CN114315996B - 一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组Protein A蛋白，该重组Protein A蛋白是由Protein A蛋白的E结构域、D结构域、A结构域及B结构域或Z结构域的一个或多个突变体构成，此外该重组Protein A蛋白也可以由4‑8个重复的突变体组合的重复单元构成，本发明另一方面公开了一种包含重组Protein A蛋白突变体或突变体组合的重复单元的亲和层析介质及其制备方法和应用。基于本发明提供的重组ProteinA蛋白，具有较好的化学稳定性、耐碱性以及更为优异的IgG结合能力，因此本发明提供的重组Protein A蛋白作为亲和配基制备亲和层析填料，应用于抗体的分离纯化。

Description

一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法
技术领域
本发明涉及亲和色谱领域，具体涉及一种重组Protein A蛋白及亲和层析介质的制备方法。
背景技术
近年来，生物制药领域蓬勃发展，全球生物药市场日益扩大。抗体药物作为最大的治疗用生物制剂类别，在癌症治疗中具有比传统疗法更为明显的疗效以及更低的毒性。抗体药物包括单克隆抗体(裸单克隆抗体)、双特异性抗体及抗体药物偶联物(偶联的单克隆抗体)，抗体药物特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值使得各大制药公司将重点放在将其各自的抗体药物生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本，所以在抗体药物的制备过程中，纯化工艺至关重要。
目前现有的纯化工艺主要有由金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)为基础的用于抗体纯化的短链多肽类层析填料。Protein A能够和免疫球蛋白(抗体)相结合，可在亲和层析介质中用作配基。含有Protein A配基的层析介质具有较为优异的纯化效率，已经广泛应用于纯化抗体药物过程。但目前常用的Protein A层析介质存在处理能力有限、成本高、寿命短等缺陷，例如：纯化过程中结合载量较低，导致纯化成本高；洗脱过程中，抗体发生部分变性，导致抗体回收率较低；配基自身不稳定，导致脱落率高。另外，为了使Protein A层析介质能够重复使用，须对其进行在位清洗(CIP)流程，以除去层析介质上残留的抗体、内毒素等杂质。CIP步骤最常用及有效的清洁剂是NaOH，在CIP过程中适用的NaOH浓度为0.5～1.0M。虽然在此条件下能够有效去除杂质，但由于天然Protein A耐碱性较差，在清洗过程中会破坏层析介质，降低了层析介质的使用寿命。因此需要制备一种耐碱Protein A，使得以耐碱Protein A为配基的层析介质能够在CIP过程中不被强碱破坏，以此达到Protein A层析介质可重复利用的目的。
目前，关于如何提升Protein A的耐碱性的研究很广泛，例如Susanne Gilich等人提出可以通过蛋白质工程来提高蛋白配体的结构域在碱性条件下的稳定性。为此，本领域技术人员对蛋白配体各个结构域中的氨基酸进行突变研究，找寻能提高蛋白配体耐碱性的氨基酸。已有的研究表明，蛋白配体结构域中天冬酰胺和谷氨酰胺残基的存在会导致肽链在碱性溶液中脱酰胺化以及裂解，从而造成蛋白配体的失活。进而发现在碱性条件下天冬酰胺具有脱酰胺化、异构化和外消旋作用，使其成为对碱性最为敏感的氨基酸。SusanneGilich等人将ProteinG的ABD结构域中的四个天冬酰胺残基替换为其他氨基酸，制备了一种ProteinG的突变体。并将该突变体应用在亲和层析介质中，该介质在CIP清洗程序下，比以天然ProteinG为配体的亲和层析介质显示出更高的结合能力以及更为优异的耐碱性。由此可以得出，对蛋白配体中天冬酰胺残基的替换并不会对该蛋白配体造成影响，并且会提升其碱性稳定性。
Protein A含有五个高度同源的IgG结合结构域(E，D，A，B，和C)，光谱学核磁共振和X射线晶体结构显示，每个结构域均是由呈Z型的3个α螺旋束反向平行排列组成(分别为螺旋H1，H2，H3)，单个结构域均具备自主结合抗体IgG Fc片段和VH3亚类抗体Fab片段的能力。结构域Z是将Protein A结构域B中1位的丙氨酸替换为缬氨酸，29位的甘氨酸替换为丙氨酸所得。该突变赋予了结构域Z更加突出的化学稳定性。研究发现，如果对Protein A的B结构域或Z结构域上一些特定位点的氨基酸进行突变，同样也会提升其耐碱稳定性，并且以该突变蛋白为配体的亲和层析介质具有更高的结合能力。例如，专利CN111315887、CN105377881、CN105377880等将Protein A的B结构域或Z结构域上的谷氨酸替换为其他氨基酸，获得的Protein A突变体与天然Protein A相比具有更优异的化学稳定性。因此，蛋白配体中谷氨酸的替换不会影响其本身的结合能力，而且可提升其耐碱性。然而，上述已经报道的ProteinA突变体对高pH的耐受性仍有限，对于要求更高的CIP清洗程序(0.5～1.0M氢氧化钠)仍有一定局限性。但是，其在更高的pH条件下仍然不稳定，无法满足抗体纯化过程中的CIP清洗步骤的要求。这些突变体与天然配体相比在碱性条件下具有更高的耐碱性。使用上述配体制备的层析介质在抗体纯化过程中可以耐受0.1～0.5M氢氧化钠清洗，但距标准CIP(0.5～1.0M氢氧化钠)仍有一定差距。
此外已有相当多的成果对Protein A的B/C结构域上的部分耐碱性较差的氨基酸进行突变，得到的重组Protein A兼具耐碱稳定性和吸附特异性，该类成果专利较多，例如GE的US9896486、CN105377880等。对于Protein A的A结构域上的突变位点成果，主要集中在将天冬酰胺残基替换成部分其他氨基酸，且可获得的突变体其清洗环境的NaOH浓度通常还是被限制在0.1M，对较高NaOH浓度依旧不适用。
Protein A蛋白E结构域氨基酸序列存在的谷氨酰胺为五个同源结构域中数量最多，其耐碱性也最差(专利CN106188251A)。因此，需要对E结构域相应位置进行氨基酸的修饰或替换。
专利CN103037885B中对Protein A蛋白D结构域的谷氨酰胺替换为组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或精氨酸，得到的Protein A蛋白突变体为非产毒突变体，及对Fc或Fab融合蛋白的亲和力有所减弱或被干扰，这些Protein A蛋白突变体可以用作亚单位疫苗，具有提高体液免疫应答的作用，使得金黄色葡萄球菌具有攻击的保护性免疫。也就是说，通过对Protein A蛋白氨基酸序列中的耐碱性差的谷氨酰胺进行突变，有利于增加Protein A蛋白特异性。但尚未有研究对Protein A蛋白E结构域的谷氨酰胺进行定点突变为上述氨基酸，因此尚未清楚在E结构域中进行上述突变对Protein A蛋白的性能有何影响。
另一方面，为解决Protein A蛋白E结构域耐碱性差问题，专利CN106188251A通过对Protein A蛋白E结构域氨基酸序列中的天冬酰胺进行定点突变，使其与天然Protein A蛋白相比具有更好的耐碱性、动态吸附载量以及对IgG免疫球蛋白更高的亲和力。目前为止，还没有相关的公开文献提出对Protein A蛋白E结构域的谷氨酰胺进行定点突变为组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或精氨酸的研究。
因此为了提高重组ProteinA蛋白的耐碱性及其纯化效果，需要本领域技术人员继续研发并提供一种合适的重组ProteinA蛋白用于纯化作业。
发明内容
为了提高Protein A的耐碱性，在天然Protein A的基础上，有必要对ProteinA的E结构域、D结构域、A结构域以及B结构域或Z结构域的氨基酸序列进行一个或多个位点的突变，将E结构域、D结构域、A结构域以及B结构域或Z结构域中的部分氨基酸残基替换为耐碱性的氨基酸，从而提高Protein A的耐碱性，进而使其在CIP清洗期间能够耐受0.5-1.0M的NaOH，同时还能够保持IgG结合活性。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
第一部分、Protein A蛋白的B结构域或Z结构域突变
本发明提供了一种B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白，重组Protein A蛋白是由SEQ ID No:1或SEQ ID No:2指定的Protein A的B结构域或Z结构域的一个或多个突变体的单体构成，其中B结构域的氨基酸序列为SEQ ID No:1，Z结构域的氨基酸序列为SEQ ID No:2。
进一步地，重组Protein A蛋白中的任一氨基酸序列具有选自以下(a)～(b)中的至少一种替换或突变的氨基酸序列构成：
a.选自将SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位、6位的位置中的至少一个天冬酰胺替换为选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸的氨基酸；
b.选自将SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的15位中的谷氨酸替换为选自脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸；
进一步地，选自上述(a)～(b)中的至少1种替换或突变是下列突变中的任一种：
(a1)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸；
(a2)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸；
(a3)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为组氨酸；
(a4)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的6位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸；
(a5)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的6位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸；
(a6)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的6位的位置由天冬酰胺替换为组氨酸；
(a7)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸，以及对应于6位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸；
(a8)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为组氨酸，以及对应于6位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸；
(a9)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸，以及对应于6位的位置由天冬酰胺替换为组氨酸；
(a10)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸，以及对应于6位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸；
(b1)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的15位的位置由谷氨酸替换为脯氨酸；
(b2)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的15位的位置由谷氨酸替换为半胱氨酸；
(c1)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸，对应于6位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸，以及对应于15位的位置由谷氨酸替换为脯氨酸；
(c2)对应于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列的3位的位置由天冬酰胺替换为赖氨酸，对应于6位的位置由天冬酰胺替换为精氨酸，以及对应于15位的位置由谷氨酸替换为半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述至少一种变异是所述(a1)～(a10)，以及(b1)～(b2)中的任一个，或者是所述(a1)～(a10)中的任一个与所述(b1)～(b2)中的任一个的组合。
针对B结构域或Z结构域突变，本发明还提供了上述重组Protein A蛋白重复单元，包含上述多个氨基酸序列的重复单体或基本由结构域本身重复组成，该重复单元包含4-8个重复单元。重组Protein A蛋白的氨基酸序列的N端可含有一个或多个氨基酸残基(如1-15个)，其来自被切下的信号转导序列的残基。重组Protein A蛋白的氨基酸序列的C端可含有一个或多个氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸和组氨酸。C端氨基酸残基可为半胱氨酸残基，则重组Protein A蛋白可通过该氨基酸残基中的硫醇基与基质上的亲电子基团反应，将重组Protein A蛋白偶联至基质上。
进一步地，该重复单元包含4个重复单元。
针对B结构域或Z结构域突变，本发明的第三方面是提供一种重组ProteinA蛋白或重复单元作为配基的层析介质制备方法，在固相载体中添加重组Protein A蛋白或重组Protein A蛋白重复单元。
亲和层析介质制备方法，该方法包括以下流程：步骤1、将琼脂糖凝胶用蒸馏水清洗，加入活化剂反应活化，再用蒸馏水清洗，得到活化高刚性琼脂糖；步骤2、活化高刚性琼脂糖加入缓冲液和重组Protein A蛋白溶液，完成交联反应；步骤3、在交联反应产物中加入封闭液，用氢氧化钠调节，反应完成对残留的环氧基团的封闭；步骤4、将得到的产物用蒸馏水清洗，清洗后保存重组Protein A亲和层析介质。
制备Protein A亲和层析介质完成后，对重组Protein A亲和层析介质的IgG结合能力和耐碱稳定性进行评价，筛选出优异的突变位点。
本发明提供了编码上述B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白或重组Protein A蛋白重复单元的核酸以及对应的核酸载体。包括上述核酸分子的所有形式，如RNA和DNA。同时核酸分子除编码序列之外，还包括用于表达B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白的信号序列。含有核酸分子的核酸载体也包括在本发明的范围内，核酸载体包含启动子、编码重组Protein A蛋白的核酸和转录终止序列。
另外还提供了一种包含上述核酸或载体的表达系统。表达系统可为例如革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如经修饰以表达本上述任一项B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白的大肠杆菌或芽孢杆菌。在某些实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。
本发明提供了一种分离基质，该基质包含上述任一项B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白或重组Protein A蛋白的重复单元与固体支持物偶联。本发明中固体支持物是多糖例如葡聚糖、淀粉、纤维素、琼脂糖、甘露聚糖、半乳聚糖和壳聚糖等。多糖表面存在的大量反应性基团(羟基)，为其与B结构域或Z结构域突变的重组Protein A蛋白的偶联提供可能，并且多糖在CIP清洗程序中的碱性条件下基本稳定。第六方面，本发明涉及一种分离免疫球蛋白的方法，使用本发明前述的任一项分离基质。具体而言，该方法包括以下步骤：
1)使含免疫球蛋白(IgG)的样品与上述任一分离基质接触；
2)洗涤经接触后的分离基质；
3)将IgG从上述分离基质洗脱；
4)清洗液清洗分离基质。
第二部分、针对Protein A蛋白的D结构域，对D结构域中的氨基酸序列进行重组优化突变。在SEQ ID No:21上指定的D结构域进行氨基酸置换，通过氨基酸序列重组突变的方式，优化Protein A蛋白。
将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的第6位点的天冬酰胺已经突变为选自谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸；
将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的第9位点的天冬酰胺已经突变为选自天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸；
将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的第12位点的谷氨酰胺已经突变为选自赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸；
将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的第18位点的谷氨酸已经突变为选自组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸；
进一步地，将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的6位、9位、12位以及18位的任意位置的氨基酸残基替换为其他氨基酸残基，所述突变选自：N6Q，N6S，N6H，N6K，N6R，N6L，N6Y，N9D，N9Q，N9H，N9K，Q12K，Q12L，Q12S，Q12T，Q12R，E18H，E18K，E18L，E18S，E18T，E18R。
进一步地，将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的6位、9位、12位以及18位的任意两个位置的氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
进一步地，将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的6位、9位、12位以及18位的任意三个位置的氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
进一步地，将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的6位、9位、12位以及18位的四个位点的氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
进一步地，将SEQ ID No:21中指定D结构域氨基酸序列的突变组合方式重复4-8个单元，突变组合后形成重复单元。
另一方面合成D结构域突变的重组Protein A蛋白的核酸，分别构建载体，再对重组Protein A蛋白进行表达与纯化，将质粒转染大肠杆菌感受态细胞，放入培养基培养，诱导表达离心，最后将D结构域突变的重组Protein A蛋白或重复单元进行纯化以制备Protein A亲和层析介质。
制备Protein A亲和层析介质完成后，对D结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的IgG结合能力和耐碱稳定性进行评价，筛选出优异的突变位点。
本发明的基于D结构域的突变还提供了编码重组Protein A蛋白及其重复单元的核酸，携带该核酸的载体通过转染大肠杆菌感受态细胞，放入培养基培养，诱导表达编码重组Protein A蛋白或其重复单元。
同时本发明还提供了一种D结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的制备方法：括以下流程：步骤1、将琼脂糖凝胶用蒸馏水清洗，加入活化剂反应活化，再用蒸馏水清洗，得到活化高刚性琼脂糖；步骤2、活化高刚性琼脂糖加入缓冲液和D结构域突变的重组Protein A蛋白溶液，完成交联反应；步骤3、在交联反应产物中加入封闭液，用氢氧化钠调节，反应完成对残留的环氧基团的封闭；步骤4、将得到的产物用蒸馏水清洗，清洗后保存重组ProteinA亲和层析介质。
制备D结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质完成后，对D结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的IgG结合能力和耐碱稳定性进行评价，进一步筛选出优异的突变位点。
第三部分、针对Protein A蛋白的A结构域，通过对当前研发成果较少的A结构的碱敏感性较大氨基酸残基进行大量随机突变试验，得到本发明结果。本发明提供由SEQ IDNO:64定义天然A结构域的部分氨基酸突变，包括以下(a)～(d)至少一种情况的氨基酸残基替换：
(a)由SEQ ID NO:64定义的A结构域天然序列基础上，第3号位天冬酰胺残基替换为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸或酪氨酸。
(b)由SEQ ID NO:64定义的A结构域天然序列基础上，第6号位天冬酰胺残基替换为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸或亮氨酸。
(c)由SEQ ID NO:64定义的A结构域天然序列基础上，第9号位谷氨酰胺残基替换为赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或精氨酸。
(d)由SEQ ID NO:64定义的A结构域天然序列基础上，第15号位谷氨酸残基替换为组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或精氨酸。
进一步的，第3号突变点优选替换为赖氨酸。
进一步的，第6号突变点优选替换为丝氨酸。
进一步的，第9号突变点优选替换为苏氨酸。
进一步的，第15号突变点优选替换为组氨酸。
进一步的，上述Protein A蛋白的A结构域的氨基酸替换优选以下情况：N3K；N6S；Q9T；E15H；N3K，N6S；N3K，Q9T；N3K，E15H；N6S，Q9T；N6S，E15H；Q9T，E15H；N3K，N6S，Q9T；N3K，N6S，E15H；N3K，Q9T，E15H；N6S，Q9T，E15H；N3K，N6S，Q9T，E15H。其突变氨基酸序列对应如下：SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79。本发明还提供了具有上述重组Protein A蛋白包含4-8个重组Protein A蛋白组成的重复单元，该重组Protein A蛋白依旧保持原有的空间构象，并且能够在碱性环境中保持良好的化学为稳定性。重组Protein A蛋白的氨基酸C端可含有一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸和组氨酸。C端氨基酸残基可为半胱氨酸残基，则重组Protein A蛋白可通过该氨基酸残基中的硫醇基与基质上的亲电子基团反应，将重组Protein A蛋白偶联至基质上。进一步地，优选上述重组Protein A蛋白的A结构域的氨基酸序列进行重复4个序列串连，优选氨基酸替换序列选自：N3K；N3K，N6S；N3K，E15H；N6S，E15H；N3K，N6S，E15H；N3K，N6S，Q9T，E15H且包含4个重复单元，其序列为：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:86。
同时进一步提供了以上述A结构域突变的重组Protein A蛋白为配基的亲和层析介质，该亲和层析介质的制备方法包括以下流程：步骤1、将琼脂糖凝胶用蒸馏水清洗，加入活化剂反应活化，再用蒸馏水清洗，得到活化高刚性琼脂糖；步骤2、活化高刚性琼脂糖加入缓冲液和A结构域突变的重组Protein A蛋白溶液，完成交联反应；步骤3、在交联反应产物中加入封闭液，用氢氧化钠调节，反应完成对残留的环氧基团的封闭；步骤4、将得到的产物用蒸馏水清洗，清洗后保存重组Protein A亲和层析介质。
第四部分、针对Protein A蛋白的E结构域的突变，本发明提供了一种重组ProteinA蛋白，该重组Protein A蛋白是包含由SEQ ID No:87指定的E结构域的突变体。
进一步地，重组Protein A蛋白可被用作特异性亲和配基，也可以用于制备纯化抗体药物用的亲和介质。
进一步地，由SEQ ID No:87上指定的E结构域氨基酸序列的突变位置为第2位和/或第8位。
进一步地，E结构域氨基酸序列的第2位的谷氨酰胺突变为赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种。
进一步地，E结构域氨基酸序列的第8位的谷氨酰胺突变为组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种。
进一步地，重组Protein A突变体的至少一个突变时包含下列突变中的任一种：
1)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的2位的位置的氨基酸残基为赖氨酸；
2)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的2位的位置的氨基酸残基为亮氨酸；
3)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的2位的位置的氨基酸残基为丝氨酸；
4)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的2位的位置的氨基酸残基为苏氨酸；
5)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的2位的位置的氨基酸残基为精氨酸；
6)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为组氨酸；
7)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为赖氨酸；
8)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为亮氨酸；
9)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为丝氨酸；
10)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为苏氨酸；
11)对应于SEQ ID No:87的氨基酸序列的8位的位置的氨基酸残基为精氨酸。
进一步地，重组Protein A蛋白包含的至少一种变异是1)～11)中的任一个突变，或是1)～5)中任一个与6)～11)中的任一个突变的组合。
进一步地，重组Protein A蛋白包含4～8个重组Protein A蛋白的重复单元。
针对E结构域突变的重组Protein A蛋白提供了一种载体，该载体包含编码前述本发明第一方面提供重组Protein A蛋白的多核苷酸。
针对E结构域突变的重组Protein A蛋白提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含前述本发明第二方面提供的载体。
针对E结构域突变的重组Protein A蛋白提供了一种亲和层析介质，亲和层析介质包含针对E结构域突变的重组Protein A蛋白。
本发明还提供了一种含有上述E结构域突变的重组Protein A蛋白的亲和层析介质的应用，在抗体纯化中的应用。
本发明的有益效果为：
Protein A的结构域B与免疫球蛋白结合特异性具有较大的优势。而结构域Z是将Protein A结构域B中的特定氨基酸突变所得。结构域Z具有更加突出的化学稳定性。但是由于结构域B和结构域Z中都存在对碱敏感的氨基酸(天冬酰胺和谷氨酸)，本发明对结构域B和结构域Z中至少一个氨基酸进行突变，将对碱敏感的氨基酸替换掉，制备的重组ProteinA具有优异的碱性稳定性，同时在实验过程中显示出更好的IgG结合能力。同样地，针对E结构域、D结构域、A结构域本发明也进行了针对性的突变，同样获得了碱性稳定性较佳、IgG结合能力很强的重组Protein A蛋白。因此本发明提供的多种重组Protein A可以大幅度提高Protein A亲和层析介质在CIP程序时的碱性稳定性，此外相对于重组Protein A蛋白，重组Protein A蛋白重复单元具有更为优异的IgG结合能力。
附图说明
下面结合附图说明优选实施例，对本发明的重组Protein A蛋白进行进一步解释说明。
图1显示了实施例1中Protein A-1～9对1.0M NaOH碱稳定性的结果示意图；
图2显示了实施例1中Protein A-10～15对1.0M NaOH碱稳定性的结果示意图；
图3显示了实施例1中Protein A-16～19对1.0M NaOH碱稳定性的结果示意图；
图4是实施例2中D结构域突变的重组Protein A蛋白在1.0M NaOH碱性条件下的结果示意图，随着时间变化IgG动态载量的变化曲线；
图5是实施例3中实施对象在0.5M NaOH碱性条件下蛋白活性维持率结果示意图；
图6是实施例3中实施对象在1.0M NaOH碱性条件下蛋白活性维持率结果示意图；
图7实施例4中本发明提供重组Protein A亲和层析的酸碱性进行评价示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于下列实施例。实施例中提供相关附表及附图，可用于解释本发明实施例的实验原理，本领域普通技术人员可参考该内容理解本发明的优势。如无特殊说明均为常规方法。
实施例1
1、B结构域或Z结构域突变的Protein A蛋白的蛋白质的诱变
为改善Protein A蛋白的化学稳定性，利用蛋白质工程对其进行修饰而制备重组Protein A蛋白作为配体改善亲和层析柱碱稳定性的研究日益增多。专利CN104804073B将Protein A蛋白氨基酸序列突变导入了亮氨酸、精氨酸以及赖氨酸，所述重组Protein A蛋白与天然Protein A蛋白相比表现出对IgG增强的结合能力。专利US6399750 B1在ProteinA蛋白中突变导入了半胱氨酸，获得的重组Protein A蛋白易于固定在水不溶性载体表面，具有结合载量高且配体不易脱落的优点。专利CN102365361A在Protein A蛋白中突变导入了酪氨酸、组氨酸，发现与突变前相比，重组Protein A具有更高的耐碱性和充分的抗体酸解离特性。专利CN108864263A在Protein A蛋白中突变导入了脯氨酸，结果表明该突变有利于提高重组Protein A的碱稳定性，且对其IgG结合能力基本无影响。
如上所述，利用蛋白质工程对Protein A蛋白进行修饰，在其氨基酸序列突变中导入精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸或半胱氨酸，不会对破坏Protein A蛋白对IgG的结合能力，且可能具有提高结合载量、碱稳定性且配体不易脱落的优点。但是，尚未有将Protein A蛋白B结构域和Z结构域3位和6位的氨基酸突变为赖氨酸、精氨酸或组氨酸，以及将B结构域和Z结构域突变为脯氨酸和半胱氨酸的报道。因此，本发明在Protein A蛋白中突变导入了精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸或半胱氨酸，并委托基因合成公司进行全基因合成。
2、构建体的表达和纯化
将构建体转化到大肠杆菌中，使大肠杆菌在标准培养基中发酵。发酵后，通过热处理使细胞周质内含物释放，对其进行微滤并收集构建体。将收集所得构建体上样到含有固定的IgG的色谱介质上，用磷酸缓冲溶液对其进行洗脱。将洗脱液pH调至中性，并用二硫苏糖醇还原。将阴离子交换剂加入还原后的样品，在洗涤步骤之后，用氯化钠梯度洗脱去除污染物，最后通过超滤使洗脱合并物浓缩至40-50mg/mL。
3、亲和层析介质的制备
利用得到的Protein A突变体制备亲和层析介质，具体制备步骤如下：
(1)活化
在烧瓶中加入25mL琼脂糖基质，10mL纯化水以及2g NaOH，25℃搅拌10min后，在悬浮液中加入4mL环氧氯丙烷(ECH)。反应2h后，用1L水洗涤活化的琼脂糖凝胶。
(2)交联
在100mL烧瓶中加入经活化的琼脂糖凝胶，继续加入20mL纯化水，搅拌均匀后，在得到的悬浮液中加入200mg碳酸氢钠，180mg氯化钠以及10mgEDTA，搅拌10min后，加入25mL的Protein A突变体溶液，并于35℃下交联8h。
4、通过蛋白质诱变、构建体的表达纯化以及亲和层析介质的制备步骤，得到如表1所示的Protein A-1～9亲和层析介质。
表1，Protein A-1～9亲和层析介质表
重组Protein A的亲和层析介质 突变位点 序列号 重复单元数
Protein A-1 - SEQ ID No 2 1
Protein A-2 N3K SEQ ID No 3 1
Protein A-3 N3R SEQ ID No 4 1
Protein A-4 N3H SEQ ID No 5 1
Protein A-5 N6K SEQ ID No 6 1
Protein A-6 N6R SEQ ID No 7 1
Protein A-7 N6H SEQ ID No 8 1
Protein A-8 E15P SEQ ID No 9 1
Protein A-9 E15C SEQ ID No10 1
5、通过蛋白质诱变、构建体的表达纯化以及亲和层析介质的制备步骤，得到如表2所示的Protein A-10～15亲和层析介质。
表2，Protein A-10～15亲和层析介质表
重组Protein A的亲和层析介质 突变位点 序列号 重复单元数
Protein A-10 N3K,N6R SEQ ID No 11 1
Protein A-11 N3H,N6R SEQ ID No12 1
Protein A-12 N3K,N6H SEQ ID No13 1
Protein A-13 N3K,N6K SEQ ID No14 1
Protein A-14 N3K,N6R,E15P SEQ ID No 15 1
Protein A-15 N3K,N6R,E15C SEQ ID No16 1
6、通过蛋白质诱变、构建体的表达纯化以及亲和层析介质的制备步骤，得到如表3所示的Protein A-16～19亲和层析介质。
表3，Protein A-20～23亲和层析介质表
重组Protein A的亲和层析介质 突变位点 序列号 重复单元数
Protein A-16 - SEQ ID No 17 4
Protein A-17 N3K SEQ ID No 18 4
Protein A-18 N3K,N6R SEQ ID No 19 4
Protein A-19 N3K,N6R,E15P SEQ ID No 20 4
7、针对第4部分所制备的重组Protein A的亲和层析介质Protein A-1～9，使用下面所述方法对其进行IgG结合能力和耐碱稳定性评价。实验步骤如下：
1)取4.4mL重组Protein A亲和层析介质，用20％乙醇，5ml/min的流速装入层析柱中。
缓冲液：Buffer A(PBS，pH 7.6)；Buffer B(0.1M柠檬酸钠，pH 3.0)；Buffer C(1MNaOH)。
样品：用纯品配制1mg/ml的IgG样品(稀释纯品的溶液为Buffer A)。
2)10％动态载量测定：
设备：AKTAPure
测定过程：
1.Buffer A平衡层析柱，流速：1.8ml/min；
2.IgG样品Bypass，流速：10-15ml/min，记录Bypass时的紫外吸收峰10％的值；
3.上样：流速：1.8ml/min，记录基础流穿的紫外吸收峰值；
4.二者相加得出10％动态载量对应的紫外吸收峰值；
5.继续上样至紫外吸收峰值达到d中紫外吸收峰时所对应的体积为10％动态载量；
3)耐碱循环：
控制室温：23±0.5℃；根据载量的下降更新程序中的上样量，其他程序保持一致。
测定过程：
1.PBS平衡：流速：1.8ml/min；体积：1cv；
2.上样：流速：1.8ml/min；200ml(后续程序根据载量的下降更新上样量)
3.PBS清洗：流速：1.8ml/min；体积：5cv；
4.0.1M柠檬酸钠洗脱：流速：1.8ml/min；体积：3cv；
5.1M NaOH处理2h：先用1.8ml/min的流速过1cv使层析柱内充满1M NaOH，后改为流速：0.5ml/min；体积：60ml；时间：2h；
6.PBS平衡：流速：1.8ml/min；体积：10cv；
上述测试中测得的结果见表4和图1。结果显示，突变后Protein A制备的得到的亲和层析介质耐碱性都有一定程度的提高。其中，Protein A-2、Protein A-4、Protein A-5、Protein A-6、Protein A-7以及Protein A-8在暴露于1.0M氢氧化钠24小时后仍有45％以上的剩余IgG结合能力，相较于Protein A-1的24h后的剩余IgG能力较高。这一结果表明，以上所述突变体制备的亲和层析介质耐碱性较高，可承受1.0M氢氧化钠24小时处理。
表4，Protein A-1～9亲和层析介质IgG结合能力分析表
Figure BDA0003452754480000181
Figure BDA0003452754480000191
8、针对第5部分所制备的重组Protein A的亲和层析介质Protein A-10～15，使用下面第7部分的方法对其进行IgG结合能力和耐碱稳定性评价。测得的结果见表5和图2。结果显示，在暴露于1.0M氢氧化钠24小时后，Protein A-10～13的双位点突变的剩余IgG结合能力均在50％以上，耐碱性明显优于单位点突变。三位点突变在暴露于1.0M氢氧化钠24小时后剩余IgG结合能力在65％以上，大大提高了亲和层析介质的耐碱性。
表5，Protein A-10～15亲和层析介质IgG结合能力分析表
Figure BDA0003452754480000192
9、针对制备的重组Protein A的亲和层析介质Protein A-20～23，使第7部分的方法对其进行IgG结合能力和耐碱稳定性评价。
上述测试中测得的结果见表6和图3。结果显示，具有多个重复单元的Protein A制备得到的亲和层析介质在暴露于1.0M氢氧化钠24小时后的剩余IgG结合能力较试验例1～2中单个重复单元的Protein A制备得到的亲和层析介质更为优异。其中，Protein A-19在暴露于1.0M氢氧化钠24小时后的剩余IgG结合能力能达到80％以上，表明其耐碱性高，能经受较为严酷的CIP清洗。
表6，Protein A-16～19亲和层析介质IgG结合能力分析表
Figure BDA0003452754480000201
实施例2 D结构域突变的重组Protein A蛋白
1、Protein A蛋白基因的优化
基于发明技术方案，基于SEQ ID NO:21的序列，将指定D结构域氨基酸序列的第6位点的天冬酰胺已经突变为选自谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸；第9位点的天冬酰胺已经突变为选自天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸；第12位点的谷氨酰胺已经突变为选自赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸；第18位点的谷氨酸已经突变为选自组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸，设计好的单点氨基酸突变序列如SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:43所示；同时优选的实施方案中，对SEQ ID NO:21序列进行两个位点突变，SEQ ID NO:21上指定的D结构域氨基酸序列的第6个位点天冬酰胺突变成谷氨酰胺或者亮氨酸，第9个位点天冬酰胺突变成谷氨酰胺或者组氨酸，第12个位点谷氨酰胺突变成丝氨酸或者苏氨酸，第18个位点谷氨酸突变成赖氨酸或者精氨酸。有如下突变方式：N6Q及N9Q、N6Q及N9H、N6L及N9H、N6L及Q12S、N6L及Q12T、N6L及E18K、N6L及E18R、N9H及Q12S、N9H及E18R、Q12S及E18R；且包含以下序列SEQ ID No:44、SEQ ID No:45、SEQ ID No:46、SEQ ID No:47、SEQ ID No：48、SEQ ID No：49、SEQ ID No：50、SEQ ID No：51、SEQ IDNo：52、SEQ ID No：53；在进一步优选的实施方案中，对SEQ ID NO:21序列进行三个位点突变，SEQ ID NO:21上指定的D结构域氨基酸序列的第6个位点天冬酰胺突变成亮氨酸，第9个位点天冬酰胺突变成组氨酸，第12个位点谷氨酰胺突变成丝氨酸，第18个位点谷氨酸突变成精氨酸。有如下突变方式：N6L和N9H和Q12S、N6L和N9H和E18R、N6L和Q12S和E18R、N9H和Q12S和E18R；且包含以下序列SEQ ID No:54、SEQ ID No:55、SEQ ID No:56、SEQ ID No:57。
在进一步优选的实施方案中，对其序列进行四个位点突变，SEQ ID No:21上指定的D结构域氨基酸序列的第6个位点天冬酰胺突变成亮氨酸，第9个位点天冬酰胺突变成组氨酸，第12个位点谷氨酰胺突变成丝氨酸，第18个位点谷氨酸突变成精氨酸。有如下突变方式：N6Q和N9H和Q12S和E18R；且包含以下序列SEQ ID No:58；另外，本发明公开了重组Protein重复单元，包含4-8个重组Protein蛋白，且包含以下序列SEQ ID No:59、SEQ IDNo:60、SEQ ID No:61、SEQ ID No:62、SEQ ID No:63。将SEQ ID No:21～SEQ ID No:63翻译成核苷酸序列委托基因合成公司进行基因合成。
2、重组Protein A蛋白的表达和纯化
1.蛋白的诱导表达
表达前：LB培养基的制备
1g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl按照一定比例配制，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L NaOH调pH至7.0后定容及高压蒸汽灭菌。
(1)含有重组Protein蛋白的质粒转染大肠杆菌Rosetta感受态细胞(Rosetta感受态细胞含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，在真核细胞的蛋白表达上有着更高的水平)，挑菌检测并保种。
(2)将其放入LB培养基在37℃进行培养，当大肠杆菌到达对数生长曲线时，添加IPTG进行诱导蛋白表达4个小时(低转速状态)，通过离心收集诱导后的大肠杆菌。
(3)取少量菌体加入蛋白酶抑制剂PMSF后用超声波技术进行裂解释放出全菌蛋白，将全菌蛋白进行4～20％胶浓度的SDS-PAGE检测。
2.蛋白的纯化
纯化前：装柱
用蒸馏水把恒流泵冲洗干净，然后把玻璃层析柱冲洗干净。向柱中加入约200mlNi-IDA(Genscript)装柱，待柱料全部自然沉淀下来。用约3L的平衡缓冲液以5ml/min的流速通过恒流泵；
(1)上样：将10g诱导后的含有ProteinA的大肠杆菌用200ml平衡缓冲液重悬，用细胞超声破碎仪破碎，将破碎液离心后细胞以2ml/min的流速上清上样；
(2)洗脱：上样完成后，用平衡缓冲液以5ml/min的流速洗杂至吸光度不变；洗杂完毕后，以5ml/min的流速开始洗脱。
(3)检测：洗脱完毕后收集洗脱液移至干净的容器中，取样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)检测。
实验表明本发明重组的蛋白A经纯化后纯度达到90％以上。
3、D结构域突变的重组Protein A亲和层析介质的制备
实验前用0.15M的NaCl、30mM Na2HPO4和10mM NaH2PO4制备磷酸盐缓冲液(pH调至7.0)。
制备过程包括介质活化和配基偶联两个步骤；
(1)活化
在烧瓶中加入25mL琼脂糖基质，10mL纯化水以及2g NaOH，25℃搅拌10min后，在悬浮液中加入4mL环氧氯丙烷(ECH)。反应2h后，用1L水洗涤活化的琼脂糖凝胶。
(2)交联
在100mL烧瓶中加入经活化的琼脂糖凝胶，继续加入20mL纯化水，搅拌均匀后，在得到的悬浮液中加入200mg碳酸氢钠，180mg氯化钠以及10mgEDTA，搅拌10min后，加入25mL的Protein A突变体溶液，并于35℃下交联8h。
4、D结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的IgG结合能力和耐碱稳定性进行评价
实验前用纯品配制1mg/ml的IgG样品(稀释纯品的溶液为Buffer A)，用Buffer A(PBS，pH 7.6)、Buffer B(0.1M柠檬酸钠，pH 3.0)、Buffer C(1M NaOH)制备缓冲液；
实验步骤如下：
(1)取4.4mL重组Protein A蛋白亲和层析介质，用20％乙醇，5ml/min的流速装入层析柱中。
(2)用AKTAPure设备对IgG动态载量进行测定。先用Buffer A以1.8ml/min的流速平衡层析柱，用IgG样品以流速10-15ml/min通过仪器，记录此时的紫外吸收峰10％的值；再将IgG样品以流速1.8ml/min通过柱子，记录基础流穿的紫外吸收峰值，二者相加得出10％动态载量对应的紫外吸收峰值；继续上样至紫外吸收峰值达到上述两者相加对应紫外吸收峰值时所对应的体积为10％动态载量
(3)耐碱循环：在室温23±0.5℃下根据载量的下降更新程序中的上样量，其他程序保持一致。先用PBS缓冲液以流速1.8ml/min通过1cv来平衡柱子，以流速：1.8ml/min；200ml上样(后续程序根据载量的下降更新上样量)。用PBS缓冲液以流速1.8ml/min通过5cv来清洗柱子。然后用0.1M柠檬酸钠以1.8ml/min的流速洗脱3cv，用1M NaOH以1.8ml/min的流速过1cv充满层析柱，后将流速改为0.5ml/min，体积改为60ml处理2h；最后用PBS缓冲液以1.8ml/min的流速通过10cv来平衡柱子。
(4)在每个循环中可以根据洗脱液中的免疫球蛋白的量确定作为亲和层析配体的重组Protein A蛋白结合免疫球蛋白的能力。每两个小时重复上述(1)(2)(3)步骤，记录免疫球蛋白G动态载量及剩余动态结合载量。
上述耐碱性比较实验结果分析如下表7、图4所示：
表7，免疫球蛋白G动态载量及剩余动态结合载量分析表
Figure BDA0003452754480000241
综合上述实施例，本发明提供的重组蛋白A能牢固结合到抗体分子，可以作为偶联于固相载体的配体用于分离抗体。这类重组蛋白A可以提高其在碱性条件下的化学稳定性，可耐受1.0M NaOH清洗，24h后IgG结合载量能力70-90％。
实施例3 A结构域突变的重组Protein A蛋白
1、Protein A蛋白基因的优化
A结构域序列由SEQ ID NO:64限定
基于发明技术方案，设计好氨基酸序列如SEQ ID NO:65～SEQ ID NO:86，并翻译成核苷酸序列委托基因合成公司进行基因合成。
2、A结构域突变的重组Protein A蛋白的表达和纯化
将合成的氨基酸序列通过重组质粒PET30a载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过LB液体培养基进行发酵培养。在发酵后，通过热裂解的方式将周质内物质离散至培养基中并且离心分离，得到表达物质溶液。
通过IgG层析介质对分离后的表达物质溶液进行纯化，分离液上样经过亲和层析介质，将层析后的产物用10mM的磷酸盐缓冲液清洗，使用缓冲溶液收集洗脱后蛋白，调节洗脱表达蛋白至中性，并且使用二硫苏糖醇还原，最后保存。
3、A结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的制备
将100g琼脂糖凝胶用1L左右的蒸馏水清洗，再加入30ml环氧氯丙烷和70mL、100ml的1M NaOH溶液和0.2g硼氢化钠，35℃下搅拌反应2h，反应结束后，即可得到活化高刚性琼脂糖100mL，再用1L左右的蒸馏水清洗该琼脂糖。得到活化高刚性琼脂糖加入0.1mol/L的硼酸盐缓冲液150mL，加入14g重组Protein A溶液，在34℃下恒温反应20h，完成活化后的琼脂糖与重组Protein A的交联。在交联反应产物中加入200mL 0.2M的乙醇胺封闭液，用氢氧化钠调节PH为8.6，在26℃下恒温反应10h，完成对残留的环氧基团的封闭，将得到的产物用蒸馏水清洗，清洗后保存重组Protein A亲和层析介质。
4、介质动态载量(DBC)和耐碱性测定的实施策略
a)本实施例将对重组Protein A亲和层析介质的IgG结合能力和耐碱稳定性进行评定分析，实验设置实验组2～实验组16，对象为包含A结构域突变序列如SEQ ID NO:65～SEQ ID NO:79的重组Protein A单聚体亲和层析介质，实验设置序列SEQ ID NO:64天然Protein A亲和层析介质为对照组1。测定上述实验组的IgG结合能力和耐碱稳定性，记录结果并分析评价。
b)分析a)实验结果，优选实验结果测定耐碱性(0.5M NaOH)相比亲本分子提高20％的若干A结构域重组Protein A基因序列，氨基酸突变包括N3K；N3K，N6S；N3K，E15H；N6S，E15H；N3K，N6S，E15H；N3K，N6S，Q9T，E15H所述优选基因序列进行4个重复序列串联，翻译成核苷酸序列并委托基因公司合成得到SEQ ID NO:81～SEQ ID NO:86，通过第2、3部分重新制备对应的重组或天然Protein A亲和层析介质，设置重组序列SEQ ID NO:81～SEQID NO:86为实验组18～实验组23。同时，设置4个重复A结构域天然序列SEQ ID NO:80的Protein A介质为对照组17。测定上述实验组的的IgG结合能力和耐碱稳定性，记录结果并分析评价。
在0.5M NaOH碱性条件和1.0M NaOH碱性条件下蛋白活性维持率结果如图5、图6所示。
5、A结构域突变的重组Protein A蛋白及聚体亲和层析介质动态载量的测定
将4.4mL重组Protein A亲和层析介质，加入20％乙醇，以5ml/min的流速装入层析柱中，用Buffer A(PBS，pH 7.6)缓冲液稀释纯品配制1mg/ml人多克隆IgG样品；使用设备AKTAPure，使用Buffer A平衡层析柱，流速为1.8ml/min；IgG样品Bypass，记录Bypass时的紫外吸收峰10％的值，流速为10-15ml/min；上样，记录基础流穿的紫外吸收峰值，流速为1.8ml/min；计算出10％动态载量对应的紫外吸收峰值，并继续上样至紫外吸收峰值达到该值时的体积，即为需测定动态载量。
6、A结构域突变的重组Protein A蛋白及聚体亲和层析介质耐碱性的测定
a、根据第5部分的方式测定层析介质未经0.5M NaOH处理前初始IgG动态结合载量，并记录。
b、测定初始IgG动态结合载量，层析柱加入5cv平衡缓冲液清洗，流速为1.8ml/min；层析柱加入3cv 0.1M柠檬酸钠洗脱，流速为1.8ml/min；层析柱加入60ml 0.5M NaOH溶液,先以1.8ml/min流速使其充满，后改流速为0.5ml/min，共处理2小时；层析柱加入10cv平衡缓冲液，流速为1.8ml/min，平衡结束后继续上样，重复试验第5部分测定经0.5M NaOH处理2h后IgG动态结合载量，并记录。
c、重复步骤b所述流程12次循环，共计24小时，并记录每次循环的IgG动态结合载量。
d、重复上述步骤a、b、c，但使用1.0M NaOH取代0.5M NaOH进行清洗，记录试验结果。
根据上述描述的实验方法，测定实施例各组人多克隆IgG浓度突破10％时的初始DBC，以及测定各组经0.5M和1.0M NaOH溶液清洗24h处理后的DBC。计算出各组DBC的维持率，由(NaOH溶液清洗24h后DBC)/(初始DBC)计算可得。按照以下公式计算各实验组相对耐碱性：
相对耐碱性(％)＝[实验组X(X＝2～16；18～23)的DBC维持率]/[对照组X(X＝1；17)的DBC维持率]*100％
上述实验结果分析如下表8、表9、图5、图6所示：
表8，对照组1及实验组2～16的相对耐碱性分析表
Figure BDA0003452754480000271
表9，对照组17及实验组18～23的相对耐碱性分析表
Figure BDA0003452754480000272
Figure BDA0003452754480000281
上述实验表明本发明技术方案内提供的重组Protein A通过对氨基酸残基的有效替换方法，部分方案的以重组Protein基质的层析介质比天然Protein A的相对耐碱性提高40％以上，提高了该蛋白及其多肽链应用层析介质等在碱性环境中的化学稳定性，且在较高碱性环境也依旧能保持良好的抗体结合活性。
实施例4 E结构域突变的重组Protein A蛋白
本发明设计好E结构域的突变位点后委托基因合成公司进行全基因合成。
在E结构域突变的重组Protein A蛋白方案中，SEQ ID No:86中指定E结构域氨基酸序列的第2位的谷氨酰胺已经突变为选自赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种；第8位的谷氨酰胺已经突变为选自组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种。
在E结构域突变的重组Protein A蛋白设计方案中，SEQ ID No:90中指定E结构域上的Q2、Q8位点任意进行单个位点突变，有如下突变方式：Q2K、Q2L、Q2S、Q2T、Q2R、Q8H、Q8K、Q8L、Q8S、Q8T、Q8R；且包含以下序列SEQ ID No:88、SEQ ID No:89、SEQ ID No:90、SEQ IDNo:90、SEQ ID No:92、SEQ ID No:93、SEQ ID No:94、SEQ ID No:95、SEQ ID No:96、SEQ IDNo:97、SEQ ID No:98。
在优选的方案中，对其序列进行两个位点突变，SEQ ID No:87中指定E结构域氨基酸序列的第2位的谷氨酰胺已经突变为选自赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种；第8位的谷氨酰胺已经突变为选自组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸中的任一种。有如下突变方式：Q2K和Q8H、Q2K和Q8K、Q2K和Q8L、Q2K和Q8S、Q2K和Q8T、Q2K和Q8R、Q2L和Q8L、Q2L和Q8L、Q2T和Q8L、Q2R和Q8L；且包含以下序列SEQ ID No:99、SEQ ID No:100、SEQ ID No:101、SEQ ID No:102、SEQ ID No:103、SEQ ID No:104、SEQ ID No:105、SEQID No:106、SEQ ID No:107、SEQ ID No:108。
在进一步优选的实施方案中，所述突变体包含4-8个重复单元，且包含以下序列SEQ ID No:110、SEQ ID No:111、SEQ ID No:112。
在下述的实施方案中，重组Protein A蛋白包含选自以下的序列或基本由选自以下的序列组成：
SEQ ID No:87；SEQ ID No:88(Q2K)；SEQ ID No:89(Q2L)；SEQ ID No:90(Q2S)；SEQ ID No:91(Q2T)；SEQ ID No:92(Q2R)；SEQ ID No:93(Q8H)；SEQ ID No:94(Q8K)；SEQID No:95(Q8L)；SEQ ID No:96(Q8S)；SEQ ID No:97(Q8T)；SEQ ID No:98(Q8R)；SEQ IDNo:99(Q2K,Q8H)；SEQ ID No:100(Q2K,Q8K)；SEQ ID No:101(Q2K,Q8L)；SEQ ID No:102(Q2K,Q8S)；SEQ ID No:103(Q2K,Q8T)；SEQ ID No:104(Q2K,Q8R)；SEQ ID No:105(Q2L,Q8L)；SEQ ID No:106(Q2S,Q8L)；SEQ ID No:107(Q2T,Q8L)；SEQ ID No:108(Q2R,Q8L)；SEQID No:109；SEQ ID No:110(Q2S)4；SEQ ID No:111(Q8L)4；SEQ ID No:112(Q2S,Q8L)4。
重组Protein A蛋白指定E结构域进行定点突变以后，对其分别构建载体，将上述合成的基因，利用以IgG的Fc片段为培基的亲和层析填料对重组Protein A蛋白进行分离纯化。
同时进行了E结构域突变的重组Protein A蛋白亲和层析介质的制备，并对重组Protein A蛋白亲和层析的IgG结合能力和酸碱性进行了评价。
1、蛋白质的诱变
采用本领域技术人员所知的任一技术来制备重组Protein A蛋白，所述技术为(1)通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，(2)从天然来源中分离蛋白质性化合物，或(3)化学合成蛋白质性物质。另外，还可以通过计算机数据库检索已经公开的核苷酸及蛋白质、多肽和肽的序列。本发明委托基因合成公司利用上述本领域普通技术人员所知的技术来对Protein A蛋白E结构域氨基酸序列中“碱敏感“的谷氨酰胺进行定点突变，得到本发明提供的重组Protein A蛋白。
2、将构建体转化到大肠杆菌中，使大肠杆菌在标准培养基中发酵。发酵后，通过热处理使细胞周质内含物释放，对其进行微滤并收集构建体。将收集所得构建体上样到含有固定的IgG的色谱介质上，用磷酸缓冲溶液对其进行洗脱。将洗脱液pH调至中性，并用二硫苏糖醇还原。将阴离子交换剂加入还原后的样品，在洗涤步骤之后，用氯化钠梯度洗脱去除污染物，最后通过超滤使洗脱合并物浓缩至40-50mg/mL。
3、亲和层析介质的制备
利用得到的Protein A突变体制备亲和层析介质，具体制备步骤如下：
1.活化
在烧瓶中加入25mL琼脂糖基质，10mL纯化水以及2g NaOH，25℃搅拌10min后，在悬浮液中加入4mL环氧氯丙烷(ECH)。反应2h后，用1L水洗涤活化的琼脂糖凝胶。
2.交联
在100mL烧瓶中加入经活化的琼脂糖凝胶，继续加入20mL纯化水，搅拌均匀后，在得到的悬浮液中加入200mg碳酸氢钠，180mg氯化钠以及10mgEDTA，搅拌10min后，加入25mL的Protein A突变体溶液，并于35℃下交联8h。
4、重组Protein A蛋白亲和层析的IgG结合能力和酸碱性进行评价
实验步骤如下：
(1)取4.4mL重组Protein A蛋白亲和层析介质，用20％乙醇，5ml/min的流速装入层析柱中。
缓冲液：Buffer A(PBS，pH 7.6)；Buffer B(0.1M柠檬酸钠，pH 3.0)；Buffer C(1MNaOH)。
样品：用纯品配制1mg/ml的IgG样品(稀释纯品的溶液为Buffer A)。
(2)10％动态载量测定：
设备：AKTAPure
测定过程：
1.Buffer A平衡层析柱，流速：1.8ml/min；
2.IgG样品Bypass，流速：10-15ml/min，记录Bypass时的紫外吸收峰10％的值；
3.上样：流速：1.8ml/min，记录基础流穿的紫外吸收峰值；
4.二者相加得出10％动态载量对应的紫外吸收峰值；
5.继续上样至紫外吸收峰值达到上述两者相加对应紫外吸收峰值时所对应的体积为10％动态载量。
(3)耐碱循环：
控制室温：23±0.5℃；根据载量的下降更新程序中的上样量，其他程序保持一致。
测定过程：
1.PBS平衡：流速：1.8ml/min；体积：1cv；
2.上样：流速：1.8ml/min；200ml(后续程序根据载量的下降更新上样量)
3.PBS清洗：流速：1.8ml/min；体积：5cv；
4. 0.1M柠檬酸钠洗脱：流速：1.8ml/min；体积：3cv；
5.1M NaOH处理2h：先用1.8ml/min的流速过1cv使层析柱内充满1M NaOH，后改为流速：0.5ml/min；体积：60ml；时间：2h；
6.PBS平衡：流速：1.8ml/min；体积：10cv；
(4)在每个循环中可以根据洗脱液中的免疫球蛋白的量确定作为亲和层析配体的蛋白A结合免疫球蛋白的能力。每两个小时重复上述(1)(2)(3)步骤，记录免疫球蛋白G动态载量及剩余动态结合载量。
其中，重组Protein A蛋白亲和层析的IgG结合能力如表10所示。
表10，重组Protein A蛋白亲和层析的IgG结合能力
Figure BDA0003452754480000321
重组Protein A蛋白亲和层析的酸碱性进行评价如图1所示。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博格隆（浙江）生物技术有限公司
博格隆（上海）生物技术有限公司
<120> 一种重组Protein A蛋白及亲和层析介质的制备方法
<130> 112
<160> 112
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Lys Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
Val Asp Asn Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
Val Asp His Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
Val Asp Asn Lys Phe Lys Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 7
Val Asp Asn Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 8
Val Asp Asn Lys Phe His Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 9
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Pro Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 10
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Cys Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 11
Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 12
Val Asp His Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 13
Val Asp Lys Lys Phe His Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 14
Val Asp Lys Lys Phe Lys Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 15
Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Pro Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 16
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 16
Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Cys Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 17
<211> 231
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 17
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Gln Ser Leu Lys
195 200 205
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu
210 215 220
Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
225 230
<210> 18
<211> 232
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 18
Val Asp Lys Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Lys Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
225 230
<210> 19
<211> 232
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 19
Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Arg
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
225 230
<210> 20
<211> 232
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 20
Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Pro Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Arg
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65 70 75 80
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Pro Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Lys Lys Phe Arg Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Pro Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
225 230
<210> 21
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 21
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 22
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 22
Ala Asp Ala Gln Gln Gln Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 23
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 23
Ala Asp Ala Gln Gln Ser Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 24
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 24
Ala Asp Ala Gln Gln His Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 25
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 25
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 26
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 26
Ala Asp Ala Gln Gln Arg Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 27
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 27
Ala Asp Ala Gln Gln Leu Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 28
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 28
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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Ala Leu Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 106
<211> 51
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 106
Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 107
<211> 51
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 107
Ala Thr Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 108
<211> 51
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 108
Ala Arg Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys
50
<210> 109
<211> 204
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 109
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro
50 55 60
Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
65 70 75 80
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
85 90 95
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln
130 135 140
Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr
145 150 155 160
Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
165 170 175
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
180 185 190
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
195 200
<210> 110
<211> 204
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 110
Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro
50 55 60
Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
65 70 75 80
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
85 90 95
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
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Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
195 200
<210> 111
<211> 204
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 111
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro
50 55 60
Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
165 170 175
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
180 185 190
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
195 200
<210> 112
<211> 204
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 112
Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu Asn Met Pro
50 55 60
Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
65 70 75 80
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
85 90 95
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr Leu Val Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln
130 135 140
Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gln Asn Ala Phe Tyr
145 150 155 160
Leu Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
165 170 175
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
180 185 190
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
195 200

Claims (4)

1.一种重组Protein A蛋白，其特征在于，所述重组Protein A蛋白是将Protein A蛋白A结构域中的一个或多个氨基酸替换成为耐碱性氨基酸的突变体，所述A结构域的序列如SEQ ID No:64所示，
所述重组Protein A蛋白的所述A结构域的氨基酸为：N3K；N6S；Q9T；N3K，N6S；N3K，Q9T；N3K，E15H；N6S，Q9T；N6S，E15H；Q9T，E15H；N3K，N6S，Q9T；N3K，N6S，E15H；N3K，Q9T，E15H；N6S，Q9T，E15H；N3K，N6S，Q9T，E15H，序列分别对应如下：SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ IDNO 67、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ IDNO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO79。
2.一种重复单元，所述重复单元是权利要求1所述的4～8个重组Protein A蛋白组成的重复单元。
3.一种亲和层析介质，所述亲和层析介质包含如权利要求1所述的重组Protein A蛋白或包含如权利要求2所述的重复单元。
4.根据权利要求3所述的亲和层析介质的应用，在抗体纯化中的应用。
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