JP6862008B2 - 突然変異免疫グロブリン結合ポリペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野、より具体的には、免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーに有用なプロテインＡの突然変異免疫グロブリン結合ドメインに関する。本発明はまた、突然変異ドメインの多量体、及び突然変異ドメイン又は多量体を含有する分離マトリックスに関する。
免疫グロブリンは、製造又は開発のいずれかで世界的に最も普及しているバイオ医薬品の代表である。この特定の治療市場に対する高い商業上の需要及びそれ故のその価値のため、製薬会社は、関連コストを管理しながら、それぞれのｍＡｂの製造プロセスの生産性を最大限にすることに重点を置いている。
アフィニティークロマトグラフィーは、ほとんどの場合、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の精製における重要な工程の１つとして使用される。特に興味深いクラスのアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変の部分に特異的に結合することができるタンパク質であり、このような相互作用は、抗体の抗原結合特異性と無関係である。このような試薬は、限定されないが、血清調製物もしくは血漿調製物又は細胞培養由来の供給材料などの様々なサンプルから、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用することができる。このようなタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合することができるドメインを含有するブドウ球菌プロテインＡである。
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）をベースとする試薬は、親和性及び選択性が高いため、バイオテクノロジーの分野（例えば、抗体の捕捉及び精製、並びに検出又は定量に関するアフィニティークロマトグラフィー）において、広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡをベースとするアフィニティー媒体は、おそらく、工業用の細胞培養上清を含む様々なサンプルからモノクローナル抗体及びその断片を単離するための最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡ−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインＡ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標），ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の形態で市販されており、組換えプロテインＡ（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標），ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から構成されるものもある。より具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で行われる遺伝子操作は、支持体へのその付着を容易にするためのものである。
これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、混入物質の確実な除去に総合的な配慮が必要とされる。例えば、このような混入物質は、クロマトグラフィー法において固定相又はマトリックスに吸着される非溶出分子、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを含む望ましくない生体分子又は微生物であり得る。後の使用の前にマトリックスを再生するために、マトリックスからのこのような混入物質の除去は、通常、所望の産物が最初に溶出した後に行われる。このような除去は、通常、混入物質を固定相から溶出することができる薬剤を使用するクリーンインプレイス（ＣＩＰ）として公知の手法を用いる。多くの場合に使用されるこのようなクラスの薬剤の１つは、固定相を通過するアルカリ性溶液である。現在最も広く使用されているクリーニング及び消毒薬剤はＮａＯＨであり、その濃度は混入の程度及び性質に応じて、０．１Ｍ〜例えば最大１Ｍの範囲であり得る。この戦略は、マトリックスを１３超のｐＨ値に曝露することに関連する。タンパク質性のアフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスについて、このようなアルカリ性環境は極めて苛酷な条件であるため、関連の高ｐＨに対するリガンドの不安定性を原因とする能力の低下をもたらす。
したがって、広範な研究では、アルカリ性ｐＨ値に耐える改善された能力を示す人工タンパク質リガンドの開発に焦点が当てられている。例えば、Ｇｕｌｉｃｈら（Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００），１６９−１７８）は、連鎖球菌のアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）のアルカリ性環境における安定性を改善するためにタンパク質工学を提案している。Ｇｕｌｉｃｈらは、４つのアスパラギン残基すべてがロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）及びリジン（１つの残基）により置換されたＡＢＤの突然変異体を作り出した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈらは、彼らの突然変異体が、天然のタンパク質のものと類似の標的タンパク質結合挙動を示すこと、人工リガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ性条件に繰り返し曝露した後に、親の非人工リガンドを使用して調製したカラムよりも高い結合能を示すことを報告している。したがって、そこでは、構造及び機能に対するいかなる重大な影響も及ぼさずに、４つのアスパラギン残基すべてを置換することができると結論されている。
最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）を変化させて同様の特性をもたらし得ることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号では、１以上のアスパラギン残基がグルタミン及びアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異すると、突然変異は、最大約１３〜１４のｐＨ値において、親ＳｐＡ（例えば、ＳｐＡのＢドメイン、又はＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５，１４３，８４４号））と比較して増加した化学安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの突然変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用すると、その分離媒体は、予想通り、アルカリ性薬剤を使用するクリーニング手順により耐性良好であり得ることを示している。国際公開第２００８／０３９１４１号、特開２００６３０４６３３号、欧州特許第１９９２６９２号、欧州特許第２２０２３１０号、国際公開第２０１０／１１０２８８号、国際公開第２０１２／０８６６６０号及び国際公開第２０１２／０８３４２５号では、アルカリ安定性を高めることを目的とするプロテインＡドメインのさらなる突然変異も公表されている。しかしながら、現在利用可能な突然変異は依然として、アルカリ性ｐＨに対して感受性であり、クリーニング中のＮａＯＨ濃度は通常、０．１Ｍに制限されている（これは、完全なクリーニングを達成することが困難であることを意味する）。クリーニングを改善するより高いＮａＯＨ濃度は、許容され得ない能力喪失につながる。
米国特許出願公開第２０１３００４６０５６号
したがって、この分野では、アルカリクリーニング手順に関して、さらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性が依然として存在する。
本発明の一態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチドを提供することである。これは、請求項１に記載されているポリペプチドを用いて達成される。
１つの利点は、アルカリ安定性が親ポリペプチドよりも改善されることである。さらなる利点は、免疫グロブリン及び他のＦｃ含有タンパク質に対する高選択的結合である。
本発明の第２の態様は、アルカリ安定性が向上した多量体であって、複数のポリペプチドを含む多量体を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている多量体を用いて達成される。
本発明の第３の態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクターを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている核酸又はベクターを用いて達成される。
本発明の第４の態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチド又は多量体を発現することができる発現系を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている発現系を用いて達成される。
本発明の第５の態様は、免疫グロブリン及び他のＦｃ含有タンパク質に選択的に結合することができる分離マトリックスであって、改善されたアルカリ安定性を示すことができる分離マトリックスを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている分離マトリックスを用いて達成される。
本発明の第６の態様は、免疫グロブリン又は他のＦｃ含有タンパク質を単離する効率的かつ経済的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている方法を用いて達成される。
本発明のさらなる適切な実施形態は、従属請求項に記載されている。
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質、及び抗体又は抗体断片を含むコンジュゲートを含むと理解される。
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」及び「Ｆｃ結合タンパク質」はそれぞれ、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）に結合することができるポリペプチド又はタンパク質を意味し、例えば、プロテインＡ及びプロテインＧ、又は結合特性が維持されているそれらの任意の断片もしくは融合タンパク質を含む。
ＳＰＲバイオセンサーチップにカップリングした突然変異及び非突然変異単量体Ｚｖａｒ（配列番号４）ポリペプチド変異体のアルカリ安定性に関する実施例１の結果を示す。 最高のアルカリ安定性を有するポリペプチド変異体に関する図１の拡大図である。
一態様では、本発明は、配列番号１もしくは配列番号２によって特定されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のＢもしくはＣドメインの、又は配列番号３もしくは配列番号４によって特定されるプロテインＺの１つ以上の突然変異体を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチドであって、少なくとも９位のグルタミン残基が、アスパラギン以外のアミノ酸に突然変異しているポリペプチドを開示する。配列番号４は、突然変異Ｎ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３Ｔを有するプロテインＺの変異体（本明細書ではＺｖａｒと称される）を表す。これらのドメインにおけるＱ９の突然変異は、免疫グロブリン結合特性を損なわずに、親ドメイン／ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。したがって、ポリペプチドは、Ｆｃ結合ポリペプチド又は免疫グロブリン結合ポリペプチドとも記載され得る。
配列番号１（ＳｐＡ Ｂドメイン）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２（ＳｐＡ Ｃドメイン）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３（プロテインＺ）
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４（Ｚｖａｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
いくつかの実施形態では、配列番号１〜４の少なくとも９位のグルタミン残基は、アスパラギン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。これの利点は、アミド分解に感受性のアスパラギンが導入されないこと、プロリンの導入によって鎖のコンフォメーションが障害されないこと、及びジスルフィド架橋のための部位が導入されないことである。Ｑ９突然変異（例えば、Ｑ９Ａ突然変異）は唯一の突然変異であり得るか、又はポリペプチドは、例えば、位置Ｎ３、Ｎ６、Ｑ１０、Ｅ１５、Ｈ１８、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｇ／Ａ２９、Ｄ３６、Ｑ／Ｖ４０、Ａ／Ｋ４２、Ｎ／Ｅ４３、Ｌ／Ｉ４４、Ｅ４７、Ｑ５５及びＰ５７の少なくとも１つにおいて、さらなる突然変異も含み得る。これらの位置の１つ以上において、元のアミノ酸残基は、例えば、アスパラギン、プロリン及びシステインではないアミノ酸で置換され得る。元のアミノ酸残基は、例えば、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、リジン又はアスパラギン酸で置換され得る。
特定の実施形態では、２３位のアミノ酸残基は、トレオニン又はアラニンである。
いくつかの実施形態では、３位のアミノ酸残基はアラニンであり、及び／又は６位のアミノ酸残基はアスパラギン酸である。特定の実施形態では、３位及び６位のアミノ酸残基の少なくとも１つは、アスパラギンである。
特定の実施形態では、３３位のセリン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばリジンに突然変異している。代替的な実施形態では、３３位のアミノ酸残基は、セリンである。
いくつかの実施形態では、１０位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。代替的な実施形態では、１０位のアミノ酸残基は、グルタミンである。
特定の実施形態では、３２位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。代替的な実施形態では、３２位のアミノ酸残基は、グルタミンである。
いくつかの実施形態では、４０位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン又はバリンに突然変異している。代替的な実施形態では、４０位のアミノ酸残基は、グルタミンである。
特定の実施形態では、５５位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン、セリン又はグルタミン酸に突然変異している。代替的な実施形態では、５５位のアミノ酸残基は、グルタミンである。
いくつかの実施形態では、２６位のアミノ酸残基は、グルタミンである。Ｑ９突然変異を有するポリペプチドのアルカリ安定性は、Ｑ２６がトレオニン又はアラニンに突然変異していない場合よりも優れていると思われる。代替的な実施形態では、２６位のアミノ酸残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン、システイン、トレオニン及びアラニン以外のアミノ酸に突然変異し得る。
特定の実施形態では、１５位のグルタミン酸残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している。特定の実施形態では、１５位のグルタミン酸残基は、リジンに突然変異している。この偶発的突然変異は、Ｑ９突然変異を有するポリペプチドのアルカリ安定性をさらに改善する。代替的な実施形態では、１５位のアミノ酸残基は、グルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、４７位のグルタミン酸残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン又はトレオニンに突然変異している。代替的な実施形態では、４７位のアミノ酸残基は、グルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、２１位のアスパラギン残基は、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアスパラギン酸に突然変異している。代替的な実施形態では、２１位のアミノ酸残基は、アスパラギンである。
特定の実施形態では、３６位のアスパラギン酸残基は、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している。特定の実施形態では、３６位のアスパラギン酸残基は、アラニン又はトレオニンに突然変異している。代替的な実施形態では、３６位のアミノ酸は、アスパラギン酸である。
いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｑ９Ａ、Ｑ９Ａ，Ｅ１５Ｋ、Ｑ９Ａ，Ｅ４７Ｔ、Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ｔ、Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ａ及びＱ９Ｔ，Ｅ４７Ｔからなる群から選択される。これらの突然変異は、特に高いアルカリ安定性を提供する。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３並びにさらに配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７からなる群から選択される配列を含む。それは、例えば、配列番号６〜１０及び２０〜２３からなる群から選択される配列によって定義され得るが、それはまた、さらなるアミノ酸残基をＣ末端及び／又はＮ末端に含み得る。
配列番号６ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ１５Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ４７Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＴＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＡＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ｔ，Ｅ４７Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＴＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２１
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＴＤＰＳＶ ＳＫＮＩＬＡＡＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２２
ＶＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＴＤＰＳＶ ＳＫＮＩＬＡＡＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３
ＶＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＴＤＰＳＶ ＳＫＮＩＬＡＡＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４ Ｚｖａｒ４
ＡＱ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２５ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ）４
ＡＱ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２６ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ１５Ｋ）４
ＡＱ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＫＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２７ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ４７Ｔ）４
ＡＱ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＴＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
第２の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態によって定義される複数のポリペプチドユニットを含むか、又はこれらから本質的になる、多量体を開示する。多量体は、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体であり得る。それは、多量体中のすべてのユニットが同一であるホモ多量体であり得るか、又はそれは、１以上のユニットが他のものと異なるヘテロ多量体であり得る。有利には、多量体中のすべてのユニットは、上記に開示される突然変異を含むことなどによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって、直接連結され得る。或いは、多量体中の２つ以上のユニットは、オリゴマー種又はポリマー種を含む要素、例えば最大１５アミノ酸又は３０アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０又は５〜１０アミノ酸を含む要素によって、連結され得る。好ましくは、このような連結の性質は、タンパク質ユニットの空間的立体構造を不安定化すべきではない。これは、例えば、連結におけるプロリンの存在を回避することによって達成され得る。さらに、連結はまた、好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質ユニットの特性を損なわない程十分に安定であるべきである。このために、連結がアスパラギンを含有しない場合には、有利である。連結がグルタミンを含有しない場合には、さらに有利であり得る。多量体は、クローニングプロセスに由来するか、又は切断されるシグナル配列由来の残基を構成する複数のアミノ酸残基をＮ末端にさらに含む。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば、１５以下、例えば１０以下又は５以下であり得る。具体的な例として、多量体は、ＡＱ配列をＮ末端に含み得る。
いくつかの実施形態では、上記の開示されるポリペプチド及び／又は多量体は、システイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される１つ以上のカップリング要素をＣ末端又はＮ末端にさらに含む。カップリング要素は、例えば、Ｃ末端の単一のシステインであり得る。カップリング要素は、Ｃ末端もしくはＮ末端に直接連結され得るか、又はそれは、最大１５アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０又は５〜１０アミノ酸を含むリンカーを介して連結され得る。このストレッチはまた、好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質の特性を損なわない程十分に安定であるべきである。このために、ストレッチがアスパラギンを含有しない場合には、有利である。ストレッチがグルタミンを含有しない場合には、さらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有することの利点は、タンパク質の端点のカップリングが、システインチオールと支持体上の求電子基との反応によって達成され得ることである。これは、結合能に重要なカップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。
第３の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態のポリペプチド又は多量体をコードする核酸を開示する。したがって、本発明は、ポリペプチド又は多量体をコードする本核酸配列のすべての形態、例えばＲＮＡ及びＤＮＡを包含する。本発明は、コード配列に加えて、本発明のポリペプチド又は多量体の発現に必要なシグナル配列を含むベクター、例えばプラスミドを包含する。一実施形態では、ベクターは、本発明の多量体をコードする核酸を含み、各ユニットをコードする別個の核酸は、同種ＤＮＡ配列又は異種ＤＮＡ配列を有し得る。
第４の態様では、本発明は、上記に開示される核酸又はベクターを含む発現系を開示する。発現系は、例えば、本ポリペプチド又は多量体を発現するように改変されているグラム陽性又はグラム陰性原核生物宿主細胞系、例えばＥ．ｃｏｌｉ種又はＢａｃｉｌｌｕｓ種であり得る。代替的な実施形態では、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばＰｉｃｈｅａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
第５の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態の複数のポリペプチド又は多量体が固体支持体にカップリングされている分離マトリックスを開示する。このようなマトリックスは、免疫グロブリン又は他のＦｃ含有タンパク質の分離に有用であり、ポリペプチド／多量体の改善されたアルカリ安定性により、マトリックスは、クリーニング中の高アルカリ条件（これは、バイオプロセス分離の状況において、長期の反復使用に必須である）に耐えるであろう。
当業者であれば理解するように、発現されたポリペプチド又は多量体を、支持体に固定化する前に適切な程度に精製されなければならない。このような精製方法は当技術分野で周知であり、支持体へのタンパク質系リガンドの固定化は、標準的な方法を使用して容易に行われる。適切な方法及び支持体を以下でより詳細に議論する。
本発明のマトリックスの固体支持体は、任意の適切な周知の種類のものであり得る。従来のアフィニティー分離マトリックスは、多くの場合、有機性であり、使用する水性媒体に親水性表面が露出する（すなわち、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ2、おそらくＮ−置換形態）、アミノ（−ＮＨ2、おそらく置換形態）、オリゴ−もしくはポリエチレンオキシ基をその外部表面上に、及び存在する場合にはその内部表面上に露出する）ポリマーをベースとするものである。固体支持体は、適切には、多孔質であり得る。多孔性は、例えば、Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，ｐｐ６−１３に記載されている方法にしたがって、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるＫａｖ値又はＫｄ値（利用可能な細孔容積と、特定サイズのプローブ分子との割合）と表され得る。定義では、Ｋｄ値及びＫａｖ値は両方とも常に、０〜１の範囲内にある。プローブ分子として分子量（Ｍｗ）１１０ｋＤａのデキストランを用いて測定する場合、Ｋａｖ値は、有利には、０．６〜０．９５、例えば０．７〜０．９０又は０．６〜０．８であり得る。この利点は、本発明のポリペプチド／多量体、及びポリペプチド／多量体に結合する免疫グロブリンの両方に適合可能な多数の細孔であって、結合部位への及び結合部位からの免疫グロブリンの大量輸送を提供可能な多数の細孔を支持体が有することである。
ポリペプチド又は多量体は、例えば、リガンドに存在するチオール、アミノ及び／又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術によって支持体に結合され得る。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド／多量体との間に、ポリペプチド／多量体のアベイラビリティを改善し、支持体へのポリペプチド／多量体の化学的カップリングを容易にする分子（スペーサーとして公知である）を導入し得る。或いは、ポリペプチド／多量体は、物理的吸着又は生物特異的な吸着などの非共有結合によって支持体に結合され得る。
いくつかの実施形態では、マトリックスは、支持体にカップリングされた５〜２０、例えば５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌ又は６〜１１ｍｇ／ｍｌのポリペプチド／多量体を含む。カップリングされるポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスに使用されるポリペプチド／多量体の濃度、使用されるカップリング条件及び／又は使用される支持体の細孔構造によって制御され得る。原則として、マトリックスの絶対的な結合能は、少なくとも、カップリングされたポリペプチド／多量体によって細孔が著しく狭窄されるようになる時点までは、カップリングされるポリペプチド／多量体の量と共に増加する。高いカップリングレベルでは、カップリングされるポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合能は低下し、上記範囲内で最適な費用便益となる。
特定の実施形態では、ポリペプチド又は多量体は、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。このようなカップリングを実施する方法は当技術分野で周知であり、標準的な技術及び装置を使用して当業者により容易に実施される。チオエーテル結合は柔軟かつ安定であり、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用に一般に適切である。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチド又は多量体の末端又は末端付近のシステイン残基を介したものである場合、カップリングされるポリペプチド／多量体の移動度が増強されて、改善された結合能及び結合速度が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド／多量体は、上記のようにタンパク質上に存在するＣ末端のシステインを介してカップリングされる。これにより、システインチオールと、支持体上の求電子基（例えば、エポキシド基、ハロヒドリン基など）との効率的なカップリングが可能となり、チオエーテル架橋結合が生じる。
特定の実施形態では、支持体は、多糖などのポリヒドロキシポリマーを含む。多糖の例としては、例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖は本来的に親水性であり、非特異的な相互作用の程度が低く、高含量の反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基を提供し、バイオプロセシングで使用されるアルカリ性クリーニング溶液に対して一般に安定である。
いくつかの実施形態では、支持体は、寒天又はアガロースを含む。本発明で使用される支持体は、逆懸濁ゲル化（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））などの標準的な方法にしたがって容易に調製され得る。或いは、ベースマトリックスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販の製品である。大規模な分離に特に有利な一実施形態では、支持体は、米国特許第６６０２９９０号又は米国特許第７３９６４６７号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用してその剛性を増加するように適合されているので、マトリックスは、高流速により適切になる。
特定の実施形態では、多糖又はアガロース支持体などの支持体は、例えばヒドロキシアルキルエーテル架橋により架橋されている。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えばエピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライド又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であり得る。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋は、アルカリ安定性であり、有意な非特異的吸着を生じない。
或いは、固体支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどをベースとする。ジビニル置換ベンゼン及びモノビニル置換ベンゼンをベースとするマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックスの表面は、上記に定義される親水性基を周囲の水性液体に露出するように親水化されることが多い。このようなポリマーは、標準的な方法にしたがって容易に生産される。例えば、「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照のこと。或いは、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販の製品が使用される。別の代替方法では、本発明の固体支持体は、支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
さらに別の実施形態では、固体支持体は、表面、チップ、毛細管又はフィルター（例えば、膜又はデプスフィルタマトリックス）などの別の形態である。
本発明のマトリックスの形状に関して、一実施形態では、マトリックスは、多孔質モノリスの形態である。代替的な実施形態では、マトリックスは、多孔質又は非多孔質であり得るビーズ形態又は粒子形態である。ビーズ形態又は粒子形態のマトリックスは、充填層として、又は懸濁形態で使用され得る。懸濁形態としては、粒子又はビーズが自由に移動する膨張床及び純粋な懸濁液として公知のものが挙げられる。モノリス、充填層及び膨張床の場合、分離手順は、一般に、濃度勾配を有する従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ式モードが使用される。
第６の態様では、本発明は、免疫グロブリンを単離する方法であって、上記に開示される分離マトリックスを使用する方法を開示する。
特定の実施形態では、本方法は、
ａ）免疫グロブリンを含む液体サンプルを、上記に開示される分離マトリックスと接触させる工程、
ｂ）洗浄液で分離マトリックスを洗浄する工程、
ｃ）溶出液を用いて、分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
ｄ）クリーニング液で分離マトリックスをクリーニングする工程
を含む。
本方法はまた、工程ａ）の前に、上記に開示される実施形態のいずれかのアフィニティー分離マトリックスを提供する工程、並びに免疫グロブリン及び１以上の他の物質を含む溶液を液体サンプルとして提供する工程を含み得、工程ｃ）の後に、溶出液を回収する工程、及び場合により溶出液を、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる分離工程に供する工程を含み得る。液体サンプル、洗浄液及び溶出液の適切な組成、並びに分離を実施するための一般的な条件は、アフィニティークロマトグラフィーの技術分野、特にプロテインＡクロマトグラフィーの技術分野で周知である。Ｆｃ含有タンパク質及び１以上の他の物質を含む液体サンプルは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばＣＨＯ細胞又はＥ Ｃｏｌｉタンパク質を含み得る。便利なことに、ＣＨＯ細胞及びＥ Ｃｏｌｉタンパク質の内容物は、これらのタンパク質に対するイムノアッセイ、例えばＣｙｇｎｕｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＨＯ ＨＣＰ又はＥ Ｃｏｌｉ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットによって決定され得る。工程ｂ）において、宿主細胞タンパク質又はＣＨＯ細胞／Ｅ Ｃｏｌｉタンパク質を脱着し得る。
溶出は、プロテインＡ媒体からの溶出に使用される任意の適切な溶液を使用することによって実施され得る。これは、例えば、ｐＨ５以下、例えばｐＨ２．５〜５又は３〜５の溶液又は緩衝液であり得る。いくつかの場合では、それは、ｐＨ１１以上、例えばｐＨ１１〜１４又はｐＨ１１〜１３の溶液又は緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、１以上の一官能性カルボン酸、二官能性カルボン酸もしくは三官能性カルボン酸又はこのようなカルボン酸の塩を含む。特定の実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、コハク酸塩、リン酸塩及びギ酸塩からなる群から選択される１以上の陰イオン種を含む。
いくつかの実施形態では、クリーニング液は、アルカリ性であり、例えば１３〜１４のｐＨを有する。このような溶液は、特に間隔の上限において、マトリックスの効率的なクリーニングを提供する。
特定の実施形態では、クリーニング液は、０．１〜２．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．５〜２．０又は０．５〜１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。
いくつかの実施形態では、工程ａ）〜ｄ）を少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回又は５０〜２００回繰り返す。
タンパク質の突然変異誘発
アスパラギン置換体をコードするオリゴヌクレオチドを使用してツーステップＰＣＲにより、部位特異的突然変異誘発を行った。鋳型として、Ｚ又はＣのいずれかの単一ドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（ｐＧＯ）にライゲーションした。ＤＮＡ配列決定を使用して、挿入された断片の正しい配列を確認した。
突然変異体の多量体を形成するために、Ｃ又はＺドメインの開始コドン（ＧＴＡ ＧＡＣ）（アミノ酸ＶＤに対応する）内に位置するＡｃｃＩ部位を使用した。単量体ドメイン用のｐＧＯをＡｃｃＩで消化し、ＣＩＰ処理した。各変異体に特異的なＡｃｃＩ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各鋳型から作製した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上のＰＣＲ産物を比較することによって、濃度を評価した。連結緩衝液中で、等量の対合ＰＣＲ産物をハイブリダイズさせた（４５分で９０℃→２５℃）。得られた産物は、ＡｃｃＩ部位（正しいＰＣＲ断片及び／又は消化ベクター）にライゲーションされる可能性が高い断片の約１／４からなる。ライゲーション及び形質転換の後、コロニーをＰＣＲスクリーニングして、所望の突然変異体を含有する構築物を同定した。ＤＮＡ配列決定によって、陽性クローンを確認した。
構築物の発現及び精製
標準培地中、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の発酵により、構築物を細菌のペリプラズム内で発現させた。発酵後、細胞を熱処理して、ペリプラズム内容物を培地中に放出させた。０．２μｍの細孔径を有する膜を用いて精密ろ過により、培地中に放出された構築物を回収した。
アフィニティーにより、各構築物（この時点では、ろ過工程からの透過液である）を精製した。この透過液を、固定化ＩｇＧを含有するクロマトグラフィー媒体にロードした。ロードした産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることによって溶出した。
溶出プールを中性のｐＨに調整し、ジチオトレイトールの追加により還元した。次いで、サンプルを陰イオン交換体にロードした。洗浄工程後、構築物をＮａＣｌ勾配で溶出して、混入物質からそれを分離した。限外ろ過によって、溶出プールを４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。固定化ＩｇＧ媒体上の構築物のアフィニティー精製の成功は、問題の構築物がＩｇＧに対して高い親和性を有することを示すことに留意すべきである。
ＬＣ−ＭＳで精製リガンドを分析して純度を決定し、分子量が（アミノ酸配列に基づいて）予想されたものに対応することを確認した。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（アミンをチップ上のカルボキシメチル基にカルボジイミドカップリングするためのもの）を使用して、表１に記載されている精製単量体リガンドをＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に十分な量で固定化して、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）で約１０００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合能を把握するために、１ｍｇ／ｍｌのヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、表面をクリーンインプレイス（ＣＩＰ）した（すなわち、５００ｍＭ ＮａＯＨによって室温（２２＋／−２℃）で１０分間洗い流した）。これを９６サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクル後のＩｇＧ結合能（シグナル強度）の相対喪失として把握した。結果は、図１及び表１に示されており、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ１５Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｅ４７Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ａ）１及びＺｖａｒ（Ｑ９Ｔ，Ｅ４７Ｔ）１が、親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が向上したことを示している。
Figure 0006862008
下記方法を使用して、表２の精製四量体リガンド（すべてが、さらなるＮ末端システインを有する）をアガロースビーズ上に固定化し、能力及び安定性について評価した。
Figure 0006862008
 活性化
使用したベースマトリックスは、平均直径８５マイクロメートル（容積重量）の堅く架橋されたアガロースビーズであり、米国特許第６６０２９９０号の方法にしたがって調製し、Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，ｐｐ６−１３に記載されている方法にしたがって、分子量（Ｍｗ）１１０ｋＤａのデキストランについて０．７０の逆ゲルろ過クロマトグラフィーＫａｖ値に相当する細孔径を有する。
１００ｍＬフラスコ中で、２５ｍＬ（ｇ）のドレインしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水及び２．０２ｇのＮａＯＨ（ｓ）を、機械的に撹拌しながら２５℃で１０分間混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを追加し、反応を２時間進行させた。１０ゲル堆積容量（ＧＶ）の水で活性化ゲルを洗浄した。
カップリング
５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中の２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ3、２１ｍｇのＮａ2ＣＯ3、１７５ｍｇのＮａＣｌ及び７ｍｇのＥＤＴＡを追加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブル上に５〜１０分間置き、次いで、７７ｍｇのＤＴＥを追加した。還元を４５分間超行った。次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムで、リガンド溶液を脱塩した。２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって、脱塩溶液中のリガンド含量を決定した。
３〜５ＧＶの｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．６｝で活性化ゲルを洗浄し、次いで、米国特許第６３９９７５０号に記載されている方法にしたがって、リガンドをカップリングした。実験で使用したすべての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。リガンド溶液の濃度を変化させることによって、ゲルのリガンド含量を制御することができる。
固定化後、３×ＧＶの蒸留水でゲルを洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロール ｐＨ８．６｝を混合し、チューブを振盪台に室温で一晩放置した。次いで、３×ＧＶの｛０．１Ｍ ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．６｝及び０．５Ｍ ＨＡｃで、次いで８〜１０×ＧＶの蒸留水で、ゲルを交互に洗浄した。アミノ酸分析のために、ゲルサンプルを外部の試験所に送付し、リガンド含量（ｍｇ／ｍｌゲル）を総アミノ酸含量から計算した。
２ｍｌの樹脂をＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５１００カラムに充填した。
タンパク質
平衡化緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈したＧａｍｍａｎｏｒｍ １６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃ
ｔａｐｈａｒｍａ）。
平衡化緩衝液
ＡＰＢリン酸緩衝液２０ｍＭ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏ
ｍ ＡＢ）。
吸着緩衝液
ＡＰＢリン酸緩衝液２０ｍＭ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏ
ｍ ＡＢ）。
溶出緩衝液
クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ６
クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ３。
ＣＩＰ
０．５Ｍ ＮａＯＨ。
滞留時間２．４分において、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ １０システムを用いて、貫流容量を決定した。安定ベースラインが得られるまで、平衡緩衝液をバイパスカラムに流した。自動ゼロ化の前に、これを行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで、サンプルをカラムに添加した。次いで、安定ベースラインが得られるまで、平衡緩衝液を添加した。
最大吸光度の８５％のＵＶシグナルが達成されるまで、サンプルをカラムにロードした。次いで、流速０．５ｍｌ／分で、最大吸光度の２０％のＵＶシグナルまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。流速０．５ｍｌ／分で、ｐＨ６．０から開始してｐＨ３．０で終了する１０カラム容量の直線勾配で、タンパク質を溶出した。次いで、流速０．５ｍｌ／分の０．１Ｍ ＮａＯＨでカラムをクリーニングし、平衡緩衝液で再平衡化してから、２０％エタノールでクリーニングした。この最終工程は、１００％ＵＶシグナルが得られるまでサンプルをバイパスカラムにロードすることにより、サンプル濃度をチェックするためのものであった。
１０％における貫流容量の計算では、以下の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧ濃度が供給液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムにロードされるＩｇＧの量である。
Figure 0006862008
 Ａ100%＝１００％ＵＶシグナル、
Ａsub＝非結合性ＩｇＧサブクラスによる吸光度寄与、
Ａ（Ｖ）＝所定の添加量における吸光度、
Ｖc＝カラム容量、
Ｖapp＝１０％貫流までに添加した量、
Ｖsys＝システムのデッドボリューム、
Ｃ0＝供給液濃度。
１０％貫流における動的結合容量（ＤＢＣ）を計算し、曲線の外観を検討した。結合、溶出及びＣＩＰピークに関しても、曲線を検討した。１０及び８０％貫流について、動的結合容量（ＤＢＣ）を計算した。
アルカリ性クリーニング溶液に繰り返し曝露する前後に、１０％貫流ＤＢＣ（Ｑｂ１０）を決定した。各サイクルには、０．５Ｍ ＮａＯＨをカラムに速度５マイクロリットル／分でポンピングして、１サイクル当たり１０分間の曝露時間をもたらすＣＩＰ工程が含まれていた。曝露を室温（２２±２℃）で行った。表２は、１００サイクル後の残存容量（すなわち、（０．５Ｍ ＮａＯＨに対する１０００分間の累積曝露時間）を、絶対数及び初期容量に対する相対数の両方で示す。
本発明（最良の形態を含む）を開示するために、そしてさらに、当業者が本発明を実施すること（任意のデバイス又はシステムを作製及び使用すること、並びに組み込まれている任意の方法を実施することを含む）ができるように、本明細書では実施例を使用している。本発明の特許可能な範囲は特許請求の範囲によって規定され、当業者が想到する他の例を含み得る。このような他の例は、特許請求の範囲の文言と相違しない構成要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文言と実質的な相違を有する均等な構成要素を含む場合には、特許請求の範囲の範囲内にあるものである。

Claims (13)

  1. アルカリ安定性が向上した、免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質に結合することができるポリペプチドであって、配列番号１もしくは配列番号２によって特定されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のＢもしくはＣドメインの、又は配列番号３によって特定されるプロテインＺの突然変異体を含み、
    ９位のアミノ酸残基がアラニンであり、
    １０位のアミノ酸残基がグルタミンであり、
    ２１位のアミノ酸残基がアスパラギンであり、
    ２３位のアミノ酸残基がトレオニンであり、
    ２６位のアミノ酸残基がグルタミンであり、
    ３２位のアミノ酸残基がグルタミンであり、
    ３３位のアミノ酸残基がセリンであり、
    ４７位のアミノ酸残基がグルタミン酸であり、かつ
    ５５位のアミノ酸残基がグルタミンであり、
    前記アミノ酸残基の位置が、配列番号１から３に基づいて規定される、
    ポリペプチド。
  2. ３位のアミノ酸残基がアラニンであり、及び／又は６位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ４０位のアミノ酸残基がグルタミン又はバリンである、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。
  4. １５位のアミノ酸残基がグルタミン酸である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  5. １５位のグルタミン酸残基がリジンに突然変異している、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. ３６位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  7. 突然変異が、Ｑ９Ａ、Ｑ９Ａ，Ｅ１５Ｋ、Ｑ９Ａ，Ｄ３６Ｔ及びＱ９Ａ，Ｄ３６Ａからなる群から選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドユニットを含む或いはそれらから本質的になる、多量体。
  9. 二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体である、請求項８に記載の多量体。
  10. システイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される１つ以上のカップリング要素をＣ末端又はＮ末端にさらに含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体。
  11. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固体支持体にカップリングされている、分離マトリックス。
  12. 免疫グロブリンを単離する方法であって、
    ａ）免疫グロブリンを含む液体サンプルを、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の分離マトリックスと接触させる工程、
    ｂ）洗浄液で分離マトリックスを洗浄する工程、
    ｃ）溶出液を用いて、分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
    ｄ）０．１〜１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含むアルカリ性クリーニング液で分離マトリックスをクリーニングする工程
    を含む、請求項１１に記載の分離マトリックスを使用する、方法。
  13. 工程ａ）〜ｄ）を少なくとも１０回繰り返す、請求項１２に記載の方法。
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