JP3614866B2 - 人工抗体ポリペプチド - Google Patents
人工抗体ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP3614866B2 JP3614866B2 JP50319599A JP50319599A JP3614866B2 JP 3614866 B2 JP3614866 B2 JP 3614866B2 JP 50319599 A JP50319599 A JP 50319599A JP 50319599 A JP50319599 A JP 50319599A JP 3614866 B2 JP3614866 B2 JP 3614866B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- loop
- sequence
- nucleic acid
- monobody
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 68
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 72
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 64
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 39
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 31
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 27
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- -1 amino amino Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 129
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 74
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 47
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 46
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 35
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 35
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 25
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 24
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 24
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 24
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 12
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 description 10
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 description 10
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- HRHJHXJQMNWQTF-UHFFFAOYSA-N cannabichromenic acid Chemical compound O1C(C)(CCC=C(C)C)C=CC2=C1C=C(CCCCC)C(C(O)=O)=C2O HRHJHXJQMNWQTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 3
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229940030980 inova Drugs 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VQTBINYMFPKLQD-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound C=12C=CC(=O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VQTBINYMFPKLQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBWCNKVANCTCAD-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CBWCNKVANCTCAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGNLFUXWZJGETL-YUSKDDKASA-N (Z)-[(2S)-2-amino-2-carboxyethyl]-hydroxyimino-oxidoazanium Chemical compound N[C@@H](C\[N+]([O-])=N\O)C(O)=O ZGNLFUXWZJGETL-YUSKDDKASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004466 2D NOESY spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003979 3D HSQC-TOCSY Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710146708 Acid alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000921522 Bos taurus Cytochrome c Proteins 0.000 description 1
- 240000001546 Byrsonima crassifolia Species 0.000 description 1
- 235000003197 Byrsonima crassifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001074954 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 5-phosphatase A Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MLFKVJCWGUZWNV-UHFFFAOYSA-N L-alanosine Natural products OC(=O)C(N)CN(O)N=O MLFKVJCWGUZWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 238000005654 Michaelis-Arbuzov synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102100035985 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 5-phosphatase A Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229950005033 alanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000006854 communication Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000002062 molecular scaffold Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000002922 simulated annealing Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は一般にコンビネーション化学及び組み換え体DNAの両方を利用した分子生物学的方法による、結合性であり触媒性であるポリペプチドの製造及び選別の分野に関する。具体的には、本発明はそのループ領域の1またはそれ以上が変更されたフィブロネクチンIII型(Fn3)の分子骨格(scaffolding)をコードする核酸及びそれに由来するポリペプチドの両者のライブラリーの作成に関する。本発明はまた、例えば各種分子構造(抗体結合部位の様な)へ結合できるループ域が移殖されたFn3骨格(scaffolding)を含むポリペプチド、すなわち“人工ミニ−抗体”または“モノボディー”(monobody)に関する。
発明の背景
抗体の構造
通常、抗体(Ab)は2本の同一の免疫グロブリン(Ig)重鎖及び2本の同一の軽鎖より成る4量構造体である。Abの重鎖と軽鎖は異なる領域を含む。軽鎖はそれぞれ1可変領域(VL)と1不変領域(CL)を含むが、重鎖はそれぞれ1の可変領域(VH)と3または4の不変領域(CH)を含む(Alzariら、1988)。各領域は〜110アミノ酸残基より成り、2枚のβシートが相互に包み合って折り込まれて特徴的なβサンドイッチ構造、免疫グロブリンフォールドになっている。VH及びVL領域はそれぞれ、その領域の一端部でβシートと連結しているループまたは折れ曲がり部である3カ所の相補性決定領域(CDR1〜3)を有している(図1:A,C)。一般に軽鎖および重鎖の可変領域は共に抗原特異性に関係しているが、個々の鎖の特異性への関係の強さは必ずしも同じではない。抗体分子は6カ所のループ(CDRs)を無作化し利用することで、多数の分子と結合するよう発展してきた。しかし、たとえ最終結果が比較的小さなペプチドドリガンドであっても、抗体の大きさ及び6カ所のループの複雑さが設計上の大きなハードルになっている。
抗体の亜構造
Absの機能構造体は、蛋白質解析及び組み換え法により調製することができる。これらには、1つの鎖間ジスルフィド結合により連結した重鎖のVH−CH1領域と軽鎖のVL−CL1領域を含むFab断片と、VH及びVL域だけを含むFv断片とがある。1VH域が十分な親和性をもつこともある(Wardら、1989)。特定の単量体κ軽鎖が同源性(cognate)抗原に対し特異的に結合することも示されている(L.Masatら、1994)。時として、分離された軽鎖または重鎖が抗原結合活性を保持することが知られている(Wardら、1989)。これらの抗体断片は、その大きさ、低い溶解性または立体構造安定性の低さからNMRスペクトル法による構造解析には適していない。
別の機能構造体は、ペプチドリンカーにより共有結合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変域を含む単鎖Fv(scFv)である(S−zHuら、1996)。これら小(Mr25,000)蛋白は一般に単ペプチド中の抗原に対する特異性と親和性を保持しており、より大きな抗原特異的分子の簡便な構成単位を提供することができる。各種腫瘍抗原に反応性であるscFvを利用した異種移植無胸腺マウスに於ける成体分布研究をいくつかのグループが報告しており、その中で腫瘍の特異的な分布が観察されている。しかし、循環血液中でのscFvの寿命は短いことから、scFvsへの腫瘍細胞の暴露は限られており、取り込みのレベルも限られている。結果として、無傷抗体の場合には投与量の30〜40%ID/gが腫瘍内に局在し、60〜70%ID/gに達すこともあるのに対し、動物研究に於ける腫瘍のscFvs取り込みは1〜5%ID/gにすぎない。
“ミニボディー(Minibody)”と称される小蛋白骨格は、IgVHの一部を鋳型として利用して設計される(Pessiら、1993)。インターロイキン6に対し高い親和性(解離定数(Kd)〜10-7M)ミニボディーが、CDR1とCDR2に相当するループを無作為化し、それからファージディスプレー法を利用して突然変異を選別することで特定されている(Martinら、1994)。これらの実験は、Ab機能のエッセンスをより小さなシステムに転移可能であることを示している。しかし、ミニボディーはVH域の低溶解性を引き継いでいる(Bianchiら、1994)。
ラクダ(Camelus dromedarius)では、血清由来のIgG様物質を解析するとしばしば可変軽鎖域を欠損していることが報告されており、抗体特異性及び親和性がVH域(3CDRループ)だけに由来することもあることが示唆されている。最近、DaviesとRiechmannは高い親和性(Kd−10−7M)および特異性を持つ“ラクダ化"VHドメインはCDR3だけを無作為化し作成できることを報告している。溶解性を改善し、非特異的結合を抑制するために、3種類の突然変異がフレームワーク域に導入された(Davies & Riechmann,1995)。しかし、VHsの溶解性と安定性の改善にラクダ化が一般的に利用できるかはまだ明らかではない。
別の“ミニボディー”に“ダイアボディー(diabody)”がある。ダイアボディーは小さな二価の二重特異性抗体断片であり、即ちこれらは2カ所の抗原結合部位を持っている。該断片は同一ポリペプチド鎖上に重鎖可変域(VH)と軽鎖可変域(VL)が結合したものである(VH−VL)。ダイアボディーはFab断片と同等の大きさである。同一鎖上の2つの領域間を対合させるには短すぎるリンカーを利用し、該領域を別の鎖の相補的な領域と対合させ、2抗原結合部位を作り出す。これら2量体抗体断片または“ダイアボディー”は2価であり、二重特異的である。P.Holligerら、PNAS 90:6444−6448(1993)。
モノクローナル抗体技術の発達により、複合体及び/または遊離状態にあるAb断片の3D構造の多くはX−線結晶学により解明されてきた(Websterら、1994;Wilson & Stanfield,1994)。Ab構造の解析から、6つあるCDRsのうちの5つはペプチド主鎖の立体構造の数が限られており、従っていわゆるカノニカル構造を利用してCDRsの主鎖構造を推測することができる(Lesk & Tramontano,1992;Reesら、1994)。さらに分析からは、VH域のCDR3(VH−CDR3)が通常最も広い接触面積を有していること、そしてその立体構造がカノニカル構造を特定するには多様性に富むことも示された;VH−CDR3はまた長さも多様であることが知られている(Wuら、1993)。従って、Ab−抗原インターフェイスの結合域の構造について実験的に決定することがまだ求められている。
遊離状態または複合体状態間の結晶構造の比較からは、複数のタイプの立体構造の再配置が示されている。これらの中には側鎖の再配置、断片の移動、VH−CDR3の大規模な再配置及びHVとVL域の相対位置の変化がある(Wilson & Stanfield,1993)。遊離状態では、特に結合によりよって大きく立体構造が変化するCDRsはフレキシブルであると推測される。X−線結晶学は分子のフレキシブルな部分を調べるには不適であるため、液体状態に於ける構造研究は抗原結合部位の立体構造の動的な像を提供しない。
抗体−結合部位を模倣する
CDRペプチドと有機CDRの模倣体が作られている(Dougallら、1994)。CDPペプチドは短く、典型的には抗体のCDRループのアミノ酸配列に相当する環状のペプチドである。CDRループは抗体−抗原相互作用に関与している。有機CDR模倣体は、例えば小有機化合物の様な骨格に結合するCDループに対応するペプチドである。
CDRペプチド及び有機CDR模倣体はある程度の結合親和性を保持していることが知られている(Smyth & von Itzstein,1994)。しかし、予想される様にこれらは小さすぎ、またフレキシブル過ぎて完全に親和性と特異性を保つことはできない。マウスCDRsは親和性を失うことなくヒトIgフレームワーク上に移植されている(Jonesら、1986;Riechmannら、1988)が、この“ヒト化”によっても上記の液体研究に特有の問題を解決されていない。
Abの天然選択プロセスの模倣
免疫系では、特定のAbsが大きなライブラリーより選択され増幅される(親和性成熟)。このプロセスは組み替え体ライブラリー技術を利用してin vitroで再現することができる。バックテリオファージ表面へ上手くAb断片を表現させることで、きわめて多数のCDR変異体を作成し、スクリーニングすることができる(McCaffertyら、1990;Barbasら、1992;Winterら、1994)。上記技術によりFabs及びFvs(並びにその誘導体)の数を増加させることができ、構造研究の豊富な材料が提供される。コンビネーショナル技術はAb模倣体と組み合わせることができる。
蛋白骨格として機能できる蛋白ドメインの多くはファージカプシド蛋白質と融合した形で発現される。Clackson & Wells、Trends Biotechnol.12:173−184(1994)のレビュー。さらに、これらの蛋白域のいくつかは既に牛膵臓トリプシン阻害剤(Robertsら、PNAS89:2429−2433(1992))、ヒト成長ホルモン(Lowmanら、Biochemistry 30:10832−10838(1991))、Vernturiniら、Protein Peptide Letters1:70−75(1994))、及びブドウ球菌(Streptococcus)IgG結合域(O'Neilら、Techniques in Protein Chemistry V(Crabb、L、編集)pp。517−524、Academic Press.San Diego(1994))を含む無策為ペプチド配列を提示するための骨格体として利用されておいる。これら骨格体は1個の無作為化されたループまたは領域を提示する。
研究者は繊維状ファージM13の代表的な骨格体として、小さな74アミノ酸のα−アミラーゼ阻害剤であるテンダミスタット(Tendamistat)を利用している(McConnellとHoess,1995)。テンダミスタットはストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae)由来のβシート蛋白である。この蛋白は、その大きさが小さいこと、安定性、高解像度NMRやX−線構造データが利用できることなどペプチド骨格体として魅力的な特徴を有している。テンダミスタット全体のトポロジーは免疫グロブリンのトポロジーに似ており、2枚のβシートが一繋がりのループによって結合している。免疫グロブリンと異なり、テンダミスタットのβシートは1本ではなく2本のジスルフィド結合により結合している。免疫グロブリンに見られるCDRループとの類似性より、テンダミスタットのループも同様の機能を果たし、in vitro突然変異により容易に無作為化できると考えられる。
しかし、テンダミスタットはストレプトマイセス・テンダエに由来している。このことはテンダミスタットがヒトでは抗原性を有しているが、そのオキサが小さいためにその抗原性を減じているか、または阻害している可能性がある。また、テンダミスタットの安定性は不明である。さらに、テンダミスタットの安定性は2本のジスルフィド結合の存在に拠ると報告されている。しかし、ジスルフィド結合は還元状態下に破壊される様な分子では明らかに不利であり、有益な蛋白構造を持たせるためには適切に形成させる必要がある。さらにテンダミスタットのループの大きさは比較的小さいため、骨格内に合致できるインサートの大きさに制限がある。さらに、新しく合成されたペプチド中に正確にジスルフィド結合を形成することは容易ではないことが知られている。蛋白質が、最も一般的な蛋白過剰発現の宿主細菌である大腸菌の細胞質空間に発現される場合、通常ジスルフィド結合は形成されず、特に大量の人工分子を調整することを困難にしている。
上記のように、各種の治療、診断および触媒応用を目的とした、小さい、単鎖型人工抗体が現在も求められている。
発明の要約
本発明は、複数のループ域配列と結合する複数のFn3−β鎖域配列を提供する。Fn3ポリペプチドのモノボディーループ域配列の1つあるはそれ以上が、対応する野生型のFn3のループ域配列について少なくとも2個のアミノ酸が欠損し、あるいは挿入し、または置換することで変異する。モノボディーのβ鎖域は、野生型Fn3の対応アミノ酸配列に対し少なくとも約50%の全アミノ酸配列相同性を有している。好ましくは、モノボディーのループ域の1つ、またはそれ以上が次のアミノ酸残基を含む:
i)ABループに包含される15〜16;
ii)BCループに包含される22〜30;
iii)CDループに包含される39〜45;
iv)DEループに包含される51〜55;
v)EFループに包含される60〜66;及び
vi)FGループに包含される76〜87。
本発明はまた、本発明のFn3ポリペプチドモノボディーをコードする核酸分子、ならびに該核酸分子を含む発現ベクター、及び該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、Fn3ポリペプチドモノボディーを調整する方法を提供する。本方法は、複数のループ域配列と連結する複数のfn3β鎖域配列をコードするDNA配列にあって、該配列の少なくとも1つのループが特有の制限酵素部位を含むものも提供する。該DNA配列は特定制限酵素部位で切断される。前もって選択されたDNA断片は特定の結合相手(SBP)と結合できるペプチド、または遷移状態アナログ化合物(TSAC)をコードする。前もって選択されたDNA断片をDNA配列中に挿入することで、挿入部を有するポリペプチドモノボディーをコードするDNA分子を得る。続いてDNA分子を発現し、ポリペプチドモノボディーを得る。
さらに、少なくともその内の1つのループ域のヌクレオチド配列が、既知である複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードする、複製可能なDNA配列を提供することを含むFn3ポリペプチドモノボディーの調整方法を提供する。PCR条件下にハイブリダイズ可能な程度に既知ループ配列に対し十分に相補的であり、その少なくとも一つがDNA配列中に挿入される修飾核酸配列を含んでいるポリメラーゼチェインリアクション(PCR)プライマーを提供し、または調整する。次に、PCRの反応産物を発現し、ポリペプチドモノボディーを得る。
本発明はさらにFn3ポリペプチドモノボディーを調整する方法を提供する。該方法は、少なくとも1つのループ域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードする複製可能なDNA配列を提供することを含む。少なくとも1ループ域に部位特異的突然変異を実施し、挿入変異体を作る。次に、得られた挿入変異を含むDNAを発現する。
さらに、野生型Fn3中の対応するループ域より少なくとも2個のアミノ酸が欠損し、または挿入され、あるいは置換されることで1つまたはそれ以上のモノボディーループ域配列が変異した複数のループ域配列と結合する、複数のFn3β鎖域配列をコードする複数の核酸種を含むFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーを提供するが、該モノボディーβ鎖域は野生型Fn3のβ鎖域配列の対応アミノ酸配列に対し少なくとも50%の全アミノ酸配列相同性を有している。さらに本発明は、本発明の変異核酸ライブラリーに由来するペプチド提示ライブラリーも提供する。おそらく、ペプチド提示ライブラリーのペプチドはバクテリオファージ、例えばM13バクテリオファージまたはfdバクテリオファージ、またはウイルスの表面に提示されるだろう。
本発明はまた、特定の結合相手(SBP)と結合してポリペプチド:SSP複合体を形成し、該ポリペプチド:SBP複合体の解離定数が10-6モル/リッターより小さいポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法を提供する。該方法は次の工程を含む:
a)本発明のペプチド提示ライブラリーを用意し;
b)上記(a)のペプチド提示ライブラリーを固定した、または分離可能なSBPと接触せしめ;
c)ペプチド:SBP複合体の遊離型ペプチドから分離し;
d)分離したペプチドを複製することで、多様性の低い、SBPと結合できる提示ペプチドに富んだ(a)のライブラリーとは異なる新ペプチド提示ライブラリーを得:
e)必要に応じて、(d)の新たなライブラリーについて工程(b),(c)および(d)を繰り返し;そして
f)上記(d)の種の提示ペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、それによりSBPと結合できるペプチド配列を演繹する。
本発明はまた、複数のループ域をそれぞれ含む核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーを調製する方法にあって、該核酸種が複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードし、該ループ域配列の1またはそれ以上が野生型Fn3中の対応ループ配列より少なくとも2アミノ酸が欠失、挿入、または置換され変異したものである、次の工程を含む方法を提供する。
a)主要な配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し;
b)ポリペプチドを特異的結合相手(SBP)と接触させ、その解離定数が10-6モル/リッターより小さい、ポリペプチド:SSP複合体を形成せしめ;
c)該磁気共鳴またはX−線結晶法によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し;そして
d)上記(c)より提供される情報より、SBPへの結合が改良された1またはそれ以上のポリペプチドを生ずる核酸配列部位へのモザイク処理を行い、モザイク型核酸ライブラリーを調製する。
さらにkcat/kuncatが10以上である触媒速度定数kcat及び非触媒速度定数kuncatの化学反応を触媒できるポリペプチド分子のアミノ酸配列の特定方法を提供する。本法は次の工程を含む:
a)発明のペプチド提示ライブラリーを用意し、
b)上記(a)のペプチド提示ライブラリーと、化学反応の近似分子遷移状態を表す固定された、または分離可能な遷移状態類似化合物(TSAC)を接触せしめ、
c)遊離ペプチドからペプチド:TSAC複合体を分離し;
d)上記(c)で分離されたペプチドを複製し、多様性が低く、かつTSACに結合することができる提示ペプチドが豊富であることで(a)のものと区別される新ペプチド提示ライブラリーを得;
e)必要に応じて(d)の新規ライブラリーについて工程(b),(c)及び(d)を繰り返し;そして
f)上記(d)から1種の提示ペプチドをコードする領域の核酸配列を特定し、それからペプチド配列を演繹する。
本発明はまた、それぞれが複数のループ域を含む核酸種を有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーにあって、該核酸種が複数のループ域配列と結合するFn3β鎖域配列を複数含み、前記ループ域配列の1つまたはそれ以上が野生型Fn3中の対応するループ域配列より少なくとも2個のアミノ酸が欠失し、または挿入され、あるいは置換され変異したものであり、さらに前記モノボディーβ鎖域配列が野生型Fn3のβ鎖域配列の対応アミノ酸配列に対し少なくとも50%の前アミノ酸配列相同性を有しているものである、以下の工程を含む方法;
a)前もって定められ配列を有し、そのポリペプチドがkcat/kuncatが10以上である触媒速度定数kcat及び非触媒速度定数kuncatの化学反応を触媒しうるものであるFn3ポリペプチドモノボディーを調製し;
b)化学反応の近似分子遷移状態を表す固定された、または分離可能な遷移状態類似化合物(TSAC)にポリペプチドを接触せしめ;
c)核時期共鳴またはX−線血漿学によりポリペプチド:TSAC複合体の結合構造を決定し;そして
d)上記(c)より提供された情報を基にし核酸配列中の問題位置をモザイク化したモザイク型核酸ライブラリーを調製し、TSACへの結合性とTSCの安定性を改良した1つまたはそれ以上のポリペプチドを得る。
本発明はまた本発明の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。本発明はさらに、本発明の方法のいずれかによるキットを利用し調製される、または特定される成分、例えばポリペプチドを提供する。
アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質の記載には次の略称が使用されている;Ala、またはA、アラニン;Arg,またはアルギニン;AsnまたはN,アスパラギン、Asp,またはD、アスパラギン酸;CysorC、システイン;Gln、またはQ、グルタミン;GluまたはE、グルタミン酸;Gly,またはG、グリシン;His,またはH、ヒスチジン;Ile、またはI、イソロイシン;Leu、またはL,ロイシン;Lys、またはK、リジン;Met、またはM,メチオニン;Phe,またはF.フェニルアラニン;Pro,またはP,プロリン;Ser,またはS、セリン;ThrまたはT、スレオニン;Trp、またはW,トリプトファン;Tyr、またはY、チロシン;Val、またはV、バリン。
核酸、DNAまたはRNAの記載では次の略称が使用されている;A、アデノシン;T,チミジン;G,グアノシン;C,シトシン。
図の簡単な説明
図1.抗ライソゾーム免疫グロブリンD1.3(A,C;Bhatら、1994)及びヒトフィブロネクチンの第10III型ドメイン(B,D;Mainら、1992)のVHドメインのβ鎖及びループトポロジー(A,B)とMOLSCRIPT例(C,D;Kraulis,1991)。相補的決定域の位置(CDR、超可変域)及びインテグリン−結合Arg−Gly−Asp(RGD)配列が示されている。
図2.合成Fn3遺伝子のアミノ酸配列と制限酵素部位。残基番号はMianら(1992)に従った。デザインされた制限酵素部位をアミノ酸配列の上に示した。β鎖については下線を引いた。続くクローニング用にN−末端“mq"配列を発現ベクターに加えた。His−タグ(Novagen)融合蛋白はさらに上記Fn3配列の前に追加配列、MGSSHHHHHHSSGLVORGSHを有している。
図3.A,25℃および90℃に於ける野生型Fn3のFar UV CDスペクトラ。Fn3(50μM)は酢酸ナトリウム(50mM、pH4.6)に溶解した。B,215nmでモニターしたFn3の熱変性。温度は1℃/分の割合で上げた。
図4.A,ライソゾーム(HFL)と抗−ニワトリ卵−白色ライソゾーム(抗−HEL)抗体D.3(Bhatら、1994)のFv断片の複合体の結晶構造のCαトレース。HELと接触するVH CDR3残基99〜102の側鎖も示されている。B,D1.3VHの残基番号に対しプロットしたD1.3 VH−HELとVH−VLが相互作用するそれぞれの残基の接触面領域、表面領域及び二次構造はDSSPプログラム(KabshおよびSander,1983)を用いて決定した。C及びD,D1.3 VH(C)及びFn3(D)のF鎖−ループ−G鎖成分のβシート構造の模式図。四角はβ鎖内の残基を示し、○は鎖内にない残基を示す。かげ線の四角は側鎖が明らかに埋没している残基を示している。破線は水素結合を示す。
図5.DNA及びアミノ酸配列を示すデザインされたFn3遺伝子。アミノ酸番号はMainら(1992)に従った。コンビネーショナルライブラリー中に無作為化された2つのループは四角で囲った。
図6.プラスミドpAS45のマップ。プラスミドpAS45はヒス・タグ−Fn3の発現ベクターである。
図7.プラスミドpAS25のマップ。プラスミドpAS25はFn3の発現ベクターである。
図8.プラスミドpAS38のマップ。プラスミドpAS38はFn3の表面提示用のファージミドベクターである。
図9.(ユビキチン−1)ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を利用した濃縮クローンのリガンド特異的結合の特徴。マイクロタイタープレートウエルをユビキチンでコートし(1μg/ウエル;"リガンド(+))、続いてBSAでブロックした。およそ1010コロニー形成単位(cfu)を含むファージのTBS液をウエルに加え、TBSで洗浄した。結合したファージを抗ファージ抗体−POD標識体(Pharmacia)と、基質としてTurbo−TMB(Pierce)を用いて検出した。吸光度をMolecular Devices SPECTRAmax 250マイクロタイタープレート分光光度計を用いて測定した。コントロールには固定リガンド無しのウエルを利用した。2−1及び2−2は、それぞれ遊離型リガンドならびに酸によりライブラリー2より溶出された濃縮クローンを示す。4−1および4−2はそれぞれ、遊離型リガンドおよび酸でライブラリー4より溶出された濃縮クローンを示す。
図10.(ユビキチン−2)濃縮クローンの競合ファージELISA。まず、リガンドコートしたウエルへ結合させる前に、およそ1010コロニーcfuのファージを含むファージ液を遊離ユビキチンと4℃、1時間反応した。細胞を洗浄し、上記と同様にしてファージを検出した。
図11.ユビキチン結合モノボディー411の競合ファージELISA。実験条件はユビキチンに関する上記に同じである。ELISAは結合液中に遊離ユビキチンが存在する条件で実施した。実験は同一クローンの異なる4調整体で実施した。
図12.(フルオロセイン−1)4種類のクローン、pLB25.1、pLB25.4、pLB24.1及びpLB24.3のファージELISA。実験条件は上記ユビキチン−1に同じである。
図13.(フルオロセイン−2)4種類のクローンのファージELISA。実験条件は上記ユビキチン−2に同じである。
図14.蛍光−結合モノボディーLB25.5の1H,15H−HSQスペクトラム。およぼ20μM蛋白を100mMの塩化ナトリウムを含む10mm酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解した。スペクトラムはVarian Unity INOVA 600NMRスペクトロメーターで30℃で集めた。
図15.標的ユビキチンに対するUbi4−Fn3の結合反応の特徴。
(a)ユビキチンに対するUbi4−Fn3結合のファージELISA分析。ユビキチンでコートしたウエルへのUbi4−ファージの結合を測定した。コントロール実験はユビキチンを含まないウエルを利用し実施した。
(b)Ubi4−Fn3の競合ファージELISA。Ubi4−Fn3−ファージを指定濃度のユビキチン液と前反応し、続いてユビキチンでコートしたウエルでファージELISA検出を行う。
(c)Ubi4クローン特異性を試験する競合ファージELISA。Ubi4ファージを250μg/mlの蛋白液と前反応し、続いて(b)同様にファージELISAを行う。
(d)遊離蛋白を利用したELISA
図16.Ubi4−Fn3(塗りつぶし)及び野生型Fn3(中空)の平衡折り畳み曲線。四角はTBS(NaCl(150mM)を含むTris HCl緩衝液(50mM,pH7.5)中で測定したデータを示す。丸はNaCl(300mM)を含むGly HCl緩衝液(20mM,pH3.3)中で測定したデータを示す。曲線は2状態モデルに基づく遷移曲線に最も良い適合を示した。遷移を特徴付けるパラメータは表7にまとめた。
図17.(a)[15N]−Ubi4−K Fn3の1H,15N−HSQCスペクトラム。(b)。残基番号に対しプロットした1H(b)および15N(c)の化学シフトの差(δwild-type−δUbi4)。Ubi4−K欠損が無い場合の残基82〜84(塗りつぶしの丸で示した)の値。中抜き丸はUbi4−K蛋白中の変異残基を示す。β鎖の位置は矢印で示した。
発明の詳細な説明
過去10年間、免疫系はde novo触媒の豊富な源として活用されてきた。触媒抗体は化学選択性、鏡像異性体選択性、大きな速度加速脳、及び化学反応の新規経路開発能を持つことが示されている。多くの場合、抗体は遷移状態類似(TSA)ハプテンに対し惹起されている。これらTSAハプテンは、反応体と生産物の間の反応経路に短時間(約半減期10-13s)に出現するエネルギー的に不安定な遷移状態種の構造を模した安定な低分子量化合物である。抗TSA抗体は天然酵素と同様に選択的に結合して遷移状態を安定化し、それにより反応体から産生物までの経路を簡便にする。即ち、結合により抗体が実際の遷移状態のエネルギーを低下し、反応速度を上げる。これら触媒を遷移状態の幾何学的及び静電気的な機構に結合し、不利益な電荷を中和し、エントロピーバリアーを克服して、反応体の立体電気的機構を指示する反応経路をコントロールできる様にコントロールできる。この方法によれば非常に不向きな反応も触媒することができる(Jandaら、1997)。さらに、多くの場合触媒は天然または人工酵素が得られていない反応について作成されている。
特定機能を得る為のコンビネーショナル化学システムが成功するか否かはライブラリーの大きさ及び、そのメンバーへの接近能に依存している。まず反応遷移状態を模したハプテンに対する動物に作らせた抗体をハプテンに対する結合に関しスクリーニングし、続いて触媒活性に関しスクリーニングすることが極めて多い。改良法ではファージの抗体ライブラリーより触媒を直接選択し、それを利用して化学と複製に連結することができる。
抗体断片のライブラリーは、無作為化した抗体遺伝子をファージのコート蛋白をコードする遺伝子に加えることで繊維ファージウイルスの表面に作ることができる。次に各ファージはその表面に1種類の抗体断片のコピーを複数発現し提示する。各ファージは表面に提示した抗体断片とその断片をコードするDNAの両方を有しており、標的に結合する抗体断片は付属のDNAを増幅することで特定することができる。
免疫化学では化学的反応性が可能な限り小さい物質を抗原として利用する。多くの場合、最終的な抗体は無傷の構造体と相互作用することが望まれる。反応性免疫では、コンセプトは全く逆である。誘導プロセスに於ける抗体分子への結合ににより、化学反応が生じるほと強く反応性である化合物を免疫する。その後、これと同じ化学反応が触媒現象のメカニズムの一部となる。場合によっては、それ自体物質ではない化学反応により免疫することがある。反応性免疫源は、メカニズムを阻害する代わりにメカニズムを誘導するという逆の形で利用されること除けばm酵素学者が利用するメカニズムに基づく阻害剤に類似のものであると考えられる。
人工触媒抗体は多くの様々な応用について、大きな産業的な可能性を有している。触媒抗体に基づく産物はプロドラッグの活性化やコカインの不活化といった治療応用のプロトタイプ実験や、バイオセンサー及び有機合成といった非治療応用に利用され、成功している。
触媒抗体は非触媒性抗体に比べより触媒的であり、低用量で使用でき、またその作用が通常可逆的であることから(例えばペプチド結合は結合するよりもむしろ切断する)、理論的には非触媒性抗体に比べて治療薬としてより魅力的である。治療に於いては、精製された触媒抗体を直接患者に投与し、あるいは適当なハプテンで免疫化して患者自身の触媒抗体応答を惹起することができる。触媒抗体はまた臨床診断の道具とし、あるいはファインケミカルの合成に於ける部位特異的または立体特異的触媒としても利用できる。
1.Fn3ループの変異およびFn3へのAbループの移殖
CDR移植用の理想的な骨格は溶解性に優れ安定している。それは構造解析に十分な小ささを持ち、かつ複数のCDRsを調節するのに十分な大きさを持ち、高い結合性及び/または特異性を得ている。
既存非Ab蛋白のフレームワーク上に人工Abシステムを構築する新しい方法が開発された。このAb骨格を最小化するという方法の利点は、不要のAbs特性を引き継がずにすむことである。フイブロネクチンIII型域(Fn3)が骨格として利用されている。フィブロネクチンは細胞外基質の形成と細胞−細胞相互作用で重要な役割を果たす巨大分子である;それは3つの型(I,II及びIII)の小ドメインの多数の繰り返しより成っている(Baronら、1991)。Fn3それ自体は免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)の大サブファミリー(Fn3ファミリーまたはs−型Igファミリー)の代表例である。Fn3ファミリーには細胞接着分子、細胞表面のホルモン及びサイトカインのレセプター、シャペロン、及び炭水化物結合ドメインを含んでいる(Bork & Doolittle,1992;Jones、1993;Borkら、1994;Campbell & Spitzfaden、1994;Harpez & Chothia、1994)。
最近、結晶学研究より転写因子NF−kBのDNA結合域の構造もFn3溝に密接に関係していることが示された(Ghoshら、1995;Mullerら、1995)。これら蛋白質は全て特異的分子認識に関与しており、多くの場合リガンド結合部位は表面ループにより形成されていることから、Fn3骨格は結合特異的結合蛋白の優れたフレームワークであることが示唆されている。Fn3の3D構造はNMR(Mainら、1992)及びX線結晶学(Leahyら、1992;Dickinsonら、1994)により決定されている。Fn3のβ鎖が9個ではなく7個である以外、その構造はAbのVH域の構造に似たβサンドイッチとして最も良く表現される(図1)。Fn3のそれぞれの末端には3個のループがある;BC,DE及びFGループの位置はそれぞれVH域のCDR1,2及び3に対応する(図1C、D)。
Fn3は小さく(〜95残基)、単量体であり、可溶性で安定している。これはジスルフィド結合を持たない数少ないIgSfのメンバーの一つである;VHは鎖間ジスルフィド結合(図1A)を持ち、還元状態での安定性は低い。Fn3は大腸菌で発現されている(Aukhilら、1993)。さらにヒトフィブロネクチンには17個のFn3域が存在しており、安定性と折りたたみにとりしばしば重要である保存的残基に関する重要な情報を提供している(例えば配列のアライメント、Mainら、1992とDickinsonら、1994参照)。配列解析から、BC及びFGループには大きな多様性が認められており、これらループが安定性には重要でないことが示唆されている。NMR研究からは、FGループが非常にフレキシブルであることが示されている:この柔軟性は第10Fn3がArg−Gly−Asp(RFD)モチーフを介してα5β1インテグリンに特異的に結合することと密接に関係している。ヒト成長ホルモン−レセプター複合体の結晶構造(de Vosら、1992)では、レセプターの第2Fn3域がFG及びBCループを介してホルモンと相互作用しており、この2個のループを利用して結合部位が形成される可能性が示唆されている。
フィブロネクチンの第10III型モジュールは免疫グロブリン域の同モジュールと似た折りたたみを有しており、7本のβ鎖より形成され、相互に包み合う2枚の逆平行のβシートを持つ(Mainら、1992)。II型モジュールの構造は2枚の逆平行βシートのサンドイッチを形成する7本のβ鎖より成り、1方のシートが3本(ABE)、もう一方のシートが4本(C'CFG)の鎖を含んでいる(Williamsら、1988)。3本鎖のβシートはGlu−9−Thr−14−(A)、Ser−17−Asp−23(B)及びThr−56−Ser−60(E)の残基を含む。保存残基の大部分は疎水性核を形成し、核のN−末端とC−末端に向かってそれぞれ不変型の疎水性残基、Trp−22とTry−68が配されている。β鎖は柔軟性に劣ることから、その上に機能的なフレキシブルループが形成される堅牢なフレームワークを提供すると考えられている。トポロジーは免疫グロブリンC域のトポロジーに似ている。
遺伝子の構築および突然変異誘導
ヒトフィブロネクチンの第10Fn3の合成遺伝子(図2)は、突然変異誘導を容易にするために好都合である制限酵素を含み、高レベルの蛋白発現のため特異的コドンを利用する形に設計された(Gribskovら、1984)。
この遺伝子を次の様にして組み立てた:(1)遺伝子配列を設計された制限酵素部部位を境にして5つの部分に分割した(図2);(2)各部分について、反対鎖をコードし、−15塩基が相補的に重なり合うオリゴヌクレオチドの対を合成した;(3)2本のオリゴヌクレオチドをアニールし、1本鎖の領域をDNAポリメラーゼのクレノー断片(Klenow fragment)を利用して満たした;(4)2本鎖オリゴヌクレオチドを、断片の末端にある制限酵素部位を利用してpET3aベクター(Novagen)にクローニングし、その配列をメーカーより提供されたジデオキシターミネーション法をもちいてApplied Biosystems DNAシークエンサーにより確認した;(5)全遺伝子(プラスミドpAS25)(図7)が得られるまで工程2−4を繰り返した。
この方法は1ステップポリメラーゼチェインリアクション(PCR)法(Sandhuら、1992)に比べると遺伝子組立に時間を要するが、遺伝子に変異が起こることが無い。変異はTaqポリメラーゼによる忠実度の低い複製により導入されると考えられており、時間のかかる遺伝子編集が必要となる。遺伝子はまたpET15b(Vovagen)ベクター(pEW1)にもクローニングした。両ベクターはバクテリオファージT7プロモーターのコントロールの下にFn3遺伝子を発現した(Studlerら、1990);pAS25は96−残基のFn3蛋白だけを発現したが、pEW1はポリヒスチジンペプチド(His・タグ)との融合蛋白としてFn3を発現した。組み換え体DNA操作は特記無い限りMolecular Cloning(Sambrookら、1989)に従い実施した。
突然変異はカセット突然変異法またはオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法(Deng & Nickolff)のいずれかを用いてFn3遺伝子に導入した。カセット突然変異法は上記の遺伝子構築と同一手順にて行った;新規配列をコードする2本鎖DNA断片を発現ベクター(pAS25及び/またはpEW1)内にクローン化した。新たに合成した鎖(変異をコーディングしている)と遺伝子合成に用いるオリゴヌクレオチドを組み合わせることで、多くの変異体を作成することができる。得られた遺伝子の配列を決定し、変異誘導反応により設計した変異が導入され、それ以外の変異が導入されていないことを確認した。
抗体CDRsを持つFn3変異体の設計および合成
移殖のために2個の候補ループ(FG及びBC)を特定した。結晶構造が既知である抗体を調べ、Fn3に移殖されるループの供給源候補を探した。抗ニワトリ卵ライソゾーム(HEL)抗体D1.3(Bhatら,1994)をCDRループ源に選んだ。選択理由は:(1)遊離状態および複合状態に於ける高い解像度の結晶構造が得られる(図4A;Bhatら、1994)、(2)結合反応に関する熱力学データが得られる(Telloら、1993)、(3)D1.3がAb構造解析とAb工学の模範として利用されている(Verhoeyenら、1988;McCaffertyら、1990)。(4)部位特異的変異誘導実験から、重鎖(VH−CDR−3)のCDR3の親和性への関与がその他のCDRsに比べて大きいことが示されている(Hawkinsら、1993);及び(5)結合アッセイの実施が容易である。本試験の目的は、安定性を大きく損なうことなくD1.3のVH−CDR3をFn3骨格上に移すことである。
D1.3構造(図4)の分析より、VH−CDR3はより長いことが判明したが、ニワトリ卵白ライソゾーム(HEL)に直接接するのは残基99〜102(“RDYR")だけであることが示された(図4B)。またD1.3 VH−CDR3の鎖FとGの間の曲がりは(図4C)、Fn3のFGループ(図4D)に比べて短いことも明らかになった。従って、D1.3のRDYR(99〜102)を核に利用し変異配列を設計し、様々な境界とループの長さのものを作成した(表1)。より短いループがD1.3 CDR3の立体構造をより模しており、従って親和性がより高いが、同時にFn3との野生型相互作用が排除されることで安定性が大きく低下すると考えられる。
下線はβ鎖中の残基を示す。太文字は置換した残基を示す。
さらに、VH8と名付けられた抗HEL単独VH域(Wardら、1989)を鋳型に選択した。VH8はライブラリースクリーニングより選択されたものであり、VL域を欠いているがその長いVH−CDR3に拠ると思われる27nMのHELに対する親和性を有している(表1)。従って、そのVH−CDR3はFn3に移された。ループが長いと親和性が高くなり、野生型のFn3のループ長に近いため、Fn3フレームワーク上有利であると考えられる。VH8の3D構造は知られておらず、従ってVH8 CDR3の配列はD1.3 VH−CDR3の配列に合わせ並べた;2つのループを設計した(表1)。
変異体構築および産生
部位特異的変異誘導実験を実施し、設計した配列を得た。2種類の変異体Fn3s,D1.3−1及びD1.3−4(表1)を得、両変異体を可溶性His・タグ融合蛋白として発現した。D1.3−4を精製し、His・タグ蛋白をトロンビン分解して除いた。D1.3−4はpH7.2に於いて少なくとも1mMまで可溶性であった。サンプル調整中及びNMRデータ取得中に蛋白の凝集は認められなかった。
蛋白発現および精製
大腸菌(E.coli)BL21(DE3)(Novagen)を野生型または変異体の遺伝子を含む発現ベクター(pAS25、pEW1およびその誘導体)で形質転換した。細胞をM9最小培地及びアンピシリン(200μg/ml)入りバクトトリプトン(Difco)を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び/または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。2リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃で揺すった。OD(600nm)が1になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド(PTG)を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加3時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
His・タグ無しのFn3は次の様にして精製した。細胞をエチレンジアミン3酢酸(EDTA;1mM)とフェニルメチルスルフォニルフロライド(1mM)を含むTris(50mM、pH7.6)5ml/(g細胞)に懸濁した。HELを最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間超音波処理した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿を遠心分離し回収した。沈殿を5〜10mlの酢酸ナトリウムに溶解し(50mM、pH4.6)、不溶物を遠心分離により除いた。溶液を酢酸ナトリウムバッファーで平衡化したセファアルクリル(Sephacryl)S100HRカラム(Pharmacia)にかけた。Fn3を含む分画を酢酸ナトリウム(50mM、pH4.6)で平衡化したリソース(Resource)Sカラム(Pharmacia)にかけ、塩化ナトリウムの直線勾配(0〜0.5M)で溶出した。操作手順は表面電荷特性の異なる変異体産物の精製に合わせて調製できる。
His・タグ付きのFn3は次の様にして精製した。Trisバッファーの代わりに塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー(50mM、pH7.6)を使用した以外は上記同様にして細胞分画を調整した。溶液をニッケルを前負荷し、リン酸バッファーで平衡化したハイタラップ(Hi−Trap)カラム(Pharmacia)にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、His・タグ−Fn3を50mM EDTAを含むリン酸緩衝液で溶出した。His・タグ−Fn3を含む分画を酢酸ナトリウムを集め、セファアクリルS100−HRカラムにかけて、純度の非常に高い蛋白を得た。Novagen社提供のプロトコールに従いトロンビンで融合蛋白を処理し、His・タグ蛋白を切り離した。上記プロトコールに従いリソースSカラムを用いて、Fn3をHis・タグペプチドとトロンビンから分離した。
検討した野生型および2種類の変異体の蛋白は可溶性蛋白として発現していた。変異体が封入体(不溶性凝集体)として発現されている場合は、まず低温(即ち25〜30℃)で可溶性蛋白として発現されているか調べた。発現できない場合には、封入体を低速遠心分離で集めてから上記同様にして細胞を融解した。沈殿をバッファーで洗浄し、超音波処理して遠心分離した。封入体は塩酸グアニジン(GdnCl、6M)を含むリン酸バッファー(50mM、pH7.6)中で可溶可し、Hi−Trapキレートカラムにかけた。蛋白をGdnClと50mM EDTAを含むバッファーで溶出した。
変異体Fn3,D1.3−4のコンホーメーション
His・タグS1.3−4融合蛋白の1H NMRスペクトラは野生型のそれに極めて似ており、変異体が野生型と同様の立体構造に折りたたまれていることが示唆された。His・タグを除いた後のD1.3−4のスペクトラは、大きなスペクトラムの分散を示した。アミドプロトンの分散が大きく(7〜9.5ppm)とダウンフィールド(5.0〜6.5ppm)Cαプロトンの数が多いことがβシート蛋白の特徴である(Wuthrich,1986)。
D1.3−4の2D NOESYスペクトラムはさらに立体構造の保存を示す証拠を提供した。スペクトラムの一部は、アップフィールドメチルプロトン(<0.5ppm)とメチル−メチレンプロトンの間に相互作用があることを示した。Val 72γメチル共鳴吸収は野生型のスペクトラム(−0.07及び0.37ppm;(Baronら、1992))では良く分離していた。D1.3−4スペクトラムには2種類のメチルプロトンに対応する共鳴吸収が存在した(−0.07と0.44ppm)。これら2つの吸収共鳴間の交叉ピーク及びその他の保存された交叉ピークより、D1.3−4スペクトラム中のこれら2つの共鳴吸収がVa172のものと極めて近似していること、さらにその他のメチルプロトンが野生型Fn3とほぼ同一環境内にあることが示された。2種類のスペクトル間の微細な違いは変異による微細な構造攪乱によるものである。Val72はF鎖上にあり、そこでFn3の中心疎水性核を形成している(Mainら、1992)。その位置はFGループの変異残基から4残基しか離れていない(表1)。D1.3−4はループ内に7つの変異と、3個の欠失を持つにもかかわらず(全残基の10%以上;図12、表2)、その3D構造が視覚的には野生型のそれに同じであることから、この結果は注目に値する。従って、この結果はFGループがFn3分子の折りたたみ及び安定性に大きく関与しておらず、従ってFGループだけを変異できることを強く支持している。
制限酵素部位には下線を付した。N及びKはそれぞれA,T,G及びCの当モル混合体ならびにGとTの当モル混合体を意味する。
構造および安定性測定
Absの構造は、定量法(例えばDSSP(Kabsch & Sander、1983)およびPDBfit(D.McRee、The Scripps Research Institute))ならびにコンピューターグラフィクッス(例えば、Quanta(Molecular Simulations)及びWhat if(G.Vriend,European Molecular Biology Laboratory))を利用し解析し、AbsのFn3の鎖−ループ−鎖構造を積み重ねた。
温度および化学変性で誘導された巻き戻し(unfolding)反応を測定しFnAbsの安定性を決定した(Paceら、1989)。温度−誘導巻き戻し反応は円二色性(CD)施光計を用いて測定した。サンプルの温度をゆっくり上げながら222及び215nmの楕円率を測定した。サンプル濃度は10ないし50μMを使用した。巻き戻しのベースラインが決定されたら、温度を下げて巻き戻し反応が可逆的であることを確かめた。巻き戻しの自由エネルギーは、データを2状態遷移式に当てはめ決定した(Becktel & Schellman、1987;Paceら、1989)。マッキントッシュコンピューター上でプログラムIgor(WaveMetrics)を利用し非線形最小二乗法を行った。
選択した2種類の変異体Fn3sの構造及び安定性を調べた;第1の変異体はD1.3−4(表2)であり、第2変異体はAS40と呼ばれる変異体で、BCループ内に4つの変異を含んでいる(A26V27T28V29)→TQRQ)。AS40は上記のBCループライブラリーより無作為に選別された。両変異体は大腸菌の中で可溶性蛋白を発現し、少なくとも1mMまで濃縮され、NMR試験が可能であった。
両変異体の温度変性の中間点はおよそ69℃であり、野生型のそれはおよそ79℃であった。この結果は、2本の表面ループの拡大変異はFn3安定性を大きく低下させないことを示しており、従って両ループ内に多くの変異を誘導することが可能であることが示唆された。
安定性は塩化グアニジン(GdnCl)−及び尿素−誘導巻き戻し反応でも決定した。予備巻き戻し曲線をモーター駆動注射器を装着した蛍光光度計を利用して記録した;GndClまたは尿素をキュベット内の蛋白溶液に連続的に加えた。予備巻き戻し曲線に基づき、様々な濃度の変性物を含む分離サンプルを調整し、サンプルが測定温度に最低1時間平衡化した後、蛍光(290nm励起、300〜400nm発光)またはCD(222及び215nmの楕円率)を測定した。曲線は最小二乗法を利用して2状態モデル(Santoro & Bolen,1988;Koideら、1993)に適合した。必要に応じてプロトン濃度の変化を補正した。
温度巻き戻し反応の可逆性が確立された後、巻き戻し反応をMicroad MC−2ディファレンシャルスキャニングカロリーメーター(DSC)を利用して測定した。セル(−1.3ml)にFnAb液(0.1−1mM)を満たし、温度をゆっくり上げながら△Cp(=△H/△T)を記録した。遷移曲線をMirocal社提供のOriginソフトウエアーに適用し、Tm(巻き戻し中間点)、巻き戻し△H及び巻き戻しの△Gを決定した。
熱的巻き戻し
Fn3の温度誘導巻き戻し実験を円二色施光法(CD)分光計を用いて実施し、二次構造の変化をモニターした。未変性Fn3のCDスペクトラムは222nm付近にFn3の主要β鎖構造(Perczelら、1992)に一致する弱いピークを示し(図3A)た。80〜90℃に協調的巻き戻し遷移が観察され、Fn3の安定性が高いことが明瞭に示された(図3B)。巻き戻しの自由エネルギーは遷移後のベースラインを欠いたことから決定できなかった。本結果はヒトフィブロネクチンの第1 Fn3域の高い安定性(Litvinovichら、1992)と一致し、Fn3域の安定性が一般に高いことを示唆している。
結合アッセイ
FnAbsの結合反応を、等温滴定カロリーメーター(ITC)と蛍光分光計を用いて定量的に調べた。
結合の円たるピーの変化はMicrocal Omega ITC(Wisemanら、1989)を用いて測定した。サンプルセル(〜1.3ml)をFnAb液で満たし(≦100μM、Kdによって変えた)、リファレンスセルは蒸留水で満たした;ベースラインが安定するまでシステムを設定温度で平衡化した;リンガンド液(≦2mM)5〜20μlをモーター駆動式注射器を利用して短時間に注入し、平衡化した(4分);注入を繰り返し、注入毎に熱発生/吸収を測定した。リガンド濃度の関数として観察された熱変化より、△HとKdを決定した(Wisemanら、1989)。結合反応の△Gと△Sは、直接測定したこの2変数から演繹した。理論曲線からの変動を検証し、特異的(複数部位)結合について調べた。セル内のリガンドを交換し、FnAbで滴定した実験も行った。その結果、ITCだけが△Hの直接測定値を提供し、これによって結合エネルギーへのエンタルピーとエントロピーの関与が評価できたこと、それによりITCを利用してD1.3Abの結合反応のモニターに成功した(Telloら、1993;Bhatら、1994)ことを強調しなければならない。
内因性蛍光をモニターし、ITCによるKd決定が難しいμM以下のKdとの結合反応を測定した。Fn3−変異液(≦10μM)をリガンド液(≦100μM)で滴定しながらTrp蛍光(〜290nm励起、300〜350nm発光)とTyr蛍光(〜260nm励起、〜303nm発光)をモニターした。反応のKdは生体分子結合式に非線形最小二乗法を適用して決定した。二次結合部位の存在はスキャッチャード(Scatchard)分析から調べた。全ての結合アッセイで、対象のFnAbsの代わりに野生型Fn3(または無関係なFnAbs)を利用するコントロール実験を実施した。
II.高親和性と特異性FAbsによるFn3変異体の作成
特異的リガンドに結合するFnAbsを選択するためにライブラリースクリーニングを行った。これは上記のモデルする方法を補完するものである。コンビネーショナルスクリーニングの利点は、特異的変異体誘導(“合理的設計”)法では不可能な多数の変異体を(≧108)容易に作り、スクリーニングできる点である。ファージディスプレー法(Smith,1985;O'Neil & Hoess,1995)を利用し効果的にスクリーニングした。Fn3をファージのコート蛋白(p III)に融合し、繊維状ファージの表面に提示させた。これらファージはFn3融合蛋白をコードする遺伝子を含んだ単鎖DNAゲノムを取り込んでいる。Fn3の特定領域のアミノ酸配列を核酸配列を変性して無作為化し、ライブラリーを構築した。所望の結合能を持つFn3変異体を提示するファージをin vitroで選別し、回収して増幅した。選択したクローンのアミノ酸配列は、選択したファージのFn3遺伝子の配列を決定して容易に特定することができる。Smith(Smith & Scott,1993)のプロトコールに若干の改良を加え実施した。
目的は小蛋白リガンドに対し高い親和性を持つFnAbsを作成することである。HEL及びブドウ球菌蛋白GのB1域(以後、蛋白Gと称する)をリガンドとして利用した。その構造はNMRスペクトロスコピー(Gronenbornら、1991)により、4本鎖βシートに対し螺旋状に折り込まれたものであることが決定されている。得られたFnAb−蛋白G複合体(〜150残基)は、直接NMR法の範囲内にある、今日までに作られた最も小さい蛋白−蛋白複合体の一つである。両成分が小さいこと、安定性と溶解性に優れていること、さらに安定型同位元素(13Cおよび15N、以下蛋白Gについては以下参照)により安定して標識できることが、本複合体は蛋白−蛋白相互作用のNMR研究の理想モデルシステムにしている。
Fn3のループの交換の成功(変異体D1.3−4)は、全体のたたみ込みを失うことなく少なくとも10個の残基を変異することができる。これに基づき、FGループの残基だけを無作為化したライブラリーをまず構築した。BCループのループ交換実験の結果を得た後、変異部位を延ばし、BCループ及びその他の部位を含むようにした。
Fn3ファージ提示システムの構築
M13ファージを基本とする発現ベクターpASM1を以下の様にして構築した:OmpTの単一ペプチドをコーディングするオリゴヌクレオチドをFn3遺伝子の5'端にクローン化した;M13p IIIのC−末端域をコーディングする遺伝子断片を、PCRを用いてM13mp18の野生型遺伝子III遺伝子より調整し(Coreyら、1993)、OmpT−Fn3遺伝子の3'末端に挿入した;スペーサー配列をFn3とp IIIの間に挿入した。得られた断片(OOmpT−Fn2−p III)を、融合遺伝子がlacプロモーター下にコントロールされるM13mp18のマルチクローニングサイト内にクローン化した。このシステムはFn3−p III融合蛋白ならびに野生型p III蛋白を産生する。野生型p IIIの共発現は融合p III蛋白の数を減少させ、それによりファージ感染性を増大することが期待される(Coreyら、1993)(5コピーのp IIIがファージ粒子上に存在する)。さらに、強固に結合する蛋白を選別する為には、マルチ結合部位のキレート作用は5コピー全ての融合p IIIに比べて小さくなければならないことから(Bassら、1990)、融合p III蛋白の数はより少ない方が有利である。このシステムでセリンプロテアーゼトリプシンの提示に成功している(Coreyら、1993)。ファージ粒子を第2ポリエチレングリコール沈殿と酸沈殿で精製する以外標準的な方法(Sambrookら、1989)に従い、ファージを作成し、大腸菌K91kanを利用して精製した(Smith & Scott,1993)。
融合ファージ上へのFn3提示の成功はフィブロネクチンに対するAbを利用したELISAにより確認されており、このシステムを利用してライブラリーが構築できることが明瞭に示された。
fUSE5を用いた別のシステム(Pamley & Smith,1988)も利用できる。Fn3遺伝子を、Fn3遺伝子PCRの5'−及び3'−末端に導入されたSfil制限酵素部位を利用してfUSE5に挿入する。このシステムはファージ表面に融合p III蛋白(5コピーまで)だけを提示する。ファージを上記の様にして作成し、精製する(Smith & Scott,1993)。このシステムを利用し多くの蛋白及びその正常体がを提示されてきた。fUSE5の利点はその低い毒性である。これは宿主内での複製型(RF)のコピー数が少ないためであり、そのためライブラリー構築のためのRFを十分量調整することを難しくしている(Smith & Scott,1993)。
ライブラリーの構築
最初のライブラリーはFGループ(図4D)内の7つの残基(77〜83)を無作為化し、MBファージの表面にFn3域を提示させたものを構築した。無作為化は変性ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し実施できる。二重鎖ヌクレオチドは、1本の鎖の変異部位に、NがA,T,G及びCの等モル混合体であり、KがGおよびTの等モル混合体である(NNK)6(NNG)配列をもつ以外遺伝子合成(上記)と同様のプロトコールにより調整される。残基83の(NNK)コドンは、Sac I制限酵素部位の保存に必要である(図2)。(NNK)コドンは20種類全てのアミノ酸をコードしているが、NNGコドンは14種類をコードしている。従って、このライブラリーは〜109の別々の配列を含んでいる。二重鎖ヌクレオチドを野生型ファージベクター、pASM1内に連結し、エレクトロポレーションを利用し大腸菌XL1ブルー(Stratagene)に形質転換しレイブラリーを作成した。XL1ブルーはlac Iq表現形を有しており、即ちlac誘導体の無い状態ではFn3−p III融合蛋白の発現を抑制する。同様にして最初のライブラリーを継代し、有害なFn3−p IIIクローンに対する選別を避ける。K91kanをもつファージを宿主として継代し、無作為化したFn3−p III融合蛋白を提示するファージを調整した。K91kanはlac Iqを有していないことから、融合蛋白の産生を抑制しない。BCループ(残基26〜20)を無作為化した別のライブラリーも作成した。
提示されたFnAbの選別
バイオパンニングプロトコール(Smith & Scott、1993)を利用してFn3ファージライブラリーをスクリーニングした;リガンドはビオチンかされており、強いビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用しリガンドをストレプトアビジンをコートした皿に固定した。実験は室温で行った(〜22℃)。ライブラリーからの最初のファージ回収を行うためい、10μgのビオチンかリガンドをストレプトアビジンをコートしたポリスチレン皿(35mm,Falcon1008)に固定し、続いてファージ液(〜1011pfu(プラーク形成単位)を加えた。この皿を適当なバッファー(典型的にはTBST、Tris−HCl(50mM、pH7.5)mNaCl(150mM)及びTween20(0.5%))で洗浄した後、結合したファージを以下の条件の一つまたはその組み合わせにより溶出した;低pH、遊離型リガンドの添加、尿素(6Mまで)、抗蛋白GFnAbsの場合トロンビンによる蛋白G−ビオチンリンカーの開裂。回収されたファージを、K91kanを宿主として利用する標準的プロトコールにより増幅した(Sambrookら、1989)。選択プロセスを3〜5回繰り返し陽性クローンを濃縮した。2回目からリガンド量を漸次減らし(〜1μgまで)、皿に移す前にビオチン化したリガンドをファージ液と混合した(G.P.Smith、私信)。最終回後、10〜20クローンを採取し、そのDNA配列を決定した。クローンのリガンドの親和性をまずファージELISA法で測定した(以下参照)。
Fn3フレームワークのリガンドへの強い結合を抑制するために(バックグランド結合)、野生型Fn3をバッファー中に競合体として加えることができる。さらに、無関係な蛋白(例えばウシ血清アルブミン、チトクロームcおよびRNaseA)を競合体として利用し、より特異的なFnAbsを選別した。
結合アッセイ
ファージへのFnAbsの結合親和性はファージELISA法(Liら、1995)を利用して半定量的に調べた。マイクロタイタープレート(Nunc)のウエルをリガンド蛋白でコートし(あるいはストレプトアビジンでコートし、続いてビオチン化リガンドを結合する)、Blotto液(Pierce)でブロックした。1つのプラーク(M13)/コロニー(fUSE5)に由来するファージ(〜1010pfu)精製体を各ウエルに加え、一晩4℃で反応した。ウエルを適当なバッファー(上記)で洗浄した後、抗M13Ab(ウサギ、Sigma)と抗−ウサギIg−パーオキシダーゼ標識体(Pierce)あるいは抗M13Ab−パーオキシダーゼ標識体(Pharmacia)を利用した標準的なELISA法により、結合ファージを検出した。発色アッセイはTMB(3,3',5,5'−テトラメチルベンジディン、Pierce)を利用して行った。免疫グロブリンに対する蛋白Gの親和性が高いことが特殊な問題を提示する:Absは検出に利用できない。従って、抗−蛋白GFnAbsを検出するために、融合ファージをウエル内に固定し、続いてビオチン化蛋白G、さらにストレプトアビジン−パーオキシダーゼ標識体を利用して結合を測定した。
可溶性FnAbsの産生
ファージELISAを利用して変異体Fn3sを予備的に調べた後、変異体遺伝子を発現ベクターpEW1にサブクローニングした。変異体蛋白はHis・タグ融合体蛋白として産生し、精製し、その立体構造、安定性とリガンド親和性を調べた。
即ちFn3は結合蛋白を操作するため応用できる単量体免疫グロブリン様骨格(scaffold)の4番目の例である。新規結合蛋白の選別の成功は、ミニボディー、テンダミスタットおよび“ラクダ化”(camelized)免疫グロブリンVH域骨格にも左右されてきた(Martinら、1994;Davies & Riechmann,1995;McMoneell & HOess,1995)。Fn3骨格はこれらシステムについても有益である。Bianchiらは、身のボディーの安定性は2.5kcal/molであり、Ubi4−Kに比べて有意に低い。これまでにミニボディーの構造上の特徴は詳細報告されている。テンダミスタットとVH域はジスルフィド結合を含んでおり、従って正確にたたみ込まれた蛋白を調整することは困難である。DaviesとRiechmannは、彼らのラクダ化したVH域の収量が1mg/リッター培養体以下であると報告している(Davies & Riechmann,1996)。
即ち、Fn3フレームワークは分子認識骨格として利用できる。そのサイズが小さいこと、安定であること、構造が良く特徴付けされていることが、Fn3を魅力的なシステムにしている。広範囲のリガンド結合に関与する天然蛋白にFn3が広く存在しており、様々なクラスの標的に対しFn3を基本とした結合蛋白を作成することができる。
以下の実施例より本発明を例示するが、もとよりこれに限定されるものではない。
実施例1.Fn3遺伝子の構築
フィブロネクチンの第10Fn3の合成遺伝子が、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸残基1416〜1509(Kornblihttら、1985)とその3次元構造(Mainら、1992)を基に設計された。遺伝子を加工し、突然変異誘導に便利な制限酵素部位を導入し、高レベル蛋白発現を目的にいわゆる“好適コドン”(Gribskovら、1984)を利用した。更に、しばしばNMRスペクトラムを崩すN−末端メチオニンの部分的修飾を避けるために、グルタミン残基をN−末端メチオニンの後ろに導入した(Smithら、1994)。化学薬品は特記しない限り分析級またはそれ以上であり、Sigma Chmeical Company及びJ.T.Baker社より購入した。組み換え体DNAの操作は、特記ない限り“分子クローニング(Molecular Cloning"(Sambrookら、1989)の記述に従い実施した。カスタムオリゴヌクレオチドはOperon Technologiesより購入した。制限酵素および修飾酵素はNew England Biolabsより購入した。
遺伝子は次の方法により組み立てた。まず、遺伝子配列(図5)を制限酵素部位を設計された境界部分の5カ所に挿入した:断片1、Ndel−Pst I(オリゴヌクレオチドFN1F及びFN1R(表2);断片2、Pst I−EcoR I(FN2F及びFN2R)1断片3、EcoR I−Sal I(FN3F及びFN3R);断片4,Sal I−Sac I(FN4F及びFN4R);断片5、Sac I−BamH I(FN5F及びFN5R)。第二に、各断片について、反対の鎖をコードし、およそ15塩基が相補的に重なり合うオリゴヌクレオチド対を合成した。これらオリゴヌクレオチドはFN1F−FN5Rと命名し、表2に示した。3番目に、それぞれの対(例えばFN1FとFN1R)をアニールし、DNAポリメラーゼのクレノー断片を利用して単鎖部分を充足した。4番目に、2本鎖オリゴヌクレオチドを断片末端に対応する制限酵素を処理して消化し、該断片に使用したものと同一制限酵素で処理されたpBlueScriptSKプラスミド(Stratagene)にクローン化した。挿入断片のDNA配列は、Applied Biosystems DNAシークエンサー及びメーカー提供のジデオキシターミネーションプロトコールを利用し配列を決定し、確認した。最後に全配列が得られるまで上記工程2〜4を繰り返した。
遺伝子はpET3a及びpET15b(Novagen)ベクター(それぞれpAS45及びpAS25)内にクローン化した。プラスミドの地図を図6および7に示す。これらプラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)(Novagen)はバクテリオファージT7プロモーターのコントロール下にFn3遺伝子を発現した(Studierら、1990);pAS24は96−残基Fn3蛋白だけを発現したが、pSA45はポリ−ヒスチジンペプチドとの融合蛋白(His・タグ)の形でFn3を発現した。大腸菌で高レベルに発現されたFn3蛋白とその誘導体は、CBBで染色したSDS−PAGE上に強い染色バンドとして検出された。
モノボディーの結合反応は、精製可溶性モノボディーを利用し、蛍光分光計を用いて定量的に調べた。
内因性の蛍光をモニターし、結合反応を測定した。Trp蛍光(〜260nm励起、〜303nm発行)をFn3−変異体液(≦100μM)をリガンド液で滴定しながらモニターした。リガンドが蛍光体(例えばフルオロセイン)の場合、リガンドからの蛍光を利用することができる。成体分子結合式に非線形最小2乗法を適合し、反応のKdを決定した。
内因性蛍光を利用して結合反応をモニターできない場合には、モノボディーを蛍光−NHS(Pierce)で標識し、蛍光変更を利用して結合反応をモニターする(Brukeら、1996)。
実施例II.Fn3遺伝子内への制限酵素導入修飾
アミノ酸配列Fn3を変化させることなく、合成Fn3遺伝子内に制限酵素部位を導入した。制限酵素部位を選択することで、長い(>60塩基)オリゴヌクレオチドを合成することなく遺伝子構築体を完成させ、カセット変異誘導法(即ち、断片を変異を含む別の合成断片と交換する)により2つのループ域を変異(無作為化も含む)させることができる。さらに、大部分の制限酵素部位はファージディスプレー用ベクターに特異的である形で選択された。特異的制限酵素部位は、より長い配列スペースを提供するためにすでに選択されているモノボディークローンを組み合わせることを可能にする。
実施例III.M13ファージディスプレーライブラリーの構 築
ファージディスプレー用ベクター、pAS38(その地図については図8参照)は次のようにして構築した。OmpTの単一ペプチドをコードするpET12aXbal−BamH I断片をFn3遺伝子の5'端にクローン化された。Fn3遺伝子のC−末端域(FN5F及びFN5Rオリゴヌクレオチドより、表2参照)を、バクテリオファージM13のp III蛋白との融合蛋白を作成するためのMlu I部位とリンカー配列を同友するFN5F及びFN5R'オリゴヌクレオチド(表2)を含む新規断片で置換した。M13p IIIのC−末端域をコードする遺伝子断片を、PCRを利用してM13mpの野生型遺伝子IIIから調整し(Coreyら、1993)、Mlu I及びHInd III部位を利用してOmpT−Fn3融合遺伝子の3'末端に該断片を挿入された。
ファージ粒子を第2ポリエチレングリコール沈殿により精製した以外は通常の方法に従い(Sambrookら1989)ファージを作成し、ヘルパーファージM13K07を利用して精製した。融合ファージ上へのFn3の提示の成功は、フィブロネクチンに対する抗体(Sigma)及び特性の抗FN3抗体(Cocadico Biologicals、PA,USA)を利用したELISAにより確認した(Harlow & Lane、1988)
実施例IV.ABループにループモザイクを含むライブラリ ー
ABループ中にモザイクを有する核酸ファージディスプレーライブラリーを次の方法により調整した。無作為化は変性した核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し行った。モザイク化する残基をFn3のX−線およびNMR構造を検討して決めた(それぞれの蛋白データバンク受付番号、1FNAおよび1TIF)。モザイク化した残基用のNNKを含むオリゴヌクレオチド(N及びKはそれぞれA,T,GとCの等モル混合体及びGとTの当モル混合体を意味する)を合成した(例えば表2のオリゴヌクレオチドBC3、FG2、FG3およびFG4を参照せよ)。NNK混合体は20種類全てのアミノ酸と1つの停止コドン(TAG)をコードしている。しかしTAGは大腸菌XL−1ブルーでは抑制されている。ぱS38の単鎖DNA(およびその誘導体)は通常の方法により調整される(Sambrookら、1989)。
部位特異的変異誘発は、Muta−Geneキット(BioRad)を利用した発表方法により実施される(例えばKunkel、1985参照)。ライブラリーは大腸菌XL−1ブルーエレクトロポレーション反応細胞(200μl;Stratagene)にBTXエレクトロセルマニュピレーターECM3951mmギャップキュベットを利用し、プラスミドDNA1μgをエレクトロポレーションして構築される。形質転換された細胞の一部をアンピシリン(100μg.ml)を含むLB−寒天プレートに播いて形質転換効率を決定した。典型的には1μgのDNAで3×108形質転換細胞が得られ、従ってライブラリーには108ないし109の独立クローンが含まれる。ファージミッド粒子は前記に従い調整した。
実施例V.BC,CD,DE,EF、またはFGループ中のループモ ザイク
BCループに5つのモザイク残基(残基番号26〜30)と、FGループ中に5つのモザイク残基を有する核酸ファージディスプレーライブラリーを実施例IV記載の方法を用いて調整した。CD,DEまたはEFループ中にモザイクを有するその他の核酸ファージディスプレーライブラリーも同様の方法により調整できる。
実施例VI.FGおよびBCループ中のループモザイク
FGループ中に7つのモザイク残基(残基番号78〜84)を有し、BCループ中に5つのモザイク残基(残基番号26〜30)有する核酸ファージディスプレーライブラリーを調整した。BCループ中にモザイクは表1記載のBC3オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘導(Kunkelら)し、調整した。FGループ中のモザイクは、出発材料としてBCループライブラリーを利用した部位特異的変異導入法により調整し、その結果BCループとFGループの両方にモザイクを含むライブラリーを得た。オリゴヌクレオチドFG2はモザイク残基78〜84を、オリゴヌクレオチドFG4はモザイク残基77〜81を有し、かつ残基82〜84を欠失している。
FGループ中に5つのモザイク残基を持ち、FGループ中の3残基が欠失しているものと、BCループ中に5つのモザイク残基(残基26〜30)を有する核酸ファージディスプレーライブラリーを調整した。Mainら(1992)のNMR研究によれば、FGループは短いほど柔軟性に富んでいる(リガンド結合によりフレキシブルなループがより堅くなるため、エントロピーの消失が予想される)ことが示されている。さらに、他のFn3域はさらに短いFGループを持っている(例えば配列アラインメント、Dickinsonら(1994)の図12参照))。
無作為化は変性ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し実施した(BCループをモザイク化にはオリゴヌクレオチドBC3、FGループのモザイク化はFG2及びFG4)。
部位特異的変異誘導は発表された方法により実施した(例えばKunkel、1985参照)。ライブラリーは大腸菌XL−1ブルー(Stratagene)を形質転換し構築した。典型的にはライブラリーは108ないし109の独立クローンを含む。ライブラリー2はBCループ内に5モザイク残基を、さらにBCおよびFGループ中に7モザイク残基を含んでいる。ライブラリー4はBCループおよびFGループ内にれぞれに5モザイク残基を含み、FGループの長さは3残基だけ短い。
実施例VII.ループモザイクにより構築したfdファージ ディスプレーライブラリー
遺伝子ベクターとしてfdファージを利用し、ファージディスプレーライブラリーを構築した。Fn3遺伝子を、Fn3遺伝子PCRの5'−及び3'−末端に導入されたSfil制限酵素部位を利用してfUSE5に挿入した(Parmley & Smith,1988)。このファージの発現により、fdファージ表面上に融合p III蛋白が提示された。Fn3ループ内のモザイクは、上記の部位特異的変異誘導法、またはM13ファー時内に構築されたFn3ライブラリーをfUS5ベクター内にサブクローニングし導入された。
実施例VIII.その他のファージディスプレーライブラリ ー
T7ファージライブラリー(Novagen,Madison,WI)および細菌繊毛発現システム(Invitrogen)もFn3遺伝子の発現に有用である。
実施例IX.巨大分子構造に結合するポリペプチドの単離
ファージディスプレーモノボディーはBarbasと共同研究者のプロトコール(Rosenblum & Barbas,1995)に従い選択した。略記すると、炭酸ナトリウムバッファー(100mM、pH8.5)中のおよそ1μgの標的分子(“抗原”)を気密容器内で一晩4℃で反応してマイクロタイタープレート(Maxisorp,Nunc)のウエル内に固定した。この液を除いた後、プレートを3%BSA(Sigma、フラクションIV)のTBS液と37℃で1時間反応し、ウエルをブロックした。およそ1012コロニー形成単位のファージミドを含むファージミドライブラリー液(50μl)を各ウエル中に37℃で1時間吸着させた。続いて植えるを適当なバッファー(典型的にはTBST、50mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaClおよび0.5%Tween20)で3回(1操作について1回)洗浄した。結合したファー時は酸性液(通常は0.1Mグリシン−HCl,pH2.2;50μl)で溶出し、回収したファージはすぐに3μlのTris液で中和した。あるいは、ウエルを抗原(1〜10μM)を含むTBS50μlと反応して、結合したファージを溶出した。回収したファージはXL1ブルー細胞を宿主細胞として使用する標準的な方法を利用し、増幅した(Sambrookら)。選別を5〜6回繰り返し陽性クローンを濃縮した。最終選別回の後、個々のクローンを取り出し、その結合親和性とDNA配列を決定した。
ファージ表面のモノボディーの結合親和性はファージELISA技術(Liら、1995)を用いて決定した。マイクロタイタープレート(Nunc)のウエルを抗原でコートし、BSAでブロックした。単一コロニーに由来する精製ファージ(108〜1011cfu)を各ウエルに加え、2時間、37℃で反応した。ウエルを適当なバッファー(上記参照)で洗浄した後、結合したファージを抗M13Ab(ウサギ、Sigma)と抗−ウサギIg−パーオキシダーゼ標識体(Pierce)を利用した標準的なELISA法により検出した。発色アッセイはTurbo−TMB(3,3',5,5'−テトラメチルベンジディン、Pierce)を基質として利用し行った。
ファージ表面にあるモノボディーの結合親和性を、競合ELISA法(Djavadi−Ohanianceら、1996)を利用してさらに調べた。本実験では、ファージ液が各種濃度のリガンドを含む以外は上記同様にしてファージELISAを行った。ファージ液はマイクロタイタープレートウエル内に固定したリガンドに結合させる前に4℃で1時間反応した。ファージが提示したモノボディーの親和性は、遊離型リガンドの濃縮を挙げた時のELISAシグナルの減少より見積もった。
ファージELISAを利用してファージ表面上に提示されたモノボディーを予備調査した後、陽性クローンの遺伝子を発現ベクターpSA45にサブクローニングした。大腸菌BL21(DE3)(Novagen)を発現ベクター(pAS45およびその誘導体)により形質転換した。細胞はM9最小培地、及びアンピシリン(200μg/ml)入りバクトトリプトン(Difco)を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び/または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。2リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃でおよそ140rpmで振蘯した。OD(600nm)が1になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド(PTG)を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加3時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
Fn3およびHis・タグ付きモノボディーは次の様にして精製した。細胞を1mMのフェニルメチルスルフォニルフロライドを含む50mM Tris(pH7.6)の5ml/(g細胞)に懸濁した。HEL(Sigma、3X結晶化)を最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間、3回超音波処理して細胞を破壊した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿をSS−34ローターを用いてSorvalRC−2B遠心分離器で15,000rpm遠心分離し回収した。濃塩化ナトリウムを最終濃度0.5Mになるよう溶液に加えた。次にこの溶液を塩化ニッケル(0.1M,1ml)を前負荷し、0.5M塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー(50mM,pH8.0)で平衡化したハイタラップ(Hi−Trap)カラム(Pharmacia)にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、0.5Mイミダゾルを含むTrisバッファー(50mM、pH8.0)で結合蛋白を溶出した。必要に応じてNovagen社(Madison,WI)提供のプロトコールに従いトロンビンで融合蛋白を処理し、His・タグ−蛋白を切り離した。酢酸ナトリウムバッファー(20mM、pH5.0)中の塩化ナトリウム直線勾配(0〜0.5M)を利用し、リソースSカラムによりFn3をHis・タグペプチドとトロンビンより分離した。
少量の可溶性モノボディーは次の様にして調整した。pAS38誘導体を含むXL−1細胞(Fn3−p III融合蛋白をコードするプラスミド)を37℃で激しく攪拌しながらOD(600nm)がほぼ1になるまでLB培地中で増殖させた;IPTGを最終濃度1mMになるように培地に加え、細胞をさらに37℃で一晩増殖させた。遠心分離により細胞を培地から除き、上清をリガンドでコートしたマイクロタイターウエルに加えた。pAS38およびその誘導体を含むXL−1ブルー細胞はFN3−p III融合蛋白を発現するが、大腸菌の蛋白分解活性によりFn3とp III域の間が切断され可溶性蛋白質も産生される。(Rosenblum & Barbas、1995)。リガンドに対するモノボディーの結合はFn3に対する特注抗体(Cocalico Biologicals,Reamstown,PAより購入)を利用した標準的ELISAにより試験した。通常の浸透圧ショック法を利用し、大腸菌の細胞周辺腔より得た可溶性モノボディーも利用できる。
実施例X.ユビキチン結合モノボディー
ユビキチンは真核生物の分解経路に関与する小蛋白(76残基)である。単一ドメイン球状蛋白である。酵母ユビキチンはSigma Chemical Companyより販売されており、精製なしに利用した。
実施例VI記載のライブラリー3および4を利用し、ユビキチン−結合モノボディーを選別した。ユビキチン(50μl重炭酸ナトリウムバッファー中に1μg(100mM,pH8.5)をマイクロタイタープレートウエルに固定し、続いてBSA(TBSの3%液)でブロックした。パンニングは上記同様に実施した。最初の2回は、1ウエル当たりユビキチン1μgを固定し、結合したファージを酸性液で溶出した。3回目から6回目まではウエル当たり0.1μgのユビキチンを固定し、ファー時を酸性液または10μMユビキチンを含むTBSで溶出した。
選別したクローンの結合を、ポリクローナルモード、即ちクローン個々に分離する前に調べた。これらの結果は図9に示した。競合ELISA実験では、固定されたユビキチンへのユビキチン結合は30μM以下の可溶性ユビキチンによりほぼ完全に阻害された(図10参照)。ユビキチン結合モノボディーのBC及びFGループの配列は表3に示した。
最も濃縮されたクローンである411クローンを、ファージELISAを用いて調べた。411クローンは溶液中およそ10μMのユビキチン存在下に選択結合と阻害を示した。
実施例XI.小分子固定法
標的分子を下記に従いマイクロタイタープレートのウエル(Maxisorp,Nunc)に固定し、さらにウエルをBSAでブロックした。下記キャリアー蛋白の利用に加え、標的分子のビオチン標識体も作成できる。続いてビオチン化リガンドをストレプトアビジンでコートしておいたマイクロタイタープレートのウエルに固定化した。
下記キャリアー蛋白の利用に加え、標識分子とビオチンの標識体を作成し、ビオチン化リガンドを前もってストレプトアビジンでコートしておいたマイクロタイタープレートウエルに固定することもできる(Smith及びScott,1993)。
小分子は牛血清アルブミン(BSA,Sigma)の様なキャリアー蛋白で標識し、またマクロタイタープレートウエルに能動的に吸着させることができるだろう。あるいは、化学的標識方法を利用することもできる。さらに、マイクロタイタープレート以外の固相支持体も容易に利用することができる。
実施例XII.フルオロセイン結合モノボディー
フルオロセインはコンビネーショナルライブラリーからの抗体選別の標的として利用されている(Barbasら、1992)。NHS−フルオロセインはPeirceより得、メーカーの支持に従い使用してBSA(Sigma)標識体を調整した。モル比およそ17(フルオロセイン)対1(BSA)の2タイプのフルオロセイン−BSA標識体を調整した。
選別工程を5〜6回繰り返し、陽性クローンを濃縮した。本実験では、リガンドをコートしたウエルに加える前に、ファージライブラリーを蛋白混合体(BSA、チトクロームC(Sigma、ウマ)及びRNaseA(Sigma、ウシ)、各1mg/ml)と室温で30分間反応した。結合したファージは酸溶出の代わりに10μMの可溶性フルオロセインを含むTBSで溶出した。最終回後、個々のクローンを取り上げ、その親和性(下記参照)及びDNA配列を決定した。
選別されたクローンの結合親和性の予備的検討をファージELISAおよび競合ファージELISAを利用し実施した(図12(フルオロセイン−1)及び図13(フルオロセイン−2)参照)。試験した4クローンはリガンドコートしたウエルとの特異的結合を示し、またその結合反応は可溶性フルオロセインにより阻害された(図13参照)。
実施例XIII.ジゴキシゲニン結合モノボディー
ジゴキシゲニン−3−O−メチル−カルボニル−e−アミノカプロン酸−NHS(Boehringer Mannheim)を用いて、ジゴキシゲニン−BSA標識体を調整した。ジゴキシゲニン−BSA標識体をマイクロタイタープレートウエルに固定し、パンニングに使用した。パンニングを5ないし6回繰り返し、結合クローンを濃縮した。ジゴキシゲニンは水溶液中への溶解性が低く、結合ファージは酸性液を用いてウエルより溶出した。実施例XIV参照。
実施例XIV.TSAC(遷移状態類似化合物)結合モノボデ ィー
炭酸エステル加水分解モノボディーを次のようにして選別した。炭酸エステル加水分解の遷移状態類似体、4−ニトロフェニルフォスフォネートを既報のArbuzov反応(JacobsとSchultz,1987)により合成した。次にフォスフォネートをキャリアー蛋白、BSAとカルボジイミドを用いて結合し、続いて良く透析した(JacobsとSchultz,1987)。ハプテン−BSA標識体をマイクロタイタープレートのウエル内に固定し、モノボディー選別を上記に従い実施した。選別されたモノボディーの触媒活性を4−ニトロフェニルカーボネートを基質に利用し試験した。
触媒性モノボディー作成に有用な他のハプテンはH.Suzuki(1994)及びN.R.Thomas(1994)にまとめられている。
実施例XV.Fn3のNMR解析及び酵母分泌Fn3と大腸菌分泌F n3の比較
核磁気共鳴(NMR)実験を行い、FnAbと標的分子、例えばフルオロセインに対するモノボディー、ユビキチン、RNaseAならびにジゴキシゲニン可溶性誘導体との間の接触面を特定した。次に、この情報を利用してモノボディーの親和性と特異性を改良した。精製したモノボディーサンプルはNMRスペクトロスコピー用に、YM−3メンブレン付きAmicon限外濾過セルを利用し適当なバッファーに溶解された。バッファーは90%H2O・10%D2O(蒸留等級、Isotec)または100%D2Oで作成した。これらからの強いシグナルは重水素化化合物(例えばアセテート)を用いて排除した。
NMR実験は4つのRFチャンネルとパルスフィールド勾配能を持ったトリプルリソーナンスプローブが装着されたVarian Unity INOVA 600スペクトロメーターを用いて行った。NMRスペクトラムはFelix(Molecular Simulations)、umrPipe、PIPP及びCAPP(Garrettら、1991;Delaglioら、1995)といった処理プログラムをUNIXワークステーション上で利用し、解析した。配列特異的リソーナンスアサインメントは、トリプルリソーナンス実験のセットを利用した良く確立された方法に従い実施した(CBCA(CO)NH及びHNC ACB)(Gresiek & Bax,1992;Wittenkind & Mueller,1993)。
およそ5オングストロームより近い1H核の間で核オーバーハウザー効果(NOE)が観察され、これによりプロトン間の距離に関する情報が得られた。一連のダブル−及びトリプルリソーナンス実験(表5;これら技術の最近のレビューについては、Bax & Gresiek、1993およびKay,1995を参照)を行い、距離(即ちNOE)及び二面角(J−カップリング)束縛を集めた。同位元素濾過実験を行い、結合リガンドのアサインメントを決定し、リガンド内おおびFnAbとリガンド間の距離束縛を得た。配列特異的リソーナンスアサインメント及びNOEピークアサインメントの詳細は別所に詳しく記載されている(Clone & Gronenborn、1991;Pascal、ら1994b;Metzlerら、1996)。
モノボディーに関する主骨格1H,15Nおよび13Cリソーナンスアサインメントを野生型Fn13のそれと比較し、変異体に於ける構造変化を調べた。これらのデータにより変異体が全体構造を保っていることを確認した後、実験のNOEデータを利用して構造の微調整を行った。モノボディーの構造の違いは微小であると推測されることから、野生型の構造をアミノ酸配列改良後の初期モデルとして利用することができる。相互作用分子モデリングにより野生型の構造に変異を導入し、次にQuanta(Molecular Simulations)の様な分子モデリングプログラムを利用してこの構造のエネルギーを最小化する。液体構造を、プログラムX−PLOR(Brunger,1992)で動態シュミレートアニーリング(Nilgesら、1988)のサイクルを利用して位上げる。典型的には、50の構造のアンサンブルを計算する。仕上がった構造の有効性は、無作為に作った初期構造の少数例についてYASAPプロトコールに従いX−PLORで計算して確認した(Nilgesら、1991)。モノボディー−リガンド複合体の構造は、まず分子内NOEsを利用し両成分を別々に仕上げ、次に分子間NOEsにより両者を結合して計算する。
例えば、フルオロセイン結合モノボディーLB25.5の1H,15N−HSQCスペクトラムを図14に示す。このスペクトラムは良好な分散を示しており(ピークが広がっている)、LB25.5が球状の立体構造に折り込まれていることが示唆される。さらに、このスペクトラムは野生型Fn3のスペクトラムに似ており、LB25.5の全体構造がFn3に似ていることが示されている。これらの結果は、リガンド結合モノボディーがFn3骨格の球状の折りたたみを変化させることなく得ることができるこをと示している。
同位元素標識FnAbと非標識リガンド間に複合体を形成させて化学シフト攪乱実験を行った。化学シフトは極めて核環境に敏感であることから、複合体の形成は通常境界面のアミノ酸残基のリソーナンスに本質的な化学シフト変化をもたらす。同位元素編集NMR実験(2D HSQCおよび3D CBCA(CO)NH)を用いて、複合体の標識成分、即ちモノボディー内で攪乱されたリソーナンスを特定する。長期間の立体構造変化によるアーチファクトの可能性を常に考慮しなければならないが、連続面上に集合した残基について見られる大きな差の大部分は直接接触に由来すると考えられる(Chenら、1993;Groneborn & Clore,1993)。
相互作用面をマッピングする別の方法は、水素化アミド交換(HX)実験を利用するものである。核アミドプロトンのHX速度を15N標識モノボディーについて、遊離型及びリガンドとの複合体の両方に関し測定する。リガンド結合は結果として2蛋白間の海面に於けるモノボディー残基のアミドHX速度を低下させることが予想され、これにより結合面を特定できる。複合体に於けるモノボディーのHX速度は、D2Oへの複合体を移した後様々な時間でHXを起こし測定する;複合体はpHを下げて解離し、アミドのHXが遅くなる低pHでのHSQCスペクトラムを記録する。Fn3は低pHで安定かつ可溶性であることから、本実験の条件を満たしている。
実施例XVI.ユビキチン特異的Fn3−ディスプレーシステ ムの構築と分析
Fn3−ディスプレーシステムを設計し、合成し、ユビキチン結合クローンを単離し、これらクローンの中の主要なFn3変異体を生物物理的に特徴付けした。
Fn3の遺伝子構築とファージディスプレーは実施例Iおよび上記同様に行った。Fn3−ファージIII融合蛋白はファージミド−ディスプレーベクターより発現させたが、野生型p IIIを含めたM13ファージのその他成分はヘルパーファージ(Bassら、1990)を用いて作成した。即ち、本システムにより作られるファージはその表面上に提示されるFn3は1コピー以下でなければならない。ファージのFn3の表面提示は抗Fn3抗体を利用したELISAで検出した。Fn3p III融合ベクターを含むファージだけが抗体と反応した。
ファージ表面へのFn3提示を確認した後、Fn3のファージディスプレーライブラリーを実施例III同様に構築した。無作為化配列をBCおよびFGループに導入した。第1ライブラリーでは、FGループの5個の残基(77〜81)が無作為化され、3個の残基(82〜84)が欠失した。この欠失はFGループをフレキシブルにして、結合親和性を改善することを目的としている。BCループでも標的分子との接触面を大きくするこをと目的に5個の残基(26〜30)が無作為化された。従って、得られたライブラリーには、BCおよびFGループそれぞれについて無作為化された5個の残基が含まれている(表6)。このライブラリーはおよそ108の独立したクローンを含んでいた。
ライブラリースクリーニング
ユビキチンを標的分子としたライブラリースクリーニングを行った。各パンニング回毎に、Fn3ファージをユビキチンコート表面に吸着させ、結合ファージを可溶化ユビキチンで競合的に溶出した。回収率は第2回の4.3×10-7から第5回4.5×10-6に改善した。5回のパンニングの後、個々のクローンのアミノ酸配列を決定した(表6)。
Fn3変異体濃縮ループではUbi4と命名されたクローンが優越していた。従って、以後の研究はUbi4クローンに集中して行った。Ubi4はBCループ内の4カ所の変異(BCループのArg30は保存されていた)とFGループ内の5カ所の変異と3カ所の欠失を含んでいた。従って、残基のUbi4では野生株配列の13%(94中12)が変化してた。
図15はUbi4のファージELISA分析の結果を示す。Ubi4ファージは標的分子、ユビキチンを有意な親和性をもって結合するが、野生型Fn3域を提示しているファージ、または分子を提示していないファージはユビキチンに対し検出可能な結合を示さなかった(図15a)。さらに、Ubi4ファージはユビキチンコーティングしていないコントロール表面に対するバックグランド結合についても若干高いレベルを示した。競合ELISA実験より、結合反応のIC50(結合の50%を阻害する遊離リガンドの濃度)がおよそ5μMであることを示した(図15b)。BSA、ウシリボヌクレアーゼAおよびチトクロームCはUbi4−ユビキチン結合反応を阻害せず(図15c)、Ubi4のユビキチンへの結合反応が特異的結合の結果であることを示した。
変異Fn3蛋白の特徴
発現システムは1リッター培地当たり50〜100mgのFn3蛋白を産生した。同様のレベルの蛋白発現がUbi4クローンや他の変異Fn3蛋白について観察された。
Ubi4−Fn3は独立蛋白として発現された。Ubi4の大部分は大腸菌内に可溶性蛋白として発現されたが、その溶解性は野生型Fn3に比べ明瞭に低下していた。Ubi4は低pHでは−20μMまで溶解したが、中性pHではその溶解性は大きく低下した。この溶解度はNMRスペクトロスコピーまたはX線結晶学による詳細な構造解析にっとては不十分であった。
C末端に溶化性テールであるGKKGKを加えてUbi4の溶化性を改善した。Ubi4−Fn3遺伝子をPCRを利用して発現ベクターであるpAS45にサブクローニングした。この段階でC−末端可溶化タグでるCKKCKを導入した。大腸菌BL21(DE3)(Novagen)を発現ベクター(pAS45およびその誘導体)により形質転換した。細胞はM9最小培地、及びアンピシリン(200μg/ml)入りバクトトリプトン(Difco)を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び/または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。2リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃でおよそ140rpmで振蘯した。OD(600nm)が1になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド(PTG)を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加3時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
蛋白は次の様にして精製した。細胞を1mMのフェニルメチルスルフォニルフロライドを含む50mM Tris(pH7.6)の5ml/(g細胞)に懸濁した。HEL(Sigma、3X結晶化)を最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間、3回超音波処理して細胞を破壊した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿をSS−34ローターを用いてSorvalRC−2B遠心分離器で15,000rpm遠心分離し回収した。濃塩化ナトリウムを最終濃度0.5Mになるよう溶液に加えた。次にこの溶液を塩化ニッケル(0.1M,1ml)を前負荷し、0.5M塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー(50mM、pH8.0)で平衡化したハイタラップ(Hi−Trap)カラム(Pharmacia)にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、500mMイミダゾルを含むバッファーでヒスタグ−Fn3を溶出した。蛋白はさらに、酢酸ナトリウムバッファー(20mM,pH5.0)中の塩化ナトリウム直線勾配を利用したリソースSカラム(Pharmacia)を用いて精製した。
GKKGKテールにより、Ubi4蛋白の溶解性は低pHで1mM以上、中性pHで〜50μMまで増加した。従って、以後の分析はC−末端延長したUbi4で行った(以後Ubi4−Kと称する)。ミニボディーの溶解性はN−またはC末端テールに3個のLys残基を負荷することで有意に改良されと報告されている(Bianchiら、1994)。蛋白Popの例では、非構造C末端テールが溶解性の維持に重要である(Smithら、1995)。
Ubi4蛋白のオリゴ化状態を分子篩いカラムを用いて決定した。野生型Fn3蛋白は低および中性pHでは単量体である。しかし、Ubi4−K蛋白のピークは野生型に比べ広く、やせIg他蛋白の後に溶出された。このことは、Ubi4−Kがカラム材料と相互作用しており、Ubi4のオリゴ化の決定には分子篩いカラムクロマトグラフィーを利用できないことを示している。NMR研究より、本蛋白は低pHでは単量体であることが示唆されている。
Ubi4−K蛋白はELISAの判定では、ユビキチンに対する結合親和性を保持している(図15d)。しかし、バイオセンサー(Affinity Sensors,Cambridge,UK)を用いた解離定数決定の試みは、センサーマトリックスへのUbi4−K−Fn3のバックグランド結合が高いことから失敗した。このマトリクッスは主にデキストランからできており、我々のUbi4−Kが分子篩いカラムの架橋デキストランと相互作用したという観察結果に一致した。
実施例XVII.モノボディーの安定性測定
塩酸グアニジン(GuHCl)誘導巻き戻しと再折りたたみ反応をトリプトファンの蛍光を測定して追った。実験はモーター駆動式注射器(Hamilton Co)を装備Spectronic AB−2分光蛍光光度計を利用して行った。キュベット温度は30℃に保った。分光蛍光光度計と注射器は自作インターフェイスを用いて同一コンピューターで制御されている。このシステムは自動的にCuHCl滴定後のスペクトラムを連続記録する。実験は5μMの蛋白を含む1.5mlのバッファー液より開始した。GuHClを含むバッファー液を注入した後(50または100μl)遅れて(3〜5分)発光スペクトラム(300〜400nm:励起、290nm)を記録した。この作業を溶液量がキュベットの容積(3ml)に達するまで繰り返した。蛍光強度を、別の実験で求めたイソ蛍光点に於ける強度に対する比として標準化した。巻き戻し曲線を非線形最小2乗法を用いて2状態モデルに当てはめた(Sanoro & Bolen,1988)。遅延時間(注入からスペクトラム測定開始まで)2分と10分で行った実験間に有意な差は認められなかったことから、巻き戻し/再折りたたみ反応は、それぞれの濃度において採用した遅延時間内に平衡状態近くに達していたことが示唆された。
Ubi4−Kの立体構造安定性を、上記のGuHCl−誘導巻き戻し法を利用し測定した。測定は2組の条件で行った:第1はUbi4−Kが高い溶解性にあるpH3.3,300mM塩化ナトリウム存在下で、第2はライブラリースクリーニングに使用したTBS中である。いずれの条件に於いても、巻き戻し反応は可逆的であり、我々は凝集または不可逆的巻き戻しの兆候を観察しなかった。図16は、N−末端に(his)6タグとC−末端に可溶化タグを持つUbi4−Kと野生型Fn3の巻き戻しの遷移を示す。野生型Fn3の安定性はこれらタグの付加によっても大きな影響を受けなかった。巻き戻し遷移を特徴つけるパラメータを表7に挙げた。
△Goは変性剤存在下での巻き戻しの自由エネルギーである;mGはGuHCl濃度への巻き戻しの自由エネルギーへの依存度である。溶液条件については図4脚注を参照。
2つのループ誘導された変異は、野生型Fn3に対してUbi4−Kの安定性を明瞭に低下させたが、Ubi4の安定性はなお“典型的”な球状蛋白の安定性に相当した。野生型およびUbi4−K蛋白の安定性はpH7.5よりpH3.3でより高いことにも注意すべきである。
Ubi4蛋白は野生型Fn3に比べて溶解性を明らかに低下したが、溶解性テールを付加することで溶解性は改善された。2つの変異ループの違いは野生型蛋白とUbi4蛋白との間の差だけであることから、これらループが溶解性低下の原因でなければならない。この時点では、Ubi4−Kの凝集がループ間の相互作用に拠るものか、あるいはループとFn3骨格の不変域間の相互作用によるものであるかは不明である。
Ubi4−K蛋白はFn3の球状のたたみ込みを保持していることから、試験した2ループ内の多くの変異がこの骨格により調節できることを示している。Ubi4−K蛋白の安定性は野生型Fn3蛋白に比べて低いが、Ubi4蛋白は依然として小球状蛋白と同等の立体構造安定性を有している。骨格の球状折りたたみに影響することなく変異を導入する上で、極めて安定している領域を骨格に利用することが有利であることは明確である。さらに、GuHClで誘導したUbi4蛋白の巻き戻しはほぼ完全に可逆的である。これによってFn3変異体が封入体の様な誤った形に折りこまれた場合でも、正確に折り込んだ蛋白を調整できる。
ライブラリーのスクリーニングに使用した条件でUbi4が適度に安定であることは、Fn3変異体がファージ表面でたたみ込まれていることを示している。このことは、Fn3クローンは変性した形ではなく、たたみ込まれた形状での結合親和性により選別されることを示唆している。Dickinsonらは、BCループ内のVal29およびArg30がFn3を安定化していると提案している。val29は疎水性核と接触し、Arg30はGly52とVal75と水素結合を形成する。Ubi4−Fn3では、Val29はArgに置換されているが、Arg30は保存されている。FGループはライブラリーの中でも変異した。このループは野生型構造の中ではフレキシブルであり、ヒトFn3領域での長さは様々である(Mainら、1992)。これらの観察より、FGループ中の変異は安定性に対しそれほど影響しないことが示唆される。さらも。Fn3のN−末端テールはBCおよびFGループにより形成される分子表面と隣接しており(図1及び17)、また明瞭な構造を形成しない。N−末端テールの変異は安定性に対し強い有害作用を及ぼさないと考えられる。従って、N−末端テール中の残基はさらなる変異導入に適した部位であろう。
実施例XVIII.Ubi4−Fn3のNMRスペクトロスコピー
Ubi4−Fn3をNaCl(300mM)を含む[2H]−Gly HClバッファー(20mM,pH3.3)に、Amicon限外濾過ユニットを利用し溶解した。最終濃度は1mMであった。NMR実験はパルスフィールド勾配能を持ったトリプルリソーナンスプローブが装着されたVarian Unity INOVA 600スペクトロメーターを用いて行った。プローブ温度は30℃にセットした。HSQC,TOCSY−HSQCおよびNOESY−HSQCスペクトラムは公開された方法により記録した(Kayら、1992;Zhangら、1994)。NMRスペクトラムはUNIXワークステーション上でNMR pipeとNMR Viewソフトウエアー(Hohnson & Blevins,1994;Delaglioら、1995)用い処理した。配列特異的リソーナンスアサインメントは通常の方法で作成した(Wuthrich,1986;Clore & Gronenborn,1991)。野生型Fn3に関するアサインメント(Baronら、1992)は酢酸ナトリウムバッファー(50mM,pH4.6)中に溶解した15N−標識蛋白を用いて、30℃で確認した。
Ubi4−Kの3次元構造は異核分子NMRスペクトロスコピー法により調べた。高品質のスペクトラムが、低pHで15N−標識Ubi4の1mM液について得られた(図17a)。Ubir4−Kのアミドピークの線幅は野生型Fn3のそれと同様であっり、Ubi4−Kが検討条件下では単量体であることが示唆された。主骨格1Hおよび15N核に対する完璧なアサインメントは、His残基列がN−末端(His)6タグであること以外は通常の1H,15N二重リソーナンス法を利用し実施された。N−末端のMet残基を含むマイナー種に由来すると思われる弱いピークが数個HSQCスペクトラムに認められた。マススペクトロスコピー分析からは、大部分のUbi4−KがN−末端にMet残基を含まないことが示された。図17は、Ubi4−Kと野生型Fn3間の1HNおよび15N化学シフトの違いを示している。変異したBCおよびFGループの中およびその近傍以外では、化学シフトの差は極めて小さい。これらの結果は、2つのループに多くの変異があるにも関わらずUbi4−KがFn3の球状たたみ込みを保持していること明瞭に示している。2つの変異ループに近接したN−末端域にある数個のアミノ酸もまた、上記2蛋白の間で明瞭な化学的な違いを有している。TBS中、50μMのUbi4−KサンプルについてはHSQCスペクトラムも記録した。スペクトラムは低pHで採取したものに類似しており、Ubi4の球状立体構造がpH7.5ないし3.3の間で維持されていることが示された。
上記詳細な説明および実施例は、理解を明瞭にするただけのものである。もとよりこれにより理解が限定されるものではない。本発明は開示および記載した説明に限定されるものではなく、当業者にとって明らかな変更はクレームにより規定される発明の範囲内である。
Claims (35)
- 複数のループ領域配列と結合する複数のFn3β鎖領域を含んで成るフィブロネクチンIII型(Fn3)ポリペプチドモノボディであって、該モノボディーのループ領域の1つまたはそれ以上が、野生型(図2)ルー プ領域に比べて、当該ループ領域配列中の2〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の2〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の2〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手(SBP)に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成する、ことを特徴とするモノボディー。
- 少なくとも1つのループ領域が特異的結合相手(SBP)と結合し、10-6モル/リッターより低い解離定数を有する、ポリペプチド:SBP複合体を形成することができる請求項1のモノボディー。
- 少なくとも1つのループが、kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数(kcat)および非触媒速度定数(kuncat)で遷移状態類似化合物(TS AC)の加水分解を触媒できる請求項1のモノボディー。
- 1つまたはそれより多くのループ域配列が以下のアミノ酸残基を含む請求項1のモノボディー:
i)ABループ中の15〜16;
ii)BCループ中の22〜30;
iii)CDループ中の39〜45;
iv)DEループ中の51〜55;
v)EFループ中の60〜66;及び
vi)FGループ中の76〜87。 - モノボディーのループ領域配列が、少なくとも2アミノ酸残基が欠失または置換することにより野生型Fn3ループ配列から変異したものである請求項1のモノボディー。
- モノボディーのループ領域配列が、3〜25個のアミノ酸残基が挿入されることにより野生型Fn3ループ配列から変異したものである請求項1のモノボディー。
- 請求項1のポリペプチドモノボディーをコードする単離された核酸分子。
- 請求項7の核酸分子と作用可能な状態で連結されている発現カセットを含む発現ベクター。
- 発現ベクターがM13ファージを基本とするプラスミドである請求項8の発現ベクター。
- 請求項8のベクターを含む宿主細胞。
- 以下の工程:
a)少なくとも1つのループ領域がユニーク制限酵素部位を含んでいる複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードするDNA配列を用意し;
b)ユニーク制限酵素部位でDNA配列を切断し;
c)特異的結合相手または遷移状態類似化合物に結合可能なペプチドをコードしていることが知られているDNA断片を、上記制限酵素部位に挿入して、挿入体及び(a)のDNA配列を含むDNA分子を得;
d)DNA分子を発現してポリペプチドモノボディーを得る;
を含む、請求項1〜6の何れか1項に記載のフィブロネクチンIII型(Fn3)ポリペプチドモノボディー調製方法。 - 以下の工程:
(a)少なくとも1つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードする複製可能なDNA配列を用意し;
(b)少なくとも1つのプライマーがDNAに挿入された修飾核酸配列を含み、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)条件下にハイブリダイズ可能な程度に既知ループ配列に十分相補的であるPCRプライマーを調製し;
(c)上記(a)のDNA配列と(b)のプライマーを利用してポリメラーゼチェインリアクションを実施し;
(d)上記(c)の反応産物をアニーリングし、そして伸長してDNA産物を得;そして
(e)上記(d)のDNAによりコードされたポリペプチドモノボディーを発現させる;
ことを含んで成る、請求項1〜6の何れか1項に記載のフィブロネクチンIII型(Fn3)ポリペプチドモノボディーの調製方法。 - 以下の工程:
a)少なくとも1つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードする複製可能なDNA配列を用意し;
b)少なくとも1のループ領域に部位特異的突然変異誘導を行い、挿入変異を含むDNA配列を生成せしめ、そして
c)上記挿入変異を含むDNA配列によりコードされたポリペプチドモノボディーを発現せしめる;
ことを含んで成る、請求項1〜6の何れか1項に記載のフィブロネクチンIII型(Fn3)ポリペプチドモノボディー調製方法。 - (1)複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列をコードした複製可能なDNA、及び (2)請求項11〜13のいずれか1項に記載の工程を記載 した指示書、を含む、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法を実施するキット。
- それぞれが複数のループ領域を含む核酸種を複数含むFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型(variegnted)核酸ライブラリーであって、該核酸種が複数のループ領域配列に結合したFn3β鎖ドメイン配列をコードし、該モノボディーのループ領域の1つまたはそれ以上が、野生型(図2)ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の2〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の2〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の2〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手(SBP)に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成する、ことを特徴とするライブラリー。
- 1つまたはそれより多くのループ領域が:
i)残基15〜16のABアミノ酸ループ;
ii)残基22〜30のBCアミノ酸ループ;
iii)残基39〜45のCDアミノ酸ループ;
iv)残基51〜55のDEアミノ酸ループ;
v)残基60〜66のDFアミノ酸ループ;及び
vi)残基76〜87のFGアミノ酸ループ;をコードする請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。 - 前記ループ領域配列が、少なくとも2アミノ酸の欠損または置換により野生型Fn3ループ域配列から変異している請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モノボディーループ配列が、3〜25アミノ酸残基の挿入により野生型Fn3ループ領域配列から変異している請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 6〜75の核酸塩基を含むモザイク核酸配列が前記核酸種のループ領域のいずれかの1つに挿入さている請求項15のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク配列が、システインをコードするコドンを含むグループから選択される1つまたはそれより多くのコドン、または停止コドンを避けるように構築された請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がBCループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がDEループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がFGループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がABループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がCDループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 前記モザイク型核酸配列がEFループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
- 請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリーに由来するペプチドディスプレーライブラリー。
- 前記ペプチドがバクテリオファージまたはウイルスの表面上に提示される請求項27に記載のペプチドディスプレーライブラリー。
- 前記バクテリオファージがM13またはfdである請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリー。
- 特異的結合相手(SBP)と結合して、ポリペプチド:SBP複合体の解離定数が10-6モル/リッターより小さいポリペプチド:SBP複合体を形成することができるポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法において、
a)請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリーを用意し;
b)上記(a)のペプチドディスプレーライブラリーを、固定されたまたは分離可能なSBPと接触せしめ;
c)遊離ペプチドから、ペプチド:SBP複合体を分離し;
d)上記(c)の分離されたペプチドを複製して、多様性が低められ、さらにSBPを結合できる提示ペプチドが濃縮されていることで区別される新規ペプチドディスプレーライブラリーを得;
e)上記(d)の新規ライブラリーに対し工程(b)、(c)及び(d)を繰り返し;そして
f)上記(d)由来のある種の提示ペプチドのコード領域の核酸配列を決定し、SBPと結合しうるペプチドの配列を推定する;
ことを含んで成る方法。 - それぞれが複数のループ領域を有する核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーの調製方法であって、該核酸種が複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列を複数コードし、該モノボディーのループ領域の1つまたはそれ以上が、野生型(図2)ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の2〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の2〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の2〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手(SBP)に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成し:
a)決定済み配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し;
b)ポリペプチドを特異的結合相手(SBP)と接触せしめ、ポリペプチド:SBP複合体の解離定数が10-6モル/リッターより小さいポリペプチド:SBP複合体を形成せしめ;
c)核磁気共鳴スペクトロスコピーまたはX線結晶学によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し;そして
d)上記(c)に提供された情報よりSBPへの結合が改善される1またはそれより多くのポリペプチドを生ずる核酸配列中の位置をモザイク化する;
ことを含んで成る方法。 - kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数(kcat)と非触媒速度定数(kuncat)で遷移状態類似化合物(TSAC)の加水分解を触媒できるポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法において、
a)請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリーを調製し;
b)上記(a)に記載のペプチドディスプレーライブラリーを、固定されたまたは分離可能な、化学反応の近似分子遷移状態を示している遷移状態類似化合物(TSAC)と接触せしめ;
c)ペプチド:TSAC複合体を遊離ペプチドから分離し;
d)上記(c)の分離されたペプチドを複製し、多様性が低められ、さらにTSACを結合できる提示ペプチドが濃縮されていることで区別される新規ペプチドディスプレーライブラリーを得;
e)上記(d)の新規ライブラリーに対し工程(b)、(c)及び(d)を繰り返し;そして
f)上記(d)由来の種の提示ペプチドのコード領域の核酸配列を決定し、SBPと結合しうるペプチドの配列を推定する;
ことを含んで成る方法。 - それぞれが複数のループ領域を有する核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーの調製方法であって、該核酸種は複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列を複数コードし、該モノボディーのループ領域の1つまたはそれ以上が、野生型(図2)ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の2〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の2〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の2〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手(SBP)に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成し;
a)ポリペプチドが、kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数(kcat)と非触媒速度定数(kuncat)で遷移状態類似化合物(TSAC)の加水分解を触媒できるものである、決定済み配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し;
b)上記ペプチドを、固定されたまたは分離可能な、化学反応の近似分子遷移状態を表す遷移状態類似化合物(TSAC)と接触せしめ;
c)核磁気共鳴スペクトロスコピーまたはX線結晶学によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し;そして
d)上記(c)に提供された情報よりTSACの結合製または安定性が改善される1またはそれ以上のポリペプチドを生ずる核酸配列中の位置をモザイク化する;
ことを含んで成る方法。 - 特異的結合相手(SBP)と結合し、ポリペプチド:特異的結合手(SBP)複合体の解離定数が10-6モル/リッターより小さいポリペプチド:SBP複合体を形成できるポリペプチドのアミノ酸配列を特定することを目的とする請求項28のペプチドディスプレーライブラリーを含むキット。
- kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数(kcat)と非触媒速度定数(kuncat)で遷移状態類似化合物の加水分解を触媒できるポリペプチドのアミノ酸配列を特定することを目的とする請求項28のペプチドディスプレーライブラリーを含むキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4941097P | 1997-06-12 | 1997-06-12 | |
US60/049,410 | 1997-06-12 | ||
PCT/US1998/012099 WO1998056915A2 (en) | 1997-06-12 | 1998-06-12 | Artificial antibody polypeptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001500531A JP2001500531A (ja) | 2001-01-16 |
JP3614866B2 true JP3614866B2 (ja) | 2005-01-26 |
Family
ID=21959681
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50319599A Expired - Lifetime JP3614866B2 (ja) | 1997-06-12 | 1998-06-12 | 人工抗体ポリペプチド |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (11) | US6673901B2 (ja) |
EP (3) | EP2380906A2 (ja) |
JP (1) | JP3614866B2 (ja) |
AT (1) | ATE386802T1 (ja) |
AU (1) | AU729035B2 (ja) |
CA (1) | CA2293632C (ja) |
DE (1) | DE69839147T2 (ja) |
DK (1) | DK0985039T3 (ja) |
ES (1) | ES2301198T3 (ja) |
WO (1) | WO1998056915A2 (ja) |
Families Citing this family (579)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2293632C (en) * | 1997-06-12 | 2011-11-29 | Research Corporation Technologies, Inc. | Artificial antibody polypeptides |
AUPP221098A0 (en) * | 1998-03-06 | 1998-04-02 | Diatech Pty Ltd | V-like domain binding molecules |
US20040009535A1 (en) | 1998-11-27 | 2004-01-15 | Celltech R&D, Inc. | Compositions and methods for increasing bone mineralization |
ATE338120T2 (de) | 1998-11-27 | 2006-09-15 | Ucb Sa | Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der knochenmineralisierung |
EP2154535A1 (en) * | 1998-12-10 | 2010-02-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7115396B2 (en) * | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US6818418B1 (en) * | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
DE19932688B4 (de) * | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
CA2416219C (en) * | 2000-07-11 | 2016-10-11 | Research Corporation Technologies, Inc. | Artificial antibody polypeptides |
CA2418835A1 (en) * | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7598352B2 (en) | 2000-11-17 | 2009-10-06 | University Of Rochester | Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof |
WO2002081497A2 (en) | 2001-04-04 | 2002-10-17 | University Of Rochester | αξβ3 INTEGRIN-BINDING POLYPEPTIDE MONOBODIES AND THEIR USE |
US20050037427A1 (en) * | 2001-12-10 | 2005-02-17 | Erwin Houtzager | Structure for presenting desired peptide sequences |
US20030215914A1 (en) * | 2001-12-10 | 2003-11-20 | Erwin Houtzager | Structure for presenting desired peptide sequences |
EP1318195A1 (en) * | 2001-12-10 | 2003-06-11 | CatchMabs B.V. | A structure for presenting desired peptide sequences |
AU2003207459A1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-07-24 | The Scripps Research Institute | Cancer-associated epitope |
US20040009530A1 (en) * | 2002-01-16 | 2004-01-15 | Wilson David S. | Engineered binding proteins |
US6936427B2 (en) * | 2002-02-08 | 2005-08-30 | Trellis Bioscience, Inc. | Real time detection of intermolecular interaction |
US7799523B2 (en) | 2002-04-03 | 2010-09-21 | Celltech R & D, Inc. | Association of polymorphisms in the SOST gene region with bone mineral density |
US7357928B2 (en) | 2002-04-08 | 2008-04-15 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
US7541150B2 (en) * | 2002-04-08 | 2009-06-02 | University Of Louisville Research Foundation, Inc | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
AU2003243436A1 (en) * | 2002-06-06 | 2003-12-22 | Shohei Koide | Reconstituted polypeptides |
EP1516186B1 (en) * | 2002-06-26 | 2010-02-17 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | A method for the detection of apoptosis |
US20050074865A1 (en) | 2002-08-27 | 2005-04-07 | Compound Therapeutics, Inc. | Adzymes and uses thereof |
US7083948B1 (en) | 2002-12-24 | 2006-08-01 | Immunex Corporation | Polypeptide purification reagents and methods for their use |
US7196715B2 (en) * | 2003-01-17 | 2007-03-27 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Speed control using drive current profile |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
DE10324447A1 (de) * | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
US7381409B2 (en) | 2003-06-16 | 2008-06-03 | Celltech R&D, Inc. | Antibodies specific for sclerostin and methods of screening and use therefor |
US20040266993A1 (en) * | 2003-06-30 | 2004-12-30 | Evans Glen A. | Non-immunoglobulin binding polypeptides |
AU2004270702B2 (en) * | 2003-09-05 | 2009-08-06 | The Scripps Research Institute | Ozonation products of cholesterol for the treatment and prevention of atherosclerosis and/or cardiovascular diseases |
CA2537984A1 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | The Scripps Research Institute | Detection of cholesterol ozonation products |
SG149004A1 (en) | 2003-12-05 | 2009-01-29 | Bristol Myers Squibb Co | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US20080220049A1 (en) * | 2003-12-05 | 2008-09-11 | Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company | Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins |
US7544493B2 (en) * | 2004-03-03 | 2009-06-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the purification of an N-terminal fragment of hepatocyte growth factor |
US7604947B2 (en) * | 2004-06-09 | 2009-10-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection and modulation of cancer stem cells |
DE102004049479A1 (de) * | 2004-10-11 | 2006-04-13 | Scil Proteins Gmbh | Proteinkonjugate zur Verwendung in Therapie, Diagnose und Chromatographie |
RS50785B (sr) | 2005-01-05 | 2010-08-31 | F-Star Biotechnologische Forschungs-Und Entwicklungsges M.B.H. | Domeni sintetskih imunoglobulina sa svojstvima vezivanja, konstruisani u svojstvima molekula, koji se razlikuju od regiona, koji određuju komplementarnost |
ITMI20050739A1 (it) * | 2005-04-22 | 2006-10-23 | Effebi Spa | Piastrina di connsessione valvola-attuatore |
US7592429B2 (en) | 2005-05-03 | 2009-09-22 | Ucb Sa | Sclerostin-binding antibody |
US8003108B2 (en) | 2005-05-03 | 2011-08-23 | Amgen Inc. | Sclerostin epitopes |
AT503889B1 (de) | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
CL2007002567A1 (es) | 2006-09-08 | 2008-02-01 | Amgen Inc | Proteinas aisladas de enlace a activina a humana. |
WO2008048970A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Synthetic antibodies |
CN101588816B (zh) | 2006-10-19 | 2013-06-19 | Csl有限公司 | 白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物 |
WO2008061013A2 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-22 | Amgen Inc. | Antibody-based diagnostics and therapeutics |
EP2094731A2 (en) * | 2006-11-10 | 2009-09-02 | UCB Pharma S.A. | Anti human sclerostin antibodies |
EP1925664A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-28 | Scil proteins GmbH | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin |
AU2007325838B2 (en) | 2006-11-22 | 2013-09-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR |
WO2008110348A1 (en) | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Esbatech Ag | Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies |
SI2158315T1 (sl) | 2007-06-25 | 2016-05-31 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Postopki za spreminjanje protiteles in spremenjena protitelesa z izboljšanimi funkcionalnimi lastnostmi |
SI2164961T1 (sl) * | 2007-06-25 | 2015-05-29 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | InĹľeniring na osnovi zaporedij in optimizacija mono-veriĹľnih protiteles |
HUE066143T2 (hu) | 2007-06-26 | 2024-07-28 | F Star Therapeutics Ltd | Kötõágensek megjelenítése |
EP2626371A1 (en) | 2007-07-31 | 2013-08-14 | MedImmune, LLC | Multispecific epitope binding proteins and uses thereof |
US8680019B2 (en) * | 2007-08-10 | 2014-03-25 | Protelica, Inc. | Universal fibronectin Type III binding-domain libraries |
US8470966B2 (en) | 2007-08-10 | 2013-06-25 | Protelica, Inc. | Universal fibronectin type III binding-domain libraries |
WO2009023184A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Protelix, Inc. | Universal fibronectin type iii binding-domain libraries |
US7982016B2 (en) | 2007-09-10 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin |
CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
GB2453589A (en) | 2007-10-12 | 2009-04-15 | King S College London | Protease inhibition |
WO2009058379A2 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Medimmune, Llc | Protein scaffolds |
AU2008320823B2 (en) | 2007-11-02 | 2013-01-17 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) |
EP2215115A1 (en) * | 2007-11-08 | 2010-08-11 | The University of Chicago | Molecular affinity clamp technology and uses thereof |
EP2207568B1 (en) | 2007-11-16 | 2017-05-31 | The Rockefeller University | Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein |
EP2628486A3 (en) | 2007-12-14 | 2013-10-30 | Amgen, Inc. | Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies |
US8779088B2 (en) | 2007-12-17 | 2014-07-15 | Marfl Ab | Vaccine for the treatment of Mycobacterium related disorders |
WO2009088837A2 (en) * | 2007-12-31 | 2009-07-16 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Methods and products to target, capture and characterize stem cells |
MX2010008874A (es) | 2008-02-14 | 2010-09-22 | Bristol Myers Squibb Co | Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas que se unen al receptor de factor de crecimiento epidermico. |
JP2011518782A (ja) * | 2008-04-10 | 2011-06-30 | フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ | ヘパリン結合部位および/またはヘパラン硫酸結合部位を富化した組換えタンパク質 |
EP2274331B1 (en) | 2008-05-02 | 2013-11-06 | Novartis AG | Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
EP2113255A1 (en) | 2008-05-02 | 2009-11-04 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Cytotoxic immunoglobulin |
CN102099373A (zh) | 2008-05-22 | 2011-06-15 | 百时美施贵宝公司 | 基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白 |
CA2728829C (en) | 2008-06-25 | 2018-01-02 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Solubility optimization of immunobinders |
ES2541142T3 (es) | 2008-08-05 | 2015-07-16 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos contra la proteína C5 del complemento |
EP2326351B1 (en) | 2008-08-19 | 2017-12-27 | Nektar Therapeutics | Conjugates of small-interfering nucleic acids |
US8415291B2 (en) * | 2008-10-31 | 2013-04-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses |
DK2356269T3 (en) | 2008-10-31 | 2016-08-15 | Janssen Biotech Inc | FIBRONECTIN TYPE III DOMAIN-BASED SCAFFOLD COMPOSITIONS, PROCEDURES AND APPLICATIONS |
TWI496582B (zh) | 2008-11-24 | 2015-08-21 | 必治妥美雅史谷比公司 | 雙重專一性之egfr/igfir結合分子 |
AU2009327189B2 (en) | 2008-12-16 | 2012-09-06 | Novartis Ag | Yeast display systems |
WO2010093627A2 (en) * | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Fibronectin type iii domain based scaffold compositions, methods and uses |
WO2010115932A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Novartis Ag | Combination for the treatment of bone loss |
US8067201B2 (en) | 2009-04-17 | 2011-11-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for protein refolding |
WO2010124113A1 (en) | 2009-04-23 | 2010-10-28 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Anti-fatty acid amide hydrolase-2 antibodies and uses thereof |
WO2011018421A1 (en) | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Morphosys Ag | Novel screening strategies for the identification of binders |
ES2860453T3 (es) | 2009-10-30 | 2021-10-05 | Novartis Ag | Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de la fibronectina de tipo III |
WO2011051466A1 (en) * | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Novartis Ag | Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
EP2501800A4 (en) | 2009-11-17 | 2013-05-22 | Musc Found For Res Dev | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES FOR HUMAN NUCLEOLIN |
DE102009047243A1 (de) | 2009-11-27 | 2011-06-01 | Orgentec Diagnostika Gmbh | Monospezifische Polypeptidreagenzien |
WO2011072266A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Atyr Pharma, Inc. | Aminoacyl trna synthetases for modulating hematopoiesis |
JP5749733B2 (ja) | 2009-12-14 | 2015-07-15 | シル プロテインズ ゲーエムベーハーScil Proteins GmbH | フィブロネクチンのエキストラドメインbに対する特異的結合活性を有する修飾ユビキチンタンパク質 |
EP2512600A2 (en) | 2009-12-18 | 2012-10-24 | Amgen Inc. | Wise binding agents and epitopes |
WO2012091756A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Avidbiotics Corp. | Non-natural mic proteins |
DK2528944T3 (en) | 2010-01-29 | 2015-09-14 | Morphosys Ag | Rodent combinatorial antibody libraries |
WO2011092233A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Novartis Ag | Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders |
EP2533807A2 (en) * | 2010-02-12 | 2012-12-19 | University Of Rochester | Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies |
KR20120117931A (ko) | 2010-02-12 | 2012-10-24 | 온코메드 파마슈티칼스, 인크. | 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 확인 및 분리하는 방법 |
CA2795325A1 (en) | 2010-04-13 | 2011-10-20 | Medimmune, Llc | Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds |
KR20130056871A (ko) * | 2010-04-13 | 2013-05-30 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | Pcsk9에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질 |
WO2011128424A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Novartis Ag | Methods and compositions for improving implant osseointegration |
WO2011139714A2 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-10 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-trna synthetase |
EP2563381B1 (en) | 2010-04-27 | 2017-08-09 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases |
EP2563911B1 (en) | 2010-04-28 | 2021-07-21 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl trna synthetases |
US9034320B2 (en) | 2010-04-29 | 2015-05-19 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Valyl-tRNA synthetases |
AU2011248490B2 (en) | 2010-04-29 | 2016-11-10 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Asparaginyl tRNA synthetases |
RU2603272C2 (ru) | 2010-04-30 | 2016-11-27 | Янссен Байотек, Инк. | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения |
CA2797277C (en) | 2010-05-03 | 2021-02-23 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of arginyl-trna synthetases |
EP2566496B1 (en) | 2010-05-03 | 2018-02-28 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases |
EP2566495B1 (en) | 2010-05-03 | 2017-03-01 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-trna synthetases |
TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
AU2011248101B2 (en) | 2010-05-04 | 2016-10-20 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-tRNA synthetase complex |
CN103237811A (zh) | 2010-05-06 | 2013-08-07 | 诺瓦提斯公司 | 用于治疗性低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)多价抗体的组合物及使用方法 |
CA2798432A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Novartis Ag | Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein -related protein 6 (lrp6) antibodies |
EP3023496B1 (en) | 2010-05-13 | 2020-07-29 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compounds which modulate interleukins 17 and 23 signaling activity |
AU2011252990B2 (en) | 2010-05-14 | 2017-04-20 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-tRNA synthetases |
EP2569010B1 (en) | 2010-05-14 | 2017-04-12 | Amgen, Inc | High concentration antibody formulations |
AU2011256366C1 (en) | 2010-05-17 | 2017-06-15 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-tRNA synthetases |
US9562089B2 (en) | 2010-05-26 | 2017-02-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins having improved stability |
JP6046607B2 (ja) | 2010-05-27 | 2016-12-21 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | グルタミニルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 |
EP2582717A2 (en) | 2010-06-15 | 2013-04-24 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hcv ns5b polymerase mutants |
US20130216513A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-08-22 | Biogen Idec Hemophilia Inc. | Chimeric Clotting Factors |
JP6116479B2 (ja) | 2010-07-12 | 2017-04-19 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | グリシルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 |
SG187046A1 (en) | 2010-07-14 | 2013-02-28 | Genefrontier Corp | Rnf8-fha domain-modified protein and method of producing the same |
US20120100166A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-04-26 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof |
AU2011283646B2 (en) | 2010-07-30 | 2015-07-09 | Novartis Ag | Fibronectin cradle molecules and libraries thereof |
SI2606070T1 (sl) | 2010-08-20 | 2017-04-26 | Novartis Ag | Protitelesa za receptor 3 epidermalnega rastnega faktorja (HER3) |
US9029506B2 (en) | 2010-08-25 | 2015-05-12 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of tyrosyl-tRNA synthetases |
EP2630499A2 (en) | 2010-10-21 | 2013-08-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Biomarkers for hcv infected patients |
EP2643353A1 (en) | 2010-11-24 | 2013-10-02 | Novartis AG | Multispecific molecules |
JP5893640B2 (ja) | 2010-12-23 | 2016-03-23 | ファルネファ オーストリア ゲーエムベーハー | Oprf/i試薬と入院および他の患者におけるその利用 |
CN103649118A (zh) | 2011-03-01 | 2014-03-19 | 安进公司 | 双特异性结合剂 |
SG193610A1 (en) | 2011-03-25 | 2013-11-29 | Amgen Inc | Anti - sclerostin antibody crystals and formulations thereof |
DK2697257T3 (en) | 2011-04-13 | 2017-01-30 | Bristol Myers Squibb Co | FC FUSION PROTEINS INCLUDING UNKNOWN LINKERS OR EVENTS |
DK3404041T3 (da) | 2011-04-19 | 2020-08-24 | Amgen Inc | Fremgangsmåde til behandling af osteoporose |
US20140056912A1 (en) | 2011-04-29 | 2014-02-27 | Novartis Ag | Methods of treating squamous cell carcinoma |
US20140187488A1 (en) | 2011-05-17 | 2014-07-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for maintaining pegylation of polypeptides |
US9347058B2 (en) | 2011-05-17 | 2016-05-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for the selection of binding proteins |
PL3446714T3 (pl) | 2011-06-02 | 2021-11-22 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Nanocząstki sprzężone z cząsteczką skierowaną przeciwko nukleolinie |
WO2012172495A1 (en) | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting tem8 |
AU2012268970B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-01-28 | Navigo Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
HUE039786T2 (hu) | 2011-08-04 | 2019-02-28 | Amgen Inc | Csonthiány-defektusok kezelési módszere |
US9200273B2 (en) | 2011-09-27 | 2015-12-01 | Janssen Biotech, Inc. | Fibronectin type III repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces |
DK2771022T3 (da) | 2011-10-11 | 2020-09-28 | Viela Bio Inc | Cd40l-specifikke tn3-afledte skeletter (scaffolds) og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
WO2013054307A2 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Novartis Ag | Antibodies and methods for wnt pathway-related diseases |
EP2770823A4 (en) * | 2011-10-28 | 2015-12-09 | Trianni Inc | TRANSGENIC ANIMALS AND METHOD FOR THEIR USE |
EP2773659A2 (en) | 2011-10-31 | 2014-09-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity |
US9580509B2 (en) | 2011-11-07 | 2017-02-28 | Medimmune, Llc | Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof |
ES2758433T3 (es) | 2011-12-05 | 2020-05-05 | Novartis Ag | Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3) |
WO2013084148A2 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Novartis Ag | Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3 |
KR102159843B1 (ko) | 2011-12-21 | 2020-09-24 | 노파르티스 아게 | 인자 p를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 |
KR20190120401A (ko) | 2011-12-28 | 2019-10-23 | 암젠 인크 | 항스클레로스틴 항체의 이용을 통한 치조골 소실의 치료 방법 |
CA2860579A1 (en) | 2012-01-10 | 2013-07-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier |
CN104334196B (zh) | 2012-02-16 | 2018-04-10 | Atyr 医药公司 | 用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病的组氨酰‑tRNA合成酶 |
EP2830659A1 (en) | 2012-03-27 | 2015-02-04 | Novartis AG | Treatment of fibrosis |
WO2013151649A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Sialix Inc | Glycan-interacting compounds |
EP2657334B1 (en) | 2012-04-26 | 2016-07-06 | GeneFrontier Corporation | Efficient method for displaying protein multimer |
WO2013169734A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | Amgen Inc. | Anti-erythropoietin antibodies |
WO2013175276A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Argen-X B.V | Il-6 binding molecules |
CN104334576B (zh) | 2012-06-04 | 2019-02-19 | 诺华股份有限公司 | 位点特异性标记方法及由此产生的分子 |
WO2014004549A2 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
EP2869844B2 (en) | 2012-07-05 | 2023-06-21 | UCB Pharma S.A. | Treatment for bone diseases |
WO2014015217A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Biomarkers for hcv infected patients |
WO2014039775A1 (en) | 2012-09-07 | 2014-03-13 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Hiv-1 antigens with discrete conformational forms of the v1/v2 domain and methods of use thereof |
PE20150954A1 (es) | 2012-09-13 | 2015-06-20 | Bristol Myers Squibb Co | Proteinas del dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina |
US9671405B2 (en) | 2012-09-19 | 2017-06-06 | Cornell University | Identifying taxane sensitivity in prostate cancer patients |
CA3182876A1 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Janssen Biotech, Inc. | Bispecific egfr/c-met antibodies |
US9695228B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
UY35148A (es) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | Immunoglobulinas heterodiméricas |
WO2014084859A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating tmem16a activities |
PL2928921T3 (pl) | 2012-12-05 | 2021-06-28 | Novartis Ag | Kompozycje i sposoby dla przeciwciał celujących w epo |
EP2935589A1 (en) | 2012-12-18 | 2015-10-28 | Novartis AG | Compositions and methods that utilize a peptide tag that binds to hyaluronan |
WO2014118705A1 (en) | 2013-01-31 | 2014-08-07 | Novartis Ag | Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists |
EP3985024A1 (en) | 2013-02-01 | 2022-04-20 | Atara Biotherapeutics, Inc. | Anti-activin-a compounds for the treatment of ovarian cancer |
WO2014120891A2 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins |
ES2689372T3 (es) | 2013-02-06 | 2018-11-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada |
PT2953976T (pt) | 2013-02-08 | 2021-06-23 | Novartis Ag | Sítios específicos de modificação de anticorpos para preparar imunoconjugados |
WO2014124258A2 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Irm Llc | Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates |
ES2645634T3 (es) | 2013-02-12 | 2017-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Métodos de replegado de proteínas a elevado pH |
WO2014164301A2 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Amgen Inc. | Protein formulations |
US9498532B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-22 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
CN105246916A (zh) | 2013-03-14 | 2016-01-13 | 诺华股份有限公司 | 针对notch 3的抗体 |
SG11201505926VA (en) | 2013-03-15 | 2015-09-29 | Biogen Ma Inc | Factor ix polypeptide formulations |
BR112015023752B1 (pt) | 2013-03-15 | 2023-11-14 | Zyngenia, Inc. | Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo |
WO2014144817A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amgen Inc. | Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors |
MA38396B1 (fr) | 2013-03-15 | 2019-05-31 | Novartis Ag | Anticorps medicamenteux conjugues et leurs compositions pharmaceutiques pour traiter un cancer positif a ckit |
IL301607A (en) | 2013-05-06 | 2023-05-01 | Scholar Rock Inc | Preparations and methods for growth factor modulation |
AR096601A1 (es) | 2013-06-21 | 2016-01-20 | Novartis Ag | Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso |
UY35620A (es) | 2013-06-21 | 2015-01-30 | Novartis Ag | Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso |
CN105899226B (zh) | 2013-10-14 | 2020-05-12 | 詹森生物科技公司 | 半胱氨酸工程化iii型纤连蛋白域结合分子 |
WO2015073878A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Ur Diet, Llc | Real-time satiety biofeedback |
CA2932607A1 (en) | 2013-12-03 | 2015-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and reagents for the assessment of gestational diabetes |
CN103698175B (zh) * | 2013-12-09 | 2016-06-22 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌疫苗成品的解离及含量测定方法和检测试剂盒 |
CA2932819A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-18 | New York University | Compositions and methods for phagocyte delivery of anti-staphylococcal agents |
MX2016007865A (es) | 2013-12-17 | 2017-01-11 | Novartis Ag | Peptidos citotoxicos y conjugados de los mismos. |
CN116478927A (zh) | 2013-12-19 | 2023-07-25 | 诺华股份有限公司 | 人间皮素嵌合抗原受体及其用途 |
US20150174242A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Monovalent anti-cd3 adjuvants |
WO2015090229A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Novartis Ag | Regulatable chimeric antigen receptor |
US11028143B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-06-08 | Novartis Ag | Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules |
US20170073754A1 (en) | 2014-02-07 | 2017-03-16 | Novartis Ag | Impact of genetic factors on disease progression and response to anti-c5 antibody in geographic atrophy |
SG11201606850QA (en) | 2014-03-12 | 2016-09-29 | Novartis Ag | Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates |
EP3119425B1 (en) | 2014-03-15 | 2020-09-23 | Novartis AG | Regulatable chimeric antigen receptor |
WO2015142675A2 (en) | 2014-03-15 | 2015-09-24 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
CN113150117A (zh) | 2014-03-20 | 2021-07-23 | 百时美施贵宝公司 | 新的结合血清白蛋白的纤连蛋白iii型结构域 |
DK3129470T3 (da) | 2014-04-07 | 2021-07-05 | Novartis Ag | Behandling af cancer ved anvendelse af anti-CD19-kimær antigenreceptor |
US10590485B2 (en) | 2014-05-29 | 2020-03-17 | Geneticure Llc | Therapeutic regimen for hypertension |
DK3154561T3 (da) | 2014-06-12 | 2019-10-07 | Ra Pharmaceuticals Inc | Modulering af komplementaktivitet |
CN106573956A (zh) | 2014-06-13 | 2017-04-19 | 诺华股份有限公司 | 澳瑞他汀衍生物及其缀合物 |
WO2015198243A2 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-30 | Novartis Ag | Compositions and methods for long acting proteins |
US20170327553A1 (en) | 2014-06-25 | 2017-11-16 | Novartis Ag | Compositions and methods for long acting proteins |
EP4285930A3 (en) | 2014-06-26 | 2024-02-28 | Amgen Inc. | Protein formulations |
DK3166973T3 (da) | 2014-07-10 | 2020-04-06 | Univ Zuerich | Immunstimulerende monoklonale antistoffer mod human interleukin-2 |
JP6755235B2 (ja) | 2014-07-16 | 2020-09-16 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | 低悪性度漿液性癌におけるher3阻害 |
EP3193915A1 (en) | 2014-07-21 | 2017-07-26 | Novartis AG | Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars |
WO2016014553A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
JP7054622B2 (ja) | 2014-07-21 | 2022-04-14 | ノバルティス アーゲー | ヒト化抗bcmaキメラ抗原受容体を使用した癌の処置 |
BR112017001242A2 (pt) | 2014-07-21 | 2017-12-05 | Novartis Ag | tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico a cd33 |
EP4205749A1 (en) | 2014-07-31 | 2023-07-05 | Novartis AG | Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells |
PL3194968T3 (pl) | 2014-08-01 | 2021-04-06 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Wykrywanie i traktowanie bydlęcego wirusa opryszczki |
US10786578B2 (en) | 2014-08-05 | 2020-09-29 | Novartis Ag | CKIT antibody drug conjugates |
PE20170287A1 (es) | 2014-08-07 | 2017-04-05 | Novartis Ag | Anticuerpos anti-proteina similar a angiopoyetina 4 y metodos de uso |
TW201613977A (en) | 2014-08-07 | 2016-04-16 | Novartis Ag | Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use |
AU2015302959B2 (en) | 2014-08-12 | 2018-09-20 | Novartis Ag | Anti-CDH6 antibody drug conjugates |
JP6919118B2 (ja) | 2014-08-14 | 2021-08-18 | ノバルティス アーゲー | GFRα−4キメラ抗原受容体を用いる癌の治療 |
EP3180434B1 (en) | 2014-08-15 | 2019-07-17 | Adynxx, Inc. | Oligonucleotide decoys for the treatment of pain |
SG11201700770PA (en) | 2014-08-19 | 2017-03-30 | Novartis Ag | Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment |
US20180010132A1 (en) | 2014-09-11 | 2018-01-11 | Novartis Ag | Inhibition of prmt5 to treat mtap-deficiency-related diseases |
PL3194443T3 (pl) | 2014-09-17 | 2022-01-31 | Novartis Ag | Nakierowywanie komórek cytotoksycznych za pośrednictwem receptorów chimerycznych do immunoterapii adoptywnej |
KR20170068504A (ko) | 2014-10-08 | 2017-06-19 | 노파르티스 아게 | 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도 |
EP3215519A1 (en) | 2014-11-06 | 2017-09-13 | Novartis AG | Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase |
US9879087B2 (en) | 2014-11-12 | 2018-01-30 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
EP3218005B1 (en) | 2014-11-12 | 2023-01-04 | Seagen Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
MA40913A (fr) | 2014-11-14 | 2017-09-20 | Novartis Ag | Conjugués anticorps-médicament |
EP3227446A1 (en) | 2014-12-01 | 2017-10-11 | Novartis AG | Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer |
US20180334490A1 (en) | 2014-12-03 | 2018-11-22 | Qilong H. Wu | Methods for b cell preconditioning in car therapy |
CN105669863B (zh) | 2014-12-05 | 2019-09-13 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用 |
MA41142A (fr) | 2014-12-12 | 2017-10-17 | Amgen Inc | Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement |
UY36449A (es) | 2014-12-19 | 2016-07-29 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6 |
CA3197849A1 (en) | 2014-12-29 | 2016-07-07 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
LT3250230T (lt) | 2015-01-28 | 2021-12-27 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Komplemento aktyvumo moduliatoriai |
US11161907B2 (en) | 2015-02-02 | 2021-11-02 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
CA2975362A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | Navigo Proteins Gmbh | Egfr binding proteins comprising ubiquitin muteins |
ES2839211T3 (es) | 2015-03-12 | 2021-07-05 | Medimmune Llc | Método para purificar proteínas de fusión a albúmina |
WO2016164580A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Novartis Ag | Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives |
HUE059218T2 (hu) | 2015-04-08 | 2022-11-28 | Novartis Ag | CD20-terápiák, CD22-terápiák és kombinációs terápiák CD19 kiméra antigénreceptort (CAR-t) expresszáló sejttel |
CA2982996A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | David Maxwell Barrett | Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells |
WO2016172583A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
EP3291839A1 (en) | 2015-05-05 | 2018-03-14 | The University of Louisville Research Foundation, Inc. | Anti-nucleolin agent-conjugated nanoparticles as radio-sensitizers and mri and/or x-ray contrast agents |
EP3292222A4 (en) | 2015-05-06 | 2018-10-17 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate specific membrane antigen binding fibronectin type iii domains |
US20180296537A1 (en) | 2015-06-05 | 2018-10-18 | Novartis Ag | Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders |
JP2018517708A (ja) | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ニューヨーク・ユニバーシティ | 抗ブドウ球菌生物学的薬剤のための組成物及び方法 |
PE20180041A1 (es) | 2015-06-05 | 2018-01-09 | Novartis Ag | Anticuerpos dirigidos a la proteina morfogenetica osea (bmp9) y metodos a partir de estos |
WO2016203432A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
JOP20200312A1 (ar) | 2015-06-26 | 2017-06-16 | Novartis Ag | الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام |
CN107922483B (zh) | 2015-07-16 | 2021-07-30 | 纳维格蛋白质有限公司 | 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途 |
WO2017015119A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | The University Of Chicago | Methods and composition for modifying enzymes |
JP2018520675A (ja) | 2015-07-20 | 2018-08-02 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングNavigo Proteins GmbH | ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法 |
JP7146632B2 (ja) | 2015-07-21 | 2022-10-04 | ノバルティス アーゲー | 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法 |
JP6940479B2 (ja) | 2015-08-03 | 2021-09-29 | ノバルティス アーゲー | Fgf21関連障害を処置する方法 |
EP3344996A2 (en) | 2015-09-03 | 2018-07-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomarkers predictive of cytokine release syndrome |
MY186352A (en) | 2015-09-09 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Thymic stromal lymphopoietin (tslp)-binding antibodies and methods of using the antibodies |
PT3347377T (pt) | 2015-09-09 | 2021-04-30 | Novartis Ag | Anticorpos que se ligam à linfopoietina do estroma tímico (tslp) e métodos de utilização dos anticorpos |
US9862760B2 (en) | 2015-09-16 | 2018-01-09 | Novartis Ag | Polyomavirus neutralizing antibodies |
US10766946B2 (en) | 2015-09-23 | 2020-09-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type III domains |
CN108884147B (zh) * | 2015-09-23 | 2024-02-27 | 百时美施贵宝公司 | 结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架分子 |
EP4435105A2 (en) | 2015-09-29 | 2024-09-25 | Amgen Inc. | Asgr inhibitors for reduzing cholesterol levels |
MA44334A (fr) | 2015-10-29 | 2018-09-05 | Novartis Ag | Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll |
EP3373969A4 (en) | 2015-11-12 | 2019-08-14 | Siamab Therapeutics, Inc. | GLYCANINTERAGING COMPOUNDS AND METHOD OF USE |
LT3380620T (lt) | 2015-11-23 | 2024-09-10 | Novartis Ag | Optimizuoti lentivirusiniai pernešimo vektoriai ir jų panaudojimas |
EA201891338A1 (ru) | 2015-12-04 | 2018-12-28 | Новартис Аг | Композиции и способы для иммуноонкологии |
SG11201804721SA (en) | 2015-12-16 | 2018-07-30 | Ra Pharmaceuticals Inc | Modulators of complement activity |
RU2018126297A (ru) | 2015-12-18 | 2020-01-22 | Новартис Аг | Антитела, нацеленные на cd32b, и способы их применения |
CN109069597A (zh) | 2015-12-22 | 2018-12-21 | 诺华股份有限公司 | 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗 |
CA3009852A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
ES2944597T3 (es) | 2015-12-30 | 2023-06-22 | Novartis Ag | Terapias con células efectoras inmunitarias de eficacia mejorada |
KR20180093086A (ko) | 2016-01-06 | 2018-08-20 | 론자 리미티드 | 개선된 생산을 위한 단백질 분해의 억제 |
KR20180100224A (ko) | 2016-01-11 | 2018-09-07 | 노바르티스 아게 | 인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질 |
LT3402491T (lt) | 2016-01-11 | 2022-02-25 | Rubius Therapeutics, Inc. | Kompozicijos ir būdai, susiję su daugiamodalinėmis terapinėmis ląstelių sistemomis, skirti vėžio indikacijoms |
US20210198368A1 (en) | 2016-01-21 | 2021-07-01 | Novartis Ag | Multispecific molecules targeting cll-1 |
MA43088B1 (fr) | 2016-02-19 | 2020-10-28 | Morphosys Ag | Anticorps anti-il-17c |
CN108718522A (zh) | 2016-02-23 | 2018-10-30 | 赛森生物股份有限公司 | Il-6拮抗剂制剂及其用途 |
DK3423578T3 (da) | 2016-03-04 | 2020-07-20 | Morphosys Ag | Polypeptidbibliotek |
JP2019513347A (ja) | 2016-03-04 | 2019-05-30 | ノバルティス アーゲー | 複数のキメラ抗原受容体(car)分子を発現する細胞およびその使用 |
US10689873B2 (en) | 2016-03-10 | 2020-06-23 | Lonza Ltd | Customizable facility |
BR112018068281A2 (pt) | 2016-03-10 | 2019-04-02 | Lonza Ag | instalação personalizável |
CN109153713B (zh) | 2016-03-10 | 2022-12-27 | 艾科赛扬制药股份有限公司 | 活化素2型受体结合蛋白及其用途 |
GB201604124D0 (en) | 2016-03-10 | 2016-04-27 | Ucb Biopharma Sprl | Pharmaceutical formulation |
AU2017238172B2 (en) | 2016-03-21 | 2024-06-27 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof |
EP3445391A1 (en) | 2016-04-13 | 2019-02-27 | Vivia Biotech S.L. | Ex vivo bite-activated t cells |
BR112018071107A2 (pt) | 2016-04-14 | 2019-04-16 | Lonza Ltd | composições e métodos para a detecção de proteínas da célula hospedeira |
DK3443096T5 (da) | 2016-04-15 | 2024-09-09 | Novartis Ag | Sammensætninger og fremgangsmåder til selektiv ekspression af kimære antigenreceptorer |
WO2017181061A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Ras binding peptides and methods of use |
US11312766B2 (en) | 2016-04-27 | 2022-04-26 | Novartis Ag | Antibodies against growth differentiation factor 15 and uses thereof |
CN109415748A (zh) | 2016-05-03 | 2019-03-01 | 隆扎有限公司 | 用于蛋白生产的脂质代谢的调节 |
CN109310780A (zh) | 2016-05-04 | 2019-02-05 | 纳维格蛋白质有限公司 | 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物 |
US10464969B2 (en) | 2016-05-05 | 2019-11-05 | Novartis Ag | Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of RNA polymerase |
TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
TWI826351B (zh) | 2016-05-31 | 2023-12-21 | 大陸商鴻運華寧(杭州)生物醫藥有限公司 | R抗體,其藥物組合物及其應用 |
WO2017210617A2 (en) | 2016-06-02 | 2017-12-07 | Porter, David, L. | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
KR102461666B1 (ko) | 2016-06-03 | 2022-11-01 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 iii 형 도메인 |
JP2019521105A (ja) | 2016-06-07 | 2019-07-25 | ノバルティス アーゲー | 補体c5多型を有する患者を治療するための抗c5抗体 |
CN109496237A (zh) | 2016-06-10 | 2019-03-19 | 隆扎有限公司 | 用于稳定化蛋白质的方法 |
WO2017216724A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Novartis Ag | Methods for treating disease using inhibitors of bone morphogenetic protein 6 (bmp6) |
AU2017281083B2 (en) | 2016-06-21 | 2022-01-27 | Janssen Biotech, Inc. | Cysteine engineered fibronectin type III domain binding molecules |
WO2018013918A2 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Novartis Ag | Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor |
BR112019001570A2 (pt) | 2016-07-28 | 2019-07-09 | Novartis Ag | terapias de combinação de receptores de antígeno quiméricos e inibidores de pd-1 |
CN110267677A (zh) | 2016-08-01 | 2019-09-20 | 诺华股份有限公司 | 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症 |
EP3478821A1 (en) | 2016-08-02 | 2019-05-08 | Lonza Ltd | Customizable facility |
JP2019528312A (ja) | 2016-08-07 | 2019-10-10 | ノバルティス アーゲー | mRNA媒介性の免疫化方法 |
AU2017310412A1 (en) | 2016-08-08 | 2019-02-21 | Amgen Inc. | Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies |
EP3497118B1 (en) | 2016-08-11 | 2022-09-14 | Repligen Corporation | Alkaline stable fc binding proteins for affinity chromatography |
WO2018052828A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Janssen Biotech, Inc. | Chimeric antigen receptors comprising bcma-specific fibronectin type iii domains and uses thereof |
WO2018057955A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains |
TW202340473A (zh) | 2016-10-07 | 2023-10-16 | 瑞士商諾華公司 | 利用嵌合抗原受體之癌症治療 |
AU2017351764A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-06-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Monoclonal antibodies binding to the CD160 transmembrane isoform |
EP3535396A1 (en) | 2016-11-01 | 2019-09-11 | Novartis AG | Methods and compositions for enhancing gene editing |
US11339209B2 (en) | 2016-11-14 | 2022-05-24 | Novartis Ag | Compositions, methods, and therapeutic uses related to fusogenic protein minion |
EP3541847A4 (en) | 2016-11-17 | 2020-07-08 | Seattle Genetics, Inc. | COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE |
JP7301741B2 (ja) | 2016-12-07 | 2023-07-03 | ラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 補体活性のモジュレータ |
EP3554535A4 (en) | 2016-12-14 | 2020-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | PD-L1 BINDING FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS |
US10611823B2 (en) | 2016-12-14 | 2020-04-07 | Hanssen Biotech, Inc | CD137 binding fibronectin type III domains |
JP7104703B2 (ja) | 2016-12-14 | 2022-07-21 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | Cd8a結合フィブロネクチンiii型ドメイン |
US10852271B2 (en) | 2016-12-14 | 2020-12-01 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. | On-chip heater |
WO2018111340A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Novartis Ag | Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells |
JOP20190155A1 (ar) | 2016-12-21 | 2019-06-23 | Novartis Ag | مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم |
US20200231701A1 (en) | 2016-12-23 | 2020-07-23 | Novartis Ag | Methods of treatment with anti-factor xi/xia antibodies |
CA3048156A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Novartis Ag | Factor xi antibodies and methods of use |
EP3346001A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-11 | TXCell | Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells |
WO2018127585A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Txcell | Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells |
ES2912408T3 (es) | 2017-01-26 | 2022-05-25 | Novartis Ag | Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos |
EP3580237A1 (en) | 2017-02-08 | 2019-12-18 | Novartis AG | Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof |
US20200291089A1 (en) | 2017-02-16 | 2020-09-17 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof |
US20200048359A1 (en) | 2017-02-28 | 2020-02-13 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
CN110392697A (zh) | 2017-03-02 | 2019-10-29 | 国家医疗保健研究所 | 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途 |
EP3589319A4 (en) | 2017-03-03 | 2021-07-14 | Seagen Inc. | COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCAN AND METHODS OF USE |
EP3601561A2 (en) | 2017-03-22 | 2020-02-05 | Novartis AG | Compositions and methods for immunooncology |
WO2018176103A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | The University Of Queensland | "chimeric molecules and uses thereof" |
WO2018185618A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Novartis Ag | Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment |
AU2018256406A1 (en) | 2017-04-19 | 2019-10-17 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules and uses thereof |
US11866506B2 (en) | 2017-04-21 | 2024-01-09 | Mellitus, Llc | Anti-CD59 antibodies |
US20200055948A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-02-20 | Novartis Ag | Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
EP4328241A3 (en) | 2017-04-28 | 2024-06-05 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof |
WO2018201051A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Novartis Ag | Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
AR111651A1 (es) | 2017-04-28 | 2019-08-07 | Novartis Ag | Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación |
AR113224A1 (es) | 2017-04-28 | 2020-02-19 | Novartis Ag | Conjugados de anticuerpo que comprenden un agonista de sting |
WO2018218360A1 (en) * | 2017-05-31 | 2018-12-06 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Vaccine against necrotic enteritis in poultry |
US20210246227A1 (en) | 2017-05-31 | 2021-08-12 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof |
WO2018224441A1 (en) | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Numab Innovation Ag | Novel anti-cd3 antibodies |
WO2018224439A1 (en) | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Numab Innovation Ag | Novel anti-hsa antibodies |
WO2018229706A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Combination therapy for the treatment of cancer |
CN110785494B (zh) | 2017-06-16 | 2024-07-02 | 隆萨有限公司 | 用于生产生物制品的通用自调节哺乳动物细胞系平台 |
WO2018229715A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof |
US11014978B2 (en) | 2017-06-22 | 2021-05-25 | Morphosys Ag | Canine antibody libraries |
US20200172868A1 (en) | 2017-07-19 | 2020-06-04 | Rubius Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for infectious disease |
US20200172867A1 (en) | 2017-07-19 | 2020-06-04 | Rubius Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for cardiometabolic disease |
US11472880B2 (en) | 2017-08-14 | 2022-10-18 | Morphosys Ag | Humanized antibodies for CD3 |
WO2019035938A1 (en) | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Elstar Therapeutics, Inc. | MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF |
CN111448215B (zh) | 2017-09-19 | 2024-01-16 | 英属哥伦比亚大学 | 抗-hla-a2抗体及其使用方法 |
BR112020005519A2 (pt) | 2017-09-20 | 2020-10-27 | The University Of British Columbia | novos anticorpos anti-hla-a2 e usos dos mesmos |
EP3459968A1 (en) | 2017-09-20 | 2019-03-27 | Numab Innovation AG | Novel stable antibody variable domain framework combinations |
TW201919698A (zh) | 2017-09-25 | 2019-06-01 | 德商莫菲西斯公司 | 異位性皮炎之治療 |
EP3470428A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Numab Innovation AG | Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof |
CA3074802A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-18 | Numab Therapeutics AG | Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof |
EP3470429A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Numab Innovation AG | Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof |
SG11202003111SA (en) | 2017-10-10 | 2020-05-28 | Numab Therapeutics AG | Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof |
AR123115A1 (es) | 2017-10-18 | 2022-11-02 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para la degradación selectiva de proteínas |
SG11202003177RA (en) | 2017-10-25 | 2020-05-28 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
US20210040205A1 (en) | 2017-10-25 | 2021-02-11 | Novartis Ag | Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof |
WO2019089798A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
EP3706804B1 (en) | 2017-11-07 | 2022-02-23 | Navigo Proteins GmbH | Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
CA3088095A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Novartis Ag | Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies |
CA3083210A1 (en) | 2017-11-22 | 2018-11-20 | Novartis Ag | Reversal binding agents for anti-factor xi/xia antibodies and uses thereof |
CN111417651B (zh) | 2017-12-01 | 2023-09-29 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
US20200377571A1 (en) | 2017-12-08 | 2020-12-03 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules and uses thereof |
TW201930591A (zh) | 2018-01-08 | 2019-08-01 | 瑞士商諾華公司 | 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna |
EP3740231A4 (en) | 2018-01-18 | 2022-03-23 | California Institute of Technology | PROGRAMMABLE PROTEIN SWITCHES IN LIVING CELLS |
US11965191B2 (en) | 2018-01-18 | 2024-04-23 | California Institute Of Technology | Programmable protein circuits in living cells |
CA3090249A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Novartis Ag | Combination therapy using a chimeric antigen receptor |
US12077786B2 (en) | 2018-02-02 | 2024-09-03 | Lonza Ltd | Methods of cell selection and modifying cell metabolism |
US20200399383A1 (en) | 2018-02-13 | 2020-12-24 | Novartis Ag | Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15 |
US11680091B2 (en) | 2018-02-23 | 2023-06-20 | The University Of Chicago | Methods and composition involving thermophilic fibronectin type III (FN3) monobodies |
GB201803563D0 (en) | 2018-03-06 | 2018-04-18 | Galapagos Nv | Antibodies and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of autoimmune skin diseases |
US20210009711A1 (en) | 2018-03-14 | 2021-01-14 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules and uses thereof |
WO2019178362A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
CN117003874A (zh) | 2018-03-20 | 2023-11-07 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
WO2019191534A1 (en) | 2018-03-30 | 2019-10-03 | Amgen Inc. | C-terminal antibody variants |
CN110357959B (zh) | 2018-04-10 | 2023-02-28 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
JP7447014B2 (ja) | 2018-04-13 | 2024-03-11 | サンガモ セラピューティクス フランス | インターロイキン23受容体に特異的なキメラ抗原受容体 |
US20210047405A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-02-18 | Novartis Ag | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
WO2019213282A1 (en) | 2018-05-01 | 2019-11-07 | Novartis Ag | Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome |
EP3788138A1 (en) | 2018-05-02 | 2021-03-10 | Novartis AG | Regulators of human pluripotent stem cells and uses thereof |
WO2019219765A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Morphosys Ag | Antibodies targeting glycoprotein vi |
EP3801769A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-04-14 | Novartis AG | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
TW202015726A (zh) | 2018-05-30 | 2020-05-01 | 瑞士商諾華公司 | Entpd2抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法 |
WO2019229699A1 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Hepatitis b antibodies |
EP3802611A2 (en) | 2018-06-01 | 2021-04-14 | Novartis AG | Binding molecules against bcma and uses thereof |
WO2019237035A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunooncology |
EP3806888B1 (en) | 2018-06-12 | 2024-01-31 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
CN110655577A (zh) | 2018-06-13 | 2020-01-07 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
EP3806962A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Novartis AG | Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof |
TW202014209A (zh) | 2018-06-20 | 2020-04-16 | 瑞士商諾華公司 | 用於消融造血幹細胞之抗體藥物軛合物 |
TW202011995A (zh) | 2018-07-03 | 2020-04-01 | 比利時商葛萊伯格有限公司 | 高濃度液體抗體配製物 |
US11845797B2 (en) | 2018-07-03 | 2023-12-19 | Marengo Therapeutics, Inc. | Anti-TCR antibody molecules and uses thereof |
WO2020011752A1 (en) | 2018-07-10 | 2020-01-16 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies having specificity for the orf2i protein of hepatitis e virus and uses thereof for diagnostic purposes |
CN112399972B (zh) | 2018-07-10 | 2024-02-06 | 国家医疗保健研究所 | 戊型肝炎病毒orf2i蛋白的表位 |
KR20210030949A (ko) | 2018-07-13 | 2021-03-18 | 론자 리미티드 | 내인성 단백질의 수준을 감소시켜 생물학적 생성물의 생산을 개선하는 방법 |
WO2020028616A1 (en) | 2018-08-02 | 2020-02-06 | Lonza Ltd | Methods for manufacturing recombinant protein comprising a disulfide bond |
CA3109253A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Sangamo Therapeutics France | New car constructs comprising tnfr2 domains |
US11453893B2 (en) | 2018-08-30 | 2022-09-27 | California Institute Of Technology | RNA-based delivery systems with levels of control |
EP3844265A2 (en) | 2018-08-31 | 2021-07-07 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
US11542305B2 (en) | 2018-08-31 | 2023-01-03 | California Institute Of Technology | Synthetic protein circuits detecting signal transducer activity |
WO2020047452A2 (en) | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
WO2020044252A1 (en) | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Novartis Ag | Dosage regimes for anti-m-csf antibodies and uses thereof |
WO2020053742A2 (en) | 2018-09-10 | 2020-03-19 | Novartis Ag | Anti-hla-hbv peptide antibodies |
AU2019346645A1 (en) | 2018-09-27 | 2021-04-29 | Marengo Therapeutics, Inc. | CSF1R/CCR2 multispecific antibodies |
EP3856779A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-08-04 | Novartis AG | Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies |
WO2020069409A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Novartis Ag | Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies |
JP2022512626A (ja) | 2018-10-04 | 2022-02-07 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 粘膜炎症性疾患の処置のための方法及び医薬組成物 |
TWI839395B (zh) | 2018-10-09 | 2024-04-21 | 瑞士商Numab治療公司 | 靶向cd137的抗體及其使用方法 |
EP3636320A1 (en) | 2018-10-09 | 2020-04-15 | Numab Therapeutics AG | Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof |
UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
EP3870600A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-09-01 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
WO2020089815A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Novartis Ag | Antibody conjugates comprising sting agonist |
WO2020089811A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Novartis Ag | Dc-sign antibody drug conjugates |
EP3873938A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-09-08 | Novartis AG | Dc-sign antibody conjugates comprising sting agonists |
WO2020102565A2 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Systems and methods for nondestructive testing of gametes |
CA3120364A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Celularity Inc. | Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof |
AU2019392711A1 (en) | 2018-12-05 | 2021-05-20 | Morphosys Ag | Multispecific antigen-binding molecules |
WO2020120730A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Morphosys Ag | Antibody formulations |
WO2020131935A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Novartis Ag | Reversal binding agents for anti-factor xi/xia antibodies and uses thereof |
WO2020128863A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Novartis Ag | Anti-tnf-alpha antibodies |
CN118420766A (zh) | 2018-12-21 | 2024-08-02 | 诺华股份有限公司 | 针对pmel17的抗体及其缀合物 |
CN111349550B (zh) * | 2018-12-24 | 2022-12-23 | 中粮生物科技股份有限公司 | 一种高通量发酵好氧菌种的装置和方法以及他们的应用 |
WO2020146627A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-16 | California Institute Of Technology | A synthetic system for tunable thresholding of protein signals |
BR112021013507A2 (pt) | 2019-01-10 | 2021-11-16 | Janssen Biotech Inc | Neoantígenos da próstata e seus usos |
US20220127350A1 (en) | 2019-01-31 | 2022-04-28 | Numab Therapeutics AG | Multispecific antibodies having specificity for tnfa and il-17a, antibodies targeting il-17a, and methods of use thereof |
EP3689907A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-05 | Numab Therapeutics AG | Antibodies targeting il-17a and methods of use thereof |
EP3927745A1 (en) | 2019-02-21 | 2021-12-29 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders |
CA3130508A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Marengo Therapeutics, Inc. | Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof |
GB2599229B (en) | 2019-02-21 | 2024-04-24 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
WO2020172571A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
WO2020172596A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Elstar Therapeutics, Inc. | Anti-tcr antibody molecules and thereof |
US20220088075A1 (en) | 2019-02-22 | 2022-03-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
JP2022523204A (ja) | 2019-02-25 | 2022-04-21 | ノバルティス アーゲー | ウイルス送達のためのメソポーラスシリカ粒子組成物 |
AU2020235865A1 (en) | 2019-03-08 | 2021-09-23 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation |
MA55285A (fr) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | Morphosys Ag | Anticorps ciblant c5ar |
CN113574071A (zh) | 2019-03-15 | 2021-10-29 | 莫佛塞斯公司 | 用于治疗自身抗体介导的自身免疫疾病的抗-cd38抗体及其药物组合物 |
EP3942025A1 (en) | 2019-03-21 | 2022-01-26 | Novartis AG | Car-t cell therapies with enhanced efficacy |
CA3135799A1 (en) | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir) |
US20220204994A1 (en) | 2019-04-05 | 2022-06-30 | Precision Biosciences, Inc. | Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells |
WO2020210678A1 (en) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
US20220143094A1 (en) | 2019-04-19 | 2022-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody |
US20220251152A1 (en) | 2019-04-24 | 2022-08-11 | Novartis Ag | Compositions and methods for selective protein degradation |
CN114007642A (zh) | 2019-04-30 | 2022-02-01 | 森迪生物科学公司 | 嵌合受体及其使用方法 |
US20220242952A1 (en) | 2019-05-03 | 2022-08-04 | Morphosys Ag | Anti-cd19 therapy in patients having a limited number of nk cells |
US20240124889A1 (en) | 2019-05-07 | 2024-04-18 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation |
CN113853219A (zh) | 2019-05-20 | 2021-12-28 | 诺华股份有限公司 | 具有包含亲水性基团的接头的抗体药物缀合物 |
JOP20210289A1 (ar) | 2019-05-20 | 2023-01-30 | Servier Lab | مقترنات عقار - جسم مضاد مثبط لـmcl-1 وطرق لاستخدامها |
US20220396631A1 (en) | 2019-05-21 | 2022-12-15 | Lu HUANG | Trispecific binding molecules against bcma and uses thereof |
WO2020236797A1 (en) | 2019-05-21 | 2020-11-26 | Novartis Ag | Variant cd58 domains and uses thereof |
UY38701A (es) | 2019-05-21 | 2020-12-31 | Novartis Ag | Moléculas de unión a cd19, conjugados, composiciones que las comprenden y usos de las mismas |
US11066469B2 (en) | 2019-06-12 | 2021-07-20 | Novartis Ag | Natriuretic peptide receptor 1 antibodies and methods of use |
WO2020261093A1 (en) | 2019-06-24 | 2020-12-30 | Novartis Ag | Dosing regimen and combination therapies for multispecific antibodies targeting b-cell maturation antigen |
CN112239507A (zh) | 2019-07-17 | 2021-01-19 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | ETA抗体与TGF-β Trap的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
US20220273715A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-09-01 | Precision Biosciences, Inc. | Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus |
US20220308072A1 (en) | 2019-08-12 | 2022-09-29 | Voyager Therapeutics, Inc. | High-sensitivity immunoassay for the detection of frataxin in biofluids |
WO2021035054A1 (en) | 2019-08-20 | 2021-02-25 | Precision Biosciences, Inc. | Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies |
US11787840B2 (en) | 2019-08-23 | 2023-10-17 | The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Compositions and methods for treating and preventing autoimmune induced cardiac long QT syndrome |
WO2021043933A1 (en) | 2019-09-04 | 2021-03-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies specific for il20-rb and uses thereof for the treatment of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease |
WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
JP2022548881A (ja) | 2019-09-18 | 2022-11-22 | ノバルティス アーゲー | Entpd2抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法 |
CN112521501A (zh) | 2019-09-18 | 2021-03-19 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
TW202124446A (zh) | 2019-09-18 | 2021-07-01 | 瑞士商諾華公司 | 與entpd2抗體之組合療法 |
EP3800201A1 (en) | 2019-10-01 | 2021-04-07 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities |
WO2021076546A1 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | Aro Biotherapeutics Company | Cd71 binding fibronectin type iii domains |
US11781138B2 (en) | 2019-10-14 | 2023-10-10 | Aro Biotherapeutics Company | FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof |
EP3808766A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-21 | Sangamo Therapeutics France | Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor |
US20220411479A1 (en) | 2019-10-30 | 2022-12-29 | Precision Biosciences, Inc. | Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy |
AU2020376305A1 (en) | 2019-10-31 | 2022-05-12 | Incyte Corporation | Anti-CD19 therapy in combination with lenalidomide for the treatment of leukemia or lymphoma |
KR20220116154A (ko) | 2019-10-31 | 2022-08-22 | 모르포시스 아게 | 항-cd19 항체 및 감마 델타 t-세포를 포함하는 항-종양 병용 요법 |
WO2021094461A1 (en) | 2019-11-14 | 2021-05-20 | Lonza Ltd | Methods of cell selection |
BR112022009598A2 (pt) | 2019-11-18 | 2022-08-16 | Janssen Biotech Inc | Vacinas baseadas em calr e jak2 mutantes e uso dos mesmos |
MX2022006365A (es) | 2019-11-26 | 2022-06-22 | Novartis Ag | Receptores de antigeno quimerico cd19 y cd22 y usos de los mismos. |
WO2021108661A2 (en) | 2019-11-26 | 2021-06-03 | Novartis Ag | Chimeric antigen receptors and uses thereof |
CA3161789A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Celularity Inc. | Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof |
CA3160096A1 (en) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Bruce J. Mccreedy Jr. | Methods for cancer immunotherapy |
US20230040928A1 (en) | 2019-12-09 | 2023-02-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies having specificity to her4 and uses thereof |
WO2021116789A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Anti-interleukin 1 beta antibodies for treatment of sickle cell disease |
WO2021138407A2 (en) | 2020-01-03 | 2021-07-08 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof |
TW202140550A (zh) | 2020-01-29 | 2021-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 使用抗tslp抗體治療炎性或阻塞性氣道疾病之方法 |
TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
EP4104187A1 (en) | 2020-02-14 | 2022-12-21 | Novartis AG | Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy |
TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
WO2021173719A1 (en) | 2020-02-25 | 2021-09-02 | Becton, Dickinson And Company | Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control |
US20230174933A1 (en) | 2020-02-27 | 2023-06-08 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
EP4110376A2 (en) | 2020-02-27 | 2023-01-04 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
CA3172120A1 (en) | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Inserm (Institut De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof |
JP2023520773A (ja) | 2020-03-27 | 2023-05-19 | ノバルティス アーゲー | 増殖性疾患及び自己免疫疾患を治療するための二重特異性組合せ治療 |
US20230203196A1 (en) | 2020-04-07 | 2023-06-29 | Mabwell Therapeutics Inc. | Anti-tmprss6 antibodies and uses thereof |
CN116249712A (zh) | 2020-04-15 | 2023-06-09 | 沃雅戈治疗公司 | Tau结合化合物 |
CA3180321A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
US20230181756A1 (en) | 2020-04-30 | 2023-06-15 | Novartis Ag | Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer |
CN115551553A (zh) | 2020-05-12 | 2022-12-30 | Inserm(法国国家健康医学研究院) | 治疗皮肤t细胞淋巴瘤和tfh起源淋巴瘤的新方法 |
MX2022014203A (es) | 2020-05-12 | 2023-02-22 | Lyell Immunopharma Inc | Espaciadores de receptores de antígenos quiméricos (car). |
RS65811B1 (sr) | 2020-05-19 | 2024-08-30 | Servier Lab | Para-amino-benzilni linkeri, postupak za njihovo dobijanje i njihova upotreba u konjugatima |
EP4165169A1 (en) | 2020-06-11 | 2023-04-19 | Novartis AG | Zbtb32 inhibitors and uses thereof |
CN115956088A (zh) | 2020-06-22 | 2023-04-11 | 莫佛塞斯公司 | 包括抗-CD19抗体和阻断SIRPα-CD47先天免疫检查点的多肽的抗肿瘤组合疗法 |
JP2023534214A (ja) | 2020-07-16 | 2023-08-08 | ノバルティス アーゲー | 抗ベータセルリン抗体、その断片、及び多重特異性結合分子 |
EP3943097A1 (en) | 2020-07-24 | 2022-01-26 | AB2 Bio SA | Car-t cell therapy |
WO2022035793A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Precision Biosciences, Inc. | Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof |
MX2023002107A (es) | 2020-08-21 | 2023-03-15 | Novartis Ag | Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car. |
KR20230074144A (ko) | 2020-08-26 | 2023-05-26 | 마렝고 테라퓨틱스, 인크. | NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도 |
EP4204458A1 (en) | 2020-08-26 | 2023-07-05 | Marengo Therapeutics, Inc. | Methods of detecting trbc1 or trbc2 |
CN116249718A (zh) | 2020-08-26 | 2023-06-09 | 马伦戈治疗公司 | 结合至钙网蛋白的多功能性分子及其用途 |
US11999964B2 (en) | 2020-08-28 | 2024-06-04 | California Institute Of Technology | Synthetic mammalian signaling circuits for robust cell population control |
WO2022045365A1 (ja) * | 2020-08-31 | 2022-03-03 | 国立大学法人東海国立大学機構 | フィブロネクチンiii型ドメイン骨格を含むポリペプチド |
US20230357398A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-11-09 | Morphosys Ag | Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon |
WO2022076547A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Precision Biosciences, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
WO2022097090A1 (en) | 2020-11-05 | 2022-05-12 | Novartis Ag | Dosing regimen for combination therapies with multispecific antibodies targeting b-cell maturation antigen and gamma secretase inhibitors |
MX2023005234A (es) | 2020-11-06 | 2023-05-18 | Novartis Ag | Terapia de combinacion de agente anti-cd19 y agente de direccionamiento a celulas b para el tratamiento de neoplasias malignas de celulas b. |
CA3199095A1 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Novartis Ag | Cd19 binding molecules and uses thereof |
US20240002509A1 (en) | 2020-11-06 | 2024-01-04 | Novartis Ag | ANTIBODY Fc VARIANTS |
JP2023549504A (ja) | 2020-11-13 | 2023-11-27 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体(car)発現細胞との組合せ療法 |
KR20230143605A (ko) | 2020-11-24 | 2023-10-12 | 노파르티스 아게 | Bcl-xl 억제제 항체-약물 접합체 및 그의 사용 방법 |
CN116615252A (zh) | 2020-11-24 | 2023-08-18 | 诺华股份有限公司 | 抗cd48抗体、抗体药物缀合物及其用途 |
IL303079A (en) | 2020-11-24 | 2023-07-01 | Novartis Ag | Antibody-drug conjugates inhibiting MCL-1 and methods of using them |
MX2023006538A (es) | 2020-12-04 | 2023-08-08 | Morphosys Ag | Terapia combinada de anticuerpo anti cúmulo de diferenciación 19 (cd19). |
EP4259661A1 (en) | 2020-12-14 | 2023-10-18 | Novartis AG | Reversal binding agents for anti-natriuretic peptide receptor 1 (npr1) antibodies and uses thereof |
JP2023554382A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-27 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | タウ結合化合物 |
WO2022165111A1 (en) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Precision Biosciences, Inc. | Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells |
US20240052359A1 (en) | 2021-02-10 | 2024-02-15 | Limagrain Europe | Multiplex targeted recombinations for trait introgression applications |
AU2022227686A1 (en) | 2021-02-25 | 2023-07-27 | Lyell Immunopharma, Inc. | Ror1 targeting chimeric antigen receptor |
CN115141276A (zh) | 2021-03-31 | 2022-10-04 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其在糖尿病肾病和慢性肾病治疗中的应用 |
BR112023020832A2 (pt) | 2021-04-08 | 2023-12-19 | Marengo Therapeutics Inc | Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos |
CA3214552A1 (en) | 2021-04-14 | 2022-10-20 | Russell C. Addis | Cd71 binding fibronectin type iii domains |
US20240252668A1 (en) | 2021-04-16 | 2024-08-01 | Anne-Sophie BLUEMMEL | Antibody drug conjugates and methods for making thereof |
WO2022254337A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Novartis Ag | Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof |
EP4355352A1 (en) | 2021-06-18 | 2024-04-24 | advanceCOR GmbH | Use of a pharmaceutical composition |
EP4363059A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-05-08 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof |
WO2023287573A2 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Mabwell Therapeutics Inc. | Anti-c1s antibodies and uses thereof |
CN117715939A (zh) | 2021-07-27 | 2024-03-15 | 莫佛塞斯公司 | 抗原结合分子的组合 |
JP2024531364A (ja) | 2021-08-20 | 2024-08-29 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法 |
WO2023044483A2 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
GB202113674D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Reflection Therapeutics Ltd | Targeted cell therapies |
GB202113673D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Reflection Therapeutics Ltd | Targeted cell therapies |
WO2023064872A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | Precision Biosciences, Inc. | Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors |
CA3231124A1 (en) | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Matthias Mack | Antibodies targeting ccr2 |
WO2023081767A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for immunotherapy |
WO2023091910A1 (en) | 2021-11-16 | 2023-05-25 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for cancer immunotherapy |
WO2023095034A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Novartis Ag | Modulators of adeno-associated virus transduction and uses thereof |
WO2023108150A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for cancer immunotherapy |
WO2023117987A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Universität Zürich | Adenoviral vectors |
WO2023148165A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for diagnosing collagen degradatation associated disease |
WO2023156625A1 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Adivo Gmbh | Feline antibody library |
WO2023161412A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for preventing the cleavage of cd95l by metalloproteases |
WO2023170296A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Nucleic acid system to specifically reprogram b and t cells and uses thereof |
WO2023180346A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-28 | Morphosys Ag | Deimmunized antibodies specific for cd3 |
WO2023180527A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Universität Zürich | Adenoviral mediated targeting of activated immune cells |
WO2023187657A1 (en) | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Novartis Ag | Methods of treating disorders using anti-natriuretic peptide receptor 1 (npr1) antibodies |
TW202340259A (zh) | 2022-04-14 | 2023-10-16 | 瑞士商諾華公司 | 抗cd19藥劑之劑量方案及其用途 |
WO2023214346A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides |
WO2023220695A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
AR129380A1 (es) | 2022-05-20 | 2024-08-21 | Novartis Ag | Conjugados de anticuerpo-fármaco de compuestos antineoplásicos y métodos de uso de los mismos |
WO2023225320A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Novartis Ag | Epha2 bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof |
WO2023225336A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Novartis Ag | Met bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof |
WO2023250388A1 (en) | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Voyager Therapeutics, Inc. | Tau binding compounds |
WO2024008910A1 (en) | 2022-07-07 | 2024-01-11 | Cimeio Therapeutics Ag | Antibodies targeting cd117 |
WO2024044770A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Core Biotherapeutics, Inc. | Oligonucleotides for the treatment of breast cancer |
WO2024047114A1 (en) | 2022-08-31 | 2024-03-07 | Universität Zürich | Adenoviral-based in situ delivery of bispecific t cell engagers |
WO2024052503A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof |
WO2024059739A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Tau binding compounds |
TW202423983A (zh) | 2022-09-15 | 2024-06-16 | 瑞士商諾華公司 | 使用嵌合抗原受體療法的自體免疫性障礙的治療 |
WO2024074706A1 (en) | 2022-10-07 | 2024-04-11 | Universität Zürich | Paracrine adenoviral delivery of biomolecules |
WO2024088921A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Predicting response to il-6 antagonists |
WO2024099990A1 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Leibniz-Institut Für Immuntherapie (Lit) | TGF-ß SWITCH RECEPTOR CAR T CELLS |
WO2024116053A1 (en) | 2022-11-28 | 2024-06-06 | Novartis Ag | Pcta derivatives, conjugates thereof and uses thereof |
WO2024119074A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Generation Bio Co. | Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting |
WO2024133890A1 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Cimeio Therapeutics Ag | Antibodies targeting cd45 |
WO2024148167A1 (en) | 2023-01-05 | 2024-07-11 | Precision Biosciences, Inc. | Optimized engineered meganucleases having specificity for the human t cell receptor alpha constant region gene |
US12084492B2 (en) | 2023-01-20 | 2024-09-10 | Mabwell Therapeutics, Inc. | Anti-amyloid beta protofibril/oligomer antibodies and uses thereof |
WO2024170543A1 (en) | 2023-02-14 | 2024-08-22 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Anti-cd44 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4963355A (en) * | 1986-06-23 | 1990-10-16 | Igen, Inc. | Production of antibody catalysts |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5258289A (en) | 1990-09-05 | 1993-11-02 | Davis Claude G | Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies |
AU6235294A (en) | 1993-02-02 | 1994-08-29 | Scripps Research Institute, The | Methods for producing polypeptide binding sites |
JPH08511417A (ja) | 1993-04-09 | 1996-12-03 | カタリティック アンティボディーズ,インコーポレイテッド | 触媒抗体をコードする遺伝子の選択 |
EP0759976A4 (en) | 1994-03-30 | 2001-02-07 | Igen Int Inc | THE INSULATION AND PRODUCTION OF CATALYTIC ANTIBODIES USING PHAGENTECHNOLOGY |
US6348584B1 (en) | 1996-10-17 | 2002-02-19 | John Edward Hodgson | Fibronectin binding protein compounds |
CA2293632C (en) * | 1997-06-12 | 2011-11-29 | Research Corporation Technologies, Inc. | Artificial antibody polypeptides |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
EP2154535A1 (en) | 1998-12-10 | 2010-02-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US6391855B1 (en) | 1999-06-02 | 2002-05-21 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods for modulating junctional adhesion molecule-mediated functions |
CA2416219C (en) | 2000-07-11 | 2016-10-11 | Research Corporation Technologies, Inc. | Artificial antibody polypeptides |
US7598352B2 (en) | 2000-11-17 | 2009-10-06 | University Of Rochester | Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof |
AU2003243436A1 (en) | 2002-06-06 | 2003-12-22 | Shohei Koide | Reconstituted polypeptides |
CN1678634A (zh) * | 2002-06-28 | 2005-10-05 | 多曼蒂斯有限公司 | 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体 |
JP2005537032A (ja) | 2002-08-27 | 2005-12-08 | コンパウンド セラピューティクス インコーポレーティッド | アドザイムおよびその用途 |
US20040259155A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-12-23 | Compound Therapeutics, Inc. | Methods of engineering spatially conserved motifs in polypeptides |
SG149004A1 (en) | 2003-12-05 | 2009-01-29 | Bristol Myers Squibb Co | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
-
1998
- 1998-06-12 CA CA2293632A patent/CA2293632C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 DK DK98930131T patent/DK0985039T3/da active
- 1998-06-12 DE DE1998639147 patent/DE69839147T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 WO PCT/US1998/012099 patent/WO1998056915A2/en active IP Right Grant
- 1998-06-12 EP EP20100012030 patent/EP2380906A2/en not_active Withdrawn
- 1998-06-12 JP JP50319599A patent/JP3614866B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 AT AT98930131T patent/ATE386802T1/de active
- 1998-06-12 EP EP20070022820 patent/EP1958962A3/en not_active Withdrawn
- 1998-06-12 EP EP98930131A patent/EP0985039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 AU AU79596/98A patent/AU729035B2/en not_active Ceased
- 1998-06-12 ES ES98930131T patent/ES2301198T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 US US09/096,749 patent/US6673901B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-08-11 US US09/637,614 patent/US6703199B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-11 US US09/638,202 patent/US6462189B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-06 US US10/165,155 patent/US7119171B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-18 US US10/174,717 patent/US7078490B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 US US10/190,162 patent/US7153661B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-04-24 US US11/409,939 patent/US7858090B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-24 US US11/410,227 patent/US8062858B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-30 US US11/848,155 patent/US8106162B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-31 US US11/981,784 patent/US7981620B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-06-29 US US13/172,605 patent/US9127090B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3614866B2 (ja) | 人工抗体ポリペプチド | |
US20180346551A1 (en) | Artificial antibody polypeptides | |
US8258265B2 (en) | Reconstituted polypeptides | |
AU2001277867A1 (en) | Artificial antibody polypeptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040224 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040520 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040804 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040928 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20041028 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071112 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081112 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091112 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091112 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101112 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111112 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111112 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121112 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121112 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131112 Year of fee payment: 9 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |