KR102573370B1 - 신규한 알칼리 안정성 면역글로불린 결합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1I, 11A, 11E, 11I, 35R, 35I, 및 42L로 적어도 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 (Ig) 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 부가로 본 발명의 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 상기 Ig 결합 단백질 또는 친화도 매트릭스의 용도 및 본 발명의 Ig 결합 단백질을 이용하는 친화도 정제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 1I, 11A, 11E, 11I, 35R, 35I, 및 42L로 적어도 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하는 알칼리 안정성 (alkaline stable) 면역글로불린 (Ig) 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 부가로 본 발명의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 매트릭스 (affinity matrices)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 상기 Ig 결합 단백질 또는 친화도 매트릭스의 용도 및 본 발명의 Ig 결합 단백질을 이용하는 친화도 정제 방법에 관한 것이다.
많은 생물공학적 및 약학적 적용은 항체를 함유하는 시료로부터 오염물질의 제거를 필요로 한다. 항체의 포획 및 정제를 위해 수립된 절차는 면역글로불린에 대한 선택적 리간드로서 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 박테리아 세포 표면 단백질 A를 이용하는 친화도 크로마토그래피이다 (예를 들어, 리뷰 Huse et al., J. Biochem. Biophys. Methods 51, 2002: 217-231을 참조). 야생형 단백질 A는 높은 친화도 및 선택성으로 IgG 분자의 Fc 영역에 결합하며, 또한 고온 및 넓은 범위의 pH 값에서 안정하다. 알칼리 안정성과 같은 개선된 특성을 갖는 단백질 A의 변이체가 항체 정제를 위해 이용가능하며, 또한 단백질 A 리간드를 포함하는 다양한 크로마토그래피 매트릭스가 상업적으로 이용가능하다. 그러나, 구체적으로 야생형 단백질 A 기반 크로마토그래피 매트릭스는 알칼리 조건에 노출 후 면역글로불린에 대한 결합능의 소실을 보였다.
항체 또는 Fc-함유 융합 단백질에 대한 대부분의 대규모 제조 공정은 친화도 정제를 위해 단백질 A를 이용한다. 그러나, 친화도 크로마토그래피에서 단백질 A 적용의 한계로 인해, 면역글로불린의 친화도 정제를 용이하게 하기 위해 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 개선된 특성을 갖는 신규한 Ig 결합 단백질을 제공하는 것에 대한 필요성이 당 분야에 존재한다. Ig 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 가치를 최대한 활용하기 위해, 친화도 리간드 매트릭스를 다회 이용하는 것이 바람직하다. 크로마토그래피 사이클 간에, 매트릭스 상의 잔류 오염물질의 살균 및 제거를 위해 철저한 세정 절차가 요구된다. 상기 절차에서는, 친화도 리간드 매트릭스에 고농도의 NaOH를 갖는 알칼리 용액을 적용하는 것이 일반 관례이다. 야생형 단백질 A 도메인은 연장된 시간 동안 이러한 가혹한 알칼리 조건을 견디지 못하고, 면역글로불린에 대한 결합능을 빠르게 소실한다. 따라서, 면역글로불린에 결합할 수 있는 신규한 알칼리-안정한 단백질을 수득하는 것에 대한 필요성이 당 분야에 존재한다.
본 발명은 면역글로불린의 친화도 정제에 특히 매우 적합하고, 선행 기술의 단점을 극복하는 알칼리 안정성 면역글로불린 결합 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 상당한 장점은 모체 (parental) 단백질과 비교하여 높은 pH에서 이의 개선된 안정성에 있다.
상기 개요가 반드시 본 발명에 의해 해결되는 모든 문제를 개시하는 것은 아니다.
본 발명의 제1 양상은 친화도 정제에 적합한 Ig 결합 단백질을 제공하는데 있다. 이는 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하는 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질에 의해 달성되고, 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은, 위치 1 또는 이에 상응하는 위치에서 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 11 또는 이에 상응하는 위치에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 35 또는 이에 상응하는 위치에서 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 위치 42 또는 이에 상응하는 위치에서 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 치환을 갖는 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 모체 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 Ig 결합 단백질을 포함하고 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 서열번호: 52의 컨센서스 (consensus) 아미노산 서열을 포함한다.
제2 양상에서, 본 발명은 제1 양상의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스에 관한 것이다.
제3 양상에서, 본 발명은 면역글로불린의 Fc 부분을 포함하는 면역글로불린 또는 단백질의 친화도 정제를 위한 제1 양상의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질 또는 제2 양상의 친화도 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다.
제4 양상에서, 본 발명은 면역글로불린의 Fc 부분을 포함하는 면역글로불린 또는 단백질의 친화도 정제 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화도 분리 매트릭스에 커플링되는 제1 양상의 고정화된 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 액체와 상기 친화도 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 Ig 결합 단백질에 결합하는 것인 단계; 및 (d) 상기 면역글로불린을 상기 매트릭스로부터 용출시킴으로써, 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 요약은 반드시 본 발명의 모든 특징을 개시하는 것은 아니다. 다른 구체예는 뒤따르는 상세한 설명의 검토로부터 자명해질 것이다.
도 1. 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인의 아미노산 서열. 위치 1, 11, 35, 및 42는 회색으로 나타내었다. 상부 열의 숫자는 Ig 결합 도메인에서 상응하는 아미노산 위치를 나타낸다.
도 1A. 인공 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인의 아미노산 서열.
도 1B. 알칼리 안정성 인공 Ig 결합 도메인의 컨센서스 아미노산 서열 (서열번호: 52).
도 2. 모체 IB14의 점 돌연변이 변이체의 알칼리 안정성 분석. 위치 1, 11, 35, 또는 42에서 점 돌연변이를 갖는 변이체의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%)을 모체 IB14와 비교하였다.
도 3. 위치 1, 11, 및 35, 및 선택적으로 위치 28 및 42에서 치환을 갖는 모체 IB14의 상이한 변이체의 알칼리 안정성 분석. 위치 1, 11, 28, 35, 및/또는 42에서 치환들의 조합의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%) (검정색 막대)을 모체 IB14 (연회색 막대)와 비교하였다. cs14-1은 서열번호: 18 (1I/11A/35R)을 나타내고, cs14-2는 (1I/11A/35R/42L) 서열번호: 19를 나타내고, cs14-3은 서열번호: 20 (1I/11A/28N/35R/42L)을 나타낸다.
도 4. 위치 1, 11, 및 35, 및 선택적으로 42에서 3 또는 4개의 치환들의 조합을 갖는 모체 IB27의 상이한 변이체의 알칼리 안정성 분석. 변이체 Ig 결합 단백질의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%) (검정색 막대)을 모체 IB27 (연회색 막대)과 비교하였다. cs27-1은 서열번호: 29 (1I/11A/35R)를 나타내고, cs27-2는 서열번호: 30 (1I/11A/35R/42L)을 나타낸다.
도 5. 알칼리 처리 후에 Ig 결합 도메인의 Ig 결합 활성.
6시간의 0.5 M NaOH 처리 후에 에폭시 수지 상에서 상이한 Ig 결합 도메인의 알칼리 안정성 분석. 1I, 11A, 35R, 및 42L을 갖는 Ig 결합 도메인을 나타내었다. 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인: cs14-3 (서열번호: 20), cs74h1 (서열번호: 42), cs74h2 (서열번호: 43), cs47h3 (서열번호: 44), 및 cs47h4 (서열번호: 45), cs25-2 (서열번호: 26); 모체 도메인: IB14.
도 1A. 인공 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인의 아미노산 서열.
도 1B. 알칼리 안정성 인공 Ig 결합 도메인의 컨센서스 아미노산 서열 (서열번호: 52).
도 2. 모체 IB14의 점 돌연변이 변이체의 알칼리 안정성 분석. 위치 1, 11, 35, 또는 42에서 점 돌연변이를 갖는 변이체의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%)을 모체 IB14와 비교하였다.
도 3. 위치 1, 11, 및 35, 및 선택적으로 위치 28 및 42에서 치환을 갖는 모체 IB14의 상이한 변이체의 알칼리 안정성 분석. 위치 1, 11, 28, 35, 및/또는 42에서 치환들의 조합의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%) (검정색 막대)을 모체 IB14 (연회색 막대)와 비교하였다. cs14-1은 서열번호: 18 (1I/11A/35R)을 나타내고, cs14-2는 (1I/11A/35R/42L) 서열번호: 19를 나타내고, cs14-3은 서열번호: 20 (1I/11A/28N/35R/42L)을 나타낸다.
도 4. 위치 1, 11, 및 35, 및 선택적으로 42에서 3 또는 4개의 치환들의 조합을 갖는 모체 IB27의 상이한 변이체의 알칼리 안정성 분석. 변이체 Ig 결합 단백질의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%) (검정색 막대)을 모체 IB27 (연회색 막대)과 비교하였다. cs27-1은 서열번호: 29 (1I/11A/35R)를 나타내고, cs27-2는 서열번호: 30 (1I/11A/35R/42L)을 나타낸다.
도 5. 알칼리 처리 후에 Ig 결합 도메인의 Ig 결합 활성.
6시간의 0.5 M NaOH 처리 후에 에폭시 수지 상에서 상이한 Ig 결합 도메인의 알칼리 안정성 분석. 1I, 11A, 35R, 및 42L을 갖는 Ig 결합 도메인을 나타내었다. 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인: cs14-3 (서열번호: 20), cs74h1 (서열번호: 42), cs74h2 (서열번호: 43), cs47h3 (서열번호: 44), 및 cs47h4 (서열번호: 45), cs25-2 (서열번호: 26); 모체 도메인: IB14.
정의
본 발명을 아래에서 상세히 개시하기 전에, 본 발명은 본원에 개시된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약이 변동될 수 있으므로 이에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 목적을 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니며, 본 발명은 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게, 본원에서 사용되는 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에서 제공되는 정의와 일치한다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위에 걸쳐, 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다 (comprise)", 및 "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"과 같은 변형은 명시된 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 시사하지만 임의의 다른 부재, 정수 또는 단계 또는 부재들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 시사하지 않음을 이해할 것이다.
본 발명의 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 상호교환 가능하게 사용되고 또한 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 각 의미내에서 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 사용되는, "및/또는"은 열거된 항목들 중 어느 것 및 이의 하나 이상의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석될 때는 조합의 결여를 나타내고 및 이를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시적으로 인용된 양뿐만 아니라 이로부터 ±10%의 편차를 포괄한다. 더 바람직하게는, 편차 5%가 상기 용어 "약"에 의해 포괄된다.
몇몇 문헌 (예를 들어: 특허, 특허 출원, 과학 문헌, 제조자의 사양, 지침, GenBank 접근 번호 서열 제출 등)은 본 명세서의 텍스트를 통해 인용된다. 본원에서 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시내용보다 선행하는 것으로 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 일부 문헌은 "참조로 포함"되는 것을 특징으로 한다. 이러한 포함된 참고문헌의 정의 또는 교시와, 본 명세서에서 인용되는 정의 또는 교시 사이에서 상충 시에는 본 명세서의 기재가 우선한다.
본원에서 언급되는 모든 서열은 그 전체 내용 및 개시내용과 함께, 본 명세서의 일부인 첨부되는 서열 목록에 개시되어 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "면역글로불린-결합 단백질" 또는 "Ig 결합 단백질" 또는 "면역글로불린 (Ig) 결합 단백질"은 면역글로불린의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 설명하기 위해 사용된다. Fc 영역에 이러한 특이적 결합으로 인해, 본 발명의 "Ig 결합 단백질"은 전체 면역글로불린, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘쥬게이트 (conjugates)에 결합할 수 있다. 본원에서 본 발명의 Ig 결합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역에 대해 특이적 결합을 나타내지만, Ig 결합 단백질이 면역글로불린의 다른 영역, 예컨대 Fab 영역에 대해 감소된 친화도로 추가 결합할 수 있음이 배제되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인을 포함한다.
용어 "해리 상수" 또는 "KD"는 특정 결합 친화도를 정의한다. 본원에서 사용되는, 용어 "KD" (보통 "mol/L"로 측정되며, 때때로 "M"으로 약칭됨)는 제1 단백질과 제2 단백질 사이의 특정한 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내려는 것이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 KD는 특히 Ig 결합 단백질과 면역글로불린 사이의 결합 친화도를 설명하기 위해 사용된다.
본 발명의 Ig 결합 단백질은 면역글로불린에 결합하는 것으로 간주되고, 이는 적어도 1 μM 또는 미만, 또는 바람직하게는 100 nM 또는 미만, 더 바람직하게는 50 nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 10 nM 또는 미만의 면역글로불린에 대한 해리 상수 KD를 갖는다.
본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"은 본 발명의 Ig 결합 단백질이 다른 비-면역글로불린 표적에 대한 결합과 비교하여 특이적으로 면역글로불린에 대해 더 강력하게 결합하는 것을 의미한다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되는 4개의-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 포함한다. 부가로, 또한 그의 단편 또는 변이체가 상기 용어 "면역글로불린"에 포함된다. 본원에서 Ig 단편은 온전하거나 또는 전체 Ig보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 용어는 또한 키메라 (인간 불변 도메인, 비-인간 가변 도메인), 단일쇄 및 인간화된 (비-인간 CDR을 제외한 인간 항체) 면역글로불린과 같은 구체예를 포함한다.
본원에서 이해되는 "면역글로불린"은, 이에 반드시 한정되는 것은 아니지만, 포유동물 IgG, 예컨대 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2A, 마우스 IgG2 IgG1, 래트 IgG2C, 염소 IgG1, 염소 IgG2, 소 IgG2, 기니아 피그 IgG, 토끼 IgG; 인간 IgM, 인간 IgA; 및 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘쥬게이트를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 자연 발생하는 단백질 A 도메인 및 인공 Ig 결합 단백질은 인간 IgG3에 결합하지 않는다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결되는 2개 이상의 아미노산의 임의의 선형 분자 사슬을 나타내며, 특정 길이의 산물을 나타내는 것은 아니다. 따라서, "펩티드", "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 나타내기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이러한 용어 대신에 또는 이와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 단백질분해 절단, 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형 및 당 분야에 잘-알려져 있는 유사한 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 번역-후 변형의 산물을 나타내려는 것이다. 따라서, 2개 이상의 단백질 도메인을 포함하는 Ig 결합 단백질도 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"의 정의 하에 속한다.
용어 "알칼리 안정한" 또는 "알칼리 안정성" 또는 "부식 안정한" 또는 "부식 안정성" (본원에서 "cs"로 약칭함)은 면역글로불린에 결합하는 능력을 유의하게 소실하지 않고 알칼리 조건을 견디는 본 발명의 Ig 결합 단백질의 능력을 나타낸다. 당분야의 숙련자는 Ig 결합 단백질을, 예컨대 실시예에 기재된 바와 같이 나트륨 히드록시드 용액과 인큐베이트한 후, 후속하여 당분야 숙련자에게 알려져 있는 일상적 실험 예를 들어, 크로마토그래피 접근법에 의해 면역글로불린에 대한 결합 활성을 시험하여 알칼리 안정성을 용이하게 시험할 수 있다.
본 발명의 Ig 결합 단백질뿐만 아니라 본 발명의 Ig 결합 단백질을 포함하는 매트릭스는 "증가된" 또는 "개선된" 알칼리 안정성을 나타내며, 이는 상기 Ig 결합 단백질을 포함하는 분자 및 매트릭스가 모체 단백질에 대해 연장된 기간 동안 알칼리 조건하에 안정하다는, 즉 면역글로불린에 결합하는 능력을 소실하지 않거나 또는 면역글로불린에 결합하는 능력을 모체 단백질보다 더 적은 정도로 소실함을 의미한다.
용어 "결합 활성"은 면역글로불린에 결합하는 본 발명의 Ig 결합 단백질의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 상기 결합 활성은 알칼리 처리 이전 및/또는 이후에 결정될 수 있다. 상기 결합 활성은 Ig 결합 단백질에 대해 또는 매트릭스에 커플링되는 Ig 결합 단백질에 대해, 즉 고정화된 결합 단백질에 대해 결정될 수 있다. 용어 "인공"은 자연 발생하지 않는 대상을 나타내며, 즉 상기 용어는 인간에 의해 생산 또는 변형되어진 대상을 나타낸다. 예를 들어, 인간에 의해 생성되어진 (예컨대 예를 들어 실험실에서 유전자 조작, 셔플링 방법, 또는 화학적 반응 등에 의함) 또는 의도적으로 변형시킨 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 인공이다.
본원에서 사용되는 용어 "모체 단백질" 또는 "모체 도메인"에서 용어 "모체"는 상기 모체 단백질 또는 도메인의 변이체를 생성하기 위해 후속적으로 변형되는 Ig 결합 단백질을 나타낸다. 상기 모체 단백질 또는 도메인은 인공 도메인 (예를 들어, 서열번호: 3, 4, 10, 14, 21, 25, 47, 48, 49, 50, 이에 한정되지 않음), 자연 발생하는 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A 도메인, 또는 자연 발생하는 스타필로 코쿠스 아우레우스 단백질 A 도메인의 변이체 또는 조작된 버젼일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체" 또는 "변이체 Ig 결합 도메인" 또는 "Ig 결합 도메인 변이체" 또는 "Ig 결합 단백질 변이체"는 모체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환에 의해 Ig 결합 단백질 또는 도메인의 아미노산 서열이 모체 단백질 또는 도메인 아미노산 서열과 다른 것을 포함한다. 또한, 이는 하나 이상의 변형에 의해 모체 분자와는 다른 인공 분자를 나타낸다. 상기 변형은 인간에 의해 수행되는 유전자 조작 또는 화학 합성 또는 화학 반응에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 도메인 Z는 자연 발생하는 단백질 A 도메인 B의 변이체이다. 예를 들어, 서열번호: 30은 모체 단백질 IB27의 변이체이다.
본원에서 사용되는 용어 "콘쥬게이트"는 다른 물질, 예컨대 제2 단백질 또는 비-단백질성 모이어티에 대해 화학적으로 부착되는 제1 단백질을 적어도 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되는 분자에 관한 것이다.
용어 "변형" 또는 "아미노산 변형"은 모체 폴리펩티드 서열 중에 특정 위치에서 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환, 결실, 또는 삽입을 나타낸다. 알려져 있는 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 상기 아미노산 변이체를 코딩하는 DNAs를 용이하게 제작할 수 있다.
용어 "치환" 또는 "아미노산 치환"은 모체 폴리펩티드 서열 중에 특정 위치에서 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환을 나타낸다. 예를 들어, 치환 S11A는, 위치 11에서 세린이 알라닌으로 대체된 변이체 Ig 결합 단백질을 나타낸다. 앞의 예에서, 11A는 위치 11에서 알라닌을 나타낸다. 본원의 목적을 위해, 다수의 치환은 통상적으로 슬래시로 분리된다. 예를 들어, A1I/S11A/K35R은 치환 A1I, S11A, 및 K35R의 조합을 포함하는 변이체를 나타낸다.
용어 "결실" 또는 "아미노산 결실"은 모체 폴리펩티드 서열 중에 특정 위치에서 아미노산의 제거를 나타낸다.
용어 "삽입" 또는 "아미노산 삽입"은 모체 폴리펩티드 서열로 아미노산의 부가를 나타낸다.
본 명세서를 통해, 도 1의 아미노산 잔기 위치 번호부여 규칙이 사용되고, 및 위치 번호는 예를 들어 서열번호: 1-8에 상응하게 지정된다.
용어 "아미노산 서열 동일성"은 2개 이상의 단백질 중의 아미노산 서열의 동일성 (또는 차이)의 정량적 비교를 나타낸다. 기준 폴리펩티드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)" 또는 "동일한 백분율" 또는 "동일성 백분율"은, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입한 후에, 기준 폴리펩티드 서열 중에 아미노산 잔기와 동일한 서열 중에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
서열 동일성을 결정하기 위해, 쿼리 (query) 단백질의 서열은 기준 단백질의 서열에 대해 정렬된다. 정렬 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열에 대해 임의의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성 정도를 결정하기 위해, 자유롭게 이용 가능한 SIM Local 유사성 프로그램이 바람직하게 채택된다 (Xiaoquin Huang and Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357) (또한, http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html 참조). 다중 정렬 분석을 위해 ClustalW가 바람직하게 이용된다 (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680). 바람직하게는, 서열 동일성 백분율을 계산할 때, SIM Local 유사성 프로그램 또는 ClustalW의 디폴트 파라미터 (default parameters)가 이용된다.
본 발명의 맥락에서, 명시적으로 달리 언급하지 않는 한, 변형된 서열과, 이것이 유도되는 서열 사이의 서열 동일성 정도는 일반적으로 변형되지 않은 서열의 전체 길이에 대해 계산된다.
주어진 위치에서 기준 아미노산 서열과 상이한 쿼리 서열의 각각의 아미노산은 하나의 차이로 카운팅된다. 그 다음에 차이의 합은 기준 서열의 길이와 관련되어 비-동일성 백분율을 산출한다. 정량적인 동일성 백분율은 100 마이너스 비-동일성의 백분율로 계산된다.
본원에서 사용되는, 2개의 폴리펩티드 서열과 관련하여, 문구 "동일한 백분율" 또는 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)" 또는 "동일성 백분율"은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정할 때, 최대 상응성에 대해 비교 및 정렬할 때, 일부 구체예에서 적어도 89.5%, 일부 구체예에서 적어도 91%, 일부 구체예에서 적어도 93%, 일부 구체예에서 적어도 94%, 일부 구체예에서 적어도 96%, 일부 구체예에서 적어도 98%, 및 일부 구체예에서 100%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 상기 동일성 백분율은 일부 구체예에서 적어도 약 50개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 51개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 52개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 53개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 54개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 55개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 56개 잔기의 영역에 대해, 일부 구체예에서 적어도 약 57개 잔기의 영역에 대해, 및 일부 구체예에서 적어도 약 58개 잔기의 영역에 대해 존재한다. 일부 구체예에서, 동일성 백분율은 상기 서열의 전체 길이에 대해 존재한다.
용어 "융합된"은 성분들이 직접 또는 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
용어 "융합 단백질"은 적어도 제2 단백질에 유전적으로 결합된 적어도 제1 단백질을 포함하는 단백질과 관련이 있다. 융합 단백질은 원래 개별의 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자의 결합을 통해 형성된다. 따라서, 융합 단백질은 하나의, 선형 폴리펩티드로 발현되는 동일하거나 또는 상이한 단백질의 다량체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "링커"는 그의 가장 넓은 의미로 적어도 2개의 다른 분자를 공유결합으로 결합하는 분자를 나타낸다. 본 발명의 통상적인 구체예에서, "링커"는 Ig 결합 도메인을 적어도 하나의 부가의 Ig 결합 도메인과 연결하는 모이어티, 즉 2개의 단백질 도메인을 서로 연결하여 다량체를 생성하는 모이어티로 이해되어야 한다. 바람직한 구체예에서, 상기 "링커"는 펩티드 링커이고, 즉 2개의 단백질 도메인을 연결하는 모이어티는 하나의 단일 아미노산 또는 둘 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
용어 "크로마토그래피"는 시료 중에 분자들 중 하나의 타입 (예컨대, 면역글로불린)을 다른 분자 (예컨대 오염물질)로부터 분리하기 위해 이동상 및 정지상을 채택하는 분리 기술을 나타낸다. 액체 이동상은 분자들의 혼합물을 함유하며 정지상 (예컨대 고체 매트릭스)에 걸쳐 또는 이를 통해 이들을 수송한다. 이동상 중에 상이한 분자들과 정지상의 차별적 상호작용으로 인해, 이동상 중에 분자가 분리될 수 있다.
용어 "친화도 크로마토그래피"는 정지상에 커플링된 리간드가 이동상 (시료) 중에 분자 (즉, 면역글로불린)와 상호작용하는, 즉 리간드가 정제될 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 특이적 방식의 크로마토그래피를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 이해되는 바와 같이, 친화도 크로마토그래피는 크로마토그래피 리간드, 예컨대 본 발명의 Ig 결합 단백질을 포함하는 정지상에 면역글로불린을 함유하는 시료를 부가하는 것을 포함한다.
용어 "고체 지지체" 또는 "고체 매트릭스"는 정지상에 대해 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "친화도 매트릭스" 또는 "친화도 분리 매트릭스" 또는 "친화도 크로마토그래피 매트릭스"는 친화도 리간드 예컨대, 본 발명의 Ig 결합 단백질이 부착되는 매트릭스, 예컨대 크로마토그래피 매트릭스를 나타낸다. 리간드 (예컨대, Ig 결합 단백질)는 혼합물로부터 정제되거나 또는 제거될 관심 분자 (예컨대, 상기에 정의되는 바와 같은 면역글로불린)에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도 정제"는 매트릭스에 고정화되는 Ig 결합 단백질에 상기에서 정의되는 바와 같은 면역글로불린을 결합시켜서 액체로부터 상기에서 정의되는 바와 같은 면역글로불린을 정제하는 방법을 나타낸다. 이에 의해, 면역글로불린 이외의 혼합물 중의 다른 모든 성분이 제거된다. 부가의 단계에서, 결합된 면역글로불린은 정제된 형태로 용출될 수 있다.
발명의
구체예
본 발명은 이후에 더 개시될 것이다. 하기 단락에서, 본 발명의 다양한 양상들이 보다 상세히 정의된다. 명확하게 반대로 나타내지 않는 한, 하기에 정의된 각각의 양상은 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 구체적으로, 바람직하거나 또는 유리한 것으로 시사되는 임의의 특징은 바람직하거나 또는 유리한 것으로 시사되는 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
제1 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 (Ig) 결합 단백질에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은, 위치 1에서 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 11에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 35에서 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 위치 42에서 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 갖는 모체 아미노산 서열의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 하나의 변이체 Ig 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 변형을 더 포함하고, 각 개별 변형은 단일 아미노산 치환, 단일 아미노산 결실, 단일 아미노산 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
변이체 Ig 결합 단백질의 장점은 이들이 알칼리 조건하에 연장된 기간 동안 안정하다는 것이다. 이러한 특징은 높은 NaOH 농도를 갖는 알칼리 용액을 사용하는 세정 절차를 갖는 크로마토그래피 접근법에서 중요하고, 이는 매트릭스 상의 오염물질을 제거하여 예를 들어 상기 매트릭스를 수회 사용할 수 있다. 상기 변이체 Ig 결합 단백질은 모체 폴리펩티드와 비교하여 알칼리 처리 후에 더 안정하다. 상기에서 정의되는 바와 같이 모체 단백질 중에 위치 1, 11, 35, 및/또는 42에서의 치환은 상기 모체 단백질과 비교하여, 면역글로불린-결합 특성을 손상시키지 않고, 개선된 알칼리 안정성을 제공한다.
모체 서열번호: 1. 일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 결합 단백질은 (i) 서열번호: 1의 아미노산 서열의 변이체 또는 (ii) 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열의 변이체의 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함한다. 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 1의 위치 1에서 이소류신으로의 아미노산 치환, 서열번호: 1의 위치 11에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 서열번호: 1의 위치 35에서 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 서열번호: 1의 위치 42에서 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 치환을 갖는다. 상기 변이체 Ig 결합 단백질은 부가의 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 치환 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6개의 결실을 포함할 수 있다.
서열번호: 1에 개시되는 Ig 결합 도메인은 모체 도메인이고; 적어도 위치 1, 11, 35, 및/또는 42에서 치환을 갖는 Ig 결합 도메인은 서열번호: 1의 변이체이다.
서열번호: 1은 본 발명의 변이체에 대한 모체 도메인, 바람직하게는 (i) 서열번호: 3, 4, 10, 14, 21, 25, 47, 48, 49, 50을 포함하는 인공 Ig 결합 도메인; (ii) 서열번호: 5-8을 포함하는 자연 발생하는 단백질 A 도메인 또는 변이체를 포함하는 컨센서스 서열이다. 상기 서열번호: 1의 모체 단백질은 하기 아미노산 서열이다:
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54X55APX58 상기에서 위치 1에서 아미노산 (X1)은 P, N, A, V, 또는 Q로부터 선택되고, 위치 2에서 아미노산 (X2)은 A, D, 또는 Q로부터 선택되고, 위치 3에서 아미노산 (X3)은 A, N, 또는 S, 바람직하게는 A 또는 N으로부터 선택되고, 위치 4에서 아미노산 (X4) X4은 K 또는 N, 바람직하게는 K로부터 선택되고, 위치 5에서 아미노산 (X5)은 H 또는 F로부터 선택되고, 위치 6에서 아미노산 (X6)은 D, N, A, 또는 S, 바람직하게는 D 또는 N으로부터 선택되고, 위치 7에서 아미노산 (X7)은 K 또는 E로부터 선택되고, 위치 8에서 아미노산 (X8)은 D, A, 또는 E로부터 선택되고, 위치 11에서 아미노산 (X11)은 S 또는 N으로부터 선택되고, 위치 15에서 아미노산 (X15)은 E 또는 Q로부터 선택되고, 위치 16에서 아미노산 (X16)은 I 또는 V로부터 선택되고, 위치 18에서 아미노산 (X18)은 H 또는 N으로부터 선택되고, 위치 19에서 아미노산 (X19) X19은 L 또는 M으로부터 선택되고, 위치 21에서 아미노산 (X21)은 N, S, 또는 D, 바람직하게는 N으로부터 선택되고, 위치 23에서 아미노산 (X23)은 T 또는 N으로부터 선택되고, 위치 24에서 아미노산 (X24)은 E 또는 A로부터 선택되고, 위치 25에서 아미노산 (X25)은 D 또는 E로부터 선택되고, 위치 28에서 아미노산 (X28)은 S, N, 또는 A, 바람직하게는 N 또는 S로부터 선택되고, 위치 29에서 아미노산 (X29)은 A 또는 G로부터 선택되고, 위치 40에서 아미노산 (X40)은 V, Q, 또는 T, 바람직하게는 V 또는 Q로부터 선택되고, 위치 42에서 아미노산 (X42)은 K, A, 또는 T로부터 선택되고, 위치 43에서 아미노산 (X43)은 E, N 또는 S, 바람직하게는 E 또는 N으로부터 선택되고, 위치 44에서 아미노산 (X44)은 I, V, 또는 L로부터 선택되고, 위치 46에서 아미노산 (X46)은 G 또는 A로부터 선택되고, 위치 49에서 아미노산 (X49)은 K 또는 Q로부터 선택되고, 위치 52에서 아미노산 (X52)은 N, D, 또는 S, 바람직하게는 N으로부터 선택되고, 위치 53에서 아미노산 (X53)은 D 또는 E로부터 선택되고, 위치 54에서 아미노산 (X54)은 A 또는 S로부터 선택되고, 및 위치 58에서 아미노산 (X58)은 P 또는 K로부터 선택된다.
모체 서열번호: 5- 8. 제1 양상의 일 구체예에서, 모체 도메인은 서열번호: 5-8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 5-8의 아미노산 서열에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 상기 Ig 결합 도메인은 위치 1에서 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 11에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 35에서 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 위치 42에서 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 변형을 더 포함하고, 각 개별의 변형은 단일 아미노산 치환, 단일 아미노산 결실, 단일 아미노산 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
모체 서열번호: 2. 제1 양상의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 서열번호: 2의 모체 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 서열번호: 2의 위치 1에서 이소류신으로의 아미노산 치환, 서열번호: 2의 위치 11에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 서열번호: 2의 위치 35에서 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 서열번호: 2의 위치 42에서 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 변형을 더 포함하고, 상기 각 개별의 변형은 단일 아미노산 치환, 단일 아미노산 결실, 단일 아미노산 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
서열번호: 2는 바람직한 모체 단백질 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 인공 Ig 결합 도메인 IB14, IB25, IB27, IB74, 및 IB47에 대한 컨센서스 서열이다. 바람직하게, 본 발명은 Ig 결합 단백질에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 모체 서열번호: 2의 아미노산 서열의 변이체, 또는 모체 서열번호: 2에 대해 적어도 89.5 % 동일성을 갖는 아미노산 서열의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 서열번호: 2는 서열번호: 1의 바람직한 일 구체예이다: X1AAX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRX28AFIQSLKDDPSVSKEX44LX46EAX49KLNDX54QAPX58 상기에서 위치 1에서 아미노산 (X1)은 P, N, 또는 A로부터 선택되고, 위치 5에서 아미노산 (X5)은 H 또는 F로부터 선택되고, 위치 7에서 아미노산 (X7)은 K 또는 E로부터 선택되고, 위치 8에서 아미노산 (X8)은 D, A, 또는 E로부터 선택되고, 위치 11에서 아미노산 (X11)은 S 또는 N, 바람직하게는 S로부터 선택되고, 위치 25에서 아미노산 (X25)은 D 또는 E로부터 선택되고, 위치 28에서 아미노산 (X28)은 S 또는 N, 바람직하게는 N으로부터 선택되고, 위치 44에서 아미노산 (X44)은 I 또는 V로부터 선택되고, 위치 46에서 아미노산 (X46)은 G 또는 A로부터 선택되고, 위치 49에서 아미노산 (X49)은 K 또는 Q로부터 선택되고, 위치 54에서 아미노산 (X54)은 A 또는 S로부터 선택되고, 및 위치 58에서 아미노산 (X58)은 P 또는 K로부터 선택된다.
예시되는 모체 단백질. 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 3, 4, 10, 14, 21, 25, 47-50으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 모체 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 위치 1에서 알라닌 또는 프롤린의 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 11에서 세린의 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 위치 35에서 리신의 아르기닌 또는 이소류신으로의 아미노산 치환, 및 위치 42에서 리신의 류신으로의 아미노산 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는다.
모체 단백질로서의 IB14. 제1 양상의 바람직한 일 구체예에서, 모체 단백질은 서열번호: 3의 아미노산 서열, 또는 모체 서열번호: 3에 대해 적어도 89.5 % 동일성을 갖는 단백질이다. 서열번호: 3에 대해 적어도 89.5 % 동일성을 갖는 모체 단백질에 대한 예로는 서열번호: 21 (1P/28N), 서열번호: 10 (1A/28S), 서열번호: 14 (1P/28S), 서열번호: 25 (46A/58K), 서열번호: 47 (5F/7E/8A), 서열번호: 48 (5F/7E/8A/25E), 서열번호: 49 (44V/49Q/54S/58K), 서열번호: 50 (25E/44V/49Q/54S/58K), IB13 (1P/4Q/28S), IB23 (1P/21S/28A/40T/43S), IB15 (2D/3N/5F/7E/8A/28A), 및 IB16 (2D/3S/5F/7E/8A/28A)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
모체 단백질로서의 IB27. 제1 양상의 다른 바람직한 구체예에서, 모체 단백질은 서열번호: 4, 또는 모체 서열번호: 4에 대해 적어도 89.5% 동일성을 갖는 단백질이다. 적어도 89.5 % 동일성을 갖는 모체 단백질에 대한 예로는 서열번호: 50 (5H/7K/8D), 서열번호: 49 (5H/7K/8D/25D); 서열번호: 48 (44I/49K/54A/58P), 및 서열번호: 47 (25D/44I/49K/54A/58P)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
더 바람직한 모체 도메인 . 제1 양상의 일 구체예에서, 모체 단백질은 서열번호: 25의 아미노산 서열이다. 제1 양상의 다른 구체예에서, 모체 단백질은 서열번호: 50 또는 서열번호: 49의 아미노산 서열이다. 제1 양상의 다른 구체예에서, 모체 단백질은 서열번호: 48 또는 서열번호: 47의 아미노산 서열이다.
알칼리 안정성 단백질에서 바람직한 아미노산 위치. 일부 구체예에서, 변이체 Ig 결합 단백질의 Ig 결합 도메인은 치환 또는 복수의 치환을 포함한다.
위치 1에서 이소류신 (I)으로의 치환은 유일한 치환일 수 있고 (예를 들어, 서열번호: 9) 또는 Ig 결합 도메인은 부가의 돌연변이, 예컨대 모체 단백질 중에 위치 11 및/또는 35 및/또는 42에서 적어도 치환을 포함할 수 있다. 상기 알칼리 안정성 단백질의 위치 1에서 아미노산은 트레오닌 (T)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 1에서 아미노산은 이소류신 (I) 또는 알라닌 (A)인 것이 바람직하다.
위치 11에서 알라닌 (A), 글루탐산 (E), 또는 이소류신 (I)으로의 치환은 유일한 치환일 수 있고 (예를 들어, 서열번호: 11-13) 또는 Ig 결합 도메인은 부가의 돌연변이, 바람직하게는 위치 1 및/또는 35 및/또는 42에서 적어도 치환을 포함할 수 있다. 위치 11에서 아미노산은 아스파라긴 (N) 또는 리신 (K)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 11에서 아미노산은 알라닌 (A), 이소류신 (I), 글루탐산 (E), 히스티딘 (H) 또는 프롤린 (P), 더 바람직하게는 A, I, 또는 E, 가장 바람직하게는 A인 것이 바람직하다.
위치 35에서 아르기닌 (R) 또는 이소류신 (I)으로의 치환은 유일한 치환일 수 있고 (예를 들어, 서열번호: 15-16) 또는 Ig 결합 도메인은 부가의 돌연변이, 바람직하게는 위치 1 및/또는 11 및/또는 42에서 적어도 치환을 포함할 수 있다. 위치 35에서 아미노산은 프롤린 (P), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 트립토판 (W), 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 또는 메티오닌 (M)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 35에서 아미노산은 R 또는 I인 것이 바람직하다.
위치 42에서 류신 (L)으로의 치환은 유일한 치환일 수 있고 (예를 들어, 서열번호: 17) 또는 Ig 결합 도메인은 부가의 돌연변이, 바람직하게는 위치 1 및/또는 11 및/또는 35에서 적어도 치환을 포함할 수 있다. 위치 42에서 아미노산은 티로신 (Y)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 42에서 아미노산은 L인 것이 바람직하다.
Ig 결합 도메인에서 아미노산들의 바람직한 조합. 놀랍게도, 위치 1, 11, 및 35, 및 선택적으로 위치 1, 11, 35, 42 및 선택적으로 위치 1, 11, 28, 35, 및 42에서 아미노산들의 특정 조합은, 도면 및 실시예에서 개시되는 바와 같이, 모체 도메인과 비교하여 변이체 Ig 결합 도메인의 알칼리 안정성을 증가시킨다. 위치 1, 11, 35, 42에서 치환뿐만 아니라, 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인은 부가의 1, 2, 또는 3개의 변형, 예컨대 치환, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 모체 서열과 비교하여 치환 또는 치환들을 포함하고 및 상기 치환 또는 복수의 치환들은: 1I; 11A; 35R; 42L; 11E; 11I; 35I; 1I/11A; 1I/35R; 11A/35R; 1I/42L; 11A/42L; 1I/11E; 1I/11I; 11I/35R; 11E/35R; 11I/42L; 11E/42L; 1I/35I; 11A/35I; 11I/35I; 11E/35I; 35R/42L; 35I/42L; 1I/11A/35R; 1I/11E/35R; 1I/11I/35R; 1I/11A/42L; 1I/11E/42L; 1I/11I/42L; 1I/11A/35I; 1I/11E/35I; 1I/11I/35I; 1I/35R/42L; 1I/35I/42L; 11I/35R/42L; 11I/35I/42L; 11A/35R/42L; 11A/35I/42L; 11E/35R/42L; 11E/35I/42L; 1I/11A/35R/42L; 1I/11E/35R/42L; 1I/11I/35R/42L; 1I/11A/35I/42L; 1I/11E/35I/42L; 1I/11I/35I/42L; 1I/11A/28N/35R/42L; 1I/11E/28N/35R/42L; 1I/11I/28N/35R/42L; 1I/11A/28N/35I,42L; 1I/11I/28N/35I/42L; 및 1I/11E/28N/35I/42L로 구성된 그룹으로부터 적어도 선택된다. 1I; 11A; 35R; 42L; 1I/11A; 1I/35R; 1I/42L; 11A/42L; 11A/35R; 35R/42L; 1I/11A/35R; 1I/11A/42L; 1I/11A/35R/42L; 및 1I/11A/28N/35R/42L로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환이 바람직하다. 일부 구체예에서, 아미노산 위치들 중 3 또는 4개는 1I, 11A, 35R, 및 42L로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, Ig 결합 도메인은 1I/11A/35R; 1I/11A/35R/42L; 및 1I/11A/28N/35R/42L로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환의 조합을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되고, 상기 위치 1에서 아미노산 잔기는 이소류신이고, 및 상기 위치 11에서 아미노산 잔기는 알라닌이다. 본 발명의 다른 바람직한 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되고, 상기 위치 1에서 아미노산 잔기는 이소류신이고, 및 상기 위치 11에서 아미노산 잔기는 알라닌이고, 및 상기 위치 35에서 아미노산 잔기는 아르기닌이다. 본 발명의 다른 바람직한 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되고, 상기 위치 1에서 아미노산 잔기는 이소류신이고, 및 상기 위치 11에서 아미노산 잔기는 알라닌이고, 및 상기 위치 35에서 아미노산 잔기는 아르기닌이고, 및 상기 위치 42에서 아미노산 잔기는 류신이다. 본 발명의 다른 바람직한 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되고, 상기 위치 1에서 아미노산 잔기는 이소류신이고, 및 상기 위치 11에서 아미노산 잔기는 알라닌이고, 및 상기 위치 35에서 아미노산 잔기는 아르기닌이고, 및 상기 위치 42에서 아미노산 잔기는 류신이고, 및 상기 위치 28에서 아미노산 잔기는 아스파라긴이다. 본 발명의 다른 바람직한 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되고, 상기 위치 11에서 아미노산 잔기는 알라닌이고, 및 상기 위치 35에서 아미노산 잔기는 아르기닌이고, 및 상기 위치 42에서 아미노산 잔기는 류신이다.
알칼리 안정성 단백질의 서열. 본 발명의 Ig 결합 단백질은 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Ig 결합 도메인은 서열번호: 52에 대해 적어도 89.5 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호: 52는 바람직한 인공 Ig 결합 단백질 가령 예를 들어, 서열번호: 18-20, 26, 29-30, 42-45, 56-61의 Ig 결합 도메인에 대한 컨센서스 서열이다. 서열번호: 52는 하기 아미노산 서열이다 (도 1B 참조):
IAAKX5DX7X8QQAAFYEILHLPNLTEX25QRX28AFIQSLRDDPSVSX42EX44LX46EAX49KLNDX54QAPX58 상기에서 위치 5에서 아미노산 (X5)은 H 또는 F로부터 선택되고, 위치 7에서 아미노산 (X7)은 K 또는 E로부터 선택되고, 위치 8에서 아미노산 (X8)은 D, A, 또는 E로부터 선택되고, 위치 25에서 아미노산 (X25)은 D 또는 E로부터 선택되고, 위치 28에서 아미노산 (X28)은 S 또는 N으로부터 선택되고, 위치 42에서 아미노산 (X42)은 L 또는 K, 바람직하게는 L로부터 선택되고, 위치 44에서 아미노산 (X44)은 I 또는 V로부터 선택되고, 위치 46에서 아미노산 (X46)은 G 또는 A로부터 선택되고, 위치 49에서 아미노산 (X49)은 K 또는 Q로부터 선택되고, 위치 54에서 아미노산 (X54)은 A 또는 S로부터 선택되고, 및 위치 58에서 아미노산 (X58)은 P 또는 K로부터 선택된다.
Ig 결합 단백질 중에 위치 1, 11, 35, 42에서 3 또는 4개의 아미노산의 조합의 결과로서 높은 알칼리 안정성. 일부 구체예에서, 위치 1에서 이소류신, 위치 11에서 알라닌, 위치 35에서 아르기닌, 및 위치 42에서 류신으로부터 선택되는 적어도 3 또는 4개의 아미노산의 조합은, 놀랍게도, 실시예 및 도면에 개시된 바와 같이, Ig 결합 단백질의 특히 양호한 알칼리 안정성을 제공한다. 위치 28은 아스파라긴인 것이 바람직하다. 하기 실시예에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 모든 Ig 결합 단백질은 알칼리 처리 후 조차도 Ig에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 Ig 결합 단백질은 상응하는 모체 단백질과 비교하여 0.5 M NaOH에서 적어도 6시간 동안 높은 알칼리 안정성, 구체적으로 개선된 알칼리 안정성을 나타내었다.
놀랍고도 예기치 못하게도 아미노산 위치 1에서 이소류신으로, 아미노산 위치 11에서 알라닌, 글루탐산, 또는 이소류신으로, 아미노산 위치 35에서 아르기닌 또는 이소류신으로, 및 선택적으로 아미노산 위치 42에서 류신으로의 적어도 3 또는 4개의 아미노산의 조합을 갖는 Ig 결합 단백질이 몇시간 동안 알칼리 처리한 후 조차도 Ig에 결합할 수 있다는 것이다. 가장 놀랍고도 예기치 못하게도 아미노산 1I, 11A 또는 11E 또는 11I, 35R 또는 35I, 및 선택적으로 42L의 조합, 바람직하게는 아미노산 1I, 11A, 35R, 및 42L의 조합을 포함하는 Ig 결합 단백질을 몇 시간 동안 알칼리 처리한 후 조차도 Ig에 결합할 수 있다는 것이다. 상기 Ig 결합 단백질의 알칼리 안정성은 0.5 M NaOH 중에서 6시간 동안 인큐베이션 후에 Ig 결합 활성에서의 소실을 비교하여 결정된다. 일부 구체예에서, 이는 상응하는 모체 단백질의 Ig-결합 활성에서의 소실과 비교하였다. 결합 활성의 소실은 6시간 동안 0.5 M NaOH 인큐베이션 이전 및 이후에 결합 활성을 비교하여 결정된다.
도면에서 비교 데이터로 개시되는 바와 같이, 1I, 11A 또는 11E 또는 11I, 35R 또는 35I, 및 42L로부터 선택되는 적어도 3 또는 4개의 아미노산을 갖는 Ig 결합 도메인의 Ig 결합 활성은 모체 단백질과 비교하여 적어도 25 % 만큼 증가하였다. 이는 모체 단백질과 비교하여 놀랍고도 유익한 특성이다.
바람직한 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질. 특정 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 18-20, 26, 29-40, 42-45, 및 56-61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 도메인은 서열번호: 20, 26, 30, 42-45로 구성된 그룹의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 알칼리 안정성 도메인은 부가의 변형, 예컨대 삽입, 결실, 또는 부가의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, Ig 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 부가의 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, Ig 결합 도메인은 그의 N-말단의 처음 4개의 아미노산내에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산의 결실 및/또는 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산의 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, Ig 결합 도메인은 N-말단에서의 결실, 예를 들어 위치 1, 2, 및 4, 또는 위치 1, 2, 및 3에서의 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, Ig 결합 도메인은 C-말단에서의 결실, 예를 들어 위치 57 및/또는 58에서의 결실을 갖는다. 일부 구체예는 서열번호: 20, 26, 30, 42-45, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 서열번호: 9-19, 29, 53-54, 56-61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 갖는 서열에 관한 것이다. 일부 구체예는 전술한 서열번호들 중 어느 것에 대한 아미노산 서열에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 관한 것으로서, 전술한 서열번호들 중 어느 것에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열번호: 20, 26, 29, 30, 42-45의 서열에서 위치 1, 11, 35 및 42 또는 적어도 89.5 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 유래되는 개별 아미노산 위치에 상응하는 위치 중 적어도 3 또는 4개에서 동일한 아미노산을 갖는다. 바람직한 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질에 대한 서열이 도 1에 개시되어 있다. 위치 1I, 11A, 35R, 및 42L 중 적어도 3 또는 4개가 보존되는 것이 바람직하다. 또한 위치 4는 Q가 아닌 것이 바람직하다.
서열번호: 20 ( cs14 ) 및 변이체. 특정 구체예에서, 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인은 서열번호: 20의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 91 % 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호: 18-19, 26, 42-45, 56의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 서열번호: 20의 변이체는 위치 4에서 Q를 갖지 않는다. 위치 4가 K인 것이 더 바람직하다. 특정 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 20의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 96 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 도 3 및 도 5는 연장된 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성을 나타내었다.
표 1은 서열번호: 20과 이에 대해 적어도 91 % 동일한 바람직한 변이체의 아미노산 차이를 나타낸다. 위치 5는 H 또는 F, 위치 7은 K 또는 E, 위치 8은 D 또는 A, 위치 25는 D 또는 E, 위치 44는 I 또는 V, 위치 46은 G 또는 A, 위치 49는 K 또는 Q, 위치 54는 A 또는 S, 및 위치 58은 P 또는 K인 것이 바람직하다. 위치 4가 K인 것이 더 바람직하다. 임의의 야생형 단백질 A 도메인에 대한 인공 알칼리 안정성 서열번호: 20의 동일성은 78 % 이하이다.
서열번호: 30 ( cs27 ) 및 변이체. 특정 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 94 % 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 임의의 야생형 단백질 A 도메인에 대한 서열번호: 30의 동일성은 76 % 이하이다. 도 4는 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 서열번호: 30 및 29의 남아있는 활성을 나타내었다.
서열번호: 26 ( cs25 ) 및 변이체. 특정 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 서열번호: 26의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 98 % 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 임의의 야생형 단백질 A 도메인에 대한 서열번호: 26의 동일성은 81 % 이하이다. 도 5는 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 서열번호: 26의 남아있는 Ig 결합 활성을 나타내었다.
서열번호: 42 ( cs74 ) 및 변이체. 특정 구체예에서, 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열 및 이에 대해 적어도 98 % 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 임의의 야생형 단백질 A 도메인에 대한 서열번호: 42의 동일성은 78 % 이하이다. 도 5는 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 서열번호: 42-43의 남아있는 Ig 결합을 나타내었다.
서열번호: 44 ( cs47 ) 및 그의 변이체. 특정 구체예에서, 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열 및 이에 대해 적어도 98 % 동일한 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성된다. 임의의 야생형 단백질 A 도메인에 대한 서열번호: 44의 동일성은 78 % 이하이다. 도 5는 적어도 98 % 동일성을 갖는 서열번호: 44-45의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성을 나타내었다.
면역글로불린에 대한 친화도. 본 발명의 모든 Ig 결합 단백질은 바람직하게는 1 μM 이하, 또는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 또는 미만의 해리 상수 KD로 면역글로불린에 결합한다. Ig 결합 단백질 또는 도메인의 결합 친화도를 결정하기 위한, 즉 해리 상수 KD를 결정하기 위한 방법은 당분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있고 또한 예를 들면 당 분야에 알려져 있는 하기 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR) 기반 기술, 바이오-층 간섭법 (Bio-layer interferometry: BLI), 효소-연결된 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 유세포분석 (flow cytometry), 등온 적정 열량계 (isothermal titration calorimetry: ITC), 분석용 초원심분리 (analytical ultracentrifugation), 방사선면역분석 (radioimmunoassay: RIA 또는 IRMA) 및 증강된 화학발광 (enhanced chemiluminescence: ECL). 일부 방법은 실시예에서 더 개시되어 있다. 통상적으로 해리 상수 KD는 20 ℃, 25 ℃, 또는 30 ℃에서 결정된다. 달리 구체적으로 지시되지 않는다면, 본원에서 인용되는 KD 값은 22 ℃ +/- 3 ℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 제1 양상의 일 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 0.1 nM 내지 100 nM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 10 nM 범위의 인간 IgG1에 대한 해리 상수 KD를 갖는다.
다량체. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 서로 연결되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의, Ig 결합 도메인을 포함하고, 즉 상기 Ig 결합 단백질은 예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체일 수 있다. 다량체는 2, 3, 4, 또는 초과의 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 다량체는 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 인위적으로 생성되는 융합 단백질이다. 본 발명의 Ig 결합 단백질은 많은 기존의 및 잘 알려져 있는 기술 예컨대 기본 유기 합성 전략 (plain organic synthetic strategies), 고체상-보조 합성 기술 (solid phase-assisted synthesis techniques) 또는 상업적으로 이용가능한 자동화 합성장치 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 다량체는 호모-다량체이고, 예컨대 Ig 결합 단백질 중의 모든 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인의 아미노산 서열이 동일하다.
알칼리-안정한 다량체는 둘 이상의 Ig 결합 도메인을 포함할 수 있고, 상기 Ig 결합 도메인은 바람직하게는 서열번호: 18-20, 26, 29-38, 42-45, 56-61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열 또는 전술한 서열번호 중 어느 것에 대해 적어도 89.5 % 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성된다. 일부 구체예에서, 상기 도메인은 서열번호: 18-20, 26, 29-38, 42-45, 56-61의 유도체이고 및 추가로 각 유도체는 서열번호:18-20, 26, 29-38, 42-45, 56-61 중 하나에 대해 그의 N-말단의 처음 4개의 아미노산내에 1, 2, 또는 3개의 아미노산의 결실 및/또는 이에 대해 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산의 결실을 갖는다 (예를 들어, 서열번호: 23, 24, 27 참조).
예를 들어, 서열번호: 14 및 서열번호: 20은 실시예 1에서 본원에서 개시된 호모-다량체 융합 구조물 (이량체, 사량체, 오량체, 및 육량체)을 생성하는데 사용되었다. 또한, 서열번호: 30의 이량체, 사량체, 오량체, 및 육량체가 생성되었다. 예를 들어 서열번호: 23, 24, 27, 28을 참조한다.
제1 양상의 일부 구체예에서, 상기 다량체는 헤테로-다량체이고, 예컨대 적어도 하나의 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인은 상기 면역글로불린-결합 단백질 내에서 다른 Ig 결합 도메인과 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
링커. 제1 양상의 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 Ig 결합 도메인은 서로 직접 연결된다. 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 Ig 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 서로 연결된다. 상기 통상적인 구체예에서 펩티드 링커인 것이 바람직하다. 이는 상기 펩티드 링커가 제1 Ig 결합 도메인을 제2 Ig 결합 도메인과 연결하는 아미노산 서열인 것을 의미한다. 상기 펩티드 링커는 제1 Ig 결합 도메인 및 제2 Ig 결합 도메인에 상기 도메인들의 C-말단과 N-말단 단부 사이의 펩티드 결합에 의해 연결하여, 단일, 선형 폴리펩티드 사슬을 생성한다. 링커의 길이 및 조성은 적어도 하나 내지 최대 약 30개의 아미노산 사이에서 다양할 수 있다. 더 구체적으로, 펩티드 링커는 1 내지 30개의 아미노산 길이; 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개의 아미노산 길이를 갖는다. 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 부식 조건 및 프로테아제에 대해 안정한 것이 바람직하다. 링커는 상기 Ig 결합 단백질 중에 도메인의 입체형태를 불안정하게 해서는 안된다. 작은 아미노산 예컨대 글리신 및 세린을 포함하는 링커가 잘 알려져 있다. 상기 링커는 글리신-풍부일 수 있다 (예컨대, 상기 링커 중에 잔기의 50% 초과는 글리신 잔기일 수 있다). 또한 추가의 아미노산을 포함하는 링커가 바람직하다. 본 발명의 다른 구체예는 알라닌, 프롤린, 및 세린으로 구성된 링커를 포함한다. 단백질들의 융합을 위한 다른 링커는 당 분야에 알려져 있고 또한 사용될 수 있다.
고체 지지체로의 콘쥬게이션. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 고체 지지체에 콘쥬게이트된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 도메인은 Ig 결합 단백질의 고체 지지체로의 부위-특이적 공유 커플링 (site-specific covalent coupling)을 위한 부착 부위를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 또한 N- 및/또는 C-말단 단부에서 추가의 아미노산 잔기, 가령 예를 들어 N-말단 단부에서 선두 (leader) 서열 및/또는 N- 또는 C-말단 단부에서 태그를 갖거나 또는 갖지 않는 커플링 (coupling) 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어 서열번호: 39 및 40 참조). 일부 구체예에서, 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질은 고체상 (매트릭스)에 공유 부착을 위한 부착 부위를 포함한다. 바람직하게, 상기 부착 부위는 고체상에 부위-특이적 부착을 제공하도록 특이적이다. 특정 부착 부위는 중성 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 리신을 포함하고, 이는 예를 들어 N-히드록시숙신이미드, 요오드아세트아미드, 말레이미드, 에폭시, 또는 알켄기로부터 선택되는, 고체상의 반응기 또는 고체상과 단백질 사이의 링커와 특정 화학 반응을 가능하게 한다. 상기 부착 부위는 Ig 결합 단백질의 C- 또는 N-말단 단부에 바로 존재할 수 있거나 또는 N- 또는 C-말단과 커플링 부위 사이의 링커, 바람직하게는 펩티드 링커일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질은 3 - 20개의 아미노산, 바람직하게는 4 - 10개의 아미노산의 짧은 N- 또는 C-말단 펩티드 서열을, 말단 시스테인과 포함할 수 있다. C-말단 부착 부위에 대한 아미노산은 바람직하게는 프롤린, 알라닌, 및 세린, 예를 들어, ASPAPSAPSAC (서열번호: 41)을, 커플링을 위한 C-말단 단부에서 단일 시스테인과 함께 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, C-말단 부착 부위에 대한 아미노산은 바람직하게는 글리신 및 세린, 예를 들어, GGGSC를, 커플링을 위한 C-말단 단부에서 단일 시스테인과 함께 선택될 수 있다.
C-말단 시스테인을 갖는 장점은 Ig 결합 단백질의 커플링이 지지체 상에서 시스테인 티올과 친전자성기의 반응을 통해 티오에테르 브릿지 커플링을 유도하여 달성될 수 있다는 것이다. 이는 증가된 결합능을 제공하는 커플링된 단백질의 우수한 이동성을 제공한다.
대안의 구체예에서, 상기 Ig 결합 단백질의 고체 지지체로의 커플링은 알칼리 안정성 Ig 결합 도메인의 위치 43, 46, 또는 47에서 시스테인을 통해 달성될 수 있다. 시스테인이 위치 43, 46, 또는 47에 위치하는 경우, 위치 50 또는 위치 58에서 아미노산은 시스테인이 아니다 (예를 들어 서열번호: 53 또는 54 참조). 바람직하게 위치 50에서 아미노산은 리신이고 및 위치 58에서 아미노산은 프롤린 또는 리신으로부터 선택된다.
친화도 분리 매트릭스. 다른 양상에서 본 발명은 제1 양상의 Ig 결합 단백질을 포함하는, 친화도 분리 매트릭스에 관한 것이다.
제2 양상의 바람직한 구체예에서, 상기 친화도 분리 매트릭스는 고체 지지체이다. 상기 친화도 분리 매트릭스는 본 발명의 적어도 하나의 Ig 결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 포함하는 매트릭스는 상기에서 정의된 바와 같은 면역글로불린, 즉 Ig, Fc 영역을 포함하는 Ig 변이체, Ig 중의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 Ig 중의 Fc 영역을 포함하는 콘쥬게이트의 분리, 예를 들어 크로마토그래피 분리에 유용하다. 친화도 매트릭스는 면역글로불린의 분리에 유용하고 또한 세정 과정 중에 적용되는 고도한 알칼리 조건 후 조차도 Ig 결합 특성을 보유할 것이다. 매트릭스의 이러한 세정은 매트릭스의 장기간의 반복된 사용을 위해 필수적이다.
친화도 크로마토그래피를 위한 고체 지지체 매트릭스가 당분야에 알려져 있고 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 아가로스 및 아가로스의 안정화된 유도체 (예컨대 세파로스 (Sepharose) 6B, PraestoTMPure; CaptivA®, rPROTEIN A Sepharose Fast Flow, Mabselect® 등), 셀룰로스 또는 셀룰로스의 유도체, 제어된 포어 글래스 (예컨대 ProSep® vA 수지), 모노리스 (monolith) (예컨대 CIM® 모노리스), 실리카, 지르코늄 옥시드 (예컨대 CM Zirconia 또는 CPG®), 티타늄 옥시드, 또는 합성 폴리머 (예컨대 폴리스티렌 예컨대 Poros 50A 또는 Poros MabCapture® A 수지, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 알콜, 폴리히드록시알킬 아크릴레이트, 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등) 및 다양한 조성의 히드로겔을 포함한다. 특정 구체예에서 상기 지지체는 폴리히드록시 폴리머, 예컨대 폴리사카리드를 포함한다. 지지체에 적합한 폴리사카리드의 예로는, 이에 한정되지 않고, 아가, 아가로스, 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란 등 및 이의 안정화된 변형체를 포함한다.
고체 지지체 매트릭스의 포맷은 임의의 적합한 널리 알려져 있는 종류일 수 있다. 본 발명의 Ig 결합 단백질의 커플링을 위한 이러한 고체 지지체 매트릭스는 예를 들어 컬럼, 모세관, 입자, 멤브레인, 필터, 모노리스, 파이버, 패드, 겔, 슬라이드, 플레이트, 카세트, 또는 크로마토그래피에서 일반적으로 이용되고 당분야 숙련자에게 알려져 있는 임의의 다른 포맷 중 하나를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 매트릭스는 비드, 예를 들어 세파로스 또는 아가로스 비드로도 알려져 있는, 실질적으로 구형인 입자로 이루어진다. 적합한 입자 크기는 5-500 ㎛, 예컨대 10-100 ㎛, 예컨대 20-80 ㎛의 직경 범위일 수 있다. 입자 형태의 매트릭스는 충진된 베드 (packed bed) 또는 연장된 베드를 포함하는 현탁된 형태로 사용될 수 있다.
대안의 구체예에서, 상기 고체 지지체 매트릭스는 멤브레인, 예를 들어 히드로겔 멤브레인이다. 일부 구체예에서, 상기 친화도 정제는 제1 양상의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질이 공유 결합되는 매트릭스로서 멤브레인을 포함한다. 상기 고체 지지체는 또한 카트리지 내 멤브레인의 형태일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 친화도 정제는 제1 양상의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질이 공유 결합되는 고체 지지체 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼을 포함한다.
본 발명의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질은, 예컨대 본 발명의 Ig 결합 단백질에 존재하는 아미노-, 술프히드록시-, 및/또는 카르복시-기를 이용하는 기존의 커플링 기법을 통해 적합한 고체 지지체 매트릭스에 부착될 수 있다. 상기 커플링은 Ig 결합 단백질의 질소, 산소, 또는 황 원자를 통해 수행될 수 있다. 바람직하게는, N- 또는 C-말단 펩티드 링커에 포함되는 아미노산은 상기 질소, 산소 또는 황 원자를 포함한다.
상기 Ig 결합 단백질은 직접적으로 또는 스페이서 요소를 통해 간접적으로 지지체 매트릭스에 커플링되어, Ig 결합 단백질의 이용가능성을 개선하고 본 발명의 Ig 결합 단백질의 상기 지지체로의 화학적 커플링을 촉진하는, 매트릭스 표면과 본 발명의 Ig 결합 단백질 사이에 적절한 거리를 제공할 수 있다.
단백질 리간드의 고체 지지체로의 고정화 방법은 당 분야에 잘 알려져 있고, 표준 기술 및 설비를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 수행된다.
상기 Ig 결합 단백질 및 특정 조건에 따라, 상기 커플링은, 예를 들어 몇 개의 리신을 통한 다중 포인트 커플링, 또는 예를 들어 시스테인을 통한 단일 포인트 커플링일 수 있다.
알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 용도. 제3 양상에서 본 발명은 면역글로불린 또는 그의 변이체의 친화도 정제를 위한 제1 양상의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질 또는 제2 양상의 친화도 매트릭스의 용도에 관한 것으로, 즉 본 발명의 Ig 결합 단백질은 친화도 크로마토그래피를 위해 이용된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 Ig 결합 단백질은 본 발명의 제2 양상에 개시된 바와 같이 고체 지지체 상에 고정화된다.
면역글로불린의 친화도 정제 방법. 제4 양상에서 본 발명은 면역글로불린의 친화도 정제 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화도 분리 매트릭스에 커플링되는 제1 양상의 고정화된 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 액체를 상기 친화도 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 Ig 결합 단백질에 결합하는 것인 단계; 및 (d) 상기 면역글로불린을 상기 매트릭스로부터 용출시킴으로써, 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 친화도 정제 방법은, 상기 단계 (c)와 (d) 사이에서, 상기 친화도 분리 매트릭스로부터 이에 비-특이적으로 결합되는 분자의 일부 또는 전부를 제거하기에 충분한 조건하에 1회 이상의 세정 단계를 더 포함할 수 있다. 비-특이적으로 결합되는 것은 본원에 개시된 주제 중 적어도 하나의 결합 도메인과 면역글로불린 사이의 상호작용을 포함하지 않는 임의의 결합을 의미한다.
개시된 용도 및 방법에 적합한 친화도 분리 매트릭스는 전술한 구체예에 따르고 당업자에게 알려져 있는 매트릭스이다.
제4 양상의 일부 구체예에서, 상기 단계 (d)에서 매트릭스로부터 면역글로불린의 용출은 pH의 변화 및/또는 염 농도의 변화를 통해 수행된다. 단백질 A 매질로부터 용출을 위해 사용되는 임의의 적합한 용액, 예를 들어 pH 5 또는 미만의 용액, 또는 pH 11 또는 초과의 용액이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 친화도 매트릭스를 효과적으로 세정하기 위한 추가의 단계 (f)가, 바람직하게는 예를 들어 pH 13 - 14의 알칼리액을 사용하여 부가된다. 특정 구체예에서, 상기 세정액은 0.1 - 1.0 M NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 0.25 - 0.5 M NaOH 또는 KOH를 포함한다. 본 발명의 Ig 결합 단백질의 높은 알칼리 안정성에 의해, 이러한 강한 알칼리 용액이 세정 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 친화도 매트릭스는, 단계 (a) 내지 (e)의 반복에 기인하여, 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 또는 적어도 100회 재사용될 수 있고, 선택적으로 (a) 내지 (f)는 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 또는 적어도 100회 반복될 수 있다.
일반적으로, 친화도 정제 방법을 수행하기 위한 적합한 조건은 당분야의 숙련자, 구체적으로 단백질 A 크로마토그래피에서 숙련자에게 잘 알려져 있다.
핵산 분자. 제5 양상에서, 본 발명은 전술한 임의의 구체예의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 코딩하는, 핵산 분자, 바람직하게는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포에 전달하는데 사용될 수 있는 임의의 분자 또는 대상체 (entity) (예컨대, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
제6 양상에서, 본 발명은 전술한 핵산 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템, 예를 들어 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜리 (E. coli), 또는 진핵생물 숙주, 예를 들어 효모 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 포유동물 세포 예컨대 CHO 세포에 관한 것이다.
알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 생산을 위한 방법. 제7 양상에서 본 발명은 본 발명의 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 생산을 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 단계(들): (a) 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 수득하기 위해 결합 단백질의 발현에 적합한 조건하에 제6 양상의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 선택적으로 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주의 배양에 적합한 조건은 당분야 숙련자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 Ig-결합 분자는 임의의 여러 통상적이고 잘 알려져 있는 기술, 예컨대 기본 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기술 또는 상업적으로 이용 가능한 자동화 합성장치에 의해 제조될 수 있다. 한편, 이들은 또한 통상적 재조합 기술 단독으로 또는 기존의 합성 기술과 조합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 알칼리-안정성 Ig 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계들: (a) 상기 정의된 바와 같은 Ig 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 제조하는 단계; (b) 상기 핵산을 발현 벡터 내로 도입하는 단계; (c) 상기 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (d) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (e) 상기 숙주 세포에 Ig 결합 단백질이 발현되는 배양 조건을 가하는 단계, 이에 의해 (e) 전술한 바와 같은 Ig 결합 단백질을 생산하는 단계; 선택적으로 (f) 상기 단계 (e)에서 생산된 단백질을 단리하는 단계; 및 (g) 선택적으로 전술한 고체 매트릭스에 상기 단백질을 콘쥬게이트시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가의 구체예에서, 상기 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 생산은 무-세포 인 비트로 전사/번역에 의해 수행된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 추가 예시를 위해 제공된다. 그러나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 또한 하기 실시예는 단지 상기 설명에 기반하여 본 발명의 실행가능성을 보여준다.
실시예
1.
셔플링에
의한 모체 단백질의 생성
모체 단백질 (예컨대 서열번호: 3, 4, 10, 14, 21, 22, 25, 47-50)을 처음에 자연 발생하는 단백질 A 도메인 및 단백질 A 도메인 변이체 (예컨대 Z 도메인 또는 임의의 자연 발생하는 도메인에 대해 적어도 89.5 % 동일성을 갖는 다른 도메인, 예컨대 Z/2 도메인)의 셔플링 공정 (shuffling process)에 의해 생성하였다. 더 상세하게, 본원에서 이해되는 셔플링 공정은 비-동일한 알려져 있는 아미노산 서열의 세트로부터 시작하여 인공 아미노산 서열을 유도하는 조립 공정 (assembly process)이다. 상기 셔플링 공정은 하기 단계들을 포함한다: a) 5개의 자연 발생하는 단백질 A 도메인 E, B, D, A, 및 C, 및 단백질 A 변이체 도메인 Z 또는 Z/2의 서열을 제공하는 단계; b) 상기 서열들을 정렬하는 단계; c) 인 실리코 (in silico) 통계적 단편화로 재조합되는 하위서열을 확인하는 단계, 그 다음에 d) 다양한 단편의 새로운, 인공 서열을 조립하여 모자이크 산물, 즉 신규한 아미노산 서열을 생산하는 단계. 상기 단계 c)에서 생성된 단편은 임의의 길이를 갖고, 예컨대 상기 단편화된 모체 서열이 n의 길이를 갖는 경우, 상기 단편은 1 내지 n-1의 길이를 갖는다.
상기 모자이크 산물에서 아미노산의 상대 위치는 시작하는 아미노산 서열에 대해 유지되었다. 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, A56, P57의 적어도 90%는 예를 들어 IB14, IB25, IB74h1, IB74h2, IB47h3, IB47h4, 및/또는 IB27의 인공 아미노산 서열과, 자연 발생하는 단백질 A 도메인 또는 단백질 A 도메인 변이체 사이에서 동일하다. 상기 Ig 결합 단백질 IB14, IB25, IB74h1, IB74h2, IB47h3, IB48h4, 및 IB27의 전체 아미노산 서열은 자연 발생하는 단백질 A 도메인 또는 도메인 Z의 전체 아미노산 서열에 대해 85 % 이하로 동일하다는 점에서 인공 서열이다. 초기 인공 Ig 결합 단백질이 생성된 후에, 상기 단백질은 결합 특성을 더 변형시키기 위해 아미노산 서열의 부위-특이적 무작위화 (site-specific randomization)에 의해 추가로 변형된다. 상기 추가적 변형은 개별 아미노산 잔기의 부위-포화 돌연변이화 (site-saturation mutagenesis)에 의해 도입된다.
Ig 결합 단백질 IB14, IB25, IB47, IB74 또는/및 IB27뿐만 아니라 서열번호: 5-8에 대한 유전자는 당업자에게 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 합성되고 및 이. 콜리 발현 벡터로 클로닝되었다. DNA 시퀀싱은 삽입된 단편의 정확한 순서를 확인하기 위해 사용되었다.
다량체 Ig 결합 단백질을 생성하기 위해, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 동일한 Ig 결합 도메인 (예를 들어, 서열번호: 14, 20, 30)은 아미노산 링커를 통해 유전적으로 융합되었다.
특정 멤브레인 부착 및 정제를 위해, C-말단 Cys를 갖는 짧은 펩티드 링커 (ASPAPSAPSAC; 서열번호: 41) 및 선택적으로 strep-태그 (WSHPQFEK; 서열번호: 46)를 Ig 결합 단백질의 C-말단에 부가하였다 (예를 들어, 서열번호: 39-40 참조). 다른 구체예에서, 특정 멤브레인 부착 및 정제를 위해, 위치 43, 46, 또는 47을 시스테인으로 치환하였다 (예를 들어, 서열번호: 53-54 참조).
실시예
2.
변이체를
생성하기 위한
돌연변이화
부위-특정 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 위해, Q5® 부위-특정 돌연변이화 키트 (NEB; Cat. No. E0554S)를 제조자의 지침에 따라 사용하였다. 각 특정 치환을 각각 코딩하는 올리고뉴클레오티드 및 주형으로서 서열번호: 14를 포함하는 플라스미드를 사용하여 PCRs을 수행하였다. 산물들을 결찰시켰고 이.콜리 XL2-blue 세포 (Stratagene)로 전기천공을 통해 형질전환시켰다. 단일의 콜로니를 단리시켰고 및 클론을 포함하는 삽입물에 대해 DNA 시퀀싱을 사용하여 정확한 서열을 확인하였다. 결과는 도 2에 개시되어 있다.
몇몇 점 돌연변이들의 조합을 GeneArtTM StringsTM 합성 (Thermo Fisher Scientific)에 의해 생성하였다. 상기 Strings DNA 단편은 정제된 PCR 산물에 상응하였고 및 pET28a 벡터의 유도체로 클로닝하였다. 결찰 산물을 이. 콜리 XL2-blue 세포로 전기천공을 통해 형질전환시켰다. 단일의 콜로니를 PCR로 스크리닝하여 정확한 크기의 삽입물을 포함하는 제작물을 확인하였다. DNA 시퀀싱을 사용하여 정확한 서열을 확인하였다. 점 돌연변이를 갖는 변이체는 예를 들어 서열번호: 9-13, 15-17, 및 21에 개시하였다.
실시예
3. Ig 결합 단백질의 발현
BL21 (DE3) 적격 세포를 Ig 결합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 세포를 선택적 아가 플레이트 (카나마이신) 상에 전개하고 37℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 사전배양물 (precultures)을 100 ml 2xYT 배지에서 단일의 콜로니로부터 접종하였고 락토스 및 소포제를 함유하지 않는 150 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 배플된 1 L Erlenmeyer 플라스크 중에서 통상적 오비탈 진탕장치에서 160 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. OD600 판독은 6-12 범위에 있어야 한다. 주 배양물을 150 μg/ml 카나마이신이 보충된 1 L 두꺼운 벽의 Erlenmeyer 플라스크 중에 400 ml superrich 배지 (변형된 H15 배지 2% 글루코스, 5% 효모 추출물, 0.89% 글리세롤, 0.76% 락토스, 250 mM MOPS, 202 mM TRIS, pH 7.4, 소포제 SE15)에서 개시-OD600을 0.5로 조정한 이전의 밤샘 배양물로부터 접종하였다. 배양물을 공명 음향 믹서 (RAMbio)로 옮기고 및 20 x g로 37℃에서 인큐베이트하였다. Oxy-Pump 스토퍼로 통기를 촉진하였다. 글루코스를 대사시킨 후 락토스가 세포로 들어가도록 함으로써 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 소정 시점에서 OD600을 측정하였고, 5/OD600으로 조정된 시료를 인출하여 펠렛화하였고 -20℃에서 동결하였다. 세포를 대략 24시간 동안 밤새 성장시켜 약 45-60의 최종 OD600에 도달하였다. 바이오매스를 수집하기 위해, 세포를 20℃에서 10분 동안 16000 x g로 원심분리하였다. 펠렛을 칭량하였고 (습식 중량) 상등액에서 pH를 측정하였다. 세포를 처리 전까지 -20 ℃로 보관하였다.
실시예
4: Ig 결합 단백질의 발현 및 가용성의
SDS
-PAGE 분석
발효 동안 채취한 시료를 300 ㎕ 추출 버퍼 (0.2 mg/ml 리소자임, 0.5x BugBuster, 7.5 mM MgSO4, 40 U 벤조나제가 보충된 PBS) 중에 재현탁시켰고 15분 동안 700 rpm, rt에서 서모믹서 내에서 진탕에 의해 가용화하였다. 가용성 단백질을 원심분리 (16000 x g, 2분, rt)에 의해 불용성 단백질로부터 분리시켰다. 상등액을 인출하고 (가용성 분획) 및 펠렛 (불용성 분획)을 동량의 우레아 버퍼 (8 M 우레아, 0.2 M 트리스, 2 mM EDTA, pH 8.5) 중에 재현탁시켰다. 가용성 및 불용성 분획 모두로부터 50 ㎕를 채취해서, 12 ㎕의 5x 시료 버퍼뿐만 아니라 5 ㎕의 0.5 M DTT를 첨가하였다. 시료를 5분 동안 95℃에서 끓였다. 마지막으로, 8㎕의 이들 시료를 NuPage Novex 4-12% 비스-트리스 SDS 겔에 적용하여, 제조자의 권장사항에 따라 수행하고 쿠마시 (Coomassie)로 염색하였다. 선택된 기간 내에 최적화된 조건 하에서 모든 Ig 결합 단백질의 높은 발현 수준이 확인되었다 (데이터가 개시되지 않음). 모든 발현된 Ig 결합 단백질은 SDS-PAGE에 따르면 95% 초과로 가용성이었다.
실시예
5: Ig 결합 단백질의 정제
Ig 결합 단백질을 C-말단 StrepTagII (WSHPQFEK; 서열번호: 46)를 갖는 이. 콜리의 가용성 분획에서 발현시켰다. 세포를 2회의 동결/해동 사이클로 용해시켰고 및 정제 단계는 제조자의 지침에 따라 Strep-Tactin®-수지에서 수행하였다 (IBA, Goettingen, Germany). 디술피드 형성을 피하기 위해, 상기 버퍼에 1 mM DTT를 보충하였다.
대안으로서, Ig 결합 단백질을 C-말단 StrepTagII (서열번호: 46)를 갖는 이. 콜리의 가용성 분획에서 발현시켰다. 세포를 세포 파괴 버퍼에 재현탁시켰고 및 2회의 사이클 동안 1 kbar로 콘스탄트 세포 파괴 시스템 (constant cell disruption system) (Unit F8B, Holly Farm Business Park)에 의해 용해시켰다. 정제 단계는 제조자의 지침에 따라 AKTAxpress 시스템 (Ge Healthcare)을 사용하여 Strep-Tactin-수지 (IBA, Goettingen, Germany) 및 추가의 겔 여과 (Superdex 75 16/60; GE Healthcare)에 의해 수행하였다. 디술피드 형성을 피하기 위해, Strep-Tactin-정제를 위한 버퍼에 1 mM DTT를 보충하였고 및 시트레이트-버퍼 (20 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 6,0)를 겔 여과를 위한 러닝 버퍼 (running buffer)로 사용하였다.
실시예
6. Ig 결합
단백질이 높은
친화도로
IgG에
결합함 (ELISA에 의해 결정됨)
IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4에 대한 Ig 결합 단백질의 친화도를 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA)을 이용하여 결정하였다. IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4 함유 항체 (예컨대 IgG1에 대해 세툭시맙, IgG2에 대해 파니투무맙, 또는 IgG4에 대해 나탈리주맙)를 96 웰 Nunc MaxiSorb ELISA 플레이트 (2 ㎍/ml) 상에 고정화하였다. 4℃에서 16시간 동안 인큐베이트한 후, 상기 웰을 PBST (PBS + 0.1% Tween 20)로 3회 세척하였고 상기 웰을 PBS 중 3% BSA로 차단시켰다 (실온에서 2시간). 네가티브 대조군은 BSA로만 차단된 웰이었다. 차단 후, 상기 웰을 PBST로 3회 세척하고 실온에서 (PBST 중) Ig 결합 단백질과 1시간 동안 인큐베이트하였다. 인큐베이트한 후 상기 웰을 PBST로 3회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 Strep-Tactin-HRP (1:10000) (IBA, Goettingen, Germany)와 인큐베이트하였다. 이후 상기 웰을 PBST로 3회 그리고 PBS로 3회 세척하였다. TMB-Plus 기질의 첨가에 의해 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase)의 활성을 가시화하였다. 30분 후 0.2M H2SO4의 첨가에 의해 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA를 통해 결정되는 바와 같이, 인간 IgG1에 대한 KD는 서열번호: 14에 대해 4.9 nM; 도메인 Z에 대해 3.4 nM; 도메인 B에 대해 3.1 nM; 및 도메인 C에 대해 2.8 nM이다.
실시예
7. Ig 결합
단백질이 높은
친화도로
IgG에
결합함 (표면
플라즈몬
공명 실험으로 결정됨)
CM5 센서 칩 (GE Healthcare)을 SPR 러닝 버퍼로 평형화시켰다. 표면-노출된 카르복실기를 EDC 및 NHS의 혼합물을 통과시켜 활성화하여 반응성 에스테르기를 수득하였다. 700-1500 RU 온-리간드 (on-ligand)를 플로우 셀 (flow cell) 상에 고정화하고, 오프-리간드 (off- ligand)를 다른 플로우 셀 상에 고정화하였다. 리간드 고정화 후 에탄올아민의 주입으로 비-공유 결합된 Ig 결합 단백질을 제거하였다. 리간드 결합 시에, 단백질 분석물이 상기 표면 상에 축적되어 굴절률을 증가시켰다. 이러한 굴절률 변화를 실시간으로 측정하여 시간 대비 반응 또는 공명 단위 (RU)로 플로팅하였다. 분석물을 적합한 유속 (㎕/분)으로 연속 희석하여 칩에 적용하였다. 각 수행 후, 상기 칩 표면을 재생 버퍼로 재생하고 러닝 버퍼로 평형화시켰다. 대조군 시료를 상기 매트릭스에 적용하였다. 재생 및 재-평형화를 이전에 언급된 바와 같이 수행하였다. 25℃에서 Biacore® 3000 (GE Healthcare)을 이용하는 결합 연구를 수행하였다; 데이터 평가는, Langmuir 1:1 모델 (RI=0)을 이용하여, 제조자에 의해 제공되는, BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 통해 수행하였다. 평가된 해리 상수 (KD)를 오프-타겟에 대해 표준화하였고 및 인간 IgG1-Fc, 세툭시맙 (IgG1), 나탈리주맙 (IgG4), 또는 파니투모맙 (IgG2)에 대한 다양한 인공 알칼리 안정성 Ig 결합 단백질의 KD 값을 하기 표 2에 개시하였다.
| 서열번호: | Ig 결합 단백질 | IgG1 (nM) | IgG4 (nM) | IgG2 (nM) |
| 20 | cs14 | 2.9 | 2.51 | 7.42 |
| 30 | cs27 | 3.64 | 2.54 | 21.6 |
| 26 | cs25 | 4.24 | 3.27 | 11.6 |
| 45 | cs47h4 | 4.1 | 3.11 | 25.2 |
| 44 | cs47h3 | 4.78 | 4.05 | 20.3 |
| 43 | cs74h2 | 3.48 | 2.72 | 17.2 |
| 42 | cs74h1 | 1.64 | 1.2 | 12.8 |
실시예
8. 에폭시-활성화된 매트릭스에
커플링된
Ig 결합 단백질의 알칼리 안정성
정제된 Ig 결합 단백질을 제조자의 지침 (커플링 조건: pH 9.0 밤새, 에탄올아민으로 5시간 동안 차단)에 따라 에폭시-활성화된 매트릭스 (세파로스 6B, GE; Cat. No. 17-0480-01)에 커플링시켰다. 세툭시맙을 IgG 시료로 이용하였다 (5 mg; 1 mg/ml 매트릭스). 세툭시맙을 고정화된 Ig 결합 단백질을 포함하는 매트릭스에 포화량으로 적용하였다. 상기 매트릭스를 100 mM 글리신 버퍼, pH 2.5로 세척하여 고정화된 IgG-결합 단백질에 결합된 세툭시맙을 용출시켰다. Ig 결합 단백질의 결합 활성을 결정하기 위해 용출된 IgG의 농도를 BLI (단백질 A Octet-센서 및 세툭시맙 표준으로 정량화)로 측정하였다. 컬럼을 실온 (22℃ +/- 3℃)에서 6시간 동안 0.5M NaOH와 인큐베이트하였다. 상기 고정화된 단백질의 Ig 결합 활성을 6시간 동안 0.5M NaOH와의 인큐베이트하기 이전 및 이후에 분석하였다. NaOH 처리 전에 고정화된 단백질의 Ig 결합 활성을 100%로 정의하였다.
도 2는 IB14 (서열번호: 14)의 점 돌연변이 변이체의 알칼리 안정성의 분석을 나타내었다. IB14의 위치 1, 11, 35, 및 42에서 점 돌연변이의 6시간의 연속하는 0.5 M NaOH 처리 후에 Ig 결합의 남아있는 활성 (%)을 모체 IB14와 비교하였다. 치환 P1I, S11E, S11I, S11A, K35I, K35R, 또는 K42L은 Ig 결합 활성을 적어도 약 25 % 만큼 향상시켰다.
도 3은 예를 들어 위치 1, 11, 28, 35, 및/또는 42에서 3, 4, 또는 5개의 치환들의 조합을 갖는 변이체 단백질의 활성이 모체 단백질 IB14 (서열번호: 14)의 활성과 비교하여 더 높은 것을 보여주었다. 6시간 동안 0.5 M NaOH에서 인큐베이트한 후에 IB14와 비교하여, Ig 결합 단백질 cs14-1 (서열번호: 18)은 약 적어도 50 %, cs14-2 (서열번호: 19)는 약 적어도 70 %, cs14-3 (서열번호: 20)은 약 적어도 80 % 더 높은 Ig 결합 활성을 보여주었다.
도 4는 위치 1, 11, 35, 및/또는 42에서 3, 4, 또는 5개의 치환들의 조합을 갖는 변이체 Ig 결합 단백질의 활성이 모체 단백질 IB27의 활성과 비교하여 더 높은 것을 보여주었다. 6시간 동안 0.5 M NaOH에서 인큐베이트한 후에 모체 단백질과 비교하여, cs27-1 (서열번호: 29)은 약 적어도 30 % 및 cs27-2 (서열번호: 30)는 약 적어도 40 % 더 높은 Ig 결합 활성을 보여주었다.
도 5는 1I, 11A, 35R, 및 42L의 조합들을 갖는 변이체 Ig 결합 단백질의 활성이 여기서 IB14로 표시되는 모체 단백질 (다른 모체 단백질은 IB14와 비교가능함; 데이터는 개시되지 않음)의 활성과 비교하여 더 높은 것을 보여주었다. 6시간 동안 0.5 M NaOH에서 인큐베이트한 후에 IB14와 비교하여, Ig 결합 단백질 cs74h1 (서열번호: 42), cs74h2 (서열번호: 43), cs47h3 (서열번호: 44), cs47h4 (서열번호: 45), 및 cs25 (서열번호: 26)는 유의하게 더 높은 Ig 결합 활성을 보여주었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Navigo Proteins GmbH
<120> Alkaline stable Immunoglobulin-binding proteins
<130> SP32 WO
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> generic sequence 1
<220>
<221> variant
<222> (1)..(1)
<223> may be replaced by V, N, Q, or P
<220>
<221> variant
<222> (2)..(2)
<223> may be replaced by D or Q
<220>
<221> variant
<222> (3)..(3)
<223> may be replaced by N or S
<220>
<221> variant
<222> (4)..(4)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (5)..(5)
<223> may be replaced by F
<220>
<221> variant
<222> (6)..(6)
<223> may be replaced by N, A, or S
<220>
<221> variant
<222> (7)..(7)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (8)..(8)
<223> may be replaced by E or A
<220>
<221> variant
<222> (11)..(11)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (15)..(15)
<223> may be replaced by Q
<220>
<221> variant
<222> (16)..(16)
<223> may be replaced by V
<220>
<221> variant
<222> (18)..(18)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (19)..(19)
<223> may be replaced by M
<220>
<221> variant
<222> (21)..(21)
<223> may be replaced by S or D
<220>
<221> variant
<222> (23)..(23)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (24)..(24)
<223> may be replaced by A
<220>
<221> variant
<222> (25)..(25)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (28)..(28)
<223> may be replaced by S or A
<220>
<221> variant
<222> (29)..(29)
<223> may be replaced by G
<220>
<221> variant
<222> (40)..(40)
<223> may be replaced by Q or T
<220>
<221> variant
<222> (42)..(42)
<223> may be replaced by A or T
<220>
<221> variant
<222> (43)..(43)
<223> may be replaced by N or S
<220>
<221> variant
<222> (44)..(44)
<223> may be replaced by V or L
<220>
<221> variant
<222> (46)..(46)
<223> may be replaced by A
<220>
<221> variant
<222> (49)..(49)
<223> may be replaced by Q
<220>
<221> variant
<222> (52)..(52)
<223> may be replaced by D or S
<220>
<221> variant
<222> (53)..(53)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (54)..(54)
<223> may be replaced by S
<220>
<221> variant
<222> (58)..(58)
<223> may be replaced by K
<400> 1
Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Generic sequence 2
<220>
<221> variant
<222> (1)..(1)
<223> may be replaced by N or P
<220>
<221> variant
<222> (5)..(5)
<223> may be replaced by F
<220>
<221> variant
<222> (7)..(7)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (8)..(8)
<223> may be replaced by E or A
<220>
<221> variant
<222> (11)..(11)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (25)..(25)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (28)..(28)
<223> may be replaced by S
<220>
<221> variant
<222> (44)..(44)
<223> may be replaced by V
<220>
<221> variant
<222> (46)..(46)
<223> may be replaced by A
<220>
<221> variant
<222> (49)..(49)
<223> may be replaced by Q
<220>
<221> variant
<222> (54)..(54)
<223> may be replaced by S
<220>
<221> variant
<222> (58)..(58)
<223> may be replaced by K
<400> 2
Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> parental protein IB14 1A/28N (IB14a)
<400> 3
Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> parental protein IB27 1A
<400> 4
Ala Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> domain C
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> domain B
<400> 6
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> domain Z
<400> 7
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> domain Z/2
<400> 8
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 1I
<400> 9
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 1A/28S (IB14b)
<400> 10
Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 11A
<400> 11
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 11E
<400> 12
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 11I
<400> 13
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ile Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 1P 28S (IB14d)
<400> 14
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 35R
<400> 15
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 16
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 35I
<400> 16
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Ile Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 42L
<400> 17
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs14-1 (IB14 1I/11A/35R )
<400> 18
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs14-2 (IB14 1I/11A/35R/42L)
<400> 19
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 20
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs14-3 1I/11A/28N/35R/42L
<400> 20
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 21
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB14 1P/28N (IB14c)
<400> 21
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 22
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IB27 1N
<400> 22
Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 23
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs27 delNC
<400> 23
Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg
20 25 30
Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Ser Gln Ala
50
<210> 24
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs27 delN
<400> 24
Ala Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg
20 25 30
Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 25
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> parental protein IB25 1A
<400> 25
Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs25 (IB25 1I/11A/35R/42L)
<400> 26
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 27
<211> 318
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs17 delNC hexamer
<400> 27
Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg
20 25 30
Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Ser Gln Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr
50 55 60
Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe
65 70 75 80
Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly
85 90 95
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln
100 105 110
Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
115 120 125
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser
130 135 140
Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Lys
145 150 155 160
Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro
165 170 175
Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp
180 185 190
Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
195 200 205
Asp Ser Gln Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu
210 215 220
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile
225 230 235 240
Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu
245 250 255
Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln
260 265 270
Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln
275 280 285
Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu
290 295 300
Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala
305 310 315
<210> 28
<211> 290
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs27 pentamer
<400> 28
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val
145 150 155 160
Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ile Ala
165 170 175
Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala
225 230 235 240
Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 29
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs27-1 (IB27 1I/11A/35R)
<400> 29
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs27-2 (IB27 I/11A/35R/42L)
<400> 30
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 31
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain C 1I/11A/35R
<400> 31
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 32
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain C 1I/11A/35R/42L
<400> 32
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 33
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain B 1I/11A/35R
<400> 33
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 34
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain B 1I/11A/35R/42L
<400> 34
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 35
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain Z 1I/11A/35R
<400> 35
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 36
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain Z 1I/11A/35R/42L
<400> 36
Ile Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 37
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain domain Z/2 1I/11A/35R
<400> 37
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain Z/2 1I/11A/35R/42L
<400> 38
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 39
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs14-3 with coupling sequence
and strep tag
<400> 39
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ser
50 55 60
Ala Pro Ser Ala Cys Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
65 70 75
<210> 40
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs27-2 with coupling sequence
and strep tag
<400> 40
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser
50 55 60
Ala Pro Ser Ala Cys Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
65 70 75
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coupling sequence
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1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs74h1
<400> 42
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1 5 10 15
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20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
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<213> Artificial Sequence
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<223> alkaline stable Ig binding domain cs74h2
<400> 43
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1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alkaline stable Ig binding domain cs47h3
<400> 44
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20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
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50 55
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> parental protein IB74h2
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1 5 10 15
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35 40 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> parental protein IB47h3
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Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> parental protein IB47h4
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35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> generic sequence including IB14 and IB27
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<221> variant
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<223> may be replaced by N or P
<220>
<221> variant
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<221> variant
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<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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<221> variant
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<220>
<221> variant
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<221> variant
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<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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Ala Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Generic sequence of preferred alkaline stable artifical IgG
binding proteins
<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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<221> variant
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<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
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<221> variant
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<220>
<221> variant
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<220>
<221> variant
<222> (54)..(54)
<223> may be replaced by S
<220>
<221> variant
<222> (58)..(58)
<223> may be replaced by K
<400> 52
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs27 46C
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Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 54
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs14 43C
<400> 54
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 55
<211> 174
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cs27 tetramer
<400> 55
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val
145 150 155 160
Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
165 170
Claims (22)
- 하나 이상의 Ig 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 (Ig) 결합 단백질로서, 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 서열번호: 20, 26, 29, 30, 42, 43, 44, 및 45로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 (Ig) 결합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 Ig 결합 도메인이 서로 연결된 것을 포함하는 것인 Ig 결합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 고체 지지체에 콘쥬게이트되는 것인 Ig 결합 단백질.
- 청구항 3에 있어서, 상기 Ig 결합 단백질은 고체 지지체에 대한 상기 Ig 결합 단백질의 부위-특이적 공유 결합을 위한 부착 부위를 더 포함하는 것인 Ig 결합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 Ig 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG4, IgM, IgA, Fc 영역을 포함하는 Ig 단편, Ig 중의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 Ig 중의 Fc 영역을 포함하는 콘쥬게이트 (conjugates)에 결합하는 것인 Ig 결합 단백질.
- 청구항 1의 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스 (affinity separation matrix).
- 청구항 1의 Ig 결합 단백질 또는 청구항 6의 친화도 분리 매트릭스를 포함하는, 면역글로불린의 친화도 정제용 조성물.
- 면역글로불린의 친화도 정제 방법으로서, 상기 방법은: (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화도 분리 매트릭스에 커플링되는 청구항 1의 적어도 하나의 Ig 결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 액체와 상기 친화도 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 Ig 결합 단백질에 결합하는 것인 단계; 및 (d) 상기 면역글로불린을 상기 매트릭스로부터 용출시킴으로써, 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 단계 (c)와 (d) 사이에서, 상기 친화도 분리 매트릭스로부터 이에 비-특이적으로 결합되는 분자의 일부 또는 전부를 제거하기에 충분한 조건하에 상기 친화도 분리 매트릭스를 세정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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