CN116615433A - 分离基质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及碱稳定的突变Fc‑结合蛋白A结构域，其与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％同一性。
Description
技术领域
本发明涉及亲和色谱的领域，且更特别地涉及蛋白A的突变的免疫球蛋白-结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本发明还涉及所述突变的结构域的多聚体和涉及含有突变的结构域或多聚体的分离基质。
发明背景
免疫球蛋白代表全世界生产或开发中的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此其价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。
亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆或多克隆抗体的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原-结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样品(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc以及Fab(通过VH3结构域)部分的结构域。这些结构域通常被称为E-、D-、A-、B-和C-结构域(SEQ ID NO:1-5)。
基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物技术领域，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样品(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白A-配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白A的形式(例如Protein A SEPHAROSETM,Cytiva,Uppsala,Sweden)，并且还包含重组蛋白A(例如rProtein A-SEPHAROSETM,Cytiva)。更特别地，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于支持物和提高配体的生产力。
这些应用，像其它亲和色谱应用一样，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质去除这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及称为原位清洁(CIP)的程序，其中使用能够从固定相洗脱污染物的试剂。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是NaOH，且其浓度可在从0.1直至例如1M的范围内，这取决于污染的程度和性质。这个策略与基质暴露于具有高于13的pH值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且由于配体对所涉及的高pH的不稳定性，因此导致能力下降。
因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出耐碱性pH值的改进能力。例如，Gülich等(Susanne Gülich,Martin Linhult,Nygren,Mathias Uhlén,Sophia Hober,Journal of Biotechnology 80(2000),169-178)提出蛋白工程改造以改进链球菌白蛋白-结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性特性。Gülich等创建了一种ABD突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，Gülich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非-工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。
最近的工作显示，也可对蛋白A(SpA)进行修改以实现类似的特性。美国专利7,834,158，其通过引用以其整体结合到本文中，公开了当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13-14的pH值时，与亲本SpA，例如SpA的B-结构域，或蛋白Z(SEQ ID NO:6)(一种源自SpA的B-结构域的合成构建体)(US 5,143,844，通过引用以其整体并入)相比，增加的化学稳定性。作者表明当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离基质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。这特别适用于具有突变N3A,N6D,N23T的蛋白Z(SEQ ID NO:7，本文称为Zvar)，如US 8,198,404中所公开，其通过引用以其整体并入本文。为增加碱稳定性的目的，蛋白A结构域的另外的突变也已经公开于US 8,329,860、JP 2006304633A、US 8,674,073、US 10,072,050、US 9,403,883、US 9,051,375、US 9,051,375、US 9,683,013、US 2019/048046和US 10,703,774中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，仍然需要具有较高的碱稳定性的突变体，其允许在分离基质由于能力损失而不得不丢弃之前用NaOH的较高数量的清洁循环。
因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁程序的进一步改进的稳定性。对这样的分离基质也存在需要，所述分离基质具有改进的结合能力，以允许治疗性抗体的经济有效纯化。
发明简述
本发明的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用Fc-结合多肽实现，所述多肽包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9定义，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％，例如至少98％同一性的氨基酸序列。或者，所述多肽包含由SEQ ID NO:11定义，或与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的序列。
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3SKAILAEAKK LNDAQ(SEQ ID NO:11)
其中彼此单独地：
X1＝A或W
X2＝E或R
X3＝V或Q，
前提条件是当X1是A时，X2＝R，并且当X2＝E时，X1＝W。
一个优点是碱稳定性相对于亲本多肽得到改进，并维持对免疫球蛋白和其它含有Fc的蛋白的高选择性结合。
本发明的第二个方面是提供具有改进的碱稳定性的多聚体，其包含多个多肽。这用上文公开的多肽的多聚体实现。
本发明的第三个方面是提供编码具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的核酸或载体。这用编码上文公开的多肽或多聚体的核酸或载体实现。
本发明的第四个方面是提供能够表达具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的表达系统。这用包含上文公开的核酸或载体的表达系统实现。
本发明的第五个方面是提供能够选择性结合免疫球蛋白和其它含有Fc的蛋白并显示改进的碱稳定性的分离基质。这用包含与多孔支持物共价偶联的上文所述的多肽或多聚体的分离基质实现。
一个优点是提供高的动态结合能力。进一步的优点是实现高度的碱稳定性。
本发明的第六个方面是提供分离免疫球蛋白或其它含有Fc的蛋白的有效和经济的方法。这用包括以下步骤的方法实现：
a)使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，
b)用洗涤液洗涤分离基质，
c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和
d)用清洁液清洁分离基质。
本发明的进一步合适的实施方案在从属权利要求中描述。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“Fc-结合多肽”和“Fc-结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(Fc)的多肽或蛋白，并包括例如蛋白A和蛋白G，或维持所述结合特性的其任何片段或融合蛋白。
术语“接头”在本文中意指使多聚体中的两个多肽单元、单体或结构域彼此连接的元件。
术语“间隔区”在本文中指将多肽或多肽多聚体连接于支持物的元件。
关于氨基酸序列的比较，术语“％同一性”通过标准比对算法例如Altshul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410中描述的Basic Local Alignment Tool(BLASTTM)确定。为此基于网络的软件可从US National Library of Medicine在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome自由获得。此处，算法“blastp(蛋白-蛋白BLAST)”用于询问序列与主题序列的比对，和尤其确定％同一性。
如本文使用的，术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"含有"、"具有"等可具有在美国专利法中属于它们的含义，并且可意指"包括(including)"、"包括(including)"等。"基本上由……组成"或"基本上组成"同样具有美国专利法中给予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在超过所列举的对象，只要所列举的对象的基本或新颖特征并未由于存在超过所列举的对象而改变，但不包括现有技术实施方案。
附图简述
图1显示如由SEQ ID NO:1-7定义的Fc-结合结构域的比对。
实施方案的详细描述
在一个方面，本发明公开了一种Fc-结合多肽，其包含由SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9定义，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％，例如至少98％同一性的氨基酸序列。另外，它公开了一种Fc-结合多肽，其包含由SEQ ID NO:10定义，或与SEQ ID NO:10具有至少95％，例如至少98％同一性的氨基酸序列。与亲本结构域/多肽相比，在这些结构域的位置1和3的突变赋予改进的碱稳定性，而不损害免疫球蛋白结合性质。因此，所述多肽也可描述为Fc-或免疫球蛋白-结合多肽，或者描述为Fc-或免疫球蛋白-结合多肽单元。其可进一步描述为碱稳定的Fc-或免疫球蛋白-结合多肽。此外，所述多肽能够结合IgG的Fab部分的VH3结构域，这意味着它们也可用于例如含VH3的Fab片段的捕获。这与蛋白Z衍生的碱稳定的蛋白A树脂MabSelectTM SuRe(Cytiva)形成对比，后者不结合VH3(T A Seldon等:JBiomolecular Techniques 22(2),2011,50-52)。
SEQ ID NO:8
AQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO:9
WQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO:10
WQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
(碱稳定的)Fc-或免疫球蛋白-结合多肽还可描述为包含由SEQ ID NO:11定义，或与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的序列。
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3SKAILAEAKK LNDAQ(SEQ ID NO 11)
其中彼此单独地：
X1＝A或W
X2＝E或R
X3＝V或Q，
前提条件是当X1是A时，X2＝R，并且当X2＝E时，X1＝W。
所述多肽可进一步在N-和/或C-末端包含另外的氨基酸残基，例如在N-末端的前导序列和/或在C-末端的尾序列。前导序列可例如是1-20个氨基酸的序列，例如3-20、4-12或6-8个氨基酸的序列。更具体地，它可由氨基酸序列定义，或与氨基酸序列具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性，所述氨基酸序列选自VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、ADNKFNKE、VDNKFNKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT和AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE，或者选自VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT和AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE。特别地，前导序列可由氨基酸序列VDAKFDKE定义，或与氨基酸序列VDAKFDKE具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性。尾序列可例如是1-5个氨基酸的序列，例如2-4个氨基酸的序列。更特别地，它可由选自AP、APK和APA的氨基酸序列，例如氨基酸序列APK定义，或与选自AP、APK和APA的氨基酸序列，例如氨基酸序列APK具有至少60％同一性。合适地，前导和尾不含有任何天冬酰胺残基。此外，尾可有利地包含脯氨酸。合适的前导和尾序列进一步描述于US 10,703,774，其通过引用以其整体结合到本文中。因此，所述多肽可具有如下所述的结构：
[前导]-[SEQ ID NO:8、9、10或11]-[尾]
其中前导和尾如上文所述。
在第二方面，本发明公开了包含多个连接的由上文公开的任何实施方案定义的多肽或基本上由其组成的多聚体。多聚体的使用可增加免疫球蛋白结合能力，并且多聚体还可具有比单体更高的碱稳定性。多聚体可例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。它可以是同多聚体，其中多聚体中的所有多肽是相同的，或者它可以是异多聚体，其中至少一个单元与其它不同。有利的是，多聚体中的所有多肽是碱稳定的，例如通过包含上文公开的序列。多肽可通过多肽的C-末端和N-末端之间的肽键直接彼此连接。或者，多聚体中两个或更多个多肽可通过包含寡聚体或多聚体物类的接头，例如包含具有至多25或30个氨基酸、例如3-25或3-20个氨基酸的肽的接头连接。如果所述多肽包含如上所述的前导和/或尾序列，则多聚体可合适地缺少接头。接头可例如包含由氨基酸序列定义或与氨基酸序列具有至少90％同一性或至少95％同一性的肽序列，或基本上由所述肽序列组成，所述氨基酸序列选自APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG，或备选地选自APKVDAKFDKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG。它们也可基本上由肽序列组成，所述肽序列由选自APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK和APKYEDGVDAKFDKE的氨基酸序列定义，或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性或至少95％同一性。这样的接头的性质应优选地不使蛋白单元的空间构象失去稳定。这可例如通过避免在接头中存在脯氨酸来实现。此外，所述接头还应优选地在碱性环境中足够稳定，以不损害突变的蛋白单元的特性。为此目的，如果接头不含有天冬酰胺，则是有利的。如果接头不含有谷氨酰胺，则可另外是有利的。合适的接头序列进一步描述于US 10,703,774，其通过引用以其整体结合到本文中。
多聚体可进一步在N-末端包含多个氨基酸残基，例如源自克隆过程或构成来自裂解的信号序列的残基的氨基酸残基，本文称为N-末端序列。另外的氨基酸残基的数量可例如是20或更少、例如15或更少、例如10或更少、或5或更少。作为具体的实例，多聚体可在N-末端包含AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE、AQGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYT、AQKDQTWYTG、AQHDEAQQEA、AQGGGSGGGS、AQYEDGKQYGT、AQYEDGKQGT、AQYEDGKQYTTLEKGT、AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT、AQYEDGKQYTET、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYTAT、AQYEDGKQYEDT、AQHHHHHHHHGT、AQHHHHHHGT或AQHDEAQQEAGT序列。N-末端序列进一步论述于US20200318120，其通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，如上文公开的多肽和/或多聚体还在C-末端或N-末端包含一个或多个偶联元件，其选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶联元件还可位于从C-末端或N-末端起的1-5个氨基酸残基内，例如1-3或1-2个氨基酸残基内。偶联元件可以例如是在C-末端的单个半胱氨酸。偶联元件可直接连接于C-或N-末端，或它/它们可通过包含至多15个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的一段序列(stretch)连接。这段序列应该优选在碱性环境中也是足够稳定的，不损害突变蛋白的特性。为此目的，如果这段序列不含天冬酰胺，则是有利的。如果这段序列不含谷氨酰胺，则可另外是有利的。具有C-末端半胱氨酸的优点是蛋白的端点偶联可通过半胱氨酸硫醇与支持物上的亲电子基团的反应完成。这提供了对于结合能力是重要的偶联蛋白的优越移动性。
根据上文的描述，多聚体可例如具有结构：
[N-末端序列]-([多肽])n-[偶联元件]，或者
[N-末端序列]-([多肽]-[接头])n-[偶联元件]，
其中N-末端序列、多肽、接头和偶联元件如上所述，并且其中n是2-10，以2、3、4、5、6、7、8、9或10为例，例如4、5、6或7。
多肽或多聚体的碱稳定性可通过使用例如NHS-或马来酰亚胺偶联化学使之偶联于SPR芯片，例如如在实施例中所述的Biacore CM5传感器芯片，并在指定温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，通常使用多克隆人IgG测量芯片的免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5M NaOH中进行许多个10min的循环，例如100、200或300个循环。于22+/-2℃，在0.5M NaOH中在100个10min的孵育循环后，基质的IgG能力可以是孵育前IgG能力的至少55％，例如至少60％、至少80％或至少90％。或者，对于如上测量的特定突变体在100个循环后的剩余IgG能力可与对于亲本多肽/多聚体的剩余IgG能力比较。在这种情况下，对于突变体的剩余IgG能力可以是亲本多肽/多聚体的至少105％，例如至少110％、至少125％、至少150％或至少200％。
在第三方面，本发明公开了编码根据以上公开的任何实施方案的多肽或多聚体的核酸。因此，本发明涵盖编码所述多肽或多聚体的本发明核酸序列的所有形式，例如RNA和DNA。本发明涵盖载体，例如质粒，其除了编码序列之外还包含用于表达根据本发明的多肽或多聚体所需的信号序列。在一些实施方案中，载体包含编码根据本发明的多聚体的核酸，其中编码各个单元的单独的核酸可具有同源或异源的DNA序列。
在第四方面，本发明公开了表达系统，其包含如上公开的核酸或载体。表达系统可以例如是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其已被修饰为表达本发明的多肽或多聚体。在可供选择的实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在第五方面，本发明公开了分离基质，其中多个根据上文公开的任何实施方案的多肽或多聚体(称为Fc-结合配体)已偶联至固体支持物。分离基质可包含至少11，例如11-25、15-25或15-22mg/ml与多孔支持物共价偶联的Fc-结合配体，其中合适地：
a)配体包含如上所述的多聚体或多肽，
b)多孔支持物包含具有50-75、例如56-70或56-66微米的体积加权中位直径(d50,v)和55-80、例如60-78或65-78mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。交联聚合物颗粒还可具有对于Mw 110kDa的葡聚糖，对应于0.69-0.85、例如0.70-0.85或0.69-0.80的反相凝胶过滤色谱Kd值的孔径。合适地，交联聚合物颗粒可具有高的刚性，以能够耐受高的流速。刚性可用压力-流动试验测量，其中用基质装填的柱经受递增流速的蒸馏水。压力逐步增加，并且测量流速和背压，直到流速开始随压力增加而降低。测量达到的最大流速和最大压力(对应于最大流速的背压)，并用作刚性的度量。当以床高度300+/-10mm在FineLineTM 35柱(Cytiva)中测量时，最大压力可合适地为至少0.58MPa、例如至少0.60MPa。这允许使用更小的粒径，其对于动态能力是有利的。多聚体可例如包含碱稳定的蛋白A结构域的四聚体、五聚体、六聚体或七聚体，例如碱稳定的蛋白A结构域的六聚体。高配体含量与粒度范围、干固体重量范围和任选的Kd范围组合，提供高的结合能力，例如使得对于IgG的10％穿透动态结合能力在2.4min停留时间时是至少45mg/ml，例如至少50或至少55mg/ml。备选地或另外地，对于IgG的10％穿透动态结合能力在6min停留时间时可以是至少60mg/ml，例如至少65、至少70或至少75mg/ml。碱稳定的蛋白A多聚体对IgG具有高度选择性，并且分离基质在20mM磷酸盐缓冲液、180mM NaCl、pH 7.5中可合适地对人IgG2具有低于0.2mg/ml、例如低于0.1mg/ml的离解常数。这可根据描述于N Pakiman等:J Appl Sci 12,1136-1141(2012)的吸附等温线方法测定。
在某些实施方案中，本发明公开了分离基质，其包含至少15、例如15-21或15-18mg/ml与多孔支持物共价偶联的Fc-结合配体，其中配体包含碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。这些多聚体可合适地如上文描述的任何实施方案所公开，或如下文说明的。
这样的基质可用来分离免疫球蛋白或其它含有Fc的蛋白，并且由于多肽/多聚体的改进的碱稳定性，基质将耐受在清洁期间的高碱性的条件，这对于在生物过程分离环境中长期重复使用是至关重要的。基质的碱稳定性可通过通常于特定的温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，使用多克隆人IgG测量免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5M或1.0M NaOH中进行多个15min循环，例如100、200或300个循环，对应于25、50或75h的总孵育时间。于22+/-2℃，在0.5M NaOH中经96-100个15min孵育循环或24或25h的总孵育时间后，基质的IgG能力可以是孵育前IgG能力的至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％。于22+/-2℃，在1.0M NaOH中经24h的总孵育时间后，基质的能力可以是孵育前IgG能力的至少70％，例如至少80％或至少90％。在22+/-2℃下在1.0M水性NaOH中孵育31h后，在2.4min或6min停留时间时对于IgG的10％穿透动态结合能力(Qb10％)可例如减少少于20％。
如技术人员应该理解的，表达的多肽或多聚体在被固定到支持物之前，应被纯化至合适的程度。这样的纯化方法是本领域熟知的，并且基于蛋白的配体固定于支持物容易使用标准方法进行。合适的方法和支持物将在下文更详细地讨论。
根据本发明的基质的固体支持物可以具有任何合适的熟知的种类。常规亲和分离基质通常具有有机性质并基于将亲水性表面暴露于所用的水性介质的聚合物，即暴露在它们的外表面和(如果存在)也在内表面上的羟基(-OH)、羧基(-COOH)、羧酰氨基(-CONH2，可能呈现为N-取代的形式)、氨基(-NH2，可能呈现为取代的形式)、寡-或聚氧乙烯基团的聚合物。固体支持物可适合为多孔的。孔隙率可以表示为Kav或Kd值(特定尺寸的探针分子可用的孔体积分数)，其通过反相尺寸排阻色谱，例如根据在Gel Filtration Principles andMethods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp 6-13中描述的方法测量。Kav作为比率(Ve-V0)/(Vt-V0)测定，其中Ve是探针分子(例如葡聚糖110kD)的洗脱体积，V0是柱的空隙容积(例如，高Mw空隙标志物、例如粗葡聚糖的洗脱体积)和Vt是柱的总体积。Kd可作为(Ve-V0)/Vi测定，其中Vi是能够进入除了基质体积(由基质聚合物分子占据的体积)之外的所有体积的盐(例如NaCl)的洗脱体积。按照定义，Kd和Kav值二者总是在0-1的范围内。Kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用Mw 110kDa的葡聚糖作为探针分子测量的。用Mw 110kDa的葡聚糖测量的Kd值可合适地是0.68-0.90，例如0.68-0.85或0.70-0.85。其优点是支持物具有大分数的孔，所述孔能够容纳本发明的多肽/多聚体和结合于多肽/多聚体的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向结合位点和离开结合位点的质量运输。
多肽或多聚体可经由常规偶联技术，利用存在于配体中的例如硫醇基、氨基和/或羧基，附接于支持物。双环氧化物、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是熟知的偶联试剂。在支持物和多肽/多聚体之间，可引入一种称为间隔区的分子，其改进多肽/多聚体的可利用性并促进多肽/多聚体化学偶联于支持物。取决于多肽/多聚体的性质和偶联条件，偶联可以是多点偶联(例如经由多个赖氨酸)或单点偶联(例如经由单个半胱氨酸)。或者，多肽/多聚体可通过非-共价键合，例如物理吸附或生物特异性吸附，附接于支持物。
在一些实施方案中，基质包含5-25，例如5-20mg/ml、5-15mg/ml、5-11mg/ml或6-11mg/ml的偶联于支持物的多肽或多聚体。偶联的多肽/多聚体的量可受在偶联过程中所用的多肽/多聚体的浓度，受所用的激活和偶联条件和/或受所用支持物的孔结构的控制。作为一般规则，基质的绝对结合能力随着偶联的多肽/多聚体的量增加，至少达到其中孔变得受偶联的多肽/多聚体显著阻塞的点。不受理论的约束，然而似乎对于支持物所述的Kd值，孔被偶联配体的阻塞具有较低的重要性。每mg偶联的多肽/多聚体的相对结合能力将在高偶联水平下降低，导致在以上指定范围内的成本-效益最优。
在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联于支持物。执行这样的偶联的方法是本领域熟知的并由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。硫醚键是柔性和稳定的，且一般适用于亲和色谱。特别是当硫醚键经由多肽或多聚体上的末端或接近末端的半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的移动性增加，这提供了改进的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体经由如上所述的蛋白上提供的C-末端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇有效偶联于支持物上的亲电子基团，例如环氧化物基团、卤代醇基团等，导致硫醚桥偶联。
在某些实施方案中，支持物包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可激活的)羟基且它们对用于生物处理的碱性清洁溶液一般是稳定的。
在一些实施方案中，支持物包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的支持物可根据标准方法，例如逆悬浮凝胶化(S Hjertén:Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964))容易地制备。或者，基础基质是可市售获得的产品，例如以SEPHAROSETMFF(Cytiva)商品名销售的交联琼脂糖珠。在对于大规模分离是特别有利的实施方案中，使用在US 6,602,990或US 7,396,467(通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法，支持物经修改以增加其刚性，因而使基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，支持物，例如聚合物、多糖或琼脂糖支持物被交联，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂试剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烷基化试剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联对于支持物的刚性是有益的并改进化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定性的且不引起显著的非特异性吸附。
或者，固体支持物基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质的情况下，基质的表面常常被亲水化，以使如上定义的亲水性基团暴露于周围的水性液体。这样的聚合物根据标准方法，见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization”(R Arshady:Chimica eL'Industria 70(9),70-75(1988))，容易地生产。或者，使用可市售获得的产品，例如SOURCETM(Cytiva)。在另一个替代中，根据本发明的固体支持物包含无机性质的支持物，例如二氧化硅、氧化锆等。
在又一个实施方案中，固体支持物呈现为另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或过滤器(如膜或深度过滤基质)。当支持物是膜时，所述膜可合适地是包含10-1000nm直径的纳米纤维的纤维膜，如描述于US 10,696,714、US 10,850,259或US 16/959,373，其通过引用以其整体结合到本文中。纳米纤维可合适地是纤维素纳米纤维。
关于根据本发明的基质的形状，在某些实施方案中，基质呈现为多孔整料的形式。在可供选择的实施方案中，基质以可以是多孔或无孔的珠或颗粒的形式呈现。以珠或颗粒的形式呈现的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括称为膨胀床的那些和纯粹的悬浮液，其中颗粒或珠自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规色谱。在纯粹的悬浮液的情况下，使用分批的模式。
在第六方面，本发明公开了一种分离免疫球蛋白的方法，其中使用上文公开的分离基质。所述方法可包括以下步骤：
a)使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，
b)用洗涤液洗涤分离基质，
c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和
d)用清洁液清洁分离基质，所述清洁液可包含0.1–1.0M NaOH或KOH，例如0.4–1.0M NaOH或KOH。
步骤a)–d)可重复至少10次，例如至少50次、50-200次、50-300次或50-400次。
在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：
a)使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，
b)用洗涤液洗涤所述分离基质，
c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和
d)用清洁液清洁分离基质，所述清洁液可备选地称为原位清洁(CIP)液，例如接触(孵育)时间为至少10min。
该方法还可包括以下步骤：在步骤a)之前，提供根据上文描述的任何实施方案的亲和分离基质和提供包含免疫球蛋白和至少一种其它物质的溶液作为液体样品，以及在步骤c)之后，回收洗出液和任选地使洗出液经历进一步的分离步骤，例如通过阴离子或阳离子交换色谱、多元色谱和/或疏水相互作用色谱。液体样品、洗涤液和洗脱液的合适组成，以及执行分离的一般条件是亲和色谱领域且特别是蛋白A色谱领域熟知的。包含含有Fc的蛋白和至少一种其它物质的液体样品可包含宿主细胞蛋白(HCP)，例如CHO细胞、大肠杆菌或酵母蛋白。CHO细胞和大肠杆菌蛋白的含量可便利地通过针对这些蛋白的免疫分析法测定，如得自Cygnus Technologies的CHO HCP或大肠杆菌HCP ELISA试剂盒。宿主细胞蛋白或CHO细胞/大肠杆菌蛋白可在步骤b)期间被解除吸附。
洗脱可通过使用用于从蛋白A介质洗脱的任何合适的溶液进行。这可以例如是具有pH 5或更低，例如pH 2.5-5或3-5的溶液或缓冲液。它在一些情况下也可以是具有pH 11或更高，例如pH 11-14或pH 11-13的溶液或缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一种单-、二-或三官能的羧酸或这样的羧酸的盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一种选自乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和甲酸盐的阴离子物类。
在一些实施方案中，清洁液是碱性的，例如具有13-14的pH。这样的溶液提供基质的有效清洁，特别是在区间的上端。
在某些实施方案中，清洁液包含0.1-2.0M NaOH或KOH，例如0.5-2.0或0.5-1.0MNaOH或KOH。这些是有效的清洁溶液，并且当NaOH或KOH浓度是在0.1M以上或至少0.5M时尤其如此。本发明的多肽的高稳定性使得使用这样的强碱性溶液成为可能。
所述方法还可包括用消毒液消毒基质的步骤，所述消毒液可例如包含过氧化物，例如过氧化氢和/或过酸，例如过乙酸或过甲酸。
在一些实施方案中，步骤a)-d)重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次。这对过程经济是重要的，因为基质可重复利用多次。
步骤a)-c)也可重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次，其中步骤d)在多个步骤c)的情况后进行，使得步骤d)进行至少10次，例如至少50次。步骤d)可例如在每第2个至第20个步骤c)的情况进行。
实施例
蛋白的诱变
位点定向诱变通过两-步骤PCR，使用编码突变的寡核苷酸进行。作为模板，使用含有Z、B或者C的单一结构域的质粒。PCR片段被连接到大肠杆菌表达载体。使用DNA测序以验证插入片段的正确序列。
为形成突变体的多聚体，使用位于B、C或Z结构域的起始密码子(GTA GAC)的Acc I位点，其对应于氨基酸VD。用Acc I和磷酸酶处理，消化对于单体结构域的载体。设计对每个变体特异性的Acc I粘性-末端引物，并且从每个模板生成两个重叠PCR产物。纯化PCR产物并通过在2％琼脂糖凝胶上比较PCR产物评估浓度。等量的成对PCR产物在连接缓冲液中杂交(90℃->25℃，45min)。生成的产物大约构成可能被连接到Acc I位点的1/4的片段(正确的PCR片段和/或消化的载体)。连接和转化后，菌落经PCR筛选以鉴定含有所需突变体的构建体。通过DNA测序验证阳性克隆。
构建体表达和纯化
构建体通过大肠杆菌K12在标准培养基中的发酵在细菌周质中表达。发酵后，细胞经热处理以释放周质内容物到培养基中。释放到培养基中的构建体用具有0.2μm孔径的膜，通过微滤回收。
每个构建体，现在在来自过滤步骤的渗透液中，通过亲和纯化。将渗透液装载到含有固定化IgG的色谱介质(IgG Sepharose 6FF,Cytiva)上。装载的产物用磷酸盐缓冲盐水洗涤并通过降低pH洗脱。
将洗脱池调节至中性pH(pH 8)并通过加入二硫苏糖醇还原。然后将样品装载到阴离子交换剂中。洗涤步骤后，在NaCl梯度中洗脱构建体以使其与任何污染物分离。洗脱池通过超滤被浓缩至40-50mg/ml。应该注意，固定化IgG介质上的构建体的成功亲和纯化表明所考虑的构建体具有对IgG的高亲和力。
纯化的配体用RPC LC-MS分析以确定纯度并确定分子量对应于期望值(基于氨基酸序列)。
实施例1
表1中列出的纯化的单体配体，进一步包含在N-末端的AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE前导序列和在C-末端的APK尾序列，使用Cytiva的胺偶联试剂盒(用于芯片上的在羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在Biacore表面等离子体共振(SPR)仪器(Cytiva,Sweden)中给出约200-1500RU的信号强度的量，在Biacore CM5传感器芯片(Cytiva,Sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG(Gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(CIP)，即于室温(22+/-2℃)下，用500mMNaOH冲洗10分钟。这重复96-100个循环并在每个循环后按剩余IgG结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。配体Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1(SEQ ID NO:12)，如公开于US 10,703,774，具有AQYEDGKQYTDT前导序列，用作参考(注意，SEQ ID NO:12包括在N-末端的VDAKFDKE和在C-末端的APK)。结果显示在表1中，并且表明SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9都比参考显著更加碱稳定。
表1.用Biacore(0.5M NaOH)评价的单体配体。
本书面描述使用实施例来公开本发明，包括最佳模式，并且还能使本领域的任何技术人员实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统并执行任何结合的方法。本发明的可专利性范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员想到的其它实施例。这样的其它实施例意欲落入权利要求书的范围内，只要它们具有与权利要求书的文字语言相同的结构要素，或它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等同结构要素。本文中提及的所有专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们各自结合到本文中一样。
<110> Cytiva BioProcess R&D AB
<120> 分离基质
<130> 323898-GB-1
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 1
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白Z
<400> 6
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar
<400> 7
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar (Q9A,N11R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 8
Ala Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 9
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar (Q9W,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 9
Trp Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 10
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar (Q9W,N11R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 10
Trp Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 11
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar变体
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 其它特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 其它特征
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 11
Xaa Gln Xaa Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Xaa
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zvar (Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
<400> 12
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 13
Val Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 14
Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 15
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 16
Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 17
Lys Val Asp Lys Glu
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 18
Lys Ala Asp Lys Glu
1 5
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 19
Tyr Glu Asp Gly Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 20
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 21
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr Val Asp Ala Lys
1 5 10 15
Phe Asp Lys Glu
20
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 22
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导
<400> 23
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 26
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
1 5 10
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 27
Ala Pro Lys Val Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 28
Ala Pro Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 29
Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 30
Ala Pro Lys Val Asp Ala
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 32
Ala Pro Lys Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 33
Ala Pro Lys Tyr Glu Asp Gly Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10 15
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 34
Tyr Glu Asp Gly
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 35
Ala Gln Gly Thr
1
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 36
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 37
Ala Gln Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 38
Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 39
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 40
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 41
Ala Gln Lys Asp Gln Thr Trp Tyr Thr Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 42
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 43
Ala Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 44
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Gly Thr
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 45
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Gly Thr
1 5 10
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 46
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Gly Thr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 47
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Gly Thr
20
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 48
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Glu Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 49
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 50
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Ala Thr
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 51
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Asp Thr
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 52
Ala Gln His His His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 53
Ala Gln His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端序列
<400> 54
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala Gly Thr
1 5 10
Claims (29)
1.一种Fc-结合多肽，其包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9定义，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％、例如至少98％同一性的氨基酸序列。
2.一种Fc-结合多肽，其包含由SEQ ID NO:11定义，或与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的序列：
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3SKAILAEAKK LNDAQ(SEQ ID NO:11)
其中彼此单独地：
X1＝A或W
X2＝E或R
X3＝V或Q，
前提条件是当X1是A时，X2＝R，并且当X2＝E时，X1＝W。
3.权利要求2的Fc-结合多肽，其中X3＝V。
4.任一项前述权利要求的Fc-结合多肽，进一步包含1-20个氨基酸的前导序列。
5.权利要求4的Fc-结合多肽，其中所述前导序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性：VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、ADNKFNKE、VDNKFNKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT和
AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE。
6.权利要求4的Fc-结合多肽，其中所述前导序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性：VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、YEDGVDAKFDKE和AQYEDGKQYTDT和AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE。
7.任一项前述权利要求的Fc-结合多肽，进一步包含1-5个氨基酸的尾序列。
8.权利要求7的Fc-结合多肽，其中所述尾序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少60％同一性：AP、APK和APA。
9.一种多聚体，其包含多个连接的根据任一项前述权利要求的Fc-结合多肽。
10.权利要求9的多聚体，其是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。
11.权利要求9或10的多聚体，其中所述多肽通过包含至多25个氨基酸，例如3-25或3-20个氨基酸的接头连接。
12.权利要求9-11中任一项的多聚体，其中至少两个多肽通过包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列的接头连接：APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG。
13.权利要求9-11中任一项的多聚体，其中至少两个多肽通过包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列的接头连接：APKVDAKFDKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG。
14.权利要求9-13中任一项的多聚体，其进一步在N-末端包含1-20个氨基酸残基的N-末端序列。
15.权利要求14的多聚体，其中所述N-末端序列包含选自以下的序列：AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE、AQGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYT、AQKDQTWYTG、AQHDEAQQEA、AQGGGSGGGS、AQYEDGKQYGT、AQYEDGKQGT、AQYEDGKQYTTLEKGT、AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT、AQYEDGKQYTET、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYTAT、AQYEDGKQYEDT、AQHHHHHHHHGT、AQHHHHHHGT和AQHDEAQQEAGT。
16.权利要求9-15中任一项的多聚体，其进一步在C-末端或N-末端包含一个或多个偶联元件，所述偶联元件选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。
17.权利要求16的多聚体，其在C-末端或从C-末端起的5个氨基酸残基内包含单个半胱氨酸残基。
18.一种核酸或载体，其编码根据任一项前述权利要求的多肽或多聚体。
19.一种表达系统，其包含权利要求18的核酸或载体。
20.一种分离基质，其包含与固体支持物共价偶联的多个根据权利要求1-17中任一项的多肽或多聚体。
21.权利要求20的分离基质，其包含每ml多孔支持物至少11mg的多肽或多聚体。
22.权利要求20或21的分离基质，其中所述支持物包含多孔聚合物颗粒。
23.权利要求22的分离基质，其中所述多孔聚合物颗粒是交联琼脂糖颗粒。
24.权利要求20或21的分离基质，其中所述支持物包含多孔膜。
25.权利要求24的分离基质，其中所述支持物包含纤维膜，所述纤维膜包含10-1000nm直径的纳米纤维。
26.权利要求25的分离基质，其中所述纳米纤维是纤维素纳米纤维。
27.一种分离免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
a)使包含免疫球蛋白的液体样品与根据任何前述权利要求的分离基质接触，
b)用洗涤液洗涤所述分离基质，
c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和
d)用清洁液清洁分离基质。
28.权利要求27的方法，其中清洁液包含0.1–1.0MNaOH或KOH，例如0.4–1.0MNaOH或KOH。
29.权利要求27或28的方法，其中步骤a)–d)重复至少10次，例如至少50次、50-200次或50-400次。
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