JP2023550778A - 分離基材 - Google Patents

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Abstract

本発明は、配列番号8又は配列番号9に対して少なくとも95%の同一性を有する、アルカリ安定性変異型Fc結合プロテインAドメインに関する。

Description

本発明は、親和性クロマトグラフィーの分野、より具体的には、免疫グロブリンの親和性クロマトグラフィーに有用なプロテインAの変異型免疫グロブリン結合ドメインに関する。本発明は、変異型ドメインの多量体及び変異型ドメイン又は多量体を含有する分離基材にも関する。
免疫グロブリンは、世界中で製造又は開発のいずれにおいても最も普及している生物薬剤製品である。この特定の治療的市場の高い商業的需要、ゆえに価値のため、製薬会社は、関連費用を管理しながらそれぞれのmAb製造工程の生産性を最大化することに重点を置いている。
モノクローナル又はポリクローナル抗体等のこうした免疫グロブリン分子の精製において重要な工程の一つとして、親和性クロマトグラフィーがほとんどの場合に使用される。特に興味深いクラスの親和性試薬は、免疫グロブリン分子の不変部分に特異的に結合する能力があるタンパク質であり、そのような相互作用は、抗体の抗原結合特異性には依存しない。そのような試薬は、血清若しくは血漿調製品又は細胞培養由来原料等があるがこれに限定されない異なる試料からの免疫グロブリンの親和性クロマトグラフィー回収に広く使用されうる。そのようなタンパク質の例は、異なる種のIgG免疫グロブリンのFc、更にはFab(VH3ドメインによる)部分に結合する能力があるドメインを含有するブドウ球菌プロテインAである。これらのドメインは、E、D、A、B及びCドメイン(配列番号1～5)と一般に示される。
ブドウ球菌プロテインA(SpA)に基づく試薬は、その高い親和性及び選択性のため、生物工学分野、例えば、抗体を捕捉及び精製する並びに検出又は定量化するための親和性クロマトグラフィーにおける広範な使用が見出されてきた。現在、SpAに基づく親和性媒体は、おそらく、産業用の細胞培養上清を含めた異なる試料からモノクローナル抗体及びその断片を単離するために最も広く使用されている親和性媒体である。従って、プロテインAリガンドを含む様々な基材は、例えば、天然のプロテインAの形態[例えばプロテインA SEPHAROSE(商標)、Cytiva社、Uppsala、Sweden]で市販されており、更に、組換え体プロテインA[例えばrProtein A SEPHAROSE(商標)、Cytiva社]から構成される。より具体的には、市販の組換え体プロテインA製品において実行された遺伝子操作は、支持体へのその結合を促進すること及びリガンドの生産性を増大させることを意図するものである。
他の親和性クロマトグラフィー適用と同様に、これらの適用は、汚染物質の確実な除去に広く注意する必要がある。例えば、そのような汚染物質は、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを含めた望ましくない生体分子若しくは微生物等、クロマトグラフィー手順において固定相又は基材に吸着される非溶出分子でありうる。基材からのそのような汚染物質の除去は、所望の産物の1回目の溶出後に通常実行されて、その後の使用の前に基材が再生される。そのような除去は、定置洗浄(CIP)として公知の手順を通常含み、固定相から汚染物質を溶出する能力がある薬剤が、使用される。しばしば使用されるそのようなクラスの薬剤の1つは、前記固定相を通されるアルカリ性溶液である。現在、最も大規模に使用されているクリーニング及び浄化薬剤は、NaOHであり、その濃度は、汚染の程度及び性質に応じて0.1Mから、例えば1Mまでの範囲でありうる。この戦略は、13より高いpH値の溶液への基材の曝露を伴う。タンパク質性親和性リガンドを含有する多くの親和性クロマトグラフィー基材にとってそのようなアルカリ環境は非常に厳しい条件であり、そのため関係する高pHに対するリガンドの不安定性が原因の能力低下が生じる。
従って大規模な研究は、アルカリpH値に耐える改善された能力を呈する操作されたタンパク質リガンドの開発に集中してきた。例えば、Gulichら[Susanne Gulich、Martin Linhult、Per-Ake Nygren、Mathias Uhlen、Sophia Hober、Journal of Biotechnology 80(2000)、169～178頁]は、アルカリ環境における連鎖球菌性アルブミン結合ドメイン(ABD)の安定性特性を改善するためのタンパク質工学を示唆した。Gulichらは、4つ全てのアスパラギン残基が、ロイシン(1残基)、アスパラギン酸(2残基)及びリジン(1残基)で置換されたABDの変異体を創出した。更に、Gulichらは、その変異体が、天然のタンパク質と類似の標的タンパク質結合挙動を呈し、操作されたリガンドを含有する親和性カラムが、アルカリ性条件への反復曝露後に無操作の親リガンドを使用して調製したカラムより高い結合能力を示すことを報告している。従って、4つ全てのアスパラギン残基が、構造及び機能にいかなる有意な効果もなく置きかえられうることが、この点で結論される。
最近の研究は、プロテインA(SpA)に変更を加えることで、類似の特性を発揮させる得ることも示す。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,834,158号は、少なくとも1つのアスパラギン残基が、グルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異する場合に、その変異が、SpAのBドメイン、又はSpAのBドメインから得られる合成構築物であるプロテインZ(配列番号6)(米国特許第5,143,844号、その全体を参照により組み込む)等の親SpAと比較して、約13～14までのpH値で化学的安定性の増大を付与することを開示している。著者らは、これら変異型タンパク質が親和性リガンドとして使用される場合、予想通り、分離基材が、アルカリ剤を使用するクリーニング手順によりよく耐えうることを示す。これは、ここにその全体が参照により組み込まれるUS8,198,404に開示される通り、変異N3A,N6D,N23Tを持つプロテインZ(配列番号7、本明細書においてZvarと示される)に特に適用する。アルカリ安定性を増大させる目的のプロテインAドメインの更なる変異も、米国特許第8,329,860号、特開2006304633A、米国特許第8,674,073号、米国特許第10,072,050号、米国特許第9,403,883号、米国特許第9,051,375号、米国特許第9,051,375号、米国特許第9,683,013号、米国特許出願公開第2019/048046号及び米国特許第10,703,774号に公開されており、その全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、分離基材が、能力の損失のため廃棄されなければならなくなる前に、より多い回数のNaOHによるクリーニングサイクルを可能にするより高いアルカリ安定性を持つ変異体がなお必要である。
従って、アルカリクリーニング手順に対する安定性が更に改善されたタンパク質リガンドを含有する分離基材を得ることが、この分野においてなお必要である。治療的抗体の経済的に効率のよい精製を可能にする、結合能力が改善されたそのような分離基材も必要である。
米国特許第7,834,158号 米国特許第5,143,844号 米国特許第8,198,404号 米国特許第8,329,860号 特開2006304633A 米国特許第8,674,073号 米国特許第10,072,050号 米国特許第9,403,883号 米国特許第9,051,375号 米国特許第9,051,375号 米国特許第9,683,013号 米国特許出願公開第2019/048046号 米国特許第10,703,774号 米国特許第20200318120号 米国特許第6,602,990号 米国特許第7,396,467号 米国特許第10,696,714号 米国特許第10,850,259号 米国特許仮出願第16/959,373号
Susanne Gulich、Martin Linhult、Per-Ake Nygren、Mathias Uhlen、Sophia Hober、Journal of Biotechnology 80 (2000)、169～178頁 Altshulら(1990) J. Mol. Biol., 215: 403～410頁 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome T A Seldonら、J Biomolecular Techniques 22(2)、2011、50～52頁 N Pakimanら、J Appl Sci 12, 1136～1141頁(2012) Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6～13頁 S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2)、393～398頁(1964) R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70～75頁(1988)
本発明の一態様は、改善されたアルカリ安定性を持つポリペプチドを提供することである。これは、配列番号8若しくは配列番号9によって定義される、又はそれと少なくとも95%、例えば少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含むFc結合ポリペプチドで実現される。
別法として、ポリペプチドは、配列番号11によって定義される、又はそれと少なくとも98%の同一性を有する配列を含む。
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3 SKAILAEAKK LNDAQ(配列番号11)
[配列中、互いに個別に:
X1=A又はW
X2=E又はR
X3=V又はQ、
ただしX1がAの場合、X2=R、及びX2=Eの場合、X1=Wである]。
1つの利点は、免疫グロブリン及び他のFc含有タンパク質に対する高い選択的結合を維持した状態で、アルカリ安定性が親ポリペプチドに比べて改善されることである。
本発明の第2の態様は、複数のポリペプチドを含む、改善されたアルカリ安定性を持つ多量体を提供することである。これは、上で開示されるポリペプチドの多量体で実現される。
本発明の第3の態様は、改善されたアルカリ安定性を有するポリペプチド又は多量体をコードしている核酸若しくはベクターを提供することである。これは、上で開示されるポリペプチド又は多量体をコードしている核酸若しくはベクターで実現される。
本発明の第4の態様は、改善されたアルカリ安定性を持つポリペプチド又は多量体を発現する能力がある発現系を提供することである。これは、上で開示される核酸又はベクターを含む発現系で実現される。
本発明の第5の態様は、免疫グロブリン及び他のFc含有タンパク質を選択的に結合し、改善されたアルカリ安定性を呈する能力がある分離基材を提供することである。これは、多孔性支持体に共有結合的にカップリングされた、上に記載のポリペプチド又は多量体を含む分離基材で実現される。
1つの利点は、高い動的結合能力が得られることである。更なる利点は、高度なアルカリ安定性が実現されることである。
本発明の第6の態様は、免疫グロブリン又は他のFc含有タンパク質を単離する効率的且つ経済的な方法を提供することである。これは、:
a)免疫グロブリンを含む液体試料を上で開示される分離基材と接触させる工程と、
b)洗浄液で分離基材を洗浄する工程と、
c)溶出液で分離基材から免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)クリーニング液で分離基材をクリーニングする工程と
を含む方法で実現される。
本発明の更なる適切な実施形態は、従属請求項に記載される。
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用され、抗体の断片、抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質及び抗体又は抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
用語「Fc結合ポリペプチド」及び「Fc結合タンパク質」は、抗体の結晶化可能部分(Fc)に結合する能力があるポリペプチド又はタンパク質をそれぞれ意味し、例えばプロテインA及びプロテインG、又は前記結合特性を維持しているその任意の断片若しくは融合タンパク質を含む。
本明細書において用語「リンカー」は、多量体において、2つのポリペプチド単位、単量体又はドメインを互いに連結する要素を意味する。
本明細書において用語「スペーサー」は、ポリペプチド又はポリペプチド多量体を支持体に接続する要素を意味する。
アミノ酸配列の比較に関する用語「%同一性」は、例えば、Altshulら(1990) J. Mol. Biol., 215: 403～410頁に記載されるBasic Local Alignment Tool [BLAST(商標)]等の標準的なアラインメントアルゴリズムによって決定される。このためのウェブベースのソフトウェアは、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeで米国立医学図書館から自由に利用可能である。ここで、アルゴリズム「blastp(タンパク質-タンパク質BLAST)」が、対象配列と問い合わせ配列のアラインメント、とりわけ%同一性の決定に使用された。
本明細書では、用語「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、「有する(having)」等は、米国特許法による意味を有することができ、「含む(includes)」、「含む(including)」等を意味することができる。「本質的になる(consisting essentially of)」又は「本質的になる(consists essentially)」は、同様に米国特許法による意味を有し、用語には制限がなく、詳述されるものの基本的又は新規の特徴である限り詳述されるもの以上の存在を許容し、詳述されるもの以上の存在によって変化しないが、先行技術の実施形態を除外する。
配列番号1～7によって定義されるFc結合ドメインのアラインメントを示す図である。
一態様において、本発明は、Fc結合ポリペプチドを開示し、それは、配列番号8若しくは配列番号9によって定義される、又はそれと少なくとも95%、例えば少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。更に、本発明は、配列番号10によって定義される、又はそれと少なくとも95%、例えば少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含むFc結合ポリペプチドを開示する。これらドメイン内の1位及び3位における変異は、免疫グロブリン結合特性を損なわずに親ドメイン/ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。それゆえ、ポリペプチドは、Fc又は免疫グロブリン結合ポリペプチド、或いはFc又は免疫グロブリン結合ポリペプチド単位とも記載されうる。それは、アルカリ安定なFc又は免疫グロブリン結合ポリペプチドと更に記載されうる。加えて、ポリペプチドは、IgGのFab部分のVH3ドメインに結合する能力があり、そのことは、そのポリペプチドが、例えばVH3含有Fab断片の捕捉にも使用されうることを意味する。これは、VH3に結合しないプロテインZ由来のアルカリ安定なプロテインA樹脂MabSelect(商標)SuRe(Cytiva社)とは対照的である[T A Seldonら、J Biomolecular Techniques 22(2)、2011、50～52頁]。
配列番号8
AQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
配列番号9
WQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
配列番号10
WQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
(アルカリ安定な)Fc又は免疫グロブリン結合ポリペプチドは、配列番号11によって定義される、又はそれと少なくとも98%の同一性を有する配列を含むとも記載されうる。
X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPS X3 SKAILAEAKK LNDAQ(配列番号11)
[配列中、互いに個別に:
X1=A又はW
X2=E又はR
X3=V又はQ、
ただしX1がAの場合、X2=R、及びX2=Eの場合、X1=Wである]。
ポリペプチドは、N及び/又はC末端に追加のアミノ酸残基、例えばN末端にリーダー配列及び/又はC末端に尾部配列を更に含んでもよい。リーダー配列は、1～20アミノ酸配列、例えば、3～20、4～12又は6～8アミノ酸配列でもよい。より具体的には、リーダー配列は、VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、ADNKFNKE、VDNKFNKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT及びAQYEDGKQYTDTVDAKFDKEからなる群から選択される、或いは別法としてVFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT及びAQYEDGKQYTDTVDAKFDKEからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも90%の同一性若しくは少なくとも95%の同一性を有することができる。特に、リーダー配列は、アミノ酸配列VDAKFDKEによって定義される、又はそれと少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも90%の同一性若しくは少なくとも95%の同一性を有することができる。尾部配列は、例えば、2～4アミノ酸配列等、1～5アミノ酸配列でもよい。より具体的には、尾部配列は、アミノ酸配列APK等、AP、APK及びAPAからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも60%の同一性を有することができる。最適には、リーダー及び尾部は、アスパラギン残基を全く含有しない。更に、尾部は、プロリンを有利に含むことができる。適切なリーダー及び尾部配列は、米国特許第10,703,774号に更に記載されており、その全体を参照により本明細に組み込む。従って、ポリペプチドは、下記の構造:
[リーダー]-[配列番号8、9、10又は11]-[尾部]
(構造中、リーダー及び尾部は、上記の通りである)
を有することができる。
第2の態様において、本発明は、上で開示される実施形態のいずれかによって定義される複数の連結されたポリペプチドを含む、又はそれから本質的になる多量体を開示する。多量体の使用は、免疫グロブリン結合能力を増大させることができ、多量体は、単量体より高いアルカリ安定性を有することもできる。多量体は、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体でありうる。多量体中の全てのポリペプチドが同一である場合、それは、ホモ多量体でありえ、又は少なくとも1つの単位が他と異なる場合、それはヘテロ多量体でありうる。有利には、多量体中の全てのポリペプチドは、上で開示される配列を含むこと等により、アルカリ安定である。ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端とN末端の間のペプチド結合によって互いに直接連結されうる。別法として、多量体中の2つ以上のポリペプチドは、25若しくは30アミノ酸まで、例えば3～25若しくは3～20アミノ酸のペプチドを含むリンカー等、オリゴマー又はポリマー種を含むリンカーによって連結されうる。ポリペプチドが上記のリーダー及び/又は尾部配列を含む場合、多量体は、最適にはリンカーを欠くことができる。例えば、リンカーは、APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE及びYEDGからなる群から選択される、別法としてAPKVDAKFDKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGVDAKFDKE及びYEDGからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される若しくはそれと少なくとも90%の同一性若しくは少なくとも95%の同一性を有するペプチド配列を含む又は本質的になりうる。また、それらは、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK及びAPKYEDGVDAKFDKEからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも90%の同一性若しくは少なくとも95%の同一性を有するペプチド配列から本質的になりうる。そのようなリンカーの性質は、タンパク質単位の空間的配座を好ましくは不安定化するべきでない。これは、例えばリンカー内のプロリンの存在を回避することによって実現されうる。更に、また、前記リンカーは、変異型タンパク質単位の特性を損なわないようにアルカリ環境において好ましくは十分に安定であるべきである。この目的にとって、リンカーがアスパラギンを含有しない場合、それは有利である。リンカーがグルタミンを含有しない場合、それは更に有利でありうる。適切なリンカー配列は、米国特許第10,703,774号に更に記載されており、その全体を参照により本明細に組み込む。
多量体は、N末端において、例えば、クローニング過程に由来する又は本明細書においてN末端配列と呼ばれる切り出されたシグナル配列の残基を構成する複数のアミノ酸残基を更に含むことができる。更なるアミノ酸残基の数は、20個若しくはより少なく、例えば15個若しくはより少ない、10個若しくはより少ない、又は5個若しくはより少なくてもよい。特定の例として、多量体は、N末端において、AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE、AQGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYT、AQKDQTWYTG、AQHDEAQQEA、AQGGGSGGGS、AQYEDGKQYGT、AQYEDGKQGT、AQYEDGKQYTTLEKGT、AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT、AQYEDGKQYTET、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYTAT、AQYEDGKQYEDT、AQHHHHHHHHGT、AQHHHHHHGT又はAQHDEAQQEAGT配列を含んでもよい。N末端配列は、米国特許出願公開第20200318120号において更に検討されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態において、上で開示されるポリペプチド及び/又は多量体は、C末端又はN末端で1つ若しくは複数のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1つ若しくは複数のカップリング要素を更に含む。カップリング要素は、C末端又はN末端から1～5アミノ酸残基内、例えば1～3若しくは1～2アミノ酸残基内に位置することもできる。カップリング要素は、例えばC末端における単一のシステインでもよい。カップリング要素は、C末端若しくはN末端に直接連結されてもよく、又は最高15アミノ酸、例えば1～5、1～10若しくは5～10アミノ酸を含む区間を介して連結されてもよい。また、この区間は、変異型タンパク質の特性を損なわないようにアルカリ環境において好ましくは十分に安定であるべきである。この目的にとって、区間がアスパラギンを含有しない場合、それは有利である。区間がグルタミンを含有しない場合、それは更に有利でありうる。C末端システインを有する利点は、タンパク質の終点カップリングが、支持体上の求電子基とシステインチオールとの反応によって実現されうることである。これは、結合能力に重要となるカップリングされたタンパク質の優れた運動性を提供する。
上の説明によると、多量体は、例えば構造:
[N末端配列]-([ポリペプチド])n-[カップリング要素]、又は
[N末端配列]-([ポリペプチド]-[リンカー])n-[カップリング要素]
(構造中、N末端配列、ポリペプチド、リンカー及びカップリング要素は、前述の通りであり、nは、2～10であり、例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10、例えば4、5、6若しくは7等、によって例示される)
を有することができる。
ポリペプチド又は多量体のアルカリ安定性は、例えばNHS又はマレイミドカップリング化学を使用してSPRチップ、例えば、実施例に記載のBiacore CM5センサーチップにそれをカップリングし、指定温度、例えば22+/-2℃で、アルカリ性溶液中でインキュベーションする前後に、ポリクローナルヒトIgGを一般に使用してチップの免疫グロブリン結合能力を測定することによって評価されうる。インキュベーションは、例えば、0.5M NaOH中で、100、200又は300サイクル等、多数の10分間サイクルで実行されうる。0.5M NaOH中で、22+/-2℃で10分間を100回のインキュベーションサイクル後の基材のIgG能力は、インキュベーション前のIgG能力の少なくとも60%、少なくとも80%又は少なくとも90%等、少なくとも55%でありうる。別法として、上記のように測定される特定の変異体に対する100サイクル後に残存するIgG能力は、親ポリペプチド/多量体に残存するIgG能力と比較されうる。この場合、変異体に対する残存するIgG能力は、親ポリペプチド/多量体の少なくとも105%、例えば少なくとも110%、少なくとも125%、少なくとも150%又は少なくとも200%でありうる。
第3の態様において、本発明は、上で開示されるいずれかの実施形態によるポリペプチド又は多量体をコードしている核酸を開示する。従って、本発明は、ポリペプチド又は多量体をコードしているRNA及びDNA等本核酸配列の全ての形態を包含する。本発明は、コード配列に加えて、本発明によるポリペプチド又は多量体の発現に必要なシグナル配列を含むプラスミド等のベクターを含む。一部の実施形態において、ベクターは、本発明による多量体をコードしている核酸を含み、各単位をコードしている別々の核酸は、相同な又は異種のDNA配列を有することができる。
第4の態様において、本発明は、上で開示される核酸又はベクターを含む発現系を開示する。発現系は、例えばグラム陽性又はグラム陰性の原核宿主細胞系、例えば本ポリペプチド若しくは多量体を発現するように改変された大腸菌(E.coli)又はバチルス属種でもよい。別の実施形態において、発現系は、酵母、例えばピキアパストリス(Pichia pastoris)若しくはサッカロミセスセレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)等の真核生物宿主細胞系、又は哺乳動物細胞、例えばCHO細胞である。
第5の態様において、本発明は、分離基材を開示し、上で開示されるいずれかの実施形態によるFc結合リガンドを示す複数のポリペプチド又は多量体は、固体支持体にカップリングされている。分離基材は、多孔性支持体に共有結合的にカップリングされたFc結合リガンドを少なくとも11mg/mL、例えば11～25、15～25又は15～22mg/mL含んでもよく、最適には:
a)リガンドは、前述の多量体又はポリペプチドを含み、
b)多孔性支持体は、50～75、例えば56～70又は56～66マイクロメートルの容積加重中位径(d50,v)、及び55～80mg/mL 、例えば60～78又は65～78mg/mLの乾燥固体質量を有する架橋されたポリマー粒子を含む。架橋されたポリマー粒子は、分子量110kDaのデキストランに対して、0.69～0.85、例えば0.70～0.85又は0.69～0.80の逆ゲル濾過クロマトグラフィーKd値に対応する細孔サイズを更に有することができる。最適には、架橋したポリマー粒子は、高い流速に耐えるうるために、高い剛性を有することができる。基材で充填されたカラムが、流速が漸増する蒸留水に供される場合、剛性は圧力フロー試験で測定されうる。圧力が段階的に増大され、圧力の漸増とともに流速が減少し始めるまで、流速及び背圧が測定される。実現された最大流速、及び最大圧力(最大流速に対応する背圧)が測定され、剛性の尺度として使用される。ベッド高300+/-10mmでFineLine(商標)35カラム(Cytiva社)で測定される場合、最大圧力は、最適には、少なくとも0.60MPa等少なくとも0.58MPaでありうる。これは、動的能力に有益な、より小さい粒径の使用を可能にする。多量体は、例えば、アルカリ安定化プロテインAドメインの六量体等、アルカリ安定化プロテインAドメインの四量体、五量体、六量体又は七量体を含みうる。高いリガンド含有量と粒径範囲、乾燥固体質量範囲及び任意のKd範囲との組合せは、高い結合能力を提供し、例えば、IgGに対する10%貫流動的結合能力が、2.4分間の滞留時間で少なくとも50又は少なくとも55mg/mL等少なくとも45mg/mLになるようになっている。別法として又は更に、IgGに対する10%貫流動的結合能力は、6分間の滞留時間で少なくとも65、少なくとも70又は少なくとも75mg/mL等少なくとも60mg/mLでありうる。アルカリ安定化プロテインA多量体は、IgGに対して高度に選択的であり、分離基材は、20mMリン酸緩衝液、180mM NaCl、pH 7.5中で0.1mg/mL以下等0.2mg/mL以下のヒトIgG2に対する解離定数を適切に有することができる。これは、N Pakimanら、J Appl Sci 12, 1136～1141頁(2012)に記載される吸着等温線方法に従って決定されうる。
特定の実施形態において、本発明は、多孔性支持体に共有結合的にカップリングされたFc結合リガンドを少なくとも15mg/mL、例えば15～21又は15～18mg/mL含む分離基材を開示し、リガンドは、アルカリ安定化プロテインAドメインの多量体を含む。これら多量体は、適切には、上に記載の実施形態のいずれかに開示される又は以下に指定される通りでありうる。
そのような基材は、免疫グロブリン又は他のFc含有タンパク質の分離に有用であり、ポリペプチド/多量体の改善されたアルカリ安定性のため、基材は、生物プロセス分離設定における長期の反復使用に不可欠であるクリーニング中の高アルカリ条件に耐えることになる。基材のアルカリ安定性は、指定温度、例えば22+/-2℃で、アルカリ性溶液中でインキュベーションする前後に、ポリクローナルヒトIgGを一般に使用して免疫グロブリン結合能力を測定することによって評価されうる。例えば、インキュベーションは、0.5M又は1.0M NaOH中で、25、50若しくは75時間の総インキュベーション時間に相当する100、200若しくは300サイクル等、多数の15分間サイクルで実行されうる。0.5M NaOH中で、22+/-2℃で15分間を96～100サイクルのインキュベーション又は総インキュベーション時間24若しくは25時間後の基材のIgG能力は、インキュベーション前のIgG能力の少なくとも80%、例えば少なくとも85、少なくとも90又は少なくとも95%でありうる。1.0M NaOH中で、22+/-2℃で総インキュベーション時間24時間後の基材の能力は、インキュベーション前のIgG能力の少なくとも80又は少なくとも90%等少なくとも70%でありうる。2.4分間又は6分間の滞留時間におけるIgGに対する10%貫流動的結合能力(Qb10%)は、例えば、1.0M水性NaOH中で、22+/-2Cで31時間のインキュベーション後に20%未満に減少しうる。
当業者が理解することになるように、発現されるポリペプチド又は多量体は、支持体に固定化される前に適切な程度に精製されるべきである。そのような精製方法は、本分野において周知であり、支持体へのタンパク質に基づくリガンドの固定化は、標準的な方法を使用して容易に実施される。適切な方法及び支持体は、更に詳細に後述することになる。
本発明による基材の固体支持体は、任意の適切な周知の種類のものでありうる。従来通りの親和性分離基材は、しばしば有機性のものであり、使用される水性媒体に親水性表面を曝露するポリマー、即ち、その外部、存在する場合には内部表面においてヒドロキシ(-OH)、カルボキシ(-COOH)、カルボキサミド(-CONH2、場合によりN-置換形態)、アミノ(-NH2、場合により置換形態)、オリゴ-又はポリ-エチレンオキシ基を曝露するポリマーに基づく。固体支持体は、適切には多孔性でありうる。多孔性は、例えば、Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6～13頁に記載される方法に従って逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるKav又はKd値(特定のサイズのプローブ分子が利用可能な細孔容積の画分)として表すことができる。Kavは、比(Ve-V0)/(Vt-V0)として決定され、Veは、プローブ分子(例えばDextran 110kD)の溶出容積であり、V0は、カラムの空隙容積(例えば、生デキストラン等の高分子量空隙マーカーの溶出容積)であり、Vtは、カラムの総容積である。Kdは、(Ve-V0)/Viとして決定することができ、Viは、基材容積(基材ポリマー分子によって占有される容積)を除く全ての容積にアクセスできる塩(例えばNaCl)の溶出容積である。定義により、KdとKav値の両方が、常に0～1の範囲内にある。有利には、Kav値は、プローブ分子として分子量110kDaのデキストランで測定される通り0.6～0.95、例えば0.7～0.90又は0.6～0.8でありうる。適切には、分子量110kDaのデキストランで測定されるKd値は、0.68～0.90、例えば0.68～0.85又は0.70～0.85でありうる。この利点は、支持体が、本発明のポリペプチド/多量体とポリペプチド/多量体に結合する免疫グロブリンの両方を収容でき、結合部位への/からの免疫グロブリンの物質移行を生じうる大きい細孔画分を有することである。
ポリペプチド又は多量体は、例えば、リガンド中に存在するチオール、アミノ及び/又はカルボキシ基を利用する従来通りのカップリング技術によって支持体に結合されてもよい。ビスエポキシド、エピクロルヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)等は、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド/多量体の間にポリペプチド/多量体の利用可能性を改善し、ポリペプチド/多量体の、支持体への化学的カップリングを促進するスペーサーとして公知の分子が導入されうる。ポリペプチド/多量体の性質及びカップリング条件に応じて、カップリングは、多点カップリング(例えば複数のリジンによる)又は一点カップリング(例えば1つのシステインによる)でありうる。別法として、ポリペプチド/多量体は、物理的吸着又は生物特異的吸着等の非共有結合によって支持体に結合されてもよい。
一部の実施形態において、基材は、支持体にカップリングされたポリペプチド又は多量体を5～25mg/mL、例えば5～20mg/mL、5～15mg/mL、5～11mg/mL若しくは6～11mg/mL含む。カップリングされるポリペプチド/多量体の量は、カップリング過程に使用されるポリペプチド/多量体の濃度、使用される活性化及びカップリング条件並びに/又は使用される支持体の細孔構造によって制御されうる。一般に、基材の絶対的な結合能力は、少なくとも、細孔がカップリングされたポリペプチド/多量体によって有意に阻害される点までは、カップリングされるポリペプチド/多量体の量に伴って増大する。理論に束縛されるものではないが、しかし、支持体について詳述されるKd値の場合、カップリングされたリガンドによる細孔の阻害は、重要度がより低いものであると思われる。カップリングされたポリペプチド/多量体1mg当たりの相対的な結合能力は、高いカップリングレベルで低下することになり、結果として指定した範囲内で費用便益の最適条件が得られる。
特定の実施形態において、ポリペプチド又は多量体は、チオエーテル結合によって支持体にカップリングされる。そのようなカップリングを実行する方法は、本分野において周知であり、標準的な技術及び器材を使用してこの分野の当業者によって容易に実行される。チオエーテル結合は、柔軟且つ安定であり、親和性クロマトグラフィーに使用するのに一般に適している。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチド又は多量体の末端若しくは末端近くにあるシステイン残基である場合、カップリングされたポリペプチド/多量体の運動性が増強され、結合能力及び結合動態の改善が得られる。一部の実施形態において、ポリペプチド/多量体は、上記のタンパク質上に提供されるC末端システインを介してカップリングされる。このことは、支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等へのシステインチオールの効率的なカップリングを可能にし、結果としてチオエーテル架橋カップリングが得られる。
特定の実施形態において、支持体は、多糖等のポリヒドロキシポリマーを含む。多糖の例には、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロース等がある。多糖は、低度の非特異的相互作用がある本質的に親水性であり、反応性(活性化可能)のヒドロキシル基の含有量が高く、バイオ処理に使用されるアルカリクリーニング溶液に対して一般に安定である。
一部の実施形態において、支持体は、寒天又はアガロースを含む。本発明に使用される支持体は、逆懸濁ゲル化(suspension gelation)[S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2)、393～398頁(1964)]等の標準的な方法に従って容易に調製されうる。別法として、基部基材は、SEPHAROSE(商標)FF(Cytiva社)という名称で販売されている架橋アガロースビーズ等、市販の製品である。実施形態において、それは、大規模分離に特に有利であり、支持体は、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第6,602,990号又は米国特許第7,396,467号に記載される方法を使用してその剛性を増大させるように構成され、それ故、基材は高流速により適するようになる。
特定の実施形態において、ポリマー、多糖又はアガロース支持体等の支持体は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋等により架橋される。そのような架橋を生じる架橋剤試薬は、例えば、エピクロルヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハロゲン化物又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬でありうる。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋は、アルカリに安定であり、有意な非特異的吸着を生じない。
別法として、固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、等々の合成ポリマーに基づく。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンに基づく基材等の疎水性ポリマーの場合、基材の表面はしばしば親水化されて、上で定義した親水基を周囲の水性液体に曝露する。そのようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に作製され、例えば「Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization」[R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70～75頁(1988)]を参照のこと。別法として、SOURCE(商標)(Cytiva社)等の市販の製品が使用される。別の選択肢において、本発明に記載の固体支持体は、無機の性質、例えばシリカ、酸化ジルコニウム等の支持体を含む。
なお更なる実施形態において、固体支持体は、表面、チップ、毛細管又はフィルタ(例えば膜又は深層フィルタ基材)等の別の形態である。支持体が膜である場合、膜は、好適には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第10,696,714号、米国特許第10,850,259号又は米国特許仮出願第16/959,373号に記載の通り、直径10～1000nmのナノ繊維を含む線維膜でありうる。ナノ繊維は、適切には、セルロースナノ繊維でありうる。
本発明による基材の形状に関して、特定の実施形態において、基材は、多孔性モノリスの形態である。別の実施形態において、基材は、多孔性若しくは非多孔性でありうるビーズ状又は粒子形態である。ビーズ状又は粒子形態の基材は、充填ベッドとして又は懸濁形態で使用されうる。懸濁形態には、粒子又はビーズが自由に動ける膨張ベッド及び純粋な懸濁液として公知のものがある。モノリス、充填ベッド及び膨張ベッドの場合、分離手順は、濃度勾配を用いる従来通りのクロマトグラフィーに一般に従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ様式が使用されることになる。
第6の態様において、本発明は、免疫グロブリンを単離する方法を開示し、上で開示される分離基材が、使用される。本方法は:
a)免疫グロブリンを含む液体試料を上で開示される分離基材と接触させる工程と、
b)洗浄液で分離基材を洗浄する工程と、
c)溶出液で分離基材から免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)0.1～1.0M NaOH若しくはKOH、例えば0.4～1.0M NaOH又はKOHを含むことができるクリーニング液で分離基材をクリーニングする工程と
を含むことができる。工程a～d)は、少なくとも10回、例えば少なくとも50回、50～200、50～300又は50～400回繰り返すことができる。
特定の実施形態において、方法は:
a)免疫グロブリンを含む液体試料を上で開示される分離基材と接触させる工程と、
b)洗浄液で前記分離基材を洗浄する工程と、
c)溶出液で分離基材から免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)例えば、定置洗浄(CIP)液と呼ばれる場合もあるクリーニング液を用いて少なくとも10分間の接触(インキュベーション)時間で分離基材をクリーニングする工程とを含む。方法は、工程a)の前に上に記載の実施形態のいずれかによる親和性分離基材を用意する工程と、液体試料として免疫グロブリン及び少なくとも1つの他の物質を含む溶液を用意する工程と、工程c)後に溶出液を回収する工程と、任意選択で、例えば陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、多モードクロマトグラフィー及び/又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによる更なる分離工程に溶出液を供する工程も含むことができる。液体試料、洗浄液及び溶出液の適切な組成物、並びに分離を実行するための一般的な条件は、親和性クロマトグラフィーの当業者、特にプロテインAクロマトグラフィーの当業者に周知である。Fc含有タンパク質及び少なくとも1つの他の物質を含む液体試料は、CHO細胞、大腸菌又は酵母タンパク質等の宿主細胞タンパク質(HCP)を含んでいてもよい。CHO細胞及びE大腸菌のタンパク質の含有量は、これらタンパク質に対して行われる免疫アッセイ、例えばCygnus Technologies社製のCHO HCP又は大腸菌HCP ELISAキットによって都合よく決定されうる。宿主細胞タンパク質又はCHO細胞/大腸菌タンパク質は、工程b)の間に脱着されうる。
溶出は、プロテインA媒体からの溶出に使用される任意の適切な溶液を使用することによって実行されうる。これは、例えばpH5若しくはそれ以下、例えばpH2.5～5若しくは3～5の溶液又は緩衝液でありうる。それは、場合によっては、pH11若しくはより高い、例えばpH11～14若しくはpH11～13の溶液又は緩衝液でもありうる。一部の実施形態において、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、少なくとも1つの単、二若しくは三官能基カルボン酸又はそのようなカルボン酸の塩を含む。特定の実施形態において、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、コハク酸塩、リン酸塩及びギ酸塩からなる群から選択される陰イオン種を少なくとも1つ含む。
一部の実施形態において、クリーニング液は、pH13～14等アルカリ性である。そのような溶液は、特に間隔の上限で、基材の効率的なクリーニングを提供する。
特定の実施形態において、クリーニング液は、0.1～2.0M NaOH若しくはKOH、例えば0.5～2.0又は0.5～1.0M NaOH若しくはKOHを含む。これらは、効率的なクリーニング液であり、特に、NaOH又はKOH濃度が、0.1Mを上回る若しくは少なくとも0.5Mである場合、そうである。本発明のポリペプチドの高い安定性は、そのような強アルカリ性溶液の使用を可能にする。
方法は、例えば、過酸化水素等の過酸化物及び/又は過酢酸若しくは過ギ酸等の過酸を含みうる浄化液で基材を浄化する工程も含みうる。
一部の実施形態において、工程a～d)は、少なくとも10回、例えば少なくとも50回、50～200、50～300又は50～500回繰り返される。これは、基材が何度も再使用されうるという点で、過程の経済性に重要である。
また、工程a)～c)は、工程d)が複数の例の工程c)の後に実行され、工程d)が少なくとも50回等少なくとも10回実行されるように、少なくとも10回、例えば少なくとも50回、50～200、50～300又は50～500回繰り返されうる。工程d)は、例えば工程c)の2～20例毎に実行されうる。
タンパク質の変異誘発
部位特異的な変異誘発を、変異をコードしているオリゴヌクレオチドを使用してツーステップPCRによって実行した。鋳型として、Z、B又はCいずれかの単一ドメインを含有するプラスミドを、使用した。PCR断片を、大腸菌発現ベクターにライゲートした。DNA配列決定を使用して、挿入された断片の正しい配列を検証した。変異体の多量体を形成するために、アミノ酸VDに対応する、B、C又はZドメインの開始コドン(GTA GAC)に位置するAcc I部位を使用した。単量体ドメインのためのベクターを、Acc Iで消化し、ホスファターゼ処理した。各バリアントに特異的な、Acc I付着末端プライマーを設計し、2つのオーバーラッピングPCR産物を、各鋳型から生成した。PCR産物を精製し、濃度を、2%アガロースゲル上でPCR産物を比較することによって推定した。等量の一対のPCR産物を、ライゲーション緩衝液中でハイブリダイズさせた(90℃→25℃ 45分間)。得られた産物は、Acc I部位(正しいPCR断片及び/又は消化されたベクター)にライゲートされる可能性が高い断片のおよそ1/4からなる。ライゲーション及び形質転換後に、コロニーをPCRでスクリーニングして、所望の変異体を含有する構築物を同定した。陽性クローンを、DNA配列決定によって検証した。
構築物の発現及び精製
構築物を、標準的な培地中での大腸菌K12の発酵によって細菌性ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理して、培地にペリプラズム内容物を放出させた。培地中に放出された構築物を、細孔サイズ0.2μmを有する膜による微量濾過によって回収した。
濾過工程からの現在濾過生成物中にある各構築物を、親和性によって精製した。濾過生成物を、固定化したIgG(IgGセファロース6FF、Cytiva社)を含有するクロマトグラフィー媒体にロードした。ロードした産物を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、pHを低下させることによって溶出させた。
溶出プールを、中性pH(pH8)に調整し、ジチオスレイトールを添加することによって還元した。その後試料を、陰イオン交換体にロードした。洗浄工程後、構築物を、NaCl勾配中で溶出させて、あらゆる汚染物質から分離した。溶出プールを、限外濾過によって40～50mg/mLに濃縮した。固定化したIgG媒体における構築物の親和性精製の成功は、当該構築物が、IgGに対して高い親和性を有することを示す点に留意する必要がある。
精製したリガンドをRPC LC-MSで分析して純度を決定し、分子量が、期待される(アミノ酸配列に基づく)それに相当することを確認した。
(実施例1)
N末端にAQYEDGKQYTDTVDAKFDKEリーダー配列及びC末端にAPK尾部配列を更に含むTable 1(表1)に挙げた精製した単量体リガンドを、Cytiva社のアミンカップリングキット(チップ上のカルボキシメチル基に対するアミンのカルボジイミドカップリング用)を使用して、Biacore表面プラスモン共鳴(SPR)機器(Cytiva社、Sweden)においてシグナル強度約200～1500RUを与えるのに十分な量でBiacore CM5センサーチップ(Cytiva社、Sweden)上に固定化した。固定化した表面のIgG結合能力を追跡するために、1mg/mLヒトポリクローナルIgG(Gammanorm)をチップ上に流し、シグナル強度(結合量に比例する)を書き留めた。その後、表面を、定置洗浄(CIP)、即ち、500mM NaOHで、室温(22+/-2℃)で10分間洗い流した。これを、96～100サイクル繰り返し、固定化したリガンドのアルカリ安定性を、各サイクル後の残存IgG結合能力(シグナル強度)として追跡した。米国特許第10,703,774号に開示される、AQYEDGKQYTDTリーダー配列を持つリガンドZvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1(配列番号12)を、参照として使用した(配列番号12は、N末端でVDAKFDKE及びC末端でAPKを含むことに留意する)。結果をTable 1(表1)に示し、配列番号8と配列番号9の両方が、参照より有意にアルカリ安定であることを示す。
本明細書は、例を使用して、最良の様式を含めて本発明を開示し、更にあらゆる当技術に熟達した者が、あらゆるデバイス若しくは系を製作及び使用し、あらゆる組み込まれた方法を実行することを含めて本発明を実施することを可能にする。本発明の特許性のある範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が思いつく他の例を含むことができる。そのような他の例が、請求項の文字通りの文言と異ならない構造的要素を有する場合、又はそれらが請求項の文字通りの文言と実体のない差異がある同等の構造的要素を含む場合、それら例が、請求項の範囲内であることを意図する。本文に記載の特許及び特許出願の全ては、それらがあたかも個々に組み込まれているかのように、その全体を参照により本明細書に組み込む。

Claims (29)

  1. 配列番号8若しくは配列番号9によって定義される、又はそれと少なくとも95%、例えば少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含むFc結合ポリペプチド。
  2. 配列番号11:
    X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3 SKAILAEAKK LNDAQ(配列番号11)
    [配列中、互いに個別に:
    X1=A又はW
    X2=E又はR
    X3=V又はQ、
    ただしX1がAの場合、X2=R、及びX2=Eの場合、X1=Wである]
    によって定義される、又はそれと少なくとも98%の同一性を有する配列を含むFc結合ポリペプチド。
  3. X3=Vである、請求項2に記載のFc結合ポリペプチド。
  4. 1～20アミノ酸のリーダー配列を更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のFc結合ポリペプチド。
  5. 前記リーダー配列が、VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、ADNKFNKE、VDNKFNKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT及びAQYEDGKQYTDTVDAKFDKEからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも80%、例えば少なくとも90%、若しくは少なくとも95%の同一性を有する、請求項4に記載のFc結合ポリペプチド。
  6. 前記リーダー配列が、VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、YEDGVDAKFDKE及びAQYEDGKQYTDT並びにAQYEDGKQYTDTVDAKFDKEからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも90%の同一性、若しくは95%の同一性を有する、請求項4に記載のFc結合ポリペプチド。
  7. 1～5アミノ酸の尾部配列を更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のFc結合ポリペプチド。
  8. 前記尾部配列が、AP、APK及びAPAからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義される、又はそれと少なくとも60%の同一性を有する、請求項7に記載のFc結合ポリペプチド。
  9. 複数連結された、請求項1から8のいずれか一項に記載のFc結合ポリペプチドを含む多量体。
  10. 二量体、三量体、四量体、五量体、六量体又は七量体である、請求項9に記載の多量体。
  11. 前記ポリペプチドが、最高25アミノ酸、例えば3～25又は3～20アミノ酸を含むリンカーによって連結される、請求項9又は10に記載の多量体。
  12. 少なくとも2つのポリペプチドが、APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE及びYEDGからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含むリンカーによって連結される、請求項9から11のいずれか一項に記載の多量体。
  13. 少なくとも2つのポリペプチドが、APKVDAKFDKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE及びYEDGからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含むリンカーによって連結される、請求項9から11のいずれか一項に記載の多量体。
  14. N末端に1～20アミノ酸残基のN末端配列を更に含む、請求項9から13のいずれか一項に記載の多量体。
  15. 前記N末端配列が、AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE、AQGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYT、AQKDQTWYTG、AQHDEAQQEA、AQGGGSGGGS、AQYEDGKQYGT、AQYEDGKQGT、AQYEDGKQYTTLEKGT、AQYEDGKQYTTLEKPVAGGT、AQYEDGKQYTET、AQYEDGKQYTDT、AQYEDGKQYTAT、AQYEDGKQYEDT、AQHHHHHHHHGT、AQHHHHHHGT及びAQHDEAQQEAGTからなる群から選択される配列を含む、請求項14に記載の多量体。
  16. C末端又はN末端に、1つ若しくは複数のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1つ若しくは複数のカップリング要素を更に含む、請求項9から15のいずれか一項に記載の多量体。
  17. 前記C末端に又は前記C末端から5アミノ酸残基以内に単一のシステイン残基を含む、請求項16に記載の多量体。
  18. 請求項1から17のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド又は多量体をコードしている核酸若しくはベクター。
  19. 請求項18に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
  20. 固体支持体に共有結合的にカップリングされた請求項1から17のいずれか一項に記載の複数のポリペプチド又は多量体を含む分離基材。
  21. 多孔性支持体1mL当たりポリペプチド又は多量体を少なくとも11mg含む、請求項20に記載の分離基材。
  22. 前記支持体が、多孔性ポリマー粒子を含む、請求項20又は21に記載の分離基材。
  23. 前記多孔性ポリマー粒子が、架橋されたアガロース粒子である、請求項22に記載の分離基材。
  24. 前記支持体が、多孔性膜を含む、請求項20又は21に記載の分離基材。
  25. 前記支持体が、直径10～1000nmのナノ繊維を含む線維膜を含む、請求項24に記載の分離基材。
  26. 前記ナノ繊維が、セルロースナノ繊維である、請求項25に記載の分離基材。
  27. a)免疫グロブリンを含む液体試料を請求項1から26のいずれか一項に記載の分離基材と接触させる工程と、
    b)洗浄液で前記分離基材を洗浄する工程と、
    c)溶出液で分離基材から免疫グロブリンを溶出する工程と、
    d)クリーニング液で分離基材をクリーニングする工程とを含む、免疫グロブリンを単離する方法。
  28. 前記クリーニング液が、0.1～1.0M NaOH又はKOH、例えば0.4～1.0M NaOH又はKOHを含む、請求項27に記載の方法。
  29. 工程a)～d)が、少なくとも10回、例えば少なくとも50回、50～200回又は50～400回繰り返される、請求項27又は28に記載の方法。
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