肽可包含结构域3的多聚体或基本由结构域3的多聚体组成。
在一些实施方案中，至少两个结构域选自结构域2、结构域3和结构域4，或选自结构域3和结构域4。
在某些实施方案中，多肽不含消化链球菌蛋白L的任何结构域1。结构域1可具有由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列，或它可具有与SEQ ID NO:2至少90%，例如至少95%的序列同源性。
在多肽的某些实施方案中，在一个或多个，例如全部的结合结构域中，至少在对应于SEQ ID NO:2-5的第45位的位置的氨基酸(例如在SEQ ID NO: 2-5或12的第45位的氨基酸)已突变为不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。第45位的氨基酸可以例如被突变为丙氨酸。
在多肽的一些实施方案中，在一个或多个，例如全部的结合结构域中，至少在对应于SEQ ID NO:2-5的第10位的位置的氨基酸(例如在SEQ ID NO: 2-5或12的第10位的氨基酸)已突变为不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。第10位的氨基酸可以例如被突变为谷氨酰胺。
在多肽的某些实施方案中，在一个或多个，例如全部的结合结构域中，至少在对应于SEQ ID NO:2-5的第60位的位置的氨基酸(例如在SEQ ID NO: 2-5或12的第60位的氨基酸)已突变为不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。第60位的氨基酸可以例如被突变为谷氨酰胺。
特别地，一个或多个，例如全部的结合结构域可具有选自N10Q；N45A；N60Q；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q，或者选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q和N10Q,N45A,N60Q的突变。
在多肽的一些实施方案中，在一个或多个，例如全部的结合结构域中，至少在对应于SEQ ID NO:2-5的第19位的位置的氨基酸(例如在SEQ ID NO: 2-5或12的第19位的氨基酸)已突变为不是谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸。第19位的氨基酸可以例如被突变为谷氨酸或丙氨酸。特别地，一个或多个，例如全部的结合结构域可具有选自Q19E和Q19A的突变。
在多肽的某些实施方案中，一个或多个，例如全部的所述结合结构域具有选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14定义的序列的氨基酸序列。或者，一个或多个，例如全部的所述结合结构域可具有选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11定义的序列的氨基酸序列。多肽还可在N-末端包含多个氨基酸残基，所述残基源自克隆过程或构成来自裂解的信号传导序列的残基。另外的氨基酸残基的数目可以例如是15个或更少，例如10个或更少，或5个或更少。作为一个特定的实例，多肽可在N-末端包含AQV序列。
SEQ ID NO: 7 (结构域3, N45A突变)
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 8 (结构域3, N10Q,N45A突变)
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 9 (结构域3,N45A,N60Q突变)
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 10 (结构域3, N10Q, N60Q突变)
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 11 (结构域3, N10Q,N45A,N60Q突变)
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 12 (结构域2的变体)
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA AAEAYRYADA LKKDNGEYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 13 (结构域3, Q19A突变)
PKEEVTIKAN LIYADGKTAT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 14 (结构域3, Q19E突变)
PKEEVTIKAN LIYADGKTET AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
在某些实施方案中，多肽是包含如由上文公开的任何实施方案所定义的多个突变或非-突变结构域，或基本由如由上文公开的任何实施方案所定义的多个突变或非-突变结构域组成的多聚体。多聚体可以例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。它可以是同源多聚体，其中多聚体中的所有单位是相同的，或它可以是异源多聚体，其中至少一个单位不同于其它的。有利地，多聚体中的所有单位，例如通过包含以上公开的突变，是碱稳定的。结构域可通过结构域的C-和N-末端之间的肽键彼此直接连接。或者，多聚体中的两个或更多个单位可通过包含寡聚或多聚种类的元件，例如包含至多15或30个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的元件连接。这样一种连接的性质应该优选不会破坏结构域的空间构象的稳定性。这可例如通过避免在连接中存在半胱氨酸来实现。而且，所述连接还应该优选在碱性环境中是足够稳定的，不损害结构域的特性。为此目的，如果连接不含天冬酰胺，则是有利的。如果连接不含谷氨酰胺，则可能是额外有利的。多聚体可进一步在N-末端包含多个氨基酸残基，其源自克隆过程或构成来自裂解的信号传导序列的残基。另外的氨基酸残基的数目可以例如是15或更少，例如10或更少，或5或更少。作为一个特定的实例，多聚体可包含在N-末端的AQV序列。
在一些实施方案中，多聚体可包含选自以下的序列，或基本由选自以下的序列组成：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18，例如选自SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的序列。
SEQ ID NO: 15 (结构域3, 四聚体)
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTVDVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADLLAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEATAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 16结构域3(N10Q,N45A,N60Q)2
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTVDVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 17结构域3 (N10Q,N45A,N60Q)4
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTVDVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADLLAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEATAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE
SEQ ID NO: 18结构域3 (N10Q,N45A,N60Q)6
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTVDVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADLLAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEATAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQTAEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQLIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE
在某些实施方案中，如上文公开的多肽和/或多聚体还包含在C-末端或N-末端的一个或多个偶联元件，其选自半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶联元件可以例如是在C-末端的单一半胱氨酸。偶联元件可直接连接于C-或N-末端，或它/它们可通过包含至多15个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的接头连接。这段序列(stretch)优选在碱性环境中应该也是足够稳定的，不损害突变蛋白的特性。为此目的，如果这段序列不含天冬酰胺，则是有利的。如果这段序列不含谷氨酰胺，则可能是额外有利的。具有C-或N-末端半胱氨酸的优点是蛋白的终点偶联可通过半胱氨酸硫醇与支持体上的亲电子基团的反应完成。这提供对于结合能力是重要的偶联蛋白的优越的移动性。
多肽或多聚体的碱稳定性可通过使之偶联于SPR芯片，例如如在实施例中所述的Biacore CM5传感器芯片，并使用例如特定的含κ轻链的蛋白或多克隆人IgG (其中大多数IgG分子具有κ轻链)，在碱性溶液中孵育之前和之后，在特定的温度，例如22 +/- 2℃下，测量芯片的κ轻链-结合能力来评价。孵育可例如在0.1 M NaOH中进行许多个10 min的周期，例如50、96或100个周期。于22 +/- 2℃，在0.1 M NaOH中在96-100个10 min的孵育周期后，基质的结合能力可以是孵育前结合能力的至少40，例如至少50或至少55%。或者，对于如上测量的特定突变体在96-100个周期后的剩余结合能力可与对亲本多肽/多聚体的剩余结合能力比较。在这种情况下，对于突变体的剩余结合能力可以是亲本多肽/多聚体的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。
本发明还公开一种包含消化链球菌蛋白L的至少一个突变结合结构域的κ轻链-结合多肽，其中由SEQ ID NO: 2-6或12定义的，或与SEQ ID NO: 2-6或12具有至少95%或98%的序列同源性的亲本结构域的至少一个天冬酰胺残基已经突变为另一个并非天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基。多肽可包含至少突变N45A和/或突变N60Q。在特定的实施方案中，所述突变选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q，或者选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q和N10Q,N45A,N60Q。相对于亲本多肽的碱稳定性可被改进和如上文所公开进行测定。
在一些实施方案中，多肽包含多个突变结合结构域或基本由多个突变结合结构域组成，例如2、3、4、5或6结构域，其中每个结构域包含突变N10Q, N45A和N60Q的至少一个，例如N45A和/或N60Q。特别地，在每个结构域中的突变可选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q,N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q，或者选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q和N10Q,N45A,N60Q。结构域可任选地通过包含至多15个氨基酸的元件彼此连接。
在第二方面，本发明公开编码依据以上公开的任何实施方案的多肽或多聚体的核酸。因此，本发明涵盖本核酸序列的所有形式，例如编码多肽或多聚体的RNA和DNA。本发明涵盖载体，例如质粒，其除了编码序列，还包含用于表达依据本发明的多肽或多聚体所需的信号序列。在一个实施方案中，载体包含编码依据本发明的多聚体的核酸，其中编码各个单位的独立的核酸可具有同源或异源的DNA序列。
在第三方面，本发明公开一种表达系统，其包含如上公开的核酸或载体。表达系统可以例如是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如芽孢杆菌(Bacillus sp)或大肠杆菌(Escherichia coli)，其已被修饰为表达本发明的多肽或多聚体。在可供选择的实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在第四方面，本发明公开一种分离基质，其中依据以上公开的任何实施方案的多个多肽或多聚体已经偶联于固体支持体。这样一种基质可用来分离含κ轻链的蛋白，并且由于多肽/多聚体的改进的碱稳定性，基质将耐受在清洁期间的高碱性的条件，这对于在生物处理分离背景下的长期重复使用是至关重要的。基质的碱稳定性可通过于特定的温度下，例如22 +/- 2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，使用例如特定的含κ轻链的蛋白或多克隆人IgG测量κ轻链-结合能力来评价。孵育可例如在0.1 M NaOH中进行一定数目的15 min周期，例如100、200或300个周期。于22 +/- 2℃，在0.1 M NaOH中经100个15 min孵育周期后，基质的结合能力可以是孵育前结合能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%。或者，孵育可在0.1 M NaOH中进行多个4 h的周期，例如6个周期(提供24 h的总孵育时间)。于22+/- 2℃，在0.1 M NaOH中经24 h的总孵育时间后，基质的结合能力可以是孵育前结合能力的至少80，例如至少85，至少90或至少95%。
如技术人员应该理解的，表达的多肽或多聚体在被固定到支持体之前，应被纯化至合适的程度。这样的纯化方法是本领域熟知的，且基于蛋白的配体固定于支持体容易使用标准方法进行。合适的方法和支持体将在下文更详细地讨论。
依据本发明的基质的固体支持体可以是任何合适的熟知的种类。常规亲和分离基质通常具有有机性质并基于亲水性表面暴露于所用的水性介质(即暴露在它们的外表面上和(如果存在)也在内表面上的羟基(-OH)、羧基(-COOH)、甲酰胺基(-CONH2，可能呈现为N-取代的形式)、氨基(-NH2，可能呈现为取代的形式)、寡-或聚乙烯氧基)的聚合物。固体支持体可适合为多孔的。孔隙率可以表示为Kav或Kd值(特定尺寸的探针分子可获得的孔体积的分数)，其通过逆尺寸排阻色谱，例如依据在Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13中描述的方法测量。按照定义，Kd和Kav值二者总是在0-1范围内。Kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用Mw 110kDa的葡聚糖作为探针分子测量的。其优点是支持体具有大分数的孔，其能够容纳本发明的多肽/多聚体和结合于多肽/多聚体的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向结合位点和离开结合位点的质量输运。
多肽或多聚体可经由常规偶联技术，利用例如存在于配体中的硫醇基、氨基和/或羧基，附接于支持体。双环氧化物(Bisepoxides)、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是熟知的偶联试剂。在支持体和多肽/多聚体之间，可引入一种称为间隔区的分子，其改善多肽/多聚体的可利用性并促进多肽/多聚体化学偶联于支持体。合适的间隔区可例如通过用表氯醇、丁二醇二环氧化物、烯丙基缩水甘油醚等激活支持体来引入。或者，多肽/多聚体可通过非-共价键合，例如物理吸附或生物特异性吸附附接于支持体。
在一些实施方案中，基质包含5-20，例如5-15 mg/ml、5-11 mg/ml或8-11 mg/ml的偶联于支持体的多肽或多聚体。偶联的多肽/多聚体的量可受在偶联过程中所用的多肽/多聚体的浓度，受所用的偶联条件和/或受所用支持体的孔结构的控制。作为一般规则，基质的绝对结合能力随着偶联多肽/多聚体的量增加而增加，至少达到其中孔变得受偶联的多肽/多聚体显著限制的点。每mg偶联的多肽/多聚体的相对结合能力将在高偶联水平上降低，导致在以上指定范围内的成本效益最优化。
在一些实施方案中，多肽经由多点附接偶联于支持体。这可通过使用这样的偶联条件，即多肽中的多个反应性基团与支持体中的反应性基团反应来适当地完成。典型地，多点附接可涉及序列中氨基酸残基的几个内在反应性基团，例如赖氨酸中的胺，与支持体上的反应性基团，例如环氧化物、氰酸酯(例如来自CNBr激活)、琥珀酰亚胺酯(例如来自NHS激活)等反应。然而，也可能是有意在多肽的不同位置引入反应性基团以影响偶联特性。为经由赖氨酸提供多点偶联，偶联反应适当地在其中很大一部分赖氨酸伯胺呈现非-质子化亲核状态的pH，例如在高于8.0，例如10以上的pH下进行。
在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联于支持体。执行这样的偶联的方法是本领域熟知的并由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。硫醚键是挠性和稳定的，且一般适用于亲和色谱。特别是当硫醚键经由多肽或多聚体上的末端或接近-末端的半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的移动性增加，这提供了改善的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体经由如上所述的蛋白上提供的C-末端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇有效偶联于支持体上的亲电子基团，例如环氧化物基团、卤代醇基团等，导致硫醚桥偶联。多肽/多聚体可例如经由单点附接(例如经由单一半胱氨酸)或经由直接的多点附接，使用例如接近多肽/多聚体的末端的多个赖氨酸或其它偶联基团偶联。
在某些实施方案中，支持体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水性的，具有较低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可激活的)羟基且它们对用于生物处理的碱性清洁溶液一般是稳定的。
在一些实施方案中，支持体包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的支持体可依据标准方法，例如逆悬浮凝胶化(inverse suspension gelation) (S Hjertén: BiochimBiophys Acta 79(2), 393-398 (1964)容易地制备。或者，碱性基质是可市售获得的产品，例如以SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare)商品名出售的交联的琼脂糖珠。在对于大规模分离是特别有利的一个实施方案中，已使用在US6602990或US7396467 (通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法，使支持体适应于增加其刚性，因而使基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，支持体，例如多糖或琼脂糖支持体被交联，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基化剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联对于支持体的刚性是有益的并改善化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定的，且不引起显著的非特异性吸附。
或者，固体支持体基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物的情况下，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质，基质的表面常常被亲水化，以使如上定义的亲水性基团暴露于周围的水性液体。这样的聚合物依据标准方法，见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization” (R Arshady: Chimicae L'Industria 70(9), 70-75 (1988))容易地生产。或者，使用可市售获得的产品，例如SOURCE™ (GE Healthcare)。在另一个替代中，依据本发明的固体支持体包含无机性质的支持体，例如二氧化硅、氧化锆等。
在再另一个实施方案中，固体支持体呈现为另一种形式例如表面、芯片、毛细管，或滤器(如膜或深过滤基质)。
关于依据本发明的基质的形状，在一个实施方案中，基质呈现为多孔整料的形式。在可供选择的实施方案中，基质以可以是多孔或无孔的串珠或粒子形式呈现。以串珠或粒子形式呈现的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括称为膨胀床的那些和纯粹的悬浮液，其中颗粒或珠自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规色谱。在纯粹的悬浮液的情况下，应使用分批的模式。
在第六方面，本发明公开一种分离含κ轻链的蛋白的方法，其中如以上公开的分离基质被使用。
在一些实施方案中，该方法包含以下步骤：
a) 使包含含κ轻链的蛋白的液体样品与如以上公开的分离基质接触，
b) 用洗涤液洗涤所述分离基质，
c) 用洗脱液从分离基质洗脱含κ轻链的蛋白，和
d) 用清洁液清洁分离基质。
该方法还可包含以下步骤：在步骤a)之前，提供依据上文描述的任何实施方案的亲和分离基质和提供包含含κ轻链的蛋白和至少一种其它物质的溶液作为液体样品，以及在步骤c)之后，回收洗脱液和任选地使洗脱液经历进一步的分离步骤，例如通过阴离子或阳离子交换色谱、多峰色谱和/或疏水相互作用色谱。液体样品的合适的组成，洗涤液体和洗脱液，以及执行分离的一般条件是亲和色谱领域且特别是蛋白L色谱领域熟知的。包含含κ轻链的蛋白和至少一种其它物质的液体样品可包含宿主细胞蛋白(HCP)，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、大肠杆菌或酵母细胞蛋白。CHO细胞和大肠杆菌蛋白的含量可通过针对这些蛋白质的免疫测定法便利地测定，如得自Cygnus Technologies的CHO HCP或大肠杆菌HCPELISA试剂盒。宿主细胞蛋白或CHO细胞/大肠杆菌/酵母蛋白可在步骤b)期间被解除吸附。
洗脱可通过使用用来从蛋白L介质洗脱的任何合适的溶液进行。这可以例如是具有pH 4或更低，例如pH 2.5-4或2.8-3.5的溶液或缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲液梯度包含至少一种单-、二-或三官能的羧酸或这样的羧酸的盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲液梯度包含至少一个选自乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和甲酸盐的阴离子种类。
在一些实施方案中，清洁液是碱性的，例如具有12-14的pH。这样的溶液提供基质的有效清洁，特别是在区间的上端。
在某些实施方案中，清洁液包含0.01-1.0 M NaOH或KOH，例如0.05-1.0或0.05-0.1 M NaOH或KOH。本发明的多肽的高稳定性使得使用这样的比较强的碱性溶液成为可能。
在一些实施方案中，步骤a)-d)重复至少10次，例如至少50次或50-200次。这对过程经济是重要的，因为基质可重复利用多次。
实施例
蛋白的突变发生
从在US6822075 (SEQ ID NO: 1)中公开的，含有4个κ轻链-结合结构域的蛋白L设计单体构建体。这些被编号为1、2、3和4，从N-末端开始(图1)。DNA片段购自DNA合成公司(DNA2.0)。4个单体构建体在pJexpress201克隆载体中制备，每个具有N-末端半胱氨酸。对构建体的概述，见SEQ ID NO: 2、4、5、12。
构建体被亚克隆至表达载体pGO，其含有大肠杆菌GAP启动子和用于靶蛋白的周质定位的OmpA信号肽序列。编码4个结构域的序列通过用含有分别在5’侧和3’侧上的FspI和PstI的限制性内切酶识别位点的寡核苷酸扩增来制备。制备的编码每个结构域的DNA片段用FspI和PstI (New England Biolabs)消化。单独地，表达载体用FspI和PstI消化来制备，通过琼脂糖凝胶电泳纯化并回收。将两者混合并用Quick连接试剂盒(New EnglandBiolabs)连接。用热休克方法，将表达每个结构域的连接的质粒转化至化学感受态大肠杆菌K12株。
结构域3中的氨基酸N10、N45、Q19和N60的进一步的突变在lac操纵子控制机制下，在含有T5启动子的表达载体pJexpress401(DNA2.0)中制备(SEQ ID NO: 7-11,13-14)。设计含有和不含OmpA信号肽，但无C-末端半胱氨酸的构建体。
结构域3的四聚体，含N45、N10和N60突变的结构域3的二聚体、四聚体和六聚体也在含有和不含C-末端半胱氨酸的pJexpress401中制备(SEQ ID NO: 15-18)。
构建体表达和纯化
于37℃，在装有补充有25 mg/l卡那霉素的LB-肉汤(10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、5 gNaCl)的摇瓶中培养大肠杆菌K12重组细胞，直至600 nm的光学密度达到0.8。在此点，蛋白表达用1 mM的最终浓度的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(VWR International)诱导。在诱导后，温度下降至30℃并将培养物培养5小时。停止培养并将细胞以4000 x g离心15分钟，弃去上清液。使细胞再次悬浮于含磷酸缓冲盐水(PBS)的1/10培养体积中并使用脉冲声波降解法超声处理2分钟的有效时间。经超声处理的样品通过以6000 x g离心30分钟从细胞碎片澄清，接着用具有0.2 µm孔径的膜微滤。
纯化的配体用LC-MS分析以确定纯度并确定分子量对应于期望值(基于氨基酸序列)。
实施例1
表1中列出的纯化的单体配体(在非-突变单一结构域的情况下，还包含在C末端的半胱氨酸和在N-末端的AQV序列)，使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在Biacore仪器(GE Healthcare, Sweden)中给出约1000 RU的信号强度的量，在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare, Sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)流过芯片并记录信号强度。然后表面经原位清洗(CIP)，即于室温(22 +/- 2℃)下，用100mM NaOH冲洗10分钟。重复96个周期并在每个周期后按IgG结合能力(信号强度)的相对损失，跟踪固定化配体的碱稳定性。对于非-突变结构域的结果示于图2中并表明结构域1具有比其它结构域明显更低的碱稳定性，和结构域3具有最高的碱稳定性。对于结构域3的单一-结构域天冬酰胺突变体的结果示于图3并表明与亲本结构域3 (其被用作与突变平行的参比)比较，所有突变体的碱稳定性改进。
表1
实施例2
表2中列出的纯化的多结构域配体，使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在Biacore仪器(GE Healthcare, Sweden)中给出约1000 RU的信号强度的量，在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare, Sweden)上固定化。蛋白L在N-末端具有另外的AIHNRA序列。为跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)流过芯片并记录信号强度。然后表面经原位清洗(CIP)，即于室温(22 +/- 2℃)下，用100mM NaOH冲洗10分钟。重复96个周期并在每个周期后按IgG结合能力(信号强度)的相对损失，跟踪固定化配体的碱稳定性。结果示于表2和图4中并表明与蛋白L(其作为参比平行运行)比较，四聚体结构域3具有改进的碱稳定性。
表2
实施例3
使表3中列出的纯化的多结构域配体在Biacore CM5传感器芯片上固定化，并通过用于实施例2的方法评价。配体的名称末端的-cys表明，配体除了由SEQ ID NO: 16-18定义的序列外，还具有C-末端半胱氨酸。结果示于表3和图5并表明与蛋白L (其作为参比平行运行)比较，所有的突变结构域3二聚体、四聚体和六聚体具有改进的碱稳定性。
表3
实施例4
表4的纯化的二聚体、四聚体和六聚体配体使用下面描述的方法在琼脂糖珠上固定化并对能力进行评价。结果示于表4。
表4
激活
所用的基础基质是依据US6602990的方法制备的85微米(体积-加权的)中值直径的刚性交联琼脂糖珠，且对于Mw 110 kDa的葡聚糖具有对应于逆凝胶过滤色谱Kav值0.70的孔径(依据在Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology1991, pp 6-13中描述的方法)。
于25℃，将25 mL (g)排干的基础基质、10.0 mL蒸馏水和2.02 g NaOH在带有机械搅拌器的100 mL烧瓶中混合10 min。加入4.0 mL表氯醇并进行反应2小时。激活的凝胶用10个凝胶沉降体积(GV)的水洗涤。
偶联
激活的凝胶用5 GV 0.2 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 11.5 (偶联缓冲液)洗涤。将15 ml凝胶 + 13 mg配体/ml凝胶(5.0 ml) + 5.5 ml偶联缓冲液 + 4.7 g硫酸钠在50 ml烧瓶中混合并于30℃搅拌18.5 h。pH经测量为10.8。
固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xGV，然后用0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.5洗涤5xGV。将凝胶 + 1 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/7.5 %硫代甘油pH 8.5}混合并于45℃，在烧瓶中搅拌2小时又20分钟。然后凝胶用1xGV 0.1 M HAc和1xGV {0.1 M TRIS/0.15 MNaCl pH 8.5}交替洗涤，然后用蒸馏水洗涤(6xGV)。将凝胶样品送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。所用的偶联方案提供多点偶联，每个结构域的数个赖氨酸附接于凝胶。
2 ml树脂被填充于TRICORN™ 5 100柱中。
蛋白
a) 从木瓜蛋白酶-消化的IgG mAb制备的纯化的Fab，在平衡缓冲液中稀释至1mg/ml。
b) 从热-处理的大肠杆菌上清液制备的纯化的Dab，在平衡缓冲液中稀释至1mg/ml。Dab仅含有κ轻链，而无任何抗原-结合位点。
平衡缓冲液
APB磷酸盐缓冲液20 mM +0.15 M NaCl，pH 7,4 (Medicago)
吸附缓冲液
APB磷酸盐缓冲液20 mM +0.15 M NaCl，pH 7.4 (Medicago)
洗脱缓冲液
25 mM柠檬酸盐pH 2.5
穿透能力用ÄKTAExplorer 10系统，以4分钟的滞留时间测定。然后使平衡缓冲液通过旁路柱，直到获得稳定的基线。这在自动归零之前进行。将样品施加于柱直至获得100% UV信号。然后，再次应用平衡缓冲液直至获得稳定的基线。
将样品装载于柱直至达到UV信号85%的最大吸光度。然后用平衡缓冲液洗涤柱并以0.5ml/min的流速(pH 2.5)洗脱。
为计算在10%时的穿透能力，采用以下方程。那是装载到柱中直至柱流出液中的Fab/Dab浓度是进料中Fab/Dab浓度的10%的Fab/Dab的量。
A100% = 100% UV信号；
Asub= 来自非-结合蛋白的吸光度贡献；
A(V)= 给定的应用体积的吸光度；
Vc= 柱体积；
Vapp= 直至10%穿透的应用体积；
Vsys= 系统死体积；
C0 =进料浓度。
计算10%穿透的动态结合能力(DBC)并对曲线的表现进行研究。还关于结合、洗脱和CIP峰，对曲线进行了研究。对10和80%穿透，计算动态结合能力(DBC)。
本书面说明书使用实施例来公开本发明，包括最佳模式，并且还能使本领域的任何技术人员实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统并执行任何结合的方法。本发明的可专利性范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员可设想的其它实施例。如果这样的其它实施例具有与权利要求书的文字语言相同的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等同结构要素，则打算使这样的其它实施例落入权利要求书的范围内。本文中提及所有专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们单独结合到本文中一样。

Claims (20)

1. 一种包含消化链球菌(Peptostreptococcus)蛋白L的至少一个突变结合结构域的κ轻链-结合多肽，在所述结构域中由SEQ ID NO: 2-6或12定义的，或与SEQ ID NO: 2-6或12具有至少95%或98%的序列同源性的亲本结构域的至少一个天冬酰胺残基已经突变为另一个并非天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基。
2.权利要求1的多肽，其至少包含突变N45A。
3.权利要求1或2的多肽，其至少包含突变N60Q。
4. 任一项前述权利要求的多肽，其中突变选自N10Q；N45A；N60Q；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q或选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q。
5.任一项前述权利要求的多肽，其包含多个突变结合结构域或基本由多个突变结合结构域组成，例如2、3、4、5或6个结构域，其中每个结构域包含突变N45A和/或N60Q。
6. 权利要求5的多肽，其中在每个结构域中的突变选自N10Q；N45A；N60Q；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q或选自N45A；N10Q,N45A；N45A,N60Q, N10Q,N60Q和N10Q,N45A,N60Q。
7.权利要求5或6的多肽，其中结构域通过包含至多15个氨基酸的元件连接。
8. 任一项前述权利要求的多肽，其中碱稳定性相对于亲本多肽有改进，如通过对含κ轻链的蛋白于22 +/- 2℃，在0.1 M NaOH水溶液中，经96-100个10 min孵育周期后的剩余结合能力所测定的。
9. 任一项前述权利要求的多肽，其中亲本结构域由选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列定义，或与选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%或98%的序列同源性。
10. 任一项前述权利要求的多肽，其中亲本结构域由SEQ ID NO: 4定义，或与SEQ IDNO: 4具有至少95%或98%的序列同源性。
11.一种编码依据任一项前述权利要求的多肽或多聚体的核酸或载体。
12.一种表达系统，其包含依据权利要求11的核酸或载体。
13.一种分离基质，其中多个依据权利要求1-10的任一项的多肽已偶联于固体支持体。
14.权利要求13的分离基质，其中多肽已通过多点附接偶联于固体支持体。
15. 权利要求13-14的任一项的分离基质，其中于22 +/- 2℃在0.1 M NaOH中的100个10 min孵育周期后，基质对含κ轻链的蛋白的结合能力是孵育前结合能力的至少40，例如至少50，或至少55%。
16.一种分离含κ轻链的蛋白的方法，其中依据权利要求13-15的任一项的分离基质被使用。
17.权利要求16的方法，其包括以下步骤：
a) 使包含含κ轻链的蛋白的液体样品与依据权利要求13-15的任一项的分离基质接触，
b) 用洗涤液洗涤所述分离基质，
c) 用洗脱液从分离基质洗脱含κ轻链的蛋白，和
d) 用清洁液清洁分离基质。
18.权利要求17的方法，其中清洁液是碱性的，例如具有12-14的pH。
19. 权利要求17或18的方法，其中清洁液包含0.01-1.0 M NaOH或KOH，例如0.05-1.0M或0.05-0.1 M NaOH或KOH。
20.权利要求17-19的任一项的方法，其中步骤a)-d)重复至少10次，例如至少50次或50-200次。
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