JPWO2020066270A1

JPWO2020066270A1 - κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片の製造方法

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Publication number: JPWO2020066270A1
Application number: JP2020548072A
Authority: JP
Inventors: 大村田; 和信水口
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-08-30
Also published as: WO2020066270A1

Abstract

κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片と抗体由来の副産物とを効率的に分離することにより、κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片を高純度で製造する方法を提供することを目的とする。本発明に係る抗体および／または抗体断片の製造方法は、上記抗体および／または抗体断片がκ鎖可変領域を含むものであり、上記抗体および／または抗体断片に加えて軽鎖誘導体および重鎖誘導体の少なくとも一方を含む液体試料を、プロテインＬなどがリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させ、上記抗体および／または抗体断片を上記リガンドに吸着させる工程、上記抗体および／または抗体断片が吸着された上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、溶出液により上記抗体および／または抗体断片を上記アフィニティ分離マトリックスから分離して溶出させる工程を含み、上記溶出工程において、上記溶出液のｐＨを連続的または段階的に低下させることを特徴とする。

Description

本発明は、κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片を副産物から効率的に分離することにより高純度で製造することができる方法に関するものである。

タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１および非特許文献２）。

一般的に、アフィニティ分離マトリックスを用いて抗体を精製する場合には、アフィニティ分離マトリックスのリガンドに抗体を選択的に結合させ、洗浄して不純物を除去した後、アフィニティ分離マトリックスから分離することが行われている。例えば特許文献１には、ＳｐＡアフィニティクロマトグラフィカラムから単量体モノクローナル抗体の画分を集めてＳｐＡ産物プールを形成させ、当該産物プールのｐＨを約３．５〜約４．５とし、抗体の凝集を抑制する方法が記載されている。

抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体である断片抗体からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。

抗体医薬製造における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆａｂなど、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。

ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、抗原結合ドメインである可変領域に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合性ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ−κ結合性ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ−κ結合性ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である（非特許文献５〜７，特許文献２および特許文献３）。そして、それら計９個のＶＬ−κ結合性ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。非特許文献８には、動物細胞、大腸菌、酵母で発現・培養した断片抗体であるＦａｂを、ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを用いて精製した例が記載されている。

特表２０１１−５３０６０６号公報特表平７−５０６５７３号公報特表平７−５０７６８２号公報

ＨｏｂｅｒＳ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７，８４８巻，４０−４７頁ＳｈｕｋｌａＡ．Ａ．ら，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２８巻，２５３−２６１頁ＮｅｌｓｏｎＡ．Ｎ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，２７巻，３３１−３３７頁ＢｏｕｖｅｔＰ．Ｊ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，１９９４，１６巻，４１９−４２４頁ＫａｓｔｅｒｎＷ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７巻，１２８２０−１２８２５頁ＭｕｒｐｈｙＪ．Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１２巻，９１１−９２０頁ＨｏｕｓｄｅｎＮ．Ｇ．ら，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２００３，３１巻，７１６−７１８頁Ｋ．Ｌｅｂｏｚｅｃら，ＮｅｗＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，２０１８，４４巻，３１−４０頁ＡｎｄｒｅＦ．ら，ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，２０１３，２１７巻，１−２０頁小林和男ら，生物工学，２００８，８６巻，３９０−３９２頁

上述したように、ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを用いてＦａｂを精製した例はある。しかし本発明者らは、ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを用いても高純度のＦａｂが得られない場合があることを見出した。
詳しくは、例えば、遺伝子工学的に微生物にＦａｂを生成させ、培養液からＦａｂを効率的に精製する方法では、標的とするＦａｂ以外に、ミスフォールド体や過剰に発現した不要な抗体断片由来の成分などが同時に生成する場合がある（非特許文献９および非特許文献１０）。例えばＦａｂと軽鎖モノマーや軽鎖ダイマーなどの副生物が両方ともκ鎖可変領域を含む場合には、いずれもＰｐＬに結合するために、ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスでＦａｂと副生物を分離することは難しいといえる。
そこで本発明は、κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片と抗体由来の副産物とを効率的に分離することにより、κ鎖可変領域を含む抗体および／または抗体断片を高純度で製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを使用して、ＶＬ−κを含む抗体および／または抗体断片を精製する際、溶出液のｐＨを適切に設定することで標的の抗体および／または抗体断片を高純度で精製できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。

［１］抗体および／または抗体断片を製造するための方法であって、
上記抗体および／または抗体断片がκ鎖可変領域を含むものであり、
上記抗体および／または抗体断片に加えて軽鎖誘導体および重鎖誘導体の少なくとも一方を含む液体試料を、プロテインＬ、プロテインＬのドメイン、プロテインＬ変異体、またはプロテインＬドメイン変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させ、上記抗体および／または抗体断片を上記リガンドに吸着させる工程、
上記抗体および／または抗体断片が吸着された上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、
溶出液により上記抗体および／または抗体断片を上記アフィニティ分離マトリックスから分離して溶出させる工程を含み、
上記溶出工程において、上記溶出液のｐＨを連続的または段階的に低下させることを特徴とする方法。

［２］上記溶出液に、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、およびチオシアン酸ナトリウムから選択される１以上の塩を配合する上記［１］に記載の方法。

［３］上記液体試料のｐＨが５．０以上、９．０以下である上記［１］または［２］に記載の方法。

［４］上記溶出液のｐＨが２．０以上、５．０以下である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。

［５］上記抗体断片がＦａｂである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。

［６］上記溶出液のｐＨを２段階または３段階の段階的に低下させる上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。

本発明方法によれば、ＶＬ−κを含む標的の抗体および／または抗体断片を高い純度で得ることができる。また、本発明方法によって目的物が高純度で得られるので、後段の精製プロセスの簡略化が可能となる。その結果、ＶＬ−κを含む抗体および／または抗体断片の製造コストを抑制することができる。

図１は、市販のＰｐＬ担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ^(R) ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ−６５０Ｆ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、５０ｍＭクエン酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ２．０の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図２は、図１の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図３は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、５０ｍＭクエン酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ２．０の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図４は、図３の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図５は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、５０ｍＭ酢酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ３．０の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図６は、図５の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図７は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ２．２の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図８は、図７の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図９は、市販のＰｐＬ担体（Ｃａｐｔｏ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ２．２の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図１０は、図９の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１１は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、１００ｍＭＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液にてｐＨ５．０からｐＨ２．２の勾配をかけた場合の溶出プロファイルである。図１２は、図１１の実験で得られた各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１３は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、５０ｍＭ緩衝液にてｐＨ３．１とｐＨ２．５で二段階溶出を行った場合の溶出プロファイルである。図１４は、図１３における各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１５は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、溶出液として５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）のみを用いた場合の溶出プロファイルである。図１６は、図１５における各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１７は、本発明方法で精製したＦａｂの溶液を、ＣＨ１領域に対する親和性を有する市販のプロテインＧ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇ）に負荷した後、ｐＨ２．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液を用いて溶出した際のクロマトグラムである。図１８は、図１７における各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１９は、従来方法で精製したＦａｂの溶液を、ＣＨ１領域に対する親和性を有する市販のプロテインＧ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇ）に負荷した後、ｐＨ２．５の５０ｍＭクエン酸緩衝液を用いた溶出した際のクロマトグラムである。図２０は、図１９における各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図２１は、市販のＰｐＬ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ）を用いてＦａｂ含有培養上清からＦａｂを精製するに際し、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．７）とＮａＣｌを含まない５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた二段階溶出を行った場合の溶出プロファイルである。図２２は、図２１における各画分の非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図２３は、本発明方法で精製したＦａｂの溶液を、ＣＨ１領域に対する親和性を有する市販のプロテインＧ担体（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇ）に負荷した後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた溶出した際のクロマトグラムである。

本発明方法は、プロテインＬ、そのドメイン、またはそれらの変異体を固定化したアフィニティ分離マトリックスを用い、ＶＬ−κを含む抗体および／または抗体断片を、純度高く精製する方法である。以下、本発明方法を工程毎に説明する。なお、「抗体および／または抗体断片」とは、抗体および抗体断片の少なくとも一方や、抗体および抗体断片から選択される１以上を意味し、「抗体または抗体断片」が好ましい。また、以下、「抗体および／または抗体断片」を「抗体／抗体断片」と略記する場合がある。

工程１：抗体／抗体断片の製造工程
「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれるかかる特定分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化したり除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。

全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。当該４本鎖構造は、軽鎖および重鎖と呼ばれるポリペプチド鎖それぞれ２本ずつから構成される。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本のγ鎖と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。

免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＰｐＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（ＶＬ−κ）に結合する（非特許文献５〜７）。

本発明方法の精製対象である抗体／抗体断片はＶＬ−κを含み、更に重鎖可変領域を含んでいてもよい。重鎖可変領域（ＶＨ）は、重鎖において重鎖定常領域のＣＨ１とＣＨ２を結合しているヒンジ部を含んでいても含んでいなくてもよいが、少なくともＦｃ領域を含まない。抗体は軽鎖と重鎖を含み、重鎖は重鎖可変領域と重鎖定常領域を含む。

本発明方法の精製対象である抗体／抗体断片としては、例えば、ＶＬ−κを含む軽鎖または軽鎖断片とＶＨを含む重鎖または重鎖断片が、ジスルフィド結合やペプチドリンカーなど、共有結合により結合しているものを挙げることができる。かかる抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ；Ｆａｂ二量体であるＦ（ａｂ’）₂；Ｆａｂ三量体であるＦ（ａｂ’）₃；ＶＨ鎖とＶＬ鎖がジスルフィド結合により結合しているｄｓＦｖ；ＶＨ鎖とＶＬ鎖がペプチドリンカーにより結合しているｓｃＦｖ；ｓｃＦｖの二量体であるＤｉａｂｏｄｙ；ｓｃＦｖの三量体であるＴｒｉａｂｏｄｙ；Ｆｓｃｖの四量体であるＴｅｔｒａｂｏｄｙを挙げることができる。また、ＶＬ−κを含む軽鎖または軽鎖断片とＶＨを含む重鎖または重鎖断片が共有結合によらず会合している抗体断片も、条件によっては本発明方法で精製できる可能性がある。かかる抗体断片としては、例えば、ＶＨ鎖とＶＬ鎖とが会合しているＦｖなどを挙げることができる。

ＶＬ−κを含む軽鎖または軽鎖断片とＶＨを含む重鎖または重鎖断片を結合するためのペプチドリンカーは特に制限されないが、例えば、５以上、２５以下のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを挙げることができる。かかるペプチドリンカーとしては、例えば、グリシンとセリンの繰り返し配列を有するＧＳリンカーが挙げられる。

本発明において、上記抗体／抗体断片は遺伝子工学的に直接製造することが好ましい。具体的には、例えば、ＶＨとＶＬ−κを含む抗体または抗体断片を構成する各鎖のアミノ酸配列をそれぞれ設計した後、逆翻訳により当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。当該塩基配列をコードするＤＮＡを化学合成し、プラスミドなどのベクターへ挿入する。当該ベクターを細胞に導入して形質転換体を得て、当該形質転換体を培養することにより、上記抗体または抗体断片を生産させる。上記抗体または抗体断片を含む培養液や細胞破砕液を粗精製することにより、上記抗体または抗体断片を含む溶液を得る。粗精製には、菌体などの不溶成分を濾過や遠心分離で除去する処置が含まれる。

上記抗体／抗体断片の製造に用いられる細胞としては、例えば、大腸菌やバチルス属細菌；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌；植物細胞；昆虫細胞；非ヒト動物細胞；ヒト細胞；ハイブリドーマなどの融合細胞を挙げることができる。非ヒト動物細胞としては、例えばハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞などが挙げられる。

上記粗精製の後、ＶＬ−κを含む軽鎖または軽鎖断片とＶＨを含む重鎖または重鎖断片を含む溶液中、化学反応によりＶＬ−κを含む軽鎖または軽鎖断片とＶＨを含む重鎖または重鎖断片を結合してもよい。

細胞に抗体を生産させる場合であっても、条件によっては重鎖または軽鎖の一方が過剰に生産され、軽鎖モノマーや軽鎖ダイマーなどの軽鎖誘導体が副生することがある。また、細胞に抗体断片を生産させる場合には、軽鎖や軽鎖断片、重鎖や重鎖断片のいずれかが過剰に生産され、軽鎖誘導体や重鎖誘導体が副生することがある。但し、細胞に抗体を生産させる場合には、軽鎖誘導体が副生する可能性はより低いといえる。また、細胞に抗体を生産させてから、抗体を分解して抗体断片を得る場合には、パパインやペプシンなどのプロテアーゼによる酵素反応工程が必要となる。よって本発明方法は、細胞に抗体断片を生産させる場合により有効に適用することができる。

工程２：吸着工程
本工程では、標的のＶＬ−κ含有抗体／抗体断片と、例えば、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を構成するＶＬ−κ含有軽鎖やＶＨ断片に由来する副生物を含む液体試料を、プロテインＬ、プロテインＬのドメイン、プロテインＬの変異体、またはプロテインＬのドメインの変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、上記抗体／抗体断片をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる。

上記液体試料は、精製すべきＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を含むものであれば特に制限されないが、ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片が水系溶媒に溶解されているものであることが好ましい。また、抗体由来の副産物としては、ＶＬ−κ含有軽鎖またはＶＨ断片のモノマーや、ＶＬ−κ含有軽鎖やＶＨ断片のホモダイマー、またＶＬ−κ含有軽鎖やＶＨ断片が断片化されたものが挙げられる。液体試料としては、例えば、ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を含む血清試料、ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を含む菌体の培養液または破砕液の上清、それらの反応液などを挙げることができる。

上記液体試料のｐＨは５．０以上、９．０以下程度の中性付近であることが好ましい。当該ｐＨが５．０以上であれば、液体試料に含まれるＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を、より確実に本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着させることが可能になる。当該ｐＨが９．０以下であれば、液体試料に含まれるＶＬ−κ含有抗体／抗体断片のアルカリ条件による変性が抑制された状態で、本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着させることが可能になる。当該液体試料の溶媒は水のみでもよいし、また、水を主成分とするものであればＣ_1-4アルコールなどの水混和性有機溶媒を含むものであってもよいし、ｐＨが５．０以上、９．０以下程度の緩衝液であってもよい。

本発明で用いるアフィニティ分離マトリックスは、プロテインＬ、プロテインＬのドメイン、プロテインＬ変異体、またはプロテインＬドメイン変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているものである。本発明に係るアフィニティ分離マトリックスのリガンドは、プロテインＬ（ＰｐＬ）の配列をベースとしており、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（ＶＬ−κ）に結合する。以下、プロテインＬ、そのドメイン、またはそれらの変異体を、まとめて「ＶＬ−κ結合性ペプチド」という場合がある。

本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。本発明における「プロテインＬのドメイン」は、ＶＬ−κに対する親和性を示すものをいう。また、本発明においてプロテインＬやドメインの「変異体」は、野生型のプロテインＬやドメインの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドであって、ＶＬ−κに対する親和性が少なくとも維持されており、好ましくは向上しているものをいう。アミノ酸配列の変異数としては、２０以下または１５以下が好ましく、１０以下または５以下がより好ましく、２または１がより更に好ましい。

「プロテインＬ」（ＰｐＬ）は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４〜６）。

ＰｐＬは、タンパク質中に７０〜８０残基からなる複数のＶＬ−κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順にＢ１〜５ドメインと呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順にＣ１〜４ドメインと呼ぶ（非特許文献５および非特許文献６）。

また、ＰｐＬのＶＬ−κ結合性ドメインのＮ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端を欠失させた場合にも、ＶＬ−κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ−κ結合性を示す（非特許文献７）。

ＰｐＬは、上述した通り、ＶＬ−κ結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含まれるタンパク質である。従って、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインであるＶＬ−κ結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より更に好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が挙げられ、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ−κ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモ多量体であってもよいし、複数種類のＶＬ−κ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロ多量体であってもよい。

上記多量体において、単量体ＶＬ−κ結合性ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。また、別の観点からは、単量体ＶＬ−κ結合性ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。

また、実施形態の１つとして、本発明のアフィニティ分離マトリックスのリガンドとしては、ＶＬ−κ結合性ペプチド、または、ＶＬ−κ結合性ドメインが２個以上連結された多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドも挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたアフィニティ分離マトリックスに対して有用性があれば、本発明に包含される。

本発明で用いるＶＬ−κ結合性ペプチドは、常法により調製することが可能である。すなわち、所望のＶＬ−κ結合性ペプチドのアミノ酸配列またはその断片をコードするＤＮＡを化学的に合成し、ＶＬ−κ結合性ペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、プラスミドなどのベクターに組み込む。得られたベクターを大腸菌などに感染させた上で培養し、培養された菌体または培養液から所望のＶＬ−κ結合性ペプチドをクロマトグラフィなどで精製すればよい。

本発明で用いるアフィニティ分離マトリックスは、上記ＶＬ−κ結合性ペプチドが不溶性担体に固定化されたものである。本発明で用いる「不溶性担体」とは、ＶＬ−κ結合性ペプチドを含む液体試料の溶媒である水系溶媒に対して不溶性を示し、且つリガンドを担持することにより、リガンドへ特異的に結合する上記抗体／抗体断片の精製に用いることができるものをいう。本発明で用いる不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。

本発明に用いる不溶性担体は、アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。

本発明においてリガンドであるＶＬ−κ結合性ペプチドを不溶性担体に固定化する方法としては、常法を用いればよい。例えば、不溶性担体の表面に存在する反応性基を利用して固定化する。具体的には、一般的な不溶性担体の表面には、アミノ基、水酸基、カルボキシ基などの反応性基が存在し、これらを活性化したり、別の反応性基に置換したり、これらに反応性基を有するリンカー基を導入してもよい。例えば、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンなどを用いて水不溶性担体の表面にエポキシ基を導入したり、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などを導入すれば、ＶＬ−κ結合性ペプチドの反応性基との間でカップリング反応が容易に進行する。

水不溶性担体へのリガンドの固定化にリンカー基を用いる場合、当該リンカー基は特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ_1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、イミノ基（＞Ｃ＝Ｎ−または−Ｎ＝Ｃ＜）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオニル基（−Ｃ（＝Ｓ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−）、スルホキシド基（−Ｓ（＝Ｏ）−）、スルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）₂−）、スルホニルアミド基（−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）₂−および−Ｓ（＝Ｏ）₂−ＮＨ−）、並びにこれら２以上が結合した基を挙げることができる。２以上のこれら基が結合して上記リンカー基が構成されている場合、当該結合数としては、１０以下または５以下が好ましく、３以下がより好ましい。

また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。また、固定化のために、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドを化学修飾してもよい。

本工程では、上記液体試料と上記アフィニティ分離マトリックスとを接触させることにより、ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を、リガンドである上記ＶＬ−κ結合性ペプチドに選択的に結合させる。その具体的な態様は特に制限されず、上記液体試料と上記アフィニティ分離マトリックスとを混合するのみでもよいが、例えば、利便性の観点から、本発明に係るアフィニティ分離マトリックスをカラムに充填してアフィニティカラムとし、当該アフィニティカラムに液体試料を通過させ、ＶＬ−κ結合性ペプチドに上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を選択的に吸着させることが好ましい。

本工程の条件は、上記液体試料に含まれる上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片が上記アフィニティ分離マトリックスに十分に吸着される範囲で適宜調整すればよく、液体試料中に含まれる標的抗体断片以外の副産物については、マトリックスに吸着してもよいし、吸着していなくてもよい。ＶＬ−κを含む副産物であれば、この段階では上記アフィニティ分離マトリックスに吸着されている可能性がある。

工程３：アフィニティ分離マトリックスの洗浄工程
本工程では、上記工程１により上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片が吸着保持されたアフィニティ分離マトリックスを洗浄し、上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片、並びにＶＬ−κを含む副産物以外の不純物を除去する。但し、ＶＬ−κを含む副産物も、ＶＬ−κ結合性ペプチドとの親和性によっては洗浄により除去される可能性がある。なお、この時点では、少なくとも標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片はアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。

本工程においてアフィニティ分離マトリックスの洗浄に用いられる洗浄液としては、上記ＶＬ−κ含有抗体断片とＶＬ−κ結合性ペプチドとの相互作用を妨げないものを使用する。例えば、ｐＨが５．０以上、９．０以下の水や緩衝液を洗浄液として用いることができる。洗浄液の使用量は、アフィニティ分離マトリックスから不純物を十分に除去できる範囲で適宜調整すればよい。不純物が十分に除去できたか否かは、例えば、クロマトグラフィーシステムを用いる場合、溶出プロファイルのモニターにより容易に判断することが可能である。

工程４：ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片の分離工程
本工程では、上記工程３により洗浄されたアフィニティ分離マトリックスから、工程２の洗浄液よりも低いｐＨの溶出液を使用して、ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片、ＶＬ−κ含有副産物を主として溶出する。

本工程では、溶出液のｐＨを連続的または段階的に低下させる。本発明者らによる実験的知見によれば、ＶＬ−κを含む点で共通する抗体／抗体断片であっても、ＶＬ−κ結合性ペプチドに対する親和性は異なり、溶出液のｐＨを変えることで互いに分離可能である。

本開示において「段階的」とは、溶出液のｐＨを低下させるに当たり、同一ｐＨの溶出液を所定量で且つ所定時間用いることをいう。当該所定量と所定時間は、ｐＨの異なる溶出液間で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本工程の開始から完了までの間、ｐＨの段階数は２以上、５以下が好ましく、４以下または３以下がより好ましく、２がより更に好ましい。特に、液体試料に含まれるＶＬ−κ含有副産物が特定されており、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片の溶出ｐＨと当該副産物の溶出ｐＨが予備実験などにより明らかである場合には、両者を分離できる２種の溶出液を用いて溶出液のｐＨを段階的に低下させることにより、溶出液の使用量や溶出に要する時間を抑制することが可能になる。段階的な溶出液ｐＨの低下は、溶出液の使用量や廃液量の低減の観点から、標的ＶＬ−κ含有抗体断片の工業的な大量生産において特に有用である。

ｐＨを段階的に低下させる場合には、ｐＨの異なる溶出液間に、上記工程２で用いたような洗浄液を用い、アフィニティ分離マトリックスを洗浄してもよい。例えば、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を溶出させた後、洗浄液を用いてアフィニティ分離マトリックスを洗浄し、更により低ｐＨの溶出液を用いて副産物を溶出してもよい。

本開示において「連続的」とは、経過時間に対して溶出液のｐＨが直線的に低下することをいう。溶出液を連続的に低下させることにより、液体試料に含まれるＶＬ−κ含有副産物が特定されていない場合であっても、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片や副産物の溶出ｐＨを特定でき、両者を分離でき得るという利点がある。溶出液のｐＨを連続的に低下させるには、ｐＨが比較的高い溶出液とｐＨが比較的低い溶出液を準備し、前者に対する後者の割合を連続的に増加させることが考えられる。

溶出液のｐＨを低下させる際のｐＨ勾配は、緩やかであるほど分離が容易となる。本工程で用いる溶出液の量としては、アフィニティ分離マトリックスの体積の５倍体積以上、１００倍体積以内が好ましい。ここでの「アフィニティ分離マトリックスの体積」は、アフィニティ分離マトリックスの分散液をアフィニティ分離マトリックスが含まれるゲル状部分の体積がそれ以上減らないまで十分な時間静置するか或いはタッピングした場合のゲル状部分の体積をいう。なお当該体積は、「カラムボリューム」（ＣＶ）と言い換えることもでき、「ｍＬ−ｇｅｌ」で表す場合がある。

ｐＨ勾配の始点と終点のｐＨ範囲には、６．０と２．０が含まれていることが好ましく、５．０と２．０が含まれていることがより好ましく、４．０と２．０が含まれていることがより更に好ましいが、この範囲に限定されるものではない。

溶出液としては特に限定されないが、例えばクエン酸、酢酸、グリシン、塩酸、リン酸、ギ酸などを用いた一般的な緩衝液を使用すればよい。

溶出液には、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片の分離がより良好になり得ることから、更に塩を添加してもよい。かかる塩としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、およびチオシアン酸ナトリウムから必須的になる群より選択される１以上を挙げることができる。溶出液における当該塩の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、５ｍＭ以上、２００ｍＭ以下とすることができる。

本工程では、設定した溶出液を流した後に、担体内に残存した副産物などを溶出させるため、最初の溶出液とは異なる溶液を更に流してもよい。最初の溶出液とは異なる溶液の種類は、１種類でもよいし、２種類でもよい。最初の溶出液とは異なる条件の例として、ｐＨ以外に、緩衝液の種類と濃度、塩添加の有無などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、基準となるアフィニティ分離マトリックスの体積は、懸濁状態であり、その体積が減少しなくなるまでタッピングまたは静置したゲル状態のアフィニティ分離マトリックスの体積とする。

本工程においては、分画量を少なくすることにより、標的ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片の分離効率がより一層高くなる。例えば、１分画の量を、０．１ＣＶ（カラムボリューム）以上、２．０ＣＶ以下とすることができる。当該量としては、１．５ＣＶ以下または１．０ＣＶ以下が好ましく、０．５ＣＶ以下がより好ましく、０．２ＣＶ以下がより更に好ましい。

工程５：アフィニティ分離マトリックスの再生工程
本工程では、上記工程３において上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を分離したアフィニティ分離マトリックスを、アルカリ性水溶液で洗浄することによって再生する。但し、本工程は、上記工程３の後に必須的に実施する必要はなく、上記工程１〜３の繰り返しの３回に１回、５回に１回、または１０回に１回の実施でも構わない。すなわち、結合容量などアフィニティ分離マトリックスの性能が維持されている状態では本工程は必ずしも実施する必要はなく、精製対象である上記ＶＬ−κ含有抗体／抗体断片を含む液体試料によってもその実施頻度や条件が異なる。

アフィニティ分離マトリックスの再生に用いる「アルカリ性水溶液」は、洗浄や殺菌などの目的を達成し得る程度のアルカリ性を示す水溶液である。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下、または、０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、１２．０以上が好ましく、１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、１４以下が好ましく、１３．５以下がさらにより好ましく、１３．０以下がさらにより好ましい。

上記工程３を経たアフィニティ分離マトリックスをアルカリ性水溶液により処理する時間は、アルカリ性水溶液の濃度や処理時の温度によってペプチドの受けるダメージは異なるので、特に限定はされず、適宜調整すればよい。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリ性水溶液に浸漬する時間の下限は、１０分間または３０分間が好ましく、１時間、２時間または４時間がより好ましく、１０時間がより更に好ましいが、アフィニティ分離マトリックスの再生が可能な条件であれば特に限定はされない。上記時間の上限としては、例えば、２０時間とすることができる。

本工程を経て再生されたアフィニティ分離マトリックスは、再び上記工程１〜３で使用し得る。

本願は、２０１８年９月２８日に出願された日本国特許出願第２０１８−１８４３８５号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年９月２８日に出願された日本国特許出願第２０１８−１８４３８５号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：Ｆａｂの精製実験 − ｐＨの連続的グラジェント
（１）Ｆａｂ含有上清の調製
ＶＬ−κ含有抗体断片として、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α抗体（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の配列の公開配列情報に基づいて設計したＦａｂを選択した。Ｆａｂ遺伝子は、前記抗ＴＮＦ−α抗体のＦｄ鎖アミノ酸配列、および軽鎖アミノ酸配列をコードする遺伝子を設計し、化学合成したものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。なお、Ｆｄ鎖とは、抗体の重鎖からヒンジ部位とＦｃ領域を除いたＣＨ１領域とＶＨ領域をいう。得られたＦａｂ遺伝子を用い、前記Ｆａｂをメタノール資化酵母に生産させた。本Ｆａｂ断片産生酵母の取得と培養は、ＷＯ２０１２／１０２１７１号公報の実施例１，８，９に記載された方法に準じて行った。この方法により、Ｆｄ鎖と軽鎖がジスルフィド結合で結合されたＦａｂ断片が生成される。得られたＦａｂ断片を含む培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。回収した培養上清を、孔径０．２２μｍの滅菌濾過フィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）を用いて濾過した。

（２）市販のＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスの準備
κ鎖可変領域（ＶＬ−κ）を含む抗体断片を吸着可能なアフィニティ分離マトリックスとして、東ソー社の「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ^(R) ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ−６５０Ｆ」と、カネカ社の「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ」を入手し、それぞれ１ｍＬ−ｇｅｌ分を市販のカラム（「Ｔｒｉｃｏｒｎ５／５０」ＧＥヘルスケア社）に充填した。なお、「１ｍＬ−ｇｅｌ」とは、懸濁状態のアフィニティ分離マトリックスを体積が減少しなくなるまでタッピングまたは静置したゲル状態のアフィニティ分離マトリックスの体積が１ｍＬであることをいう。

（３）ＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを用いたＦａｂ含有上清からのＦａｂ精製
実施例１（１）で調製したＦａｂ含有培養上清から、実施例１（２）で準備した市販のプロテインＬ担体を使用して、Ｆａｂを精製した。具体的には、それぞれの担体が充填されたカラムをクロマトグラフィーシステム（「ＡＫＴＡａｖａｎｔ２５」ＧＥヘルスケア社）に接続した。まず、５ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、実施例１（１）で調製したＦａｂ含有上清５ｍＬをカラムに負荷した。次いで、３ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した。その後、５０ｍＭクエン酸緩衝液でｐＨ５．０からｐＨ２．０へのｐＨ直線勾配にてＦａｂを溶出させた。より具体的には、カラムを５ＣＶの溶出液Ａ（５０ｍＭシトレート，ｐＨ５．０）で平衡化させた後、２０ＣＶ分の溶出液を通液する際に、溶出液Ｂ（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．０）の濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、２ｍＬの画分を採取した。また各画分（２ｍＬ）のｐＨをｐＨメーターで測定し、Ｆａｂ溶出ピークの画分のｐＨからピークトップ位置の溶出ｐＨを求めた。以上の操作において、流速は０．３３ｍＬ／ｍｉｎとした。またいずれの担体を用いた精製においても、試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２ＭＴｒｉｓ溶液にて中和した。

（４）結果の考察
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ^(R) ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ−６５０Ｆを用いた場合の溶出プロファイルを図１に、ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌを用いた場合の溶出プロファイルを図３に示す。
回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。具体的には、電源搭載型ミニスラブ電気泳動槽（「パジェラン」アトー社製）と１５％ポリアクリルアミド・プレキャストゲル（「ｅ・ＰＡＧＥＬ」アトー社製）を用いて、付属のマニュアルに従い、非還元処理条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質検出用ＣＢＢ染色溶液（「ＥｚＳｔａｉｎＡＱｕａ」アトー社）を用いて、付属のマニュアルに従いゲルの染色と脱色を行った。ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ^(R) ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ−６５０Ｆを用いた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２に、ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌを用いた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示す。
図１に示す結果の通り、Ｆａｂ培養上清をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ^(R) ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ−６５０Ｆに負荷し、５０ｍＭクエン酸緩衝液でｐＨ勾配をかけた場合、溶出ピークは２つとなった。ピークトップ位置から決定した１つ目のピークの溶出ｐＨは２．８８、２つ目のピークの溶出ｐＨは２．７２であった。図２は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。溶出ピークは前半から順に３分割したそれぞれの画分を確認した。溶出画分１から３まで順に画分のｐＨが低くなる。図２の溶出画分のバンドを確認すると、レーン４（溶出画分１）は分子量５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在し、レーン５では５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在し、レーン６は２５ｋＤａ程度のバンドの割合が小さいことが分かった。約２５ｋＤａのバンドは、分子量から軽鎖モノマーのものであると考えられる。またレーン６の５０ｋＤａ程度のバンドは２つ存在していた。この二つのバンドについては、分子量が近いＦａｂと軽鎖ダイマーであると考えられる。溶出ピークが２つに分かれていることから、採取する画分量を少なくしたり、目的物であるＦａｂを溶出する際の溶出液のｐＨ勾配をおだやかにすることにより、Ｆａｂと軽鎖ダイマーを分離できる可能性がある。なお、Ｆｄ鎖はＰｐＬが結合可能なＶＬ−κを含んでいないことから、溶出画分にはＦｄ鎖やＦｄ鎖ダイマーは含まれていないと考えられる。
図３に示す結果の通り、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、５０ｍＭクエン酸緩衝液でｐＨ勾配をかけた場合、溶出ピークは２つとなった。ピークトップから算出すると１つ目のピークの溶出ｐＨは３．１、２つ目のピークの溶出ｐＨは２．８６であった。図４は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。溶出ピークは前半から順に２分割したそれぞれの画分を確認した。図４の溶出画分のバンドを確認すると、レーン４では分子量５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在し、レーン５では５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在した。
これら２種類のＰｐＬを含むアフィニティ分離マトリックスを用いたＦａｂ含有培養上清からのＦａｂの精製では、いずれも軽鎖モノマーもしくは軽鎖ダイマーよりも高いｐＨでＦａｂが溶出するという共通の傾向があることを見出した。かつ溶出画分によってはＦａｂのみを含んでおり、この画分を選択すれば高い純度のＦａｂを取得することが可能である。

実施例２：Ｆａｂの精製実験 − 酢酸緩衝液
市販のＰｒｏｔｅｉｎＬ担体としてＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌのみと５０ｍＭ酢酸緩衝液を用い、ｐＨ５．０からｐＨ３．０へのｐＨ直線勾配にてＦａｂを溶出させた以外は上記実施例１（３）と同様にして、Ｆａｂの精製実験を行った。溶出プロファイルを図５に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図６に示す。
図５に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、５０ｍＭ酢酸緩衝液でｐＨ勾配をかけた場合、溶出ピークは２つとなった。ピークトップから算出すると１つ目のピークの溶出ｐＨは３．６５、２つ目のピークの溶出ｐＨは３．５３であった。図６は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。溶出ピークは前半から順に３分割したそれぞれの画分を確認した。図６の溶出画分のバンドを確認すると、レーン４では分子量５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在し、レーン５では５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在した。
以上の結果から、溶出液の種類によらず、軽鎖モノマーおよび軽鎖ダイマーよりも高いｐＨでＦａｂが溶出するという共通の傾向があることを見出した。

実施例３：Ｆａｂの精製実験 − ｐＨの連続的勾配と塩化ナトリウムの併用
上記実施例１（１）で調製したＦａｂ含有培養上清を孔径０．２２μｍのフィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）で濾過した後、上記実施例１（２）で準備した市販のプロテインＬ担体（「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ」カネカ社製，および「ＣａｐｔｏＬ」ＧＥヘルスケア社製）を使用してＦａｂを精製した。
担体が充填されたカラムをクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥヘルスケア社）に接続して使用した。具体的には以下の操作を行った。まず、５ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、上記実施例１（１）で調製したＦａｂ含有上清５ｍＬをカラムに負荷した。次いで、３ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した。その後、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ５．０からｐＨ２．２へのｐＨ直線勾配にてＦａｂを溶出させた。より具体的には、カラムを５ＣＶの溶出液Ａ（５０ｍＭシトレート，１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ５．０）で平衡化させた後、２０ＣＶ分の溶出液を通液する際に、溶出液Ｂ（５０ｍＭシトレート，１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ２．２）の濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、Ｆａｂを溶出させた。また各画分のｐＨをｐＨメーターで測定し、Ｆａｂ溶出ピークの画分のｐＨからピークトップの溶出ｐＨを求めた。以上の操作において、流速は０．３３ｍＬ／ｍｉｎとした。またいずれの担体を用いた精製においても、試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２ＭＴｒｉｓ溶液にて中和した。ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌの溶出プロファイルを図７に、ＣａｐｔｏＬの溶出プロファイルを図９に示す。上記実施例１（３）と同様に、回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌのその結果を図８に、ＣａｐｔｏＬの結果を図１０に示す。
図７に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液でｐＨ勾配をかけた場合、溶出ピークは２つとなった。ピークトップから算出すると１つ目のピークの溶出ｐＨは２．７、２つ目のピークの溶出ｐＨは２．１８となり、実施例１（３）の場合と比較して溶出ｐＨが低い傾向があるものの、２つのピークのｐＨの差異は大きくなった。図８は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。レーン４からレーン１０は溶出ピークの画分を前半から順に並べており、レーン４からレーン１０に向かって順に画分のｐＨが低い。この結果から分かるように、ｐＨが低くなるにつれて、まず５０ｋＤａ程度のバンド、２５ｋＤａ程度のバンド、５０ｋＤａ程度のバンドがそれぞれ主として画分に含まれている。レーン６とレーン７の約５０ｋＤａのバンドを見ると、分子量が僅かに異なることが分かる。ヒンジ部分を含むＦａｂの分子量の方が軽鎖ダイマーよりも大きいので、約５０ｋＤａのバンドの内、分子量が大きいバンドの方がＦａｂ、小さい方が軽鎖ダイマーであり、比較的高いｐＨでＦａｂが溶出し、その後に軽鎖ダイマーが溶出していると考えられる。実施例１（３）の結果と比較すると、より顕著にＦａｂと軽鎖モノマー、軽鎖ダイマーの分離が容易になるということが分かった。
また、図９に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＣａｐｔｏＬに負荷し、１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液でｐＨ勾配をかけた場合、ショルダーを含む溶出ピークとなった。ピークの前半のショルダーのｐＨは２．９４、溶出ピークのｐＨは２．５８、ピーク後半のショルダーのｐＨは２．３１であった。図１０は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。レーン４からレーン７に向かって順に画分のｐＨが低い。この結果から分かるように、ＣａｐｔｏＬについてもｐＨが低くなるにつれて、まず５０ｋＤａ程度のバンド、２５ｋＤａ程度のバンド、５０ｋＤａ程度のバンドがそれぞれ主として画分に含まれていた。溶出液にＮａＣｌが添加されてもＦａｂと軽鎖モノマー、軽鎖ダイマーの分離が可能であることが示された。

実施例４：Ｆａｂの精製実験 − ｐＨの連続的勾配と塩化マグネシウムの併用
市販のＰｒｏｔｅｉｎＬ担体としてＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌのみと、１００ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ５．０からｐＨ２．２へのｐＨ直線勾配にてＦａｂを溶出させた以外は上記実施例１（３）と同様にして、Ｆａｂの精製実験を行った。溶出プロファイルを図１１に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１２に示す。
図１１に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、１００ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液を用いてｐＨ勾配をかけた場合、ｐＨ勾配中に溶出されるピークは１つとなった。ピークトップから算出するとピークの溶出ｐＨは２．３９であった。
図１２は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。溶出ピークは前半から順に３分割したそれぞれの画分を確認した。図１２の溶出画分のバンドを確認すると、レーン４から６では分子量５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在した。また、強溶出画分のレーンに含まれる約５０ｋＤａのバンドを見ると、分子量が僅かに異なる２つのバンドが含まれていることが分かる。ヒンジ部分を含むＦａｂの分子量の方が軽鎖ダイマーよりも大きいので、この約５０ｋＤａのバンドの内、分子量が大きいバンドの方がＦａｂ、小さい方が軽鎖ダイマーであり、強溶出画分の約５０ｋＤａのバンドには主に軽鎖ダイマーが含まれると考えられる。この結果より、溶出液にＭｇＣｌ₂が添加されてもＦａｂを純度高く分離可能であることが示された。

実施例５：Ｆａｂの精製実験 − ｐＨの段階的勾配
（１）Ｆａｂの精製実験
上記実施例１（１）で調製したＦａｂ含有培養上清を孔径０．２２μｍのフィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）で濾過した後、実施例１（２）で準備した市販のプロテインＬ担体（「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ」カネカ社製）を使用し、ｐＨを段階的に低下させてＦａｂを精製した。最初に用いる溶出液１のｐＨは、実施例１（３）のＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌを用いた検討における１つ目の溶出ピークのｐＨである「３．１」とした。次に用いる溶出液２のｐＨは「２．５」とした。実施例１（３）と同様に、担体が充填されたカラムをクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥヘルスケア社）に接続して使用した。具体的には以下の操作を行った。
まず、５ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、上記実施例１（１）で調製したＦａｂ断片含有上清５ｍＬをカラムに負荷した。次いで、５ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した後、１０ＣＶ分の溶出液１（５０ｍＭシトレート，ｐＨ３．１）を流通させた。その後、３ＣＶ分の平衡化緩衝液を流通させ、さらに１０ＣＶ分の溶出液２（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．５）を流通させた。以上の操作において、流速は０．３３ｍＬ／ｍｉｎとした。試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２ＭＴｒｉｓ溶液にて中和した。溶出プロファイルを図１３に示す。上記実施例１（３）と同様に、回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。結果を図１４に示す。
図１４に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、溶出液１（５０ｍＭシトレート，ｐＨ３．１）で溶出した画分には、５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在し（レーン４，５）、溶出液２（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．５）で溶出した画分（レーン６）には、５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在した。レーン６の５０ｋＤａ付近には２つのバンドが含まれており、より低分子の軽鎖ダイマーが主に含まれていると考えられる。本結果より、適切にｐＨを設定した溶出液により、純度高くＦａｂを精製取得することが可能であることが分かる。

（２）比較実験
比較実験として、溶出液として５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）のみを用いた以外は上記実施例５と同様にして、Ｆａｂの溶出実験を行った。溶出プロファイルを図１５に、回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した結果を図１６に示す。
図１６のレーン４から分かるように、溶出画分には５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在しており、Ｆａｂと軽鎖モノマーを分離できていなかった。また、約５０ｋＤａのバンドはブロードになっており、Ｆａｂと軽鎖ダイマーがまったく分離されず含まれていると考えられる。

（３）精製Ｆａｂの純度確認
上記実施例５（１）で得られた溶出液中の全タンパク質量中のＦａｂの割合を確認した。分析用にＣＨ１領域への特異的吸着能を有する市販のプロテインＧ担体（「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇ」カネカ社製）を使用した。
上記実施例５（１）で得られたＦａｂ含有溶出液を、市販のプロテインＧ担体（「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇ」カネカ社製）に負荷した後、洗浄と酸性溶出により得られたクロマトグラムの全タンパク質のエリア面積に対する吸着画分のピークエリア面積の割合を算出した。担体が充填されたカラムをクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥヘルスケア社）に接続して使用した。具体的には以下の操作を行った。
まず、３ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、実施例５（１）で得られたＦａｂ断片含有溶出液１ｍＬをカラムに負荷した。次いで、５ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した後、５ＣＶ分の溶出液（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．５）を流通させた。その後、３ＣＶ分の平衡化緩衝液を流通させ、さらに５ＣＶ分の１Ｍ酢酸水溶液を流通させた。以上の操作において、流速は０．３３ｍＬ／ｍｉｎとした。試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２ＭＴｒｉｓ溶液にて中和した。試料負荷から溶出までのクロマトグラムを図１７に、回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した結果をそれぞれ図１８に示す。
また、上記実施例５（２）の比較実験で得られたＦａｂ含有溶出液を同様に分析したクロマトグラムを図１９に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した結果をそれぞれ図２０に示す。
更に、図１７と図１９のクロマトグラムの全ピークエリア面積中の負荷画分と溶出画分の割合を表１に示す。なお、ＦａｂはプロテインＧに吸着されるために溶出画分に含まれる一方で、ＣＨ１領域を有さない軽鎖モノマーや軽鎖ダイマーはプロテインＧに吸着されないため、負荷画分に含まれると考えられる。

図１７と図１９を比較すると、負荷画分と溶出画分のピークエリアの割合が大きく異なり、表１のそれぞれの全エリアに対する割合を比較すると明確な違いがあった。ＦａｂはＣＨ１領域を有するので、リガンドとしてプロテインＧを含むＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇに吸着されるために溶出画分に含まれる一方で、ＣＨ１領域を有さない軽鎖モノマーと軽鎖ダイマーはＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｇには吸着されないため、負荷画分に含まれると考えられる。そこで、溶出画分の割合が高いほど、精製で得られたＦａｂ含有溶出液中のＦａｂ純度が高いことを示す。実際に、図１８と図２０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、負荷画分には軽鎖モノマーと軽鎖ダイマーの約５０ｋＤａと約２５ｋＤａのバンドが存在するのに対して、溶出画分にはＦａｂの５０ｋＤａのバンドのみが存在することを確認した。これらの結果より、溶出液のｐＨを適切に設定することにより、より純度高くＦａｂを精製取得することが可能であることが分かった。

実施例６：Ｆａｂの精製実験 − 塩を用いたｐＨの段階的勾配
上記実施例１（１）で調製したＦａｂ含有培養上清を孔径０．２２μｍのフィルター（「ミニザルト」ザルトリウス社）で濾過した後、実施例１（２）で準備した市販のプロテインＬ担体（「ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌ」カネカ社製）を使用して、ｐＨを段階的に低下させつつＦａｂを溶出して精製した。最初に用いる溶出液１のｐＨは、上記実施例３のＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌを用いた検討における、１つ目の溶出ピークのｐＨである「２．７」とした。次に用いる溶出液２のｐＨは「２．５」とした。実施例１（３）と同様に、担体が充填されたカラムをクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥヘルスケア社）に接続して使用した。具体的には以下の操作を行った。
まず、５ＣＶ（カラムボリューム）分の平衡化緩衝液（２０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）をカラムに流通させて、担体を平衡化した。次に、上記実施例１（１）で調製したＦａｂ断片含有上清５ｍＬをカラムに負荷した。次いで、５ＣＶ分の前記平衡化緩衝液を流通させて洗浄した後、１０ＣＶ分の溶出液１（５０ｍＭシトレート，１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ２．７）を流通させた。その後、３ＣＶ分の平衡化緩衝液を流通させ、さらに１０ＣＶ分の溶出液２（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．５）を流通させた。以上の操作において、流速は０．３３ｍＬ／ｍｉｎとした。試料負荷、洗浄、溶出の画分を回収した。回収した溶出画分は、２ＭＴｒｉｓ溶液にて中和した。溶出プロファイルを図２１に示す。またに、回収した試料負荷画分、洗浄画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。結果を図２２に示す。
図２１に示す結果のように、Ｆａｂ培養上清をＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ^TM Ｌに負荷し、溶出液１（５０ｍＭシトレート，１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ２．７）で溶出した画分は、５０ｋＤａ程度のバンドのみが存在し（レーン５，６）、溶出液２（５０ｍＭシトレート，ｐＨ２．５）で溶出した画分（レーン７）は５０ｋＤａ程度と２５ｋＤａ程度のバンドが存在した。レーン７の５０ｋＤａ付近には２つのバンドが含まれており、より低分子量の軽鎖ダイマーが主に含まれていると考えられる。
また、精製して得られた溶出液中のＦａｂの割合を、１段階目の溶出液として１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．７）を用いた以外は上記実施例５と同様の方法で評価した。結果を図２３と表２に示す。

図２３と表２に示す結果の通り、溶出液に塩が含まれていても適切にｐＨを設定した溶出液により、高純度でＦａｂを精製取得することが可能であることが分かった。

Claims

抗体および／または抗体断片を製造するための方法であって、
上記抗体および／または抗体断片がκ鎖可変領域を含むものであり、
上記抗体および／または抗体断片に加えて軽鎖誘導体および重鎖誘導体の少なくとも一方を含む液体試料を、プロテインＬ、プロテインＬのドメイン、プロテインＬ変異体、またはプロテインＬドメイン変異体がリガンドとして不溶性担体に固定化されているアフィニティ分離マトリックスに接触させ、上記抗体および／または抗体断片を上記リガンドに吸着させる工程、
上記抗体および／または抗体断片が吸着された上記アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、
溶出液により上記抗体および／または抗体断片を上記アフィニティ分離マトリックスから分離して溶出させる工程を含み、
上記溶出工程において、上記溶出液のｐＨを連続的または段階的に低下させることを特徴とする方法。
上記溶出液に、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、およびチオシアン酸ナトリウムから選択される１以上の塩を配合する請求項１に記載の方法。
上記液体試料のｐＨが５．０以上、９．０以下である請求項１または２に記載の方法。
上記溶出液のｐＨが２．０以上、５．０以下である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
上記抗体断片がＦａｂである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
上記溶出液のｐＨを２段階または３段階の段階的に低下させる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。