KR101857953B1

KR101857953B1 - 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질

Info

Publication number: KR101857953B1
Application number: KR1020160085721A
Authority: KR
Inventors: 신용철; 박철; 최수림; 조양호; 박소영; 권대범
Original assignee: 아미코젠주식회사
Priority date: 2016-07-06
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2018-05-16
Also published as: JP6802349B2; WO2018009006A1; US20190202871A1; EP3483176A4; JP2019524088A; EP3483176A1; US10766933B2; WO2018009006A8; KR20180005513A

Abstract

본 발명은 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 특정 위치에서의 아미노산이 돌연변이 되어 모분자에 비해 알칼리 pH 값에서 증가된 화학적 안정성을 나타내는 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상된 항체 정제용 면역글로불린-결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있다.

Description

알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질 {Mutated immunoglobulin binding protein with enhanced alkali-tolerance}

본 발명은 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 특정 위치에서의 아미노산이 돌연변이 되어 모분자에 비해 알칼리 pH 값에서 증가된 화학적 안정성을 나타내는 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것이다.

단클론항체(monoclonal antibody)는 유전자 조작된 동물세포의 배양 시, 배지 중으로 분비되며, 세포 자체에서 분비되는 여러 단백질들과 배지 내의 단백질 들이 섞여 매우 낮은 농도로 존재하게 된다. 따라서 목적 단클론 항체 이외의 불순물 제거가 항체생산에서 중요한 단계이다. 단클론항체 분리정제공정은 배지로부터 단클론항체만 선택적으로 회수할 수 있는 항체친화성 리간드(antibody affinity ligand)인 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 주로 사용되고 있다.

항체 정제 후에는 레진에 남아있는 핵산, 지질, 단백질, 미생물과 같은 다양한 오염물질을 제거하기 위한 세정(cleaning-in-place, CIP)을 실시한다. 일반적으로 레진의 세정제 중 가장 광범위하게 사용되는 물질이 NaOH이다. 그러나 단백질 기반 정제용 레진은 알칼리에 취약하기 때문에 NaOH를 사용하기 힘들다. 단백질 A는 비교적 알칼리 조건에서도 안정하기 때문에 NaOH로 세척을 하나, 좀 더 세척율을 높이기 위하여 알칼리 조건에서도 안정한 단백질 A를 개발하기 위한 단백질 개량 연구들이 진행되어 왔다.

단백질 A는 포도상 구균의 세포 표면 단백질로서 높은 상동성을 지니고 있는 다섯 개의 도메인(E, D, A, B, C 도메인)으로 이루어져 있다. 도메인은 세 개의 반평행 헬릭스와 헬릭스 중간에 위치하고 있는 두 개의 루프로 이루어진 구조를 지니고 있으며, 약 58개 아미노산 잔기로 이루어져 있다. 귤리히는 스트렙토코칼 균주 유래의 알부민 결합 도메인(streptococcal albumin-결합 domain)을 모델로 하여, Asn잔기가 알칼리에 민감하다는 정보를 기반으로 모든 Asn잔기를 다른 아미노산으로 치환하였다. 그 결과, 0.5N NaOH에 대한 안정성과 열 안정성이 높은 단백질을 얻을 수 있었다. (Gulich et. al., J Biotechnol, 28(2), 169-178 (2000)). 린휼트는 우회 돌연변이 방법(bypass mutagenesis approach)을 이용하여 반복적인 알칼리 처리에도 구조적 안정성이 유지되는 Protein A를 개발하였다. 자세히 설명하면, Z 도메인(B 도메인의 G29A 변이체)의 F30은 세 번째 헬릭스 위치에 존재하고 있어, 항체 결합에는 간섭을 주진 않지만, 구조적 안정성에는 영향을 주는 잔기이다. 실제로, F30을 Ala로 치환하였을 경우, IgG의 친화력이 와일드 타입과 비슷하지만, 구조적인 안정성이 감소되어 알칼리에 대한 내성이 약해졌다. Z(F30A)를 주형으로 하여 Asn잔기를 다른 도메인(E, D, A, C 도메인)의 동일 위치에 존재하는 Asn외의 다른 잔기로 치환하였을 때에, 즉 N23T, N28A, N6A, N11S로 바뀌었을 때에, 알칼리 조건에서 안정성이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 N21A, N43E, N52A의 경우에는 와일드 타입보다 알칼리 내성이 떨어지는 것으로 보아, 단순히 Asn을 다른 잔기로 치환하는 것 외에 어떤 잔기로 치환이 되었는지도 중요하다. (Linhult et. al., Proteins, 55(2), 407-416 (2004)).

한국 등록 특허 번호 10-1307651는 B 도메인 혹은 Z 도메인의 N3A/N23T 또는 N3A/N6D/N23T 로 바뀐 돌연변이 면역글로블로린 결합 단백질을 기재하고 있으며, 모분자에 비해 알칼리 pH에서 화학적 안정성이 증가되었다. 미국 등록 특허 번호 US9051375는 Z 도메인의 N3, N6, N23의 세 위치에 히스티딘, 세린, 아스파틱산, 트레오닌으로 치환하여 알칼리 내성이 증가된 돌연변이 서열들을 기재하였다.

다른 발명으로는, 미국 특허 공개 번호 US20100048876는 N 말단으로부터 3 번잔기부터 6번잔기를 없앤 C 도메인과 야생형 C 도메인을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스를 기재하고 있으며, 이 매트릭스는 알칼리에 대한 안정성이 증가하였다. 한국 특허 등록 번호 10-1464040은 N-말단으로부터 첫 번째 아미노산에서 시작하여 3 또는 4개의 연속적 아미노산 결실을 포함하는 2개 내지 5개의 C 도메인, B 도메인 혹은 Z 도메인의 친화성 크로마토그래피 리간드 및 매트릭스를 기재하고 있으며, 이 매트릭스는 알칼리 조건에서 야생형 리간드에 비해 리간드 분해가 적다는 특징이 있다.

위와 같이, 개별 단백질 A 리간드로서, 아스파라진 잔기에 대해 몇 개의 특정 아미노산에 대해서 치환을 진행하거나, N 말단의 잔기를 없앰으로써 알칼리 내성 증가를 확인하였지만, 치환잔기에 따라 알카리 내성에 영향을 미치는 것을 고려할 때, 그 영향은 제한적일 수밖에 없다.

이에, 본 발명자들은 무작위 돌연변이 방법을 이용하여 아스파라진 외에 다른 잔기들에도 무작위로 다양한 아미노산으로 치환을 시킴으로써 알칼리 내성이 증가된 단백질 A 리간드를 발명하고자 예의 노력을 기울인 결과, 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째, 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이 되면, 알칼리 내성이 증가된 면역글로불린-결합 단백질을 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째, 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역글로불린-결합 단백질 또는 상기 다량체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 단백질 또는 상기 다량체 또는 상기 매트릭스가 사용되는 면역글로불린의 단리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 단백질 또는 상기 다량체 또는 상기 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째, 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 면역글로불린-결합 단백질 또는 상기 다량체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 돌연변이 단백질 또는 상기 다량체 또는 상기 매트릭스가 사용되는 면역글로불린의 단리 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 돌연변이 단백질 또는 상기 다량체 또는 상기 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째, 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질을 제공한다.

본 발명자들은, 단백질 A의 A 도메인의 아미노산에 다른 아미노산으로 치환시킨 재조합 단백질 변이체를 분자 설계하고, 단백질 공학적 방법 및 유전자 공학적 방법을 사용하여 상기 변이체를 형질 전환 세포로부터 취득하고, 상기 변이체의 알칼리 조건하에서의 항체결합 활성을 비교 검토함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:

A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.

본 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 천연형 폴리펩타이드의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, N23R은 천연형 폴리펩타이드의 23번에 해당하는 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된다는 것을 가리킨다. 또한 후행 표기된 아미노산에서‘사선(/)’표시는 ‘또는’을 의미한다.

본 발명은, 단백질 A의 A, B, C 또는 Z 도메인에서 선택되는 적어도 1개의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 있어서, 18 ,36, 43 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 치환된 돌연변이 단백질이며, 변이 도입 전의 단백질과 비교하여 알칼리 조건에서 화학적 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는 면역글로불린에 친화성을 갖는 단백질에 관한 것이다.

변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이, 서열번호 1에 기재된 단백질 A의 A 도메인의 염기서열, 또는 서열번호 2에 기재된 단백질 A의 A 도메인에서 유래하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 돌연변이 단백질은 서열번호 2에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 기능적 변이체이다. “기능적 변이체”는 증가된 pH 값의 환경에서 돌연변이 단백질의 향상된 화학적 안정성 또는 면역글로불린에 대한 친화성에는 영향을 주지 않는 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 변이를 포함하는 모든 유사한 서열을 포함한다.

변이 도입 전의 아미노산 잔기에 있어서, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 18 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 23 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 28 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 36 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asp, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 43 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn, 또는 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 52 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn인 것이 바람직하다.

본 발명에서 스타필로코쿠스 단백질 A의 각 도메인에 도입되는 아미노산 치환 변이가 A 도메인의 18 위치에 대응하는 Asn를 His로 치환하는 변이(N18H), A 도메인의 36 위치에 대응하는 Asp를 Val로 치환하는 변이(D36V), A 도메인의 43 위치에 대응하는 Asn를 Tyr 또는 Leu로 치환하는 변이(N43Y/L) 및 A 도메인의 52 위치에 대응하는 Asn를 Ser로 치환하는 변이(N52S)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

가장 바람직하게, 본 발명의 상기 변이 A 도메인은 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드에서 18번째 아스파라긴이 히스티딘으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AEP1로 칭함, 서열번호 3, N18H), 36번째 아스파르트산이 발린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AEP4로 칭함, 서열번호 4, D36V), 43번째 아스파라긴이 티로신으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AEP5로 칭함, 서열번호 5, N43Y/L), 52번째 아스파라긴이 세린으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AEP6으로 칭함, 서열번호 6, N53S)가 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 18번째, 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 변이 외에 23번째 및/또는 28번째 위치에서의 아미노산 잔기 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질을 제공한다.

바람직하게는, 상기 23번째 위치에서의 돌연변이는 N23T, N23A, N23E, N23H, N23K, N23L, N23P, N23S 및 N23Y로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 28번째 위치에서의 돌연변이는 N28W, N28G, N28R, N28F 및 N28I로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 23번째 아스파라긴이 루신으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AEP2로 칭함, 서열번호 7, N23L), 28번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된 폴리펩타이드(본 명세서에서 AES3로 칭함, 서열번호 8, N28W)일 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서, 18번째, 23번째, 28번째, 36번째, 43번째 및 52번째 위치의 아미노산이 모두 치환된 돌연변이 단백질을 제공한다.

상기 단백질은 바람직하게는 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서, N18H, N23L, N28W, D36V, N43Y 및 N52S 변이를 포함하는 서열번호 9로 정의되는 단백질일 수 있다.

본 발명의 상기 돌연변이 단백질들은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM과 같은 면역글로불린의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드이며, 모분자보다 알칼리 조건에서 더 장기간 친화성이 유지된다.

본 발명에 따른 상기 돌연변이 단백질의 증가된 알칼리 내성은 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 실시예에서는 야생형 A 도메인의 1, 2차 개량을 통하여 알칼리 내성이 증가된 변이체들을 발명하였으며, 최종적으로 각 잔기에서 가장 알칼리 내성이 높은 잔기들을 모아 알칼리 내성이 야생형 A 도메인에 비해 월등히 증가한 변이체를 개발하였다.

구체적으로 1차 개량은 야생형 A 도메인 염기(서열번호 1)를 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR) 방법을 이용하여 돌연변이 라이브러리를 제조하고 야생형 대비 알칼리 내성이 증가된 변이를 탐색하여, 야생형 A 도메인 폴리펩타이드(서열번호 2)의 N18, N23, N28, D36, N43, N52 위치에서 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체체적으로 상기 돌연변이는 N18이 히스티딘으로 치환, N23이 루신으로 치환, N28이 트립토판으로 치환, D36이 발린으로 치환, N43이 티로신으로 치환, N52가 세린으로 치환되는 돌연변이체들이 선별되었다.

2차 개량은 상기 1차 개량으로 선정된 6개의 아미노산 잔기(N18H, N23L N28W, D36V, N43Y, N52S)에 대한 추가적인 개량을 위해 위치포화 돌연변이 라이브러리를 제조하고 알칼리 내성이 증가된 변이체들을 탐색한 결과, 야생형 A 도메인 폴리펩타이드(서열번호 2)의 N23, N28, N43 위치에서 추가적으로 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체적으로 상기 돌연변이는 N23이 알라닌. 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 류신, 프롤린, 세린, 티로신으로 치환, N28이 글라이신, 아르기닌, 페닐알라닌, 이소류신으로 치환, N43이 류신으로 치환되는 돌연변이들이 선별되었다.

본 발명의 실시예에서 제조한 상기 변이체들의 알칼리 내성을 분석하여, 각 위치에서 가장 내성이 높았던 치환잔기를 모두 도입한 mAF(서열번호 9)를 발명하였고, 이것은 야생형에 비해 알칼리 내성이 월등히 증가되었음을 확인하였다.

본 발명은 또한, 상기 설명한 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체를 제공한다. 즉, 상기한 단백질 단량체가 결합된 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체 단백질을 제공한다.

본 발명의 상기 다량체는 또한 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 9의 단백질이 결합된 사량체(4mAF로 칭함, 서열번호 11)를 만들어 레진에 고정화한 후, 상업화된 레진(Mabselect Sure, GE Healthcare사)과 알칼리 내성을 비교하였을 때에 상업화된 레진에 비해 알칼리 내성이 우수함을 확인하였다.

한편, 본 발명은 상기 면역글루불린-결합 단백질 또는 상기 다량체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어“재조합 발현벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동 가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 즉, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어 본 발명의 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 상기 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 벡터 내에 클로닝된 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 또한 상기 발현벡터는 발현조절 서열 및 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발현벡터는 클로닝분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환은 핵산(본 발명의 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격(heat shock)법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 숙주세포(host cell)는 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로스트리디아 속(Clostridia spp., 예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum 등), 에세리치아 속(Escherichia spp.), 아세토박터 속(Acetobacter spp., 예컨대 Acetobacter turbidans, Acetobacter pasteurianus 등), 아에로모나스 속(Aeromonas spp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes spp.), 아파노클라디움 속(Aphanocladium spp.),바실러스 속(Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속(Cephalosporium spp.), 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.), 클루이베라 속(Kluyvera spp.), 미코플라나 속(Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속(Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.) 및 잔토모나스 속(Xanthomonas spp., 예컨대 Xanthomonas citri 등)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속(genus) 미생물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 변이 A 도메인 폴리펩타이드(단백질)는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 변이 A 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 배양해, 그 배양물로부터 회수함으로써 얻을 수 있다. 배양물이란 배양상청, 배양 세포 혹은 배양균체 또는 세포 혹은 균체의 파쇄물을 의미할 수 있다. 배양 후, 본 발명의 개량형 단백질이 균체내 또는 세포 안에 생산되는 경우에는 초음파 처리, 동결 융해를 반족처리 등을 이용하여 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 단백질을 채취한다. 또, 그 단백질이 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하던지, 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 변이 A 도메인 단백질의 분리정제는 기존에 밝혀진 A 도메인의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose 결합 domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 A 도메인을 정제하는 것도 가능하다.

분리정제 한 본 발명의 개량형 단백질이, 목적대로의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인지를 확인하기 위해, 그 단백질을 포함한 시료를 분석 한다. 분석 방법으로서는, SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅, 질량 분석, 아미노산 분석, 아미노산 시퀀서- 등을 이용할 수 있다

상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명의 변이 A 도메인은 유리(free) 상태뿐만 아니라 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 A 도메인의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조가 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈 (agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리메타크릴레이트 (polymethacylate), 유퍼짓 C (Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카 (silica), 벤토나이트 (bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로 인캡슐레이션(microencapsulation) 등에 의해 변이 A 도메인을 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드 (cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 A 도메인을 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 변이 A 도메인을 따로 정제할 필요가 없이 변이 A 도메인을 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 A 도메인의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스를 제공한다.

본 발명에 따른 매트릭스는 리간드로서 상기한 어떠한 형태의 돌연변이 단백질도 포함할 수 있으며, 바람직하게는 고체 지지체상에 존재하는 리간드가 상기 다량체일 수 있다.

본 발명에 따른 매트릭스의 고체 지지체는 모든 적합한 공지된 종류의 것일 수 있다. 통상적인 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기 성질이며, 사용된 수성 매질로 친수성 표면을 노출시키는, 즉 자신의 외부로 그리고 존재한다면 내부 표면상에도 역시 히드록시 (-OH), 카르복시 (-COOH), 카르복스아미도 (-CONH2, 아마도 N-치환된 형태로), 아미노 (-NH2, 아마도 치환된 형태로), 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시기를 노출시키는 중합체를 기제로 한다. 상기 중합체는 예를 들면, 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류, 유리하게는 예를 들어 비스에폭시드, 에피할로히드린, 1,2,3-트리할로 치환된 저급 탄화수소와 함께 가교결합된 다당류를 기제로 하여, 적합한 다공성 및 강도를 제공할 수 있다. 바람직하게는 상기 고체 지지체가 다공성 아가로오스 비드이다. 본 발명에 사용된 지지체는 역 (inverse) 현탁액 겔라틴화 등 표준적 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다 (S Hjerten: Biochem Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964)). 이와 다르게는, 기제 매트릭스가 시판되는 제품, 예컨대 세파로오스 (상표) FF (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)이다. 대규모 분리에 특히 유리한 지지체는 그 강도를 증가시키도록 적응시켜서 매트릭스를 높은 유속에 대해서 더 적합하게 한다.

한편, 본 발명의 상기 고체 지지체는 폴리비닐 알코올, 폴리히드록시알킬 아크릴레이트, 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등의 합성 폴리머를 기제로 할 수 있다. 디비닐 및 모노비닐-치환된 벤젠을 기제로 한 매트릭스와 같은 소수성 폴리머의 경우에는, 매트릭스 표면이 종종 친수성화되어 둘러싼 수성 액체로 상기한 바와 같은 친수성기를 노출시킨다. 이러한 폴리머는 표준적 방법에 따라 용이하게 제조하며, 예를 들면 문헌 ("Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization", R. Arshady:Chimica eL'Industria 70 (9), 70-75 (1988))을 참조한다. 이와 다르게는, 시판되는 제품, 예를 들면 소스 (Source, 상표) (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)가 사용된다.

또한, 본 발명에 따른 상기 고체 지지체는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 성질의 지지체를 포함하며, 또는 고체 지지체가 표면, 칩, 모세관 또는 필터 등의 다른 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 매트릭스의 모양과 관련하여, 매트릭스는 다공성 모노리쓰 (monolith)의 형태일 수 있다. 또는, 매트릭스가 다공성 또는 비다공성일 수 있는 비드형 또는 입자형이다. 비드 또는 입자형 매트릭스가 꽉찬 베드로서 또는 현탁된 형태로 사용될 수 있다. 현탁된 형태는 확장된 베드 및 순수한 현탁액으로 알려진 것들을 포함하며, 그 안에서 입자 또는 비드는 자유롭게 움직인다. 모노리쓰, 꽉찬 베드 및 확장된 베드의 경우, 분리 과정은 농도 구배를 통한 통상적인 크로마토그래피 이후에 하는 것이 보통이다.

리간드는 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노기 및(또는) 카르복시기를 사용하는 통상적인 커플링 기술을 통해 지지체에 부착될 수 있다. 비스에폭시드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 잘 알려진 커플링제이다. 지지체와 리간드 사이에, 스페이서로서 알려진 분자를 도입할 수 있으며, 이는 리간드의 활용도를 향상시키고 리간드의 지지체로의 화학적 커플링을 용이하게 할 것이다. 이와 다르게는, 리간드는 물리적 흡착 또는 생물특이적 흡착 등의 비공유결합에 의하여 지지체에 부착될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질, 다량체 또는 매트릭스가 사용되는, IgG, IgA 및 (또는) IgM 등의 면역글로불린을 단리하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 표적 화합물이 상기한 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스에 흡착됨으로써 액체로부터 분리되는, 크로마토그래피 방법을 포함한다. 원하는 생성물이 분리된 화합물 또는 액체일 수 있다. 따라서, 본 발명의 이런 측면은 널리 사용되고 잘 알려진 분리 기술인 친화성 크로마토그래피에 관한 것이다. 간단하게 설명하면, 제1 단계에서 표적 화합물, 바람직하게는 상술한 바와 같은 항체를 포함하는 용액을 표적 화합물이 분리 매트릭스 상에 존재하는 리간드에 흡착될 수 있는 조건하에서 분리 매트릭스를 통과시킨다. 이러한 조건은 예를 들면 pH 및(또는) 염 농도, 즉 용액 중의 이온 세기에 의하여 조절된다. 매트릭스의 용량을 초과하지 않도록 주의해야 하는데, 즉 만족스러운 흡착이 가능하도록 충분히 흐름을 느리게 하여야 한다. 이 단계에서, 그 용액의 다른 성분들은 원칙적으로 막히지 않고 통과할 것이다. 필수적인 것은 아니나, 보유된 물질 및(또는) 느슨하게 결합된 물질을 제거하기 위하여 그 후 매트릭스는 수용액 사용하는 등에 의하여 세척한다. 본 매트릭스는 상술한 바와 같이, 알칼리 제제를 사용하는 세척 단계를 통해 가장 유리하게 사용된다. 다음 단계에서, 용출제로 칭하는 제2 용액을 표적 화합물의 탈착, 즉 방출을 가능케 하는 조건하에 매트릭스 위로 통과시킨다. 이러한 조건은 pH, 염 농도, 즉 이온 세기, 소수성 등의 변화에 의하여 통상 제공된다. 구배 용출 및 단계식 용출 등 여러 가지 용출 방법이 알려져 있다. 용출은 매트릭스 상에서 원하는 항체를 대체할 경쟁 물질을 포함하는 제2 용액에 의해도가능할 수 있다. 친화성 크로마토그래피의 원리의 일반적 개관은 예를 들면 문헌 (Wilchek, M., and Chaiken, I. 2000, An overview of affinity chromatography, Methods Mol. Biol. 147:1-6)을 참조한다.

본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상된 항체 정제용 면역글로불린-결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있다.

도 1은 알칼리 내성 증가를 위한 개량실험을 통해 선별된 잔기의 정보이다.
도 2는 개량을 통해 선별된 변이 A 도메인들의 알칼리 내성 증가를 나타내는 그래프이다.
도 3은 알칼리 내성에 기여하는 잔기들을 모두 반영한 변이 A 도메인(mAF)과 야생형 A 도메인(wAd)의 알칼리 내성을 비교한 그래프이다.
도 4는 알칼리 내성에 기여하는 잔기들을 모두 반영한 변이 A 도메인 사량체(4mAF)를 레진으로 제작한 후에, 상업화 레진(Mabselect sure)과 알칼리 내성을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

개량을 위한 재조합 면역글로불린 G의 Fc 단백질 제조

<1-1> 면역글로불린 G의 Fc 도메인 유전자 합성

인간의 IgG1로부터의 Fc 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 NCBI 사이트의Blast를 통해 찾았고 (GenBank accession no. Y14735) 코스모진텍 (대전, 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.

<1-2> pET-Fc 플라스미드의 제조

pET-Fc 플라스미드는 상기 실시예<2-1>에서 수득한 Fc 유전자를 pET29a(+) 벡터 (Stratagene사, 미국)의 NdeI과 XhoI 제한효소 인식부위에 삽입하여 제조하였다. 자세하게는 하기와 같다.

상기 실시예 <1-1>에서 합성을 통해 얻은 Fc 유전자 DNA 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI로 절단한 후, 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pET29a(+) 벡터 DNA를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법(electrophoration)으로 발현용 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 40 μg/mL 농도의 카나마이신 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 형질전환체를 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 Fc 유전자를 포함하는 pET-Fc 플라스미드를 제조하였다. 상기 pET-Fc 플라스미드는 서열번호 13로 표시되는 야생형 Fc 단백질을 발현한다.

<1-3> 니켈-친화성 레진을 이용한 단백질 정제

대장균 BL21(DE3) 형질전환체를 종균배양하기 위해 카나마이신 항생제가 함유된 LB 액체배지 5 mL이 분주 된 50 mL의 코니칼 튜브에 접종한 후, 37℃, 200 rpm 조건으로 16시간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 LB 액체배지 200 mL이 분주된 500 mL 삼각 플라스크에 종균배양액의 1%(v/v)를 접종한 후, 37℃, 200 rpm으로 진탕배양하여 약 OD₆₀₀=0.6에서 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 첨가하여 37℃, 200 rpm, 18시간 동안 추가 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4℃, 10000 rpm, 30분)하여 균체를 회수한 후 PBS 버퍼 (pH 7.4) (인트론 바이오테크놀로지, 한국) 10 mL의 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기로 15분 동안 파쇄하고 4℃, 10,000 rpm 조건으로 30분 동안 원심분리하여 상등액만을 취했다. 니켈 친화성 레진인 NiNTA Chelating Agarose CL-6B (Incospharm사, 한국) 1 mL을 충진시킨 컬럼에 5 mL의 결합버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 10 mM Imidazole pH 7.4)를 흘려주고 상기의 상등액 2.5 mL과 결합 버퍼 5 mL을 섞은 후 컬럼에 흘려준다. 세척버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.4) 5 mL을 흘려준 뒤 용출버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 300 mM Imidazole pH 7.4) 2.5 mL을 15 mL의 conical tube에 받는다. 정제된 단백질은 PD10 column을 이용하여 desalting을 진행하였다.

<실시예 2>

스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus) 유래 단백질 A의 A 도메인 발현벡터 제작

<2-1> A 도메인 유전자 합성

스타필로코쿠스 아우레우스 (staphylococcus aureus) 유래의 단백질 A의 세 번째 도메인인 A 도메인 유전자에 차후 단백질 정제를 고려하여 HQ tag를 포함시킨 유전자를 코스모진텍 (대전, 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.

<2-2> pBC-wAd 플라스미드의 제조

pBC-wAd 플라스미드는 상기 실시예<1-1>에서 수득한 A 도메인 유전자를 pBC KS(+) 벡터 (Stratagene사, 미국)의 NdeI과 NotI 제한효소 인식부위에 삽입하여 제조하였다. 자세하게는 하기와 같이 진행하였다. 상기 실시예 <2-1>에서 합성을 통해 얻은 wAd 유전자 DNA 산물을 제한효소 NdeI과 NotI로 절단한 후, 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 NdeI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophoration)으로 대장균 DH5α균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 형질전환체를 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 야생형 A 도메인 유전자를 포함하는 pBC-wAd 플라스미드를 제조하였다. 상기 pBC-wAd 플라스미드는 서열번호 2로 표시되는 야생형 A 도메인 단백질을 발현한다.

<실시예 3>

에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)방법을 이용한 wAd 개량

<3-1> 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 wAd 변이체 라이브러리의 제작

합성한 wAd 유전자의 염기서열에 인위적으로 무작위 돌연변이를 유발하기 위해 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)을 수행함으로써 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 다음과 같다. 에러 유발성 중합효소 연쇄반응은 Diversity®PCR Random Mutagenesis kit (클론텍, 미국)를 사용하여 1000 bp당 1-2개의 돌연변이가 일어나도록 유도하였고, PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 1 ng의 pBC-wAd 플라스미드, 각 10 pmol의 EP-F 프라이머(서열번호 14)와 T7 프라이머(서열번호 15), 40 μM dGTP, Diversity dNTP mix, TITANIUM Taq polymerase로 최종부피는 100 μL로 조정하여 수행하였다. PCR은 Takara PCR Thermal Cycler (다카라, 일본)를 사용하였고, 반응조건은 반응 혼합액을 94℃에서 30초 동안 전-변성시키고 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 55℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 16회 반복한 후 68℃에서 1분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 각각의 변이 wAd 유전자의 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 NotI로 절단한 후 QIAEX Gel Extraction Kit (퀴아젠, 독일)를 사용하여 정제한 후 삽입 DNA로 사용하였고, pBC-KS(+) 플라스미드를 제한효소 NdeI과 NotI로 절단하여 회수한 3.4 kb 크기의 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법으로 대장균 DH5α 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

<3-2> 알칼리 내성이 증가된 변이체 선발

상기 돌연변이가 유발된 변이 wAd 유전자가 포함된 대장균 DH5α 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지 600 μL씩 분주된 96-딥 웰 플레이트(바이오니아, 한국)에 접종한 후, 37℃, 280 rpm 조건으로 18시간 동안 진탕배양하였다. 구체적인 단백질 정제 과정은 Promega HisLink™ 96 Protein Purification System (Promega사, 미국)을 사용하여 진행하였다. 600 μL의 배양액에 60 μL의 FastBreak™ Cell Lysis Reagent, 10X /DNase I solution을 넣고 45 μL의 HisLink™ Resin을 각 웰에 장착시킨 다음 100 rpm 조건으로 30분 동안 섞어준다. 반응액과 레진은 Filtration 플레이트에 옮기고, Vac-Man®96 Vacuum Manifold (Promega사, 미국)를 이용하여 10초 동안 진공을 가해 필터링하였다. 다음으로 250 μL의 wash bufffer를 96웰에 첨가한 뒤 10초간 진공을 가한다. 같은 방법으로 3회 세척하였다. 플레이트에 용출 버퍼 (100 mM HEPES, 50 mM Imidazole, pH 7.5)를 200 μL를 첨가하여 10분 동안 반응시킨 뒤 1분간 진공을 주어 새로운 96-웰 플레이트에 정제된 단백질을 받았다.

정제한 wAd 변이체들을 96-웰 플레이트에서 NHS(N-hydroxysuccinimide)-Activated sepharose 4 Fast flow (GE Healthcare사, 스웨덴)에 커플링하였다. 실시예 <1-3>에서 정제한 Fc 150 μL(59.5 μg/mL)를 상기 NHS-activated 세파로오즈 비드에 커플링된 wAd 변이체들이 포함되어 있는 Filtration 플레이트에 옮기고 상온에서 100 rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 비결합한 Fc 단백질은 진공을 주어 제거하고, PBS 버퍼 150μL를 분주하고 진공을 가해 세척하였다. 이 세척과정을 3회 반복하였다. 용출 버퍼 (0.1 M GlycineHCl, pH 3.0)를 150 μL 넣고 상온에서 30초 동안 반응시킨 뒤 1분간 진공을 주어 새로운 96-웰 플레이트에 단백질을 받았다. 용출 버퍼를 처리했던 Filtration 플레이트는 PBS 버퍼 150 μL를 분주하고 진공을 가해 세척하였다. 이 세척과정을 3번 반복하였다. 상기 상등액을 옮긴 새로운 96-웰 플레이트는 Synergy HTX multi-mode reade (BioTek, 미국)기를 사용하여 OD₂₈₀에서 Fc 단백질 양을 측정하였다. wAd 변이체들의 알칼리 내성을 확인하기 위해서 Filtration 플레이트에 들어있는 wAd 변이체 레진에 0.5 N NaOH를 150 μL를 첨가하여 상온에서 100 rpm으로 6시간 동안 반응시켰다. 그 후, PBS 버퍼로 3회 세척하고 상기와 같은 방법으로 잔존하는 Fc 결합 활성을 분석하였다.

상기 실시예 <3-3>의 mAEP 변이체들의 0.5N NaOH 처리하기 전과 후의 흡광도 값을 비교하여 wAd보다 알칼리 내성이 증가된 wAd 개량 단백질을 선발하였다. 6개 변이체는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 AEP1(N18H) (서열번호 3), AEP4(D36V) (서열번호 4), AEP5(N43Y) (서열번호 5), AEP6(N52S) (서열번호 6), AEP2(N23T) (서열번호 7), AEP3(N28W) (서열번호 8) 으로 돌연변이 되었음을 확인하였다.

<실시예 4>

위치포화 돌연변이(site-saturation mutagenesis) 방법을 이용한 wAd 개량

<4-1> 위치포화 돌연변이( site - saturation mutagenesis ) 의한 wAd 변이체 라이브러리의 제작

추가적으로 알칼리 내성을 부여하기 위하여 실시예 <3-2>에서 선정된 6개의 아미노산 잔기(N18, N23, N28, D36, N43, N52)에 대해 위치포화 돌연변이(site-saturation mutagenesis) 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로, 18번째 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 pBC KS(+) 벡터에 삽입되어있는 AEP1(서열번호3)를 주형으로 18-F 프라이머(서열번호16)와 18-R 프라이머(서열번호17), pFU-x Reaction 버퍼 , 10 mM dNTP , pFU-x polymerase로 최종 부피는 50 μL로 조정하여 수행하였다. 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 1분 동안 전-변성시키고 변성을 95℃에서 50초, 어닐링을 53℃에서 50초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 10분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 PCR 산물을 획득하여 제한효소 DpnI으로 18시간 동안 처리하였고, 정제키트 (PCR purification Kit; 코스모진텍, 한국)로 정제하여 이를 바로 전기천공법(electrophoration)으로 대장균 DH5α균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 위치포화 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

그 후 상기 서술한 방법과 동일한 방법으로 pBC KS(+) 벡터에 삽입되어있는 , AEP4(서열번호 4), AEP5(서열번호 5), AEP6(서열번호 6), AEP2(서열번호 7), AEP3(서열번호 8)를 주형으로 각각 36-F 프라이머(서열번호 20)와 36-R 프라이머(서열번호 21), 43-F 프라이머(서열번호 22)와 43-R 프라이머(서열번호 23), 52-F 프라이머(서열번호 24)와 52-R 프라이머(서열번호 25), 23-F 프라이머(서열번호 26)와 23-R 프라이머(서열번호 27), 28-F 프라이머(서열번호 28)와 28-R 프라이머(서열번호 29)를 사용하여 라이브러리를 제작하였다.

<4-2> 알칼리 내성이 증가된 변이체 선발

<3-2>에서 진행한 동일한 방법을 이용하여 라이브러리를 탐색한 결과 wAd 대비 알칼리 내성이 증가한 변이체로 AES(N23A), AES(N23E), AES(N23H), AES(N23K), AES(N23L), AES(N23P), AES(N23S), AES(N23Y), AES(N28G), AES(N28R), AES(N28F), AES(N28I), AES(N43L)이 추가적으로 선발되었다.(도 2)

<실시예 5>

최종 알칼리 내성이 증가된 mAd 변이체 개발

<5-1> mAF 유전자 합성

상기 실시예 4에서 선발된 치환잔기를 참고하여 돌연변이 잔기위치에 가장 잔존 활성이 높았던 잔기들을 wAd에 도입하고자 하였다. 변이체로 N18H/N23L/N28W/D36V/N43Y/N52S 변이체를 디자인하여 mAF(서열번호 9)로 명명하고 HQ tag를 포함한 유전자를 코스모진텍(대전, 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.

<5-2> pBC-mAF 플라스미드의 제조

상기 실시예 <5-1>에서 수득한 mAF 유전자(서열번호 10)를 상기 실시예 <1-2>의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 (Stratagene사, 미국)에 클로닝 하여 pBC-mAF 플라스미드를 제조하였다.

<5-3> 변이 단백질 mAF 단량체의 알칼리 내성 비교

상기 실시예 <1-4>와 같은 방법으로 단백질 정제를 하였고 <실시예 3>과 동일한 방법으로 시간에 따른 알칼리 내성을 비교하였다.(도 3)

그 결과 도 3에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 mAF 단백질은 0.5N NaOH에 24시간 처리 후 활성을 비교하였을 때, 야생형 아미노산 서열을 갖는 wAd 단백질에 비해, 약 7배 이상 알칼리 내성이 증가하였음을 확인하였다.

<실시예 6>

mAF 사량체의 알칼리 내성 조사

<6-1> pET - 4mAF 플라스미드의 제조

실시예 <5-3>의 정확한 알칼리 내성 결과를 확인하기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행함으로서 mAF 유전자를 사량체로 제조하였다. 자세하기는 하기와 같이 진행하였다.

mAF 유전자 사량체를 제조하기 위하여, mAF를 주형으로 하고 mAF2-F 프라이머(서열번호 28)와 mAF2-R 프라이머(서열번호 29)를 사용하여 유전자를 랜덤하게 이어 사량체를 만드는 PCR을 수행하였다. PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머, pfu-x 버퍼, dNTPs mix, pfu-x polymerase로 최종부피는 100 μl로 조정하여 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 96℃에서 2분 동안 전-변성시키고 변성을 96℃에서 30초, 어닐링을 54℃에서 30초 및 중합을 72℃에서 1분 동안 수행하는 반응을 25회 반복한 후 72℃에서 5분 동안 후-중합시켰다. 얻어진 PCR 산물은 정제 키트 QIAEX Gel Extraction Kit (퀴아젠, 독일)를 사용하여 정제하였다. 상기 mAF 유전자는 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후, 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유전자 산물을 회수하였다. 상기 회수한 사량체 mAF 유전자를 주형으로 하고 4mAF-F 프라이머(서열번호 30)와 4mAF-R 프라이머(서열번호 31)를 사용하여 상기 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유전자 DNA 산물을 회수하였고, 제한효소 NdeI과 XhoI로 절단한 후, 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유전자 DNA를 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pET29a(+) 벡터 DNA를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophoration)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 40 μg/mL 농도의 카나마이신 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, 서열번호 11의 염기서열을 갖는 4mAF 유전자를 포함하는 pET-4mAF 플라스미드를 제조하였다. 상기 pET-4mAF 플라스미드는 서열번호 32로 표시되는 변이 단백질 4mAF를 발현한다.

<6-2> 니켈-친화성 레진을 이용한 변이 단백질 mAF 사량체의 정제

대장균 BL21(DE3) 형질전환체를 종균배양하기 위해 카나마이신 항생제가 함유된 TB 액체배지 5 mL이 분주 된 50 mL의 테스트 튜브에 접종한 후, 37℃, 200 rpm 조건으로 16시간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 TB 액체배지 500 mL이 분주된 2000 mL 삼각 플라스크에 종균배양액의 1 %(v/v)를 접종한 후, 37℃, 200 rpm으로 진탕배양하였고, 약 OD₆₀₀=0.6에서 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 첨가하여 37℃, 200 rpm, 18시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4℃, 10000 rpm, 30분)하여 균체를 회수한 후 PBS 버퍼 (pH 7.4) (인트론 바이오테크놀로지, 한국) 20 mL의 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기로 30분 동안 파쇄하고 4℃, 10,000 rpm 조건으로 30분 동안 원심분리하여 상등액만을 취한다. Ni NTA Chelating Agarose CL-6B (인코스팜사, 한국) 5mL을 충진시킨 컬럼에 25 mL의 결합 버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 10 mM Imidazole pH 7.4)를 흘려주고 상기의 상등액 20 mL과 결합 버퍼 40 mL을 섞은 후 컬럼에 흘려준다. 세척 버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.4) 25 mL을 흘려준 뒤 용출 버퍼 (20 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaCl, 300 mM Imidazole pH 7.4) 40 mL을 50 mL의 conical tube에 받는다. 정제된 단백질은 PD10 column을 이용하여 desalting을 진행하였다.

<6-3> 변이 단백질 mAF 사량체의 알칼리 내성 비교

실시예 <6-2>에서 정제한 4mAF를 NHS(N-hydroxysuccinimide)-Activated sepharose 4 Fast flow (GE Healthcare사, 스웨덴)에 커플링하였다. 제작된 4mAF 레진을 알칼리 내성이 높은 것으로 알려진 상업화된 레진 MabSelect Sure (GE Healthcare Life Scicences사, 미국)와 알칼리 내성을 비교하였다. Disposable columns (ThermoFisher사, 미국)에 레진 100 ul와 5 mL의 0.5N NaOH를 넣고, 밀봉한 후 천천히 흔들어 주면서 알칼리 처리를 진행하였다. 일정시간 후에는 밀봉을 없애고 NaOH를 중력으로 흘려주어 제거한 뒤, PBS 버퍼 (pH 7.4) (인트론 바이오테크놀로지, 한국)로 레진을 5회 세척하였다. 2 mg/mL의 토끼 유래의 정제항체(영인프런티어, 한국) 5 mL을 레진과 섞어준 뒤에 다시 밀봉한 뒤, 천천히 흔들어 주면서 3시간동안 실온에서 결합반응시켰다. 비결합한 항체 단백질은 중력으로 흘려주어 제거하고, PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 용출 버퍼 (0.1 M GlycineHCl, pH 3.0) 3 mL을 흘려주어 결합된 항체를 분리하였다. 분리된 항체는 중성화 버퍼 (1M Tris-HCl, pH 8.5) 300 ul가 들어있는 튜브에 전량을 받고 회수된 단백질 양을 측정하였다. 결합분석이 끝난 뒤에는 용출 버퍼와 PBS버퍼로 교대로 세척하고 다시 5 mL의 0.5 N NaOH와 혼합하여 추가적으로 알칼리 처리하였다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 4mAF 레진은 산업용으로 널리 사용되고 있는 MabSelect Sure에 비해, 알칼리 내성이 우수한 것을 확인하였다. 100시간 동안 알칼리 처리시 4mAF의 잔존활성은 33%로 MabSelect Sure비해 1.4배 높았다.

본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상된 항체 정제용 면역글로불린-결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

<110> AMICOGEN CO., LTD <120> Mutated immunoglobulin binding protein with enhanced alkali-tolerance <130> NP16-0063 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyneclotide sequence of protein A domain A <400> 1 catatggctg acaacaattt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttgaac 60 atgcctaact tgaacgaaga acaacgcaat ggtttcatcc aaagcttaaa ggatgaccca 120 agtcaaagtg ctaacctttt agcagaagct aaaaagttaa atgaatctca agcaccgaaa 180 catcaacatc agcaccaata agcggccgc 209 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of protein A domain A <400> 2 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP1, N18H) <400> 3 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 4 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP4, D36V) <400> 4 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Val Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 5 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP5, N43Y) <400> 5 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Tyr Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 6 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP6, N52S) <400> 6 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 7 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP2, N23T) <400> 7 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 8 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(AEP3, N28W) <400> 8 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Trp Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 9 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of protein A domain A(mAF) <400> 9 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Met Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Trp Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Val Asp Pro Ser Gln Ser Ala Tyr Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys His Gln His Gln His 50 55 60 Gln 65 <210> 10 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBC-mAF plasmid <400> 10 atggctgaca acaatttcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttgcacatg 60 cctaacttgc ttgaagaaca acgctggggt ttcatccaaa gcttaaaggt tgacccaagt 120 caaagtgctt accttttagc agaagctaaa aagttaagtg aatctcaagc accgaaacat 180 caacatcagc accaataa 198 <210> 11 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4mAF <400> 11 Met Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Met Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Trp Gly Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Val Asp Pro Ser Gln Ser Ala Tyr Leu Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Ala Asp Asn 50 55 60 Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Met 65 70 75 80 Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg Trp Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Val Asp Pro Ser Gln Ser Ala Tyr Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys 115 120 125 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Met Pro Asn Leu Leu 130 135 140 Glu Glu Gln Arg Trp Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Val Asp Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Ala Tyr Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln 165 170 175 Ala Pro Lys Gly Thr Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 180 185 190 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Met Pro Asn Leu Leu Glu Glu Gln Arg 195 200 205 Trp Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Val Asp Pro Ser Gln Ser Ala Tyr 210 215 220 Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 12 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-Fc plasmid <400> 12 atggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaactcgag caccaccacc accaccactg a 711 <210> 13 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of wild type Fc <400> 13 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Leu Glu His His His His His His 225 230 235 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP-F primer <400> 14 gcttgatatc gaattcctgc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 15 taatacgact cactataggg 20 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18-F primer <400> 16 caaaatgctt tctatgaaat cttgnnkatg cctaacttga acgaag 46 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18-R primer <400> 17 cttcgttcaa gttaggcatm nncaagattt catagaaagc attttg 46 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23-F primer <400> 18 cttgaacatg cctaacttgn nkgaagaaca acgcaatggt ttc 43 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23-R primer <400> 19 gaaaccattg cgttgttctt cmnncaagtt aggcatgttc aag 43 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28-F primer <400> 20 gaacgaagaa caacgcnnkg gtttcatcca aagcttaaag 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28-R primer <400> 21 ctttaagctt tggatgaaac cmnngcgttg ttcttcgttc 40 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36-F primer <400> 22 ggtttcatcc aaagcttaaa gnnkgaccca agtcaaagtg ctaac 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36-R primer <400> 23 gttagcactt tgacttgggt cmnnctttaa gctttggatg aaacc 45 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 43-F primer <400> 24 atgacccaag tcaaagtgct nnkcttttag cagaagctaa aaag 44 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 43-R primer <400> 25 ctttttagct tctgctaaaa gmnnagcact ttgacttggg tcat 44 <210> 26 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 52-F primer <400> 26 cttttagcag aagctaaaaa gttannkgaa tctcaagcac cgaaacat 48 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 52-R primer <400> 27 atgtttcggt gcttgagatt cmnntaactt tttagcttct gctaaaag 48 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAF-F primer <400> 28 cggggtaccg ctgacaacaa tttcaacaaa g 31 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAF-R primer <400> 29 cggggtacct ttcggtgctt gagattcatt taac 34 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4mAF-F primer <400> 30 cgccatatgg ctgacaacaa tttcaacaaa g 31 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4mAF-R primer <400> 31 ccgctcgagt ttcggtgctt gagattcatt taac 34 <210> 32 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynuclotide sequence of 4mAF <400> 32 atggctgaca acaatttcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttgcacatg 60 cctaacttgc ttgaagaaca acgctggggt ttcatccaaa gcttaaaggt tgacccaagt 120 caaagtgctt accttttagc agaagctaaa aagttaagtg aatctcaagc accgaaaggt 180 accgctgaca acaatttcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttgcacatg 240 cctaacttgc ttgaagaaca acgctggggt ttcatccaaa gcttaaaggt tgacccaagt 300 caaagtgctt accttttagc agaagctaaa aagttaagtg aatctcaagc accgaaaggt 360 accgctgaca acaatttcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttgcacatg 420 cctaacttgc ttgaagaaca acgctggggt ttcatccaaa gcttaaaggt tgacccaagt 480 caaagtgctt accttttagc agaagctaaa aagttaagtg aatctcaagc accgaaaggt 540 accgctgaca acaatttcaa caaagaacaa caaaatgctt tctatgaaat cttgcacatg 600 cctaacttgc ttgaagaaca acgctggggt ttcatccaaa gcttaaaggt tgacccaagt 660 caaagtgctt accttttagc agaagctaaa aagttaagtg aatctcaagc accgaaa 717

Claims

서열번호 2로 정의된‘스타필로코쿠스 아우레우스(staphylococcus aureus) 유래 단백질 A의 A 도메인’단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 N18H, D36V, N43Y/L 및 N52S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 돌연변이를 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 23번째 및 28번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기 돌연변이를 추가로 포함하며,
상기 23번째 위치에서의 돌연변이는 N23T, N23A, N23E, N23H, N23K, N23L, N23P, N23S 및 N23Y로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 28번째 위치에서의 돌연변이는 N28W, N28G, N28R, N28F 및 N28I로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질.
삭제
제3항에 있어서, 상기 면역글로불린-결합 단백질은 서열번호 9로 정의된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질.
제1항에서 정의된 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체.
제6항에 있어서, 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체.
제1항의 면역글로불린-결합 단백질 또는 제6항의 다량체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제9항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제1항의 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스.
제1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제6항에 따른 다량체 또는 제11항에 따른 매트릭스가 사용되는 면역글로불린의 단리 방법.
제1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제6항에 따른 다량체 또는 제11항에 따른 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법.