KR20230111193A - 분리 매트릭스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9와 적어도 95% 동일성을 갖는 알칼리-안정한 돌연변이된 Fc-결합 단백질 A 도메인에 관한 것이다.
Description
본 발명은 친화성 크로마토그래피 분야, 보다 구체적으로 이뮤노글로불린의 친화성 크로마토그래피에 유용한 단백질 A의 돌연변이된 이뮤노글로불린-결합 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돌연변이된 도메인의 다량체 및 돌연변이된 도메인 또는 다량체를 함유하는 분리 매트릭스에 관한 것이다.
이뮤노글로불린은 전세계적으로 제조 또는 개발에서 가장 보편적인 생물약제 생성물을 대표한다. 이러한 특정 치료 시장에 대한 높은 상업적 요구 및 그에 따른 가치는 제약 회사로 하여금 관련 비용을 통제하면서 각각의 mAb 제조 공정의 생산성을 최대화하는데 중점을 두게 한다.
친화성 크로마토그래피는 대부분의 경우에 이러한 이뮤노글로불린 분자, 예컨대 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 정제에서의 주요 단계 중 하나로서 사용된다. 특히 흥미로운 부류의 친화성 시약은 이뮤노글로불린 분자의 불변성 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이며, 이러한 상호작용은 항체의 항원-결합 특이성에 대해 비의존성이다. 이러한 시약은 다양한 샘플, 예컨대 비제한적으로 혈청 또는 혈장 제제 또는 세포 배양물 유래 공급 원액으로부터의 이뮤노글로불린의 친화성 크로마토그래피 회수에 널리 사용될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 다양한 종으로부터의 IgG 이뮤노글로불린의 Fc 및 또한 Fab (VH3 도메인을 통해) 부분에 결합할 수 있는 도메인을 함유하는 포도상구균 단백질 A이다. 이러한 도메인은 통상적으로 E-, D-, A-, B- 및 C-도메인 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1-5)으로 표시된다.
포도상구균 단백질 A (SpA) 기반 시약은 그의 높은 친화성 및 선택성으로 인해 생명공학 분야에서, 예를 들어 항체의 포획 및 정제뿐만 아니라 검출 또는 정량화를 위한 친화성 크로마토그래피에서 광범위한 용도가 밝혀졌다. 현재, SpA-기반 친화성 매체는 아마도 산업적 세포 배양 상청액을 포함하는 다양한 샘플로부터 모노클로날 항체 및 그의 단편의 단리를 위해 가장 널리 사용되는 친화성 매체일 것이다. 따라서, 단백질 A-리간드를 포함하는 다양한 매트릭스는, 예를 들어 천연 단백질 A (예를 들어 단백질 A 세파로스(SEPHAROSE)™, 스웨덴 웁살라 소재의 시티바(Cytiva))의 형태로, 또한 재조합 단백질 A로 구성되는 형태 (예를 들어 r단백질 A 세파로스™, 시티바)로 상업적으로 입수가능하다. 보다 구체적으로, 상업적 재조합 단백질 A 제품에서 수행되는 유전자 조작은 그의 지지체에 대한 부착을 용이하게 하고 리간드의 생산성을 증가시키는 것을 목표로 한다.
이러한 적용은, 다른 친화성 크로마토그래피 적용과 마찬가지로, 오염물의 확실한 제거를 위해 포괄적인 주의를 필요로 한다. 이러한 오염물은 예를 들어 크로마토그래피 절차에서 고정상 또는 매트릭스에 흡착된 용리되지 않은 분자, 예컨대 목적하지 않은 생체분자 또는 미생물일 수 있으며, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질, 박테리아 및 바이러스를 포함할 수 있다. 매트릭스로부터의 이러한 오염물의 제거는 통상적으로 차후의 사용 전에 매트릭스를 재생시키기 위해 목적하는 생성물의 제1 용리 이후에 수행된다. 이러한 제거는 제자리 세정(cleaning-in-place, CIP)으로 알려진 절차를 포함하며, 통상적으로 고정상으로부터 오염물을 용리시킬 수 있는 작용제가 사용된다. 종종 사용되는 작용제의 하나의 이러한 부류는 상기 고정상 위로 통과하는 알칼리성 용액이다. 현재 가장 광범위하게 사용되는 세정제 및 소독제는 NaOH이고, 그의 농도는 오염의 정도 및 성질에 따라 0.1 내지 예를 들어 1 M의 범위일 수 있다. 이러한 전략은 매트릭스를 pH-값이 13 초과인 용액에 노출시키는 것과 연관된다. 단백질성 친화성 리간드를 함유하는 많은 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 있어서, 이러한 알칼리성 환경은 매우 가혹한 조건이고, 결과적으로 관련된 높은 pH에 대한 리간드의 불안정성으로 인해 용량 감소를 초래한다.
따라서, 광범위한 연구는 알칼리성 pH-값을 견디는 개선된 능력을 나타내는 조작된 단백질 리간드의 개발에 집중되어 왔다. 예를 들어, 길리히 등 (Gulich et al.) (Susanne Gulich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlen, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178)은 알칼리성 환경에서 연쇄상구균 알부민-결합 도메인 (ABD)의 안정성 특성을 개선시키기 위한 단백질 조작을 제안하였다. 길리히 등 (Gulich et al.)은 4개의 아스파라긴 잔기 모두가 류신 (1개의 잔기), 아스파르테이트 (2개의 잔기) 및 리신 (1개의 잔기)으로 교체된 ABD의 돌연변이체를 생성하였다. 추가로, 길리히 등 (Gulich et al.)은 그의 돌연변이체가 천연 단백질과 유사한 표적 단백질 결합 거동을 나타내고, 조작된 리간드를 함유하는 친화성 칼럼이 모체 비-조작된 리간드를 사용하여 제조된 칼럼보다 알칼리 조건에 대한 반복 노출 이후에 더 높은 결합 용량을 나타낸다고 보고한다. 따라서, 4개의 아스파라긴 잔기 모두가 구조 및 기능에 대한 임의의 유의한 영향 없이 대체될 수 있는 것으로 결론지어진다.
최근의 연구는 유사한 특성을 달성하기 위해 단백질 A (SpA)에 변화가 또한 이루어질 수 있음을 보여준다. 미국 특허 7,834,158 (전문이 본원에 참조로 포함된다)은 적어도 1개의 아스파라긴 잔기가 글루타민 또는 아스파르트산 이외의 아미노산으로 돌연변이되는 경우에, 돌연변이가 모체 SpA, 예컨대 SpA의 B-도메인, 또는 SpA의 B-도메인으로부터 유래된 합성 구조물인 단백질 Z (서열식별번호: 6)와 비교하여 최대 약 13-14의 pH-값에서 증가된 화학적 안정성을 부여한다는 것을 개시한다 (US 5,143,844, 전문이 참조로 포함된다). 저자들은 이러한 돌연변이된 단백질이 친화성 리간드로서 사용되는 경우에, 예상된 바와 같이 분리 매트릭스가 알칼리성 작용제를 사용하는 세정 절차를 보다 잘 견딜 수 있음을 제시한다. 이는 특히 US 8,198,404 (전문이 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 돌연변이 N3A,N6D,N23T를 갖는 단백질 Z (서열식별번호: 7, 본원에서 Zvar로 표시한다)에 적용된다. 알칼리 안정성을 증가시키기 위한 목적으로 단백질 A 도메인의 추가적인 돌연변이는 또한 US 8,329,860, JP 2006304633A, US 8,674,073, US 10,072,050, US 9,403,883, US 9,051,375, US 9,051,375, US 9,683,013, US 2019/048046 및 US 10,703,774에 공개되어 있으며, 이들 모두는 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 용량 손실로 인해 분리 매트릭스가 폐기되어야 하기 전에 NaOH를 사용한 더 많은 수의 세정 사이클을 허용하면서, 더 높은 알칼리 안정성을 갖는 돌연변이체에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 이 분야에서는 알칼리성 세정 절차에 대해 추가로 개선된 안정성을 갖는 단백질 리간드를 함유하는 분리 매트릭스를 수득할 필요성이 여전히 존재한다. 또한, 치료 항체의 경제적으로 효율적인 정제를 가능하게 하도록 개선된 결합 용량을 갖는 이러한 분리 매트릭스에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명의 한 양태는 개선된 알칼리성 안정성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 이는 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Fc-결합 폴리펩티드에 의해 달성된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 서열식별번호: 11에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3 SKAILAEAKK LNDAQ (서열식별번호 11)
여기서 서로 개별적으로
X1=A 또는 W이고,
X2=E 또는 R이고,
X3=V 또는 Q이며,
단, X1이 A인 경우, X2=R이고, X2=E인 경우, X1=W이다.
하나의 이점은 모체 폴리펩티드에 비해 알칼리성 안정성이 개선되고, 이뮤노글로불린 및 다른 Fc-함유 단백질에 대한 고도로 선택적인 결합이 유지된다는 것이다.
본 발명의 제2 양태는 복수의 폴리펩티드를 포함하는, 개선된 알칼리성 안정성을 갖는 다량체를 제공하는 것이다. 이는 상기 개시된 폴리펩티드의 다량체로 달성된다.
본 발명의 제3 양태는 개선된 알칼리성 안정성을 갖는 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산 또는 벡터를 제공하는 것이다. 이는 상기 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산 또는 벡터로 달성된다.
본 발명의 제4 양태는 개선된 알칼리성 안정성을 갖는 폴리펩티드 또는 다량체를 발현할 수 있는 발현 시스템을 제공하는 것이다. 이는 상기 개시된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템으로 달성된다.
본 발명의 제5 양태는 이뮤노글로불린 및 다른 Fc-함유 단백질에 선택적으로 결합할 수 있고 개선된 알칼리성 안정성을 나타낼 수 있는 분리 매트릭스를 제공하는 것이다. 이는 다공성 지지체에 공유 커플링된 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는 분리 매트릭스로 달성된다.
하나의 이점은 높은 동적 결합 용량이 제공된다는 것이다. 추가적인 이점은 고도의 알칼리 안정성이 달성된다는 것이다.
본 발명의 제6 양태는 이뮤노글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질을 단리하는 효율적이고 경제적인 방법을 제공하는 것이다. 이는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 달성된다.
a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 상기 개시된 바와 같은 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 분리 매트릭스를 세척액으로 세척하는 단계,
c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리하는 단계, 및
d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계.
본 발명의 추가적인 적합한 실시양태는 종속항에 기재되어 있다.
정의
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 또한 항체의 단편, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 접합체를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "Fc-결합 폴리펩티드" 및 "Fc-결합 단백질"은 각각 항체의 결정화가능 부분 (Fc)에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하고, 예를 들어 단백질 A 및 단백질 G, 또는 상기 결합 특성을 유지한 그의 임의의 단편 또는 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 용어 "링커(linker)"는 다량체에서 2개의 폴리펩티드 단위, 단량체 또는 도메인을 서로 연결하는 요소를 의미한다.
본원에서 용어 "스페이서(spacer)"는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 다량체를 지지체에 연결하는 요소를 의미한다.
아미노산 서열의 비교와 관련하여 용어 "% 동일성"은 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 예를 들어 문헌 Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410에 기재된 베이직 로컬 얼라인먼트 툴 (Basic Local Alignment Tool) (블라스트(BLAST)™)에 의해 결정된다. 이를 위한 웹-기반 소프트웨어는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome에서 미국 국립 의학 도서관으로부터 무료로 입수가능하다. 여기서, 알고리즘 "blastp (단백질-단백질 BLAST)"는 질의 서열을 대상 서열과 정렬하고, 특히 % 동일성을 결정하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)", "갖는(having)" 등은 미국 특허법에서 이들에게 부여한 의미를 가질 수 있고, "포함하다(includes)", "포함한(including)" 등을 의미할 수 있다. "~로 본질적으로 이루어진 (Consisting essentially of)" 또는 "본질적으로 이루어진다(consists essentially)"는 마찬가지로 미국 특허법에서 부여한 의미를 가지며, 상기 용어는 개방형이어서 언급된 것의 기본 또는 신규한 특징이 언급된 것을 초과하는 것의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 이러한 언급된 것을 초과하는 것의 존재를 허용하지만, 선행 기술 실시양태는 배제한다.
도 1은 서열식별번호: 1-7에 의해 정의된 Fc-결합 도메인의 정렬을 보여준다.
한 양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Fc-결합 폴리펩티드를 개시한다. 추가적으로, 서열식별번호: 10에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Fc-결합 폴리펩티드가 개시되어 있다. 이러한 도메인 내의 위치 1 및 3에서의 돌연변이는 이뮤노글로불린-결합 특성을 손상시키지 않으면서 모체 도메인/폴리펩티드와 비교하여 개선된 알칼리 안정성을 부여한다. 따라서, 폴리펩티드는 또한 Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로 Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드 단위로서 기재될 수 있다. 이는 알칼리-안정한 Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드로서 추가로 기재될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 IgG의 Fab 부분의 VH3 도메인에 결합할 수 있으며, 이는 이들이 또한 예를 들어 VH3-함유 Fab 단편의 포획에 사용될 수 있음을 의미한다. 이는 VH3에 결합하지 않는 단백질 Z-유래 알칼리-안정한 단백질 A 수지 맵셀렉트(MabSelect)TM 슈어(SuRe) (시티바)와 대조적이다 (T A Seldon et al: J Biomolecular Techniques 22(2), 2011, 50-52).
서열식별번호: 8
AQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
서열식별번호: 9
WQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
서열식별번호: 10
WQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
(알칼리-안정한) Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드는 또한 서열식별번호: 11에 의해 정의된 바와 같은 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것으로 기재될 수 있다.
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3 SKAILAEAKK LNDAQ (서열식별번호: 11)
여기서 서로 개별적으로
X1=A 또는 W이고,
X2=E 또는 R이고,
X3=V 또는 Q이며,
단, X1이 A인 경우, X2=R이고, X2=E인 경우, X1=W이다.
폴리펩티드는 N- 및/또는 C-말단 단부에 추가적인 아미노산 잔기, 예를 들어 N-말단 단부에 리더 서열 및/또는 C-말단 단부에 테일 서열을 추가로 포함할 수 있다. 리더 서열은 예를 들어 1-20개 아미노산 서열, 예컨대 3-20, 4-12 또는 6-8개 아미노산 서열일 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 VFDKE, AKFDKE, VDA, VDAKFDKE, KFDKE, KVDKE, KADKE, ADNKFNKE, VDNKFNKE, YEDGVDAKFDKE, AQYEDGKQYTDT 및 AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 대안적으로 VFDKE, AKFDKE, VDA, VDAKFDKE, KFDKE, KVDKE, KADKE, YEDGVDAKFDKE, AQYEDGKQYTDT 및 AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 80% 동일성, 예컨대 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 특히, 리더 서열은 아미노산 서열 VDAKFDKE에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 80% 동일성, 예컨대 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다. 테일 서열은 예를 들어 1-5개의 아미노산 서열, 예컨대 2-4개의 아미노산 서열일 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 AP, APK 및 APA로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 예컨대 아미노산 서열 APK에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 60% 동일성을 가질 수 있다. 적합하게는, 리더 및 테일은 어떠한 아스파라긴 잔기도 함유하지 않는다. 또한, 테일은 유리하게는 프롤린을 포함할 수 있다. 적합한 리더 및 테일 서열은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 10,703,774에 추가로 기재되어 있다. 따라서, 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
[리더]-[서열식별번호: 8, 9, 10 또는 11]-[테일]
여기서 리더 및 테일은 상기 기재된 바와 같다.
제2 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 임의의 실시양태에 의해 정의된 바와 같은 복수의 연결된 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 다량체를 개시한다. 다량체의 사용은 이뮤노글로불린 결합 용량을 증가시킬 수 있고, 다량체는 또한 단량체보다 더 높은 알칼리 안정성을 가질 수 있다. 다량체는 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체일 수 있다. 이는 다량체 내의 모든 폴리펩티드가 동일한 동종다량체일 수 있거나, 또는 적어도 1개의 단위가 다른 것과 상이한 이종다량체일 수 있다. 유리하게는, 다량체 내의 모든 폴리펩티드는 예컨대 상기 개시된 서열을 포함함으로써 알칼리 안정하다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단 단부와 N-말단 단부 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 직접 연결될 수 있다. 대안적으로, 다량체 내의 2개 이상의 폴리펩티드는 올리고머 또는 중합체 종을 포함하는 링커, 예컨대 최대 25 또는 30개의 아미노산, 예컨대 3-25 또는 3-20개의 아미노산을 갖는 펩티드를 포함하는 링커에 의해 연결될 수 있다. 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같은 리더 및/또는 테일 서열을 포함하는 경우에, 다량체는 적합하게는 링커가 없을 수 있다. 링커는 예를 들어 APKVDAKFDKE, APKVDNKFNKE, APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 대안적으로 APKVDAKFDKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다. 이들은 또한 APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK 및 APKYEDGVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다. 이러한 링커의 성질은 바람직하게는 단백질 단위의 공간 입체형태를 불안정화시키지 않아야 한다. 이는 예를 들어 링커 내의 프롤린의 존재를 피함으로써 달성될 수 있다. 또한, 상기 링커는 바람직하게는 또한 돌연변이된 단백질 단위의 특성을 손상시키지 않도록 알칼리성 환경에서 충분히 안정해야 한다. 이러한 목적을 위해, 링커가 아스파라긴을 함유하지 않는 것이 유리하다. 링커가 글루타민을 함유하지 않는 것이 추가적으로 유리할 수 있다. 적합한 링커 서열은 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 10,703,774에 추가로 기재되어 있다.
다량체는 추가로 N-말단 단부에, 예를 들어 클로닝 과정으로부터 기원하거나 또는 본원에서 N-말단 서열로 불리는 절단된 신호 서열로부터의 잔기를 구성하는 복수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 추가적인 아미노산 잔기의 수는 예를 들어 20개 이하, 예컨대 15개 이하, 예컨대 10개 이하 또는 5개 이하일 수 있다. 구체적 예로서, 다량체는 N-말단 단부에 AQ, AQGT, VDAKFDKE, AQVDAKFDKE, AQGTVDAKFDKE, AQYEDGKQYTDT, AQYEDGKQYT, AQKDQTWYTG, AQHDEAQQEA, AQGGGSGGGS, AQYEDGKQYGT, AQYEDGKQGT, AQYEDGKQYTTLEKGT, AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT, AQYEDGKQYTET, AQYEDGKQYTDT, AQYEDGKQYTAT, AQYEDGKQYEDT, AQHHHHHHHHGT, AQHHHHHHGT 또는 AQHDEAQQEAGT 서열을 포함할 수 있다. N-말단 서열은 전문이 본원에 참조로 포함되는 US20200318120에서 추가로 논의된다.
일부 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 폴리펩티드 및/또는 다량체는 C-말단 또는 N-말단 단부에 1개 이상의 시스테인 잔기, 복수의 리신 잔기 및 복수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 커플링 요소를 추가로 포함한다. 커플링 요소(들)는 또한 C-말단 또는 N-말단 단부로부터 1-5개의 아미노산 잔기 내에, 예컨대 1-3 또는 1-2개의 아미노산 잔기 내에 위치할 수 있다. 커플링 요소는 예를 들어 C-말단 단부의 단일 시스테인일 수 있다. 커플링 요소(들)는 C- 또는 N-말단 단부에 직접 연결될 수 있거나, 또는 15개 이하의 아미노산, 예컨대 1-5, 1-10 또는 5-10개의 아미노산을 포함하는 스트레치를 통해 연결될 수 있다. 이 스트레치는 바람직하게는 또한 돌연변이된 단백질의 특성을 손상시키지 않도록 알칼리성 환경에서 충분히 안정해야 한다. 이러한 목적을 위해, 스트레치가 아스파라긴을 함유하지 않는 것이 유리하다. 스트레치가 글루타민을 함유하지 않는 것이 추가적으로 유리할 수 있다. C-말단 시스테인을 갖는 것의 이점은 단백질의 끝점 커플링이 지지체 상의 친전자성 기와 시스테인 티올의 반응을 통해 달성될 수 있다는 것이다. 이는 결합 용량에 중요한 커플링된 단백질의 탁월한 이동성을 제공한다.
상기 기재에 따라, 다량체는 예를 들어 하기의 구조를 가질 수 있다:
[N-말단 서열]-([폴리펩티드])n-[커플링 요소], 또는
[N-말단 서열]-([폴리펩티드]-[링커])n-[커플링 요소],
여기서, N-말단 서열, 폴리펩티드, 링커 및 커플링 요소는 상기 논의된 바와 같고, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 예컨대 4, 5, 6 또는 7로 예시되는 바와 같이 2-10이다.
폴리펩티드 또는 다량체의 알칼리 안정성은, 예를 들어 NHS- 또는 말레이미드 커플링 화학을 사용하여 이를 SPR 칩, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 비아코어(Biacore) CM5 센서 칩에 커플링시키고, 명시된 온도, 예를 들어 22 +/- 2 ℃에서 알칼리성 용액 내에서 인큐베이션하기 이전 및 이후에, 전형적으로 폴리클로날 인간 IgG를 사용하여 칩의 이뮤노글로불린-결합 용량을 측정함으로써 평가될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들어 0.5 M NaOH 내에서 복수의 10분 사이클, 예컨대 100, 200 또는 300 사이클 동안 수행될 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서 0.5 M NaOH 내에서 100회 10분 인큐베이션 사이클 이후 매트릭스의 IgG 용량은 인큐베이션 이전 IgG 용량의 적어도 55, 예컨대 적어도 60, 적어도 80 또는 적어도 90%일 수 있다. 대안적으로, 상기와 같이 측정된 특정한 돌연변이체에 대한 100회 사이클 이후의 잔류 IgG 용량을 모체 폴리펩티드/다량체에 대한 잔류 IgG 용량과 비교할 수 있다. 이 경우에, 돌연변이체에 대한 잔류 IgG 용량은 모체 폴리펩티드/다량체의 적어도 105%, 예컨대 적어도 110%, 적어도 125%, 적어도 150% 또는 적어도 200%일 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 임의의 실시양태에 따른 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산을 개시한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열의 모든 형태, 예컨대 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 RNA 및 DNA를 포괄한다. 본 발명은 코딩 서열뿐만 아니라 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 다량체의 발현에 필요한 신호 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 플라스미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 본 발명에 따른 다량체를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 각각의 단위를 코딩하는 개별 핵산은 상동 또는 이종 DNA 서열을 가질 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템을 개시한다. 발현 시스템은 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 또는 다량체를 발현하도록 변형된 그람-양성 또는 그람-음성 원핵 숙주 세포 시스템, 예를 들어 이. 콜라이(E.coli) 또는 바실루스 종(Bacillus sp.)일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 발현 시스템은 진핵 숙주 세포 시스템, 예컨대 효모, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포이다.
제5 양태에서, 본 발명은 Fc-결합 리간드로 표시되는 복수의 폴리펩티드 또는 다량체가 상기 개시된 임의의 실시양태에 따라 고체 지지체에 커플링된 분리 매트릭스를 개시한다. 분리 매트릭스는 다공성 지지체에 공유 커플링된 적어도 11, 예컨대 11-25, 15-25 또는 15-22 mg/ml Fc-결합 리간드를 포함할 수 있고, 여기서 적합하게는
a) 리간드는 상기 논의된 바와 같은 다량체 또는 폴리펩티드를 포함하고,
b) 다공성 지지체는 50-75, 예컨대 56-70 또는 56-66 마이크로미터의 부피-가중 중앙 직경 (d50,v) 및 55-80, 예컨대 60-78 또는 65-78 mg/ml의 건조 고체 중량을 갖는 가교된 중합체 입자를 포함한다. 가교된 중합체 입자는 추가로 Mw 110 kDa의 덱스트란에 대해 0.69-0.85, 예컨대 0.70-0.85 또는 0.69-0.80의 역 겔 여과 크로마토그래피 Kd 값에 상응하는 세공 크기를 가질 수 있다. 적합하게는, 가교된 중합체 입자는 높은 강성을 가져서 높은 유속을 견딜 수 있다. 강성은 매트릭스로 패킹된 칼럼을 증류수의 증가하는 유속에 적용시키는 압력-유동 시험으로 측정될 수 있다. 압력이 증가함에 따라 유속이 감소하기 시작할 때까지, 압력을 단계적으로 증가시키고 유속 및 배압을 측정한다. 달성된 최대 유속 및 최대 압력 (최대 유속에 상응하는 배압)을 측정하고, 강성의 척도로서 사용한다. 파인라인(FineLine)™ 35 칼럼 (시티바)에서 300 +/- 10 mm의 베드 높이에서 측정시, 최대 압력은 적합하게는 적어도 0.58 MPa, 예컨대 적어도 0.60 MPa일 수 있다. 이는 보다 작은 입자 직경의 사용을 가능하게 하며, 이는 동적 용량에 유리하다. 다량체는 예를 들어 알칼리-안정화된 단백질 A 도메인의 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체, 예컨대 알칼리-안정화된 단백질 A 도메인의 육량체를 포함할 수 있다. 높은 리간드 함량과 입자 크기 범위, 건조 고체 중량 범위 및 선택적인 Kd 범위의 조합은, 예를 들어 IgG에 대한 10% 파과(breakthrough) 동적 결합 용량이 2.4분 체류 시간에서 적어도 45 mg/ml, 예컨대 적어도 50 또는 적어도 55 mg/ml이도록 높은 결합 용량을 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로, IgG에 대한 10% 파과 동적 결합 용량은 6분 체류 시간에서 적어도 60 mg/ml, 예컨대 적어도 65, 적어도 70 또는 적어도 75 mg/ml일 수 있다.
알칼리-안정화된 단백질 A 다량체는 IgG에 대해 고도로 선택적이며, 분리 매트릭스는 적합하게는 20 mM 포스페이트 완충제, 180 mM NaCl, pH 7.5에서 0.2 mg/ml 미만, 예컨대 0.1 mg/ml 미만의 인간 IgG2에 대한 해리 상수를 가질 수 있다. 이는 문헌 [N Pakiman et al: J Appl Sci 12, 1136-1141 (2012)]에 기재된 흡착 등온선 방법에 따라 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 다공성 지지체에 공유 커플링된 적어도 15, 예컨대 15-21 또는 15-18 mg/ml Fc-결합 리간드를 포함하는 분리 매트릭스를 개시하며, 여기서 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 도메인의 다량체를 포함한다. 이러한 다량체는 적합하게는 상기 기재된 임의의 실시양태에 개시된 바와 같거나 또는 하기 명시된 바와 같을 수 있다.
이러한 매트릭스는 이뮤노글로불린 또는 다른 Fc-함유 단백질의 분리에 유용하고, 폴리펩티드/다량체의 개선된 알칼리 안정성으로 인해, 매트릭스는 세정하는 동안 높은 알칼리성인 조건을 견딜 것이며, 이는 생물공정 분리 설정에서의 장기간 반복 사용에 필수적이다. 매트릭스의 알칼리 안정성은 명시된 온도, 예를 들어 22 +/- 2 ℃에서 알칼리성 용액 내에서 인큐베이션하기 이전 및 이후에, 전형적으로 폴리클로날 인간 IgG를 사용하여 이뮤노글로불린-결합 용량을 측정함으로써 평가될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들어 25, 50 또는 75시간의 총 인큐베이션 시간에 상응하는 다수의 15분 사이클, 예컨대 100, 200 또는 300회 사이클 동안 0.5 M 또는 1.0 M NaOH 내에서 수행될 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서 0.5 M NaOH 내에서 96-100회 15분 인큐베이션 사이클 또는 24 또는 25시간의 총 인큐베이션 시간 이후의 매트릭스의 IgG 용량은 인큐베이션 이전의 IgG 용량의 적어도 80, 예컨대 적어도 85, 적어도 90 또는 적어도 95%일 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서 1.0 M NaOH 내에서 24시간의 총 인큐베이션 시간 이후 매트릭스의 용량은 인큐베이션 이전 IgG 용량의 적어도 70, 예컨대 적어도 80 또는 적어도 90%일 수 있다. 2.4분 또는 6분 체류 시간에서 IgG에 대한 10% 파과 동적 결합 용량 (Qb10%)은 예를 들어 22 +/- 2 ℃에서 1.0 M 수성 NaOH 내에서 31시간 인큐베이션 이후에 20% 미만만큼 감소될 수 있다.
통상의 기술자가 이해할 바와 같이, 발현된 폴리펩티드 또는 다량체는 지지체에 고정되기 전에 적절한 정도로 정제되어야 한다. 이러한 정제 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 지지체에 대한 단백질-기반 리간드의 고정화는 표준 방법을 사용하여 용이하게 수행된다. 적합한 방법 및 지지체는 하기에서 보다 상세하게 논의될 것이다.
본 발명에 따른 매트릭스의 고체 지지체는 임의의 적합한 널리 공지된 종류의 것일 수 있다. 통상의 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기 성질을 가지며, 친수성 표면을 사용된 수성 매질에 노출시키는, 즉 그의 외부 및, 존재하는 경우, 또한 내부 표면 상에 히드록시 (-OH), 카르복시 (-COOH), 카르복스아미도 (-CONH2, 가능하게는 N- 치환된 형태), 아미노 (-NH2, 가능하게는 치환된 형태), 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시 기를 노출시키는 중합체를 기재로 한다. 고체 지지체는 적합하게는 다공성일 수 있다. 다공도는, 예를 들어 문헌 Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13에 기재된 방법에 따라 역 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 Kav 또는 Kd 값 (특정한 크기의 프로브 분자에 이용가능한 세공 부피의 분율)으로서 표현될 수 있다. Kav는 비 (Ve-V0)/(Vt-V0)로서 결정되며, 여기서 Ve는 프로브 분자 (예를 들어 덱스트란 110 kD)의 용리 부피이고, V0은 칼럼의 공극 부피 (예를 들어 미가공 덱스트란과 같은 높은 Mw 공극 마커의 용리 부피)이고, Vt는 칼럼의 총 부피이다. Kd는 (Ve-V0)/Vi로서 결정될 수 있으며, 여기서 Vi는 매트릭스 부피 (매트릭스 중합체 분자가 차지하는 부피)를 제외한 모든 부피에 접근할 수 있는 염 (예를 들어, NaCl)의 용리 부피이다. 정의에 의하면, Kd 및 Kav 값 모두 항상 범위 0 - 1 내에 있다. Kav 값은 유리하게는 프로브 분자로서 Mw 110 kDa의 덱스트란으로 측정시 0.6 - 0.95, 예를 들어 0.7 - 0.90 또는 0.6 - 0.8일 수 있다. Mw 110 kDa의 덱스트란으로 측정된 Kd 값은 적합하게는 0.68-0.90, 예컨대 0.68-0.85 또는 0.70-0.85일 수 있다. 이것의 이점은 지지체가 본 발명의 폴리펩티드/다량체 및 폴리펩티드/다량체에 결합하는 이뮤노글로불린을 둘 다 수용할 수 있고 결합 부위로 및 결합 부위로부터 이뮤노글로불린의 대량 수송을 제공할 수 있는 큰 분율의 세공을 갖는다는 것이다.
폴리펩티드 또는 다량체는 예를 들어 리간드에 존재하는 티올, 아미노 및/또는 카르복시 기를 이용하는 통상의 커플링 기술을 통해 지지체에 부착될 수 있다. 비스에폭시드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 널리 공지된 커플링 시약이다. 지지체와 폴리펩티드/다량체 사이에, 스페이서로서 알려진 분자가 도입될 수 있으며, 이는 폴리펩티드/다량체의 이용가능성을 향상시키고, 지지체에 대한 폴리펩티드/다량체의 화학적 커플링을 용이하게 한다. 폴리펩티드/다량체의 성질 및 커플링 조건에 따라, 커플링은 다중점 커플링 (예를 들어 복수의 리신을 통한다) 또는 단일점 커플링 (예를 들어 단일 시스테인을 통한다)일 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드/다량체는 비-공유 결합, 예컨대 물리적 흡착 또는 생체특이적 흡착에 의해 지지체에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 매트릭스는 지지체에 커플링된 폴리펩티드 또는 다량체 5 - 25, 예컨대 5-20 mg/ml, 5 - 15 mg/ml, 5 - 11 mg/ml 또는 6 - 11 mg/ml를 포함한다. 커플링된 폴리펩티드/다량체의 양은 커플링 과정에 사용된 폴리펩티드/다량체의 농도에 의해, 사용된 활성화 및 커플링 조건에 의해 및/또는 사용된 지지체의 세공 구조에 의해 제어될 수 있다. 일반적으로, 매트릭스의 절대 결합 용량은 적어도 세공이 커플링된 폴리펩티드/다량체에 의해 유의하게 수축되는 시점까지는 커플링된 폴리펩티드/다량체의 양에 따라 증가한다. 이론에 얽매이지 않고, 지지체에 대해 언급된 Kd 값의 경우, 커플링된 리간드에 의한 세공의 수축이 보다 낮은 유의성을 갖는 것으로 보인다. 커플링된 폴리펩티드/다량체 mg당 상대적인 결합 용량은 높은 커플링 수준에서 감소할 것이며, 그 결과 상기 명시된 범위 내에서 최적의 비용-편익을 초래한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 다량체는 티오에테르 결합을 통해 지지체에 커플링된다. 이러한 커플링을 수행하는 방법은 이 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 표준 기술 및 장비를 사용하여 이 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행된다. 티오에테르 결합은 유연하고 안정적이며, 일반적으로 친화성 크로마토그래피에 사용하기에 적합하다. 특히 티오에테르 결합이 폴리펩티드 또는 다량체 상의 말단 또는 말단-근접 시스테인 잔기를 통하는 경우에, 커플링된 폴리펩티드/다량체의 이동성이 증진되어 개선된 결합 용량 및 결합 동역학을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드/다량체는 상기 기재된 바와 같은 단백질 상에 제공된 C-말단 시스테인을 통해 커플링된다. 이는 지지체 상의 친전자성 기, 예를 들어 에폭시드 기, 할로히드린 기 등에 대한 시스테인 티올의 효율적인 커플링을 가능하게 하여, 티오에테르 가교 커플링을 야기한다.
특정 실시양태에서, 지지체는 폴리히드록시 중합체, 예컨대 폴리사카라이드를 포함한다. 폴리사카라이드의 예는 예를 들어 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란, 한천, 아가로스 등을 포함한다. 폴리사카라이드는 본래 낮은 정도의 비특이적 상호작용을 갖는 친수성이고, 이는 높은 함량의 반응성 (활성화가능한) 히드록실 기를 제공하고, 일반적으로 생물공정에 사용되는 알칼리성 세정 용액에 대하여 안정하다.
일부 실시양태에서, 지지체는 한천 또는 아가로스를 포함한다. 본 발명에 사용되는 지지체는 표준 방법, 예컨대 역 현탁 겔화 (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 대안적으로, 베이스 매트릭스는 상업적으로 입수가능한 제품, 예컨대 세파로스(SEPHAROSE)™ FF (시티바)의 이름으로 판매되는 가교된 아가로스 비드이다. 대규모 분리에 특히 유리한 실시양태에서, 지지체는 US 6,602,990 또는 US 7,396,467 (전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 방법을 사용하여 그의 강성을 증가시키도록 개조되었고, 따라서 매트릭스가 높은 유속에 보다 적합하게 된다.
특정 실시양태에서, 지지체, 예컨대 중합체, 폴리사카라이드 또는 아가로스 지지체는, 예컨대 히드록시알킬 에테르 가교로 가교된다. 이러한 가교를 생성하는 가교제 시약은 예를 들어 에피클로로히드린과 같은 에피할로히드린, 부탄디올 디글리시딜 에테르와 같은 디에폭시드, 알릴 할라이드 또는 알릴 글리시딜 에테르와 같은 알릴화 시약일 수 있다. 가교는 지지체의 강성에 유익하고, 화학적 안정성을 개선시킨다. 히드록시알킬 에테르 가교는 알칼리 안정적이고 유의한 비특이적 흡착을 유발하지 않는다.
대안적으로, 고체 지지체는 합성 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리히드록시알킬 아크릴레이트, 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등을 기재로 한다. 소수성 중합체, 예컨대 디비닐 및 모노비닐-치환된 벤젠을 기재로 하는 매트릭스의 경우에, 매트릭스의 표면은 종종 친수성화되어 상기 정의된 바와 같은 친수성 기를 주위 수성 액체에 노출시킨다. 이러한 중합체는 표준 방법에 따라 용이하게 제조되며, 예를 들어 문헌 "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))을 참조한다. 대안적으로, 상업적으로 입수가능한 제품, 예컨대 소스(SOURCE)™ (시티바)가 사용된다. 또 다른 대안에서, 본 발명에 따른 고체 지지체는 무기 성질의 지지체, 예를 들어 실리카, 산화지르코늄 등을 포함한다.
추가 실시양태에서, 고체 지지체는 표면, 칩, 모세관 또는 필터 (예를 들어, 막 또는 심층 필터 매트릭스)와 같은 또 다른 형태이다. 지지체가 막인 경우, 막은 적합하게는 US 10,696,714, US 10,850,259 또는 US 16/959,373 (전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 10-1000 nm 직경의 나노섬유를 포함하는 섬유성 막일 수 있다. 나노섬유는 적합하게는 셀룰로스 나노섬유일 수 있다.
본 발명에 따른 매트릭스의 형상과 관련하여, 특정 실시양태에서 매트릭스는 다공성 단일체의 형태이다. 대안적 실시양태에서, 매트릭스는 다공성 또는 비-다공성일 수 있는 비드 또는 입자 형태이다. 비드 또는 입자 형태의 매트릭스는 충전층으로서 또는 현탁된 형태로 사용될 수 있다. 현탁된 형태는 입자 또는 비드가 자유롭게 이동하는, 팽창층 및 순수한 현탁액으로 공지된 것을 포함한다. 단일체, 충전층 및 팽창층의 경우에, 분리 절차는 통상적으로 농도 구배를 사용하는 통상적인 크로마토그래피를 따른다. 순수한 현탁액의 경우에, 배치식 방식이 사용될 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 분리 매트릭스가 사용되는, 이뮤노글로불린을 단리하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다.
a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 상기 개시된 바와 같은 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 분리 매트릭스를 세척액으로 세척하는 단계,
c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리하는 단계, 및
d) 0.1 - 1.0 M NaOH 또는 KOH, 예컨대 0.4 - 1.0 M NaOH 또는 KOH를 포함할 수 있는 세정액으로 분리 매트릭스를 세정하는 단계
단계 a) - d)는 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50 - 200, 50-300 또는 50-400회 반복될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 상기 개시된 바와 같은 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 상기 분리 매트릭스를 세척액으로 세척하는 단계,
c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리하는 단계, 및
d) 분리 매트릭스를, 대안적으로 제자리 세정(cleaning-in-place, CIP) 액체로 불릴 수 있는 세정액으로, 예를 들어 적어도 10분의 접촉 (인큐베이션) 시간 동안 세정하는 단계.
상기 방법은 또한 단계 a) 전에, 상기 기재된 임의의 실시양태에 따른 친화성 분리 매트릭스를 제공하고, 이뮤노글로불린 및 적어도 1종의 다른 물질을 포함하는 용액을 액체 샘플로서 제공하는 단계, 및 단계 c) 후에, 용리액을 회수하고, 선택적으로 용리액을, 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가적인 분리 단계에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 액체 샘플, 세척액 및 용리액의 적합한 조성물, 뿐만 아니라 분리를 수행하기 위한 일반적 조건은 친화성 크로마토그래피 분야, 특히 단백질 A 크로마토그래피 분야에 널리 공지되어 있다. Fc-함유 단백질 및 적어도 하나의 다른 물질을 포함하는 액체 샘플은 숙주 세포 단백질 (HCP), 예컨대 CHO 세포, 이. 콜라이 또는 효모 단백질을 포함할 수 있다. CHO 세포 및 이. 콜라이 단백질의 함량은 이러한 단백질에 대해 지시된 면역검정, 예를 들어 시그누스 테크놀로지스(Cygnus Technologies)로부터의 CHO HCP 또는 이. 콜라이 HCP ELISA 키트에 의해 편리하게 결정될 수 있다. 숙주 세포 단백질 또는 CHO 세포/이. 콜라이 단백질은 단계 b) 동안 탈착될 수 있다.
용리는 단백질 A 매체로부터의 용리에 사용되는 임의의 적합한 용액을 사용함으로써 수행될 수 있다. 이는 예를 들어 pH 5 이하, 예컨대 pH 2.5 - 5 또는 3 - 5를 갖는 용액 또는 완충제일 수 있다. 이는 또한 일부 경우에 pH 11 이상, 예컨대 pH 11 - 14 또는 pH 11 - 13을 갖는 용액 또는 완충제일 수 있다. 일부 실시양태에서 용리 완충제 또는 용리 완충제 구배는 적어도 1종의 일관능성, 이관능성 또는 삼관능성 카르복실산 또는 이러한 카르복실산의 염을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용리 완충제 또는 용리 완충제 구배는 아세테이트, 시트레이트, 글리신, 숙시네이트, 포스페이트 및 포르미에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 음이온 종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세정액은 알칼리성이며, 예컨대 pH가 13 - 14이다. 이러한 용액은 특히 간격의 상한에서 매트릭스의 효율적인 세정을 제공한다.
특정 실시양태에서, 세정액은 0.1 - 2.0 M NaOH 또는 KOH, 예컨대 0.5 - 2.0 또는 0.5 - 1.0 M NaOH 또는 KOH를 포함한다. 이는 효율적인 세정 용액이고, 특히 NaOH 또는 KOH 농도가 0.1 M 초과 또는 적어도 0.5 M일 때 그러하다. 본 발명의 폴리펩티드의 높은 안정성은 그러한 강한 알칼리성 용액의 사용을 가능하게 한다.
방법은 또한 예를 들어 과산화물, 예컨대 과산화수소 및/또는 과산, 예컨대 과아세트산 또는 과포름산을 포함할 수 있는 소독액으로 매트릭스를 소독하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 a) - d)는 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50 - 200, 50-300 또는 50-500회 반복된다. 이는 매트릭스가 여러 번 재사용될 수 있다는 점에서 공정 경제성에 중요하다.
단계 a) - c)는 또한 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50 - 200, 50-300 또는 50-500회 반복될 수 있으며, 여기서 단계 d)는 단계 d)가 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회 수행되도록 복수의 단계 c)의 회차 후에 수행된다. 단계 d)는, 예를 들어 단계 c)의 2번째 내지 20번째의 회차마다 수행될 수 있다.
실시예
단백질의 돌연변이유발
돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발을 2-단계 PCR에 의해 수행하였다. 주형으로서, Z, B 또는 C의 단일 도메인을 함유하는 플라스미드를 사용하였다. PCR 단편을 이. 콜라이 발현 벡터 내로 라이게이션하였다. DNA 서열분석을 사용하여 삽입된 단편의 정확한 서열을 확인하였다.
돌연변이체의 다량체를 형성하기 위해, B, C 또는 Z 도메인의 개시 코돈 (GTA GAC)에 위치한 Acc I 부위를 사용하였고, 이는 아미노산 VD에 상응한다. 단량체 도메인에 대한 벡터를 Acc I로 소화시키고, 포스파타제 처리를 하였다. Acc I 점착성-말단 프라이머를 각각의 변이체에 대해 특이적으로 설계하고, 2개의 중첩 PCR 생성물을 각각의 주형으로부터 생성하였다. PCR 생성물을 정제하고, 2% 아가로스 겔 상에서 PCR 생성물을 비교함으로써 농도를 추정하였다. 동등량의 쌍별 PCR 생성물을 라이게이션 완충제 내에서 혼성화시켰다 (45분 동안 90 ℃ -> 25 ℃). 생성된 생성물은 Acc I 부위 내로 라이게이션될 가능성이 있는 단편 (정확한 PCR 단편 및/또는 소화된 벡터)의 대략 1/4로 이루어진다. 라이게이션 및 형질전환 후에, 콜로니를 PCR 스크리닝하여 목적하는 돌연변이체를 함유하는 구조물을 확인하였다. 양성 클론을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
구축물 발현 및 정제
표준 배지에서의 이. 콜라이 K12의 발효에 의해 구축물을 박테리아 주변세포질에서 발현시켰다. 발효 후, 세포를 열-처리하여 주변세포질 내용물을 배지 내로 방출시켰다. 배지 내로 방출된 구축물을 0.2 μm 세공 크기를 가진 막을 사용한 마이크로여과에 의해 회수하였다.
이제 여과 단계로부터의 투과물 내의 각각의 구축물을 친화성에 의해 정제하였다. 투과물을 고정된 IgG (IgG 세파로스 6FF, 시티바)를 함유하는 크로마토그래피 매체 상에 로딩하였다. 로딩된 생성물을 포스페이트 완충 염수로 세척하고, pH를 낮춰 용리시켰다.
용리 풀을 중성 pH (pH 8)로 조정하고, 디티오트레이톨을 첨가하여 환원시켰다. 이어서, 샘플을 음이온 교환체 상에 로딩하였다. 세척 단계 후, 구축물을 NaCl 구배에서 용리시켜 이를 임의의 오염물로부터 분리하였다. 용리 풀을 한외 여과로 40-50 mg/ml로 농축시켰다. 고정된 IgG 매체 상에서 구축물의 성공적인 친화성 정제는 해당 구축물이 IgG에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 나타낸다는 것을 주목해야 한다.
정제된 리간드를 RPC LC-MS로 분석하여 순도를 결정하고 분자량이 예상 (아미노산 서열에 기초한다)과 상응함을 확인하였다.
실시예 1
N-말단에 AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE 리더 서열 및 C-말단에 APK 테일 서열을 추가로 포함하는 표 1에 열거된 정제된 단량체 리간드를, 비아코어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기기 (시티바, 스웨덴)에서 약 200-1500 RU의 신호 강도를 제공하기에 충분한 양으로 시티바의 아민 커플링 키트 (칩 상의 카르복시메틸 기 상의 아민의 카르보디이미드 커플링을 위함이다)를 사용하여 비아코어 CM5 센서 칩 (시티바, 스웨덴) 상에 고정시켰다. 고정화된 표면의 IgG 결합 용량을 추적하기 위해, 1mg/ml 인간 폴리클로날 IgG (감마놈)를 칩 상에 유동시키고, 신호 강도 (결합의 양에 비례한다)를 기록하였다. 이어서, 표면을 제자리 세정(CIP)하고, 즉 500mM NaOH로 10분 동안 실온 (22 +/- 2 ℃)에서 플러싱하였다. 이를 96-100 사이클 동안 반복하고, 고정된 리간드 알칼리성 안정성을 각각의 사이클 후에 남아있는 IgG 결합 용량 (신호 강도)으로서 추적하였다. AQYEDGKQYTDT 리더 서열을 갖는, US 10,703,774에 개시된 바와 같은 리간드 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1 (서열식별번호: 12)을 참조로서 사용하였다 (서열식별번호: 12는 N-말단 단부에 VDAKFDKE 및 C-말단 단부에 APK를 포함하는 것을 주목한다). 결과는 표 1에 제시되고, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 9 둘 다 참조보다 유의하게 더 알칼리 안정함을 나타낸다.
본원 설명은 최선의 방식을 비롯하여 본 발명을 개시하기 위해, 및 또한 임의의 장치 또는 시스템을 제조 및 사용하고 임의의 포함된 방법을 수행하는 것을 비롯하여 임의의 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해 예를 사용한다. 본 발명의 특허가능한 범위는 청구범위에 의해 정의되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 발생하는 다른 예를 포함할 수 있다. 이러한 다른 예는, 이들이 청구범위의 문자 그대로의 표현과 상이하지 않은 구조적 요소를 갖는 경우에, 또는 이들이 청구범위의 문자 그대로의 표현과 비실질적인 차이를 갖는 균등한 구조적 요소를 포함하는 경우에, 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본문에 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 이들이 개별적으로 포함된 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Cytiva BioProcess R&D AB
<120> SEPARATION MATRIX
<130> 323898-GB-1
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein Z
<400> 6
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar
<400> 7
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar (Q9A,N11R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 8
Ala Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 9
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar (Q9W,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 9
Trp Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 10
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar (Q9W,N11R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 10
Trp Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 11
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar variant
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 11
Xaa Gln Xaa Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Xaa
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zvar (Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 12
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 13
Val Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 14
Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 15
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 16
Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 17
Lys Val Asp Lys Glu
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 18
Lys Ala Asp Lys Glu
1 5
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 19
Tyr Glu Asp Gly Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 20
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 21
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr Val Asp Ala Lys
1 5 10 15
Phe Asp Lys Glu
20
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 22
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader
<400> 23
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 24
Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 25
Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 26
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5 10
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 27
Ala Pro Lys Val Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 28
Ala Pro Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 29
Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 30
Ala Pro Lys Val Asp Ala
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 31
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 32
Ala Pro Lys Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 33
Ala Pro Lys Tyr Glu Asp Gly Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10 15
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 34
Tyr Glu Asp Gly
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 35
Ala Gln Gly Thr
1
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 36
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 37
Ala Gln Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 38
Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 39
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 40
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 41
Ala Gln Lys Asp Gln Thr Trp Tyr Thr Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 42
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 43
Ala Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 44
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Gly Thr
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 45
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Gly Thr
1 5 10
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 46
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Gly Thr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 47
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Gly Thr
20
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 48
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Glu Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 49
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 50
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Ala Thr
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 51
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Asp Thr
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 52
Ala Gln His His His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 53
Ala Gln His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 54
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala Gly Thr
1 5 10
Claims (29)
- 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 하기 서열식별번호: 11에 의해 정의된 바와 같거나, 또는 그와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3 SKAILAEAKK LNDAQ (서열식별번호: 11)
여기서 서로 개별적으로
X1=A 또는 W이고,
X2=E 또는 R이고,
X3=V 또는 Q이며,
단, X1이 A인 경우, X2=R이고, X2=E인 경우, X1=W인,
Fc-결합 폴리펩티드. - 제2항에 있어서, X3=V인 Fc-결합 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1-20개 아미노산 리더 서열을 추가로 포함하는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 제4항에 있어서, 리더 서열이 VFDKE, AKFDKE, VDA, VDAKFDKE, KFDKE, KVDKE, KADKE, ADNKFNKE, VDNKFNKE, YEDGVDAKFDKE, AQYEDGKQYTDT 및 AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 80% 동일성, 예컨대 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 갖는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 제4항에 있어서, 리더 서열이 VFDKE, AKFDKE, VDA, VDAKFDKE, KFDKE, KVDKE, KADKE, YEDGVDAKFDKE 및 AQYEDGKQYTDT 및 AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 80% 동일성, 예컨대 적어도 90% 동일성 또는 적어도 95% 동일성을 갖는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1-5개의 아미노산 테일 서열을 추가로 포함하는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 제7항에 있어서, 상기 테일 서열이 AP, APK 및 APA로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나 또는 그와 적어도 60% 동일성을 갖는, Fc-결합 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복수의 연결된 Fc-결합 폴리펩티드를 포함하는, 다량체.
- 제9항에 있어서, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체인, 다량체.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 폴리펩티드가 25개 이하의 아미노산, 예컨대 3-25 또는 3-20개의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 연결된, 다량체.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드가 APKVDAKFDKE, APKVDNKFNKE, APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된, 다량체.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드가 APKVDAKFDKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된, 다량체.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 단부에 1-20개 아미노산 잔기의 N-말단 서열을 추가로 포함하는, 다량체.
- 제14항에 있어서, 상기 N-말단 서열이 AQ, AQGT, VDAKFDKE, AQVDAKFDKE, AQGTVDAKFDKE, AQYEDGKQYTDT, AQYEDGKQYT, AQKDQTWYTG, AQHDEAQQEA, AQGGGSGGGS, AQYEDGKQYGT, AQYEDGKQGT, AQYEDGKQYTTLEKGT, AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT, AQYEDGKQYTET, AQYEDGKQYTDT, AQYEDGKQYTAT, AQYEDGKQYEDT, AQHHHHHHHHGT, AQHHHHHHGT 및 AQHDEAQQEAGT로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 다량체.
- 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 또는 N-말단 단부에 1개 이상의 시스테인 잔기, 복수의 리신 잔기 및 복수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 커플링 요소를 추가로 포함하는, 다량체.
- 제16항에 있어서, C-말단에 또는 C-말단으로부터 5개 아미노산 잔기 내에 단일 시스테인 잔기를 포함하는, 다량체.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는, 핵산 또는 벡터.
- 제18항의 핵산 또는 벡터를 포함하는, 발현 시스템.
- 고체 지지체에 공유 커플링된 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복수의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는, 분리 매트릭스.
- 제20항에 있어서, 다공성 지지체 ml당 적어도 11 mg의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는, 분리 매트릭스.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 지지체가 다공성 중합체 입자를 포함하는, 분리 매트릭스.
- 제22항에 있어서, 상기 다공성 중합체 입자가 가교된 아가로스 입자인, 분리 매트릭스.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 지지체가 다공성 막을 포함하는, 분리 매트릭스.
- 제24항에 있어서, 상기 지지체가 10-1000 nm 직경의 나노섬유를 포함하는 섬유성 막을 포함하는, 분리 매트릭스.
- 제25항에 있어서, 상기 나노섬유가 셀룰로스 나노섬유인, 분리 매트릭스.
- a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 상기 분리 매트릭스를 세척액으로 세척하는 단계,
c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리하는 단계, 및
d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계
를 포함하는, 이뮤노글로불린을 단리하는 방법. - 제27항에 있어서, 상기 세정액이 0.1 - 1.0 M NaOH 또는 KOH, 예컨대 0.4 - 1.0 M NaOH 또는 KOH를 포함하는, 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 단계 a) - d)가 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50 - 200회 또는 50-400회 반복되는, 방법.
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