TWI839395B - 靶向cd137的抗體及其使用方法 - Google Patents

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本發明涉及一種特異性結合人類CD137的分離的抗體，及其藥物組合物和使用方法。本發明進一步涉及包含編碼所述抗體的核苷酸序列的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或所述載體的宿主細胞以及製備所述抗體的方法。

Description

靶向CD137的抗體及其使用方法
本發明涉及一種特異性結合特異性結合的分離的抗體，及其藥物組合物和使用方法。本發明進一步涉及編碼所述抗體的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或所述載體的宿主細胞以及製備所述抗體的方法。
腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)係為受體的蛋白質超家族，其特徵在於其藉由細胞外結構域中富含半胱胺酸的假重複(pseudorepeats)與腫瘤壞死因子(TNF)結合之能力(Locksley等人，2001,Cell.104：487-501)。目前，已經鑑定出27個TNF家族成員。TNFRSF成員及其配體主要在免疫細胞上表現，其中TNFRSF成員及其配體在免疫細胞中的T細胞介導的免疫反應中發揮免疫調節物(immunomodulators)的作用。TNFRSF成員係於樹突細胞存活之增強中、T細胞之啟動能力中、效應T細胞之最佳生成中、最佳化之抗體反應中及發炎反應之擴增中發揮作用。
CD137(4-1BB，TNF-受體超家族9，TNFRSF9)係為TNFR超家族的表面糖蛋白。其係為可誘導的共刺激性T細胞受體。 CD137表現係為活化依賴性的(activation-dependent)，並且涵蓋了廣泛的免疫細胞子集，包括活化的NK和NKT細胞、調節性T細胞、樹突細胞(DC)(包括濾泡DC)、受刺激的肥大細胞、分化髓細胞(differentiating myeloid cells)、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞(Wang等人，Immunol Rev.229(1)：192-215(2009))和活化的B細胞(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。此外，還已經在腫瘤脈管系統(Broil K等人，Am J Clin Pathol.115(4)：543-549(2001)；Seaman等人，Cancer Cell 11(6)：539-554)。(2007))上和動脈粥樣硬化內皮細胞(Olofsson等人，Circulation 117(10)：12921301(2008))上證實了CD137表現。
CD137-配體(CD137L、4-1BBL或tnfsf9)係為TNF家族的分子，且CD137-配體係為CD137已知的一種細胞間天然配體(Alderson,M.R.等人，Eur.J.Immunol.24：2219-2227(1994)；Pollok K.等人，Eur.J.Immunol.24：367-374(1994)；Goodwin,R.G.等人，Eur.J.Immunol.23：2631-2641(1993))。CD137的配體形成同三聚體(homotrimer)，以及藉由CD137所進行之信息傳遞係來自細胞表面的連接分子，這些連接分子係被三聚配體(trimerized ligand)交聯(Won,E.Y.等人，J.Biol.Chem.285：9202-9210(2010))。CD137的高階聚類被認為是介導信息轉導所必需的。CD137在其細胞質尾端片段(cytoplasmic tail)中與銜接子TRAF-2和TRAF-1締合(associate)，從而導致共免疫沉澱，此係於T細胞中CD137活化時增強(Saoulli,K.,et al.,J.Exp.Med.187：1849-1862(1998)；Sabbagh,L.,et al.,J.Immunol. 180：8093-8101(2008))。藉由CD137之TRAF-1和TRAF-2的招募，係導致NF-Kb之下游活化和絲裂原活化蛋白(Mitogen Activated Protein，MAP)激酶級聯反應(Kinase cascade)(包括ERK、JNK和p38MAP激酶)。NF-kB活化係導致Bfl-1和Bcl-XL(Bcl-1家族的促存活成員(pro-survival members))之上調節。促凋亡蛋白Bim係以TRAF-1和ERK依賴性之方式下調節(Sabbagh等人，J Immunol.180(12)：8093-8101(2008))。CD137的主要作用已被提出為使兩個或更多個TRAF-2分子彼此緊密地放置在分子中(Sanchez-Paulete,AR等人，Eur.J.Immunology 46(3)：513-。522(2016)。基於此，驅動CD137信息傳導的主要因素係推測為細胞質膜之微片(micropatches)中TRAF-2組裝的CD137部分之相對密度(Sanchez-Paulete,AR等人，Eur.J.Immunology 46(3)：513-522(2016))。總體而言，CD137信息傳導係藉由多聚作用來促進的，CD137分子的交聯係推測為CD137共刺激活性的關鍵因素。
CD137共同刺激T細胞以執行效應子功能，例如根除已確定的腫瘤、擴大原發性CD8+T細胞反應、增強抗原特異性CD8+T細胞的記憶池、誘導干擾素-γ(IFN-γ)合成。CD137刺激在CD8+T細胞功能和存活中的關鍵作用係可藉由操縱CD137/CD137L相互作用而潛在地用於治療腫瘤。實際上，小鼠體內功效研究係表示抗CD137抗體治療可導致多種腫瘤模型中的腫瘤消退。舉例而言，已證明促進性抗小鼠CD137抗體係針對P815肥大細胞瘤腫瘤和低免疫原性腫瘤模型Ag104來誘導免疫反應(I.Melero等人，Nat.Med.,3(6)：682-5 (1997))。在一些研究中，已經報導了CD137促進劑mAb在單一治療和聯合治療的預防和治療環境中的作用以及抗腫瘤保護性T細胞記憶反應(Lynch等人，Immunol Rev.222：277-286(2008))。CD137促進劑還在多種自身免疫模型中抑制自身免疫反應(Vinay等人，J Mol Med 84(9)：726-736(2006))。
目前臨床上的兩種抗CD137抗體係為烏瑞魯單抗(urelumab)(Bristol-Myers Squibb)以及烏托米單抗(utomilumab)(PF-05082566，Pfizer)，其中烏瑞魯單抗(urelumab)係為一種完全人源化的IgG4 mAb，烏托米單抗(utomilumab)係為一種完全人源化的IgG2 mAb(Chester C.等人，Cancer Immunol Immunother Oct；65(10)：1243-8(2016))。儘管利用激動性CD137的治療性抗體是非常有前途的治療策略，但它還伴隨著許多困難，例如抗CD137促進劑抗體的低功效、高毒性和不良事件。CD137促進劑抗體可導致免疫系統和器官功能之改變，係增加了毒性風險。據報導，在初生和荷瘤小鼠中高劑量的CD137促進劑抗體可誘導T細胞向肝細胞浸潤、天冬胺酸轉胺酶和丙胺酸轉胺酶升高(此係與肝臟炎症一致)(Niu L,et al.J Immunol 178(7)：4194-4213(2007)；Dubrot J,et al.,Int J Cancer 128(1)：105-118(2011))。CD137促進劑抗體在人類治療用途中的初步臨床研究還證明了肝酶之升高和肝炎發生率之增加(Sznol M.,et al.,J Clin Oncol 26(115S)：3007(2008)；Ascierto PA,et al.,Semin Oncol 37(5)：508-516(2010)；Chester C.,et al.,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10)：1243-8(2016))。在先前治療過的III/IV期黑素瘤(國家臨床 試驗(NCT)00612664)之Bristol-Myers Squibb(BMS)II期抗CD137研究中，發現了潛在的致命肝炎。此研究及其他一些研究(NCT00803374、NCT00309023、NCT00461110、NCT00351325)因不良事件而終止(Chester C.等人，Cancer Immunol Immunother Oct；65(10)：1243-8(2016))。此類不良事件很可能是由於T細胞的全身過度刺激所導致。
因此，在此領域中需要產生改善的治療性抗人類CD137抗體，其係具有更高的功效而沒有一般抗增殖藥的固有副作用，特別是具有相較於現有CD137抗體之更低的毒性。
本發明之一目的係提供與人類CD137蛋白特異性結合的抗體，其具有用於治療的有益特性，例如改善的親和力、功效、安全性以及改善的生物物理特性，例如改善的溶解度、顯影性以及穩定性。特別是，CD137抗體還沒有發現，在結合之後它們不直接地(且獨立於其他細胞表面分子)導致CD137信息傳導(CD137 antibodies are yet to be found that do not directly and independent of other cell-surface molecules result in CD137 signaling upon binding)。
於一方面中，本發明關於新穎CD137抗體。
於一方面中，本發明關於包含本發明之分離的抗體以及醫藥上可接受的載體的藥物組合物。
於另一方面中，本發明涉及用作藥物之本發明的抗體或本發明的組合物。
於一方面中，本發明涉及用於治療有此需要的受試者的癌症之本發明的抗體或本發明的組合物。
於一方面中，本發明涉及在製備用於治療有此需要的受試者的癌症的藥物中本發明的抗體或本發明的組合物之用途。
於另一方面中，本發明涉及一種在有此需要的受試者中治療癌症的方法，此方法包括向此受試者施用治療有效量之本發明的抗體或本發明的組合物。
於又另一方面中，本發明涉及編碼本發明的抗體的核酸。於又一方面中，本發明關於包含所述核酸的載體。於又一方面中，本發明關於包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。
於另一方面中，本發明關於製備本發明的抗體的方法，此方法包括培養包含本發明的核酸或載體的宿主細胞之步驟。
本發明的方面、有利特徵和較佳實施例係分別地或單獨地或組合地總結為以下幾項，以進一步有助於解決本發明之目的：
項目1. 一種分離的抗體，具有對人類CD137的結合特異性，其包含一組CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中此組CDR具有從一組CDR中10個或更少的胺基酸取代，其中：HCDR1’係為選自SEQ ID Nos：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列； HCDR2’係為選自SEQ ID Nos：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列；HCDR3’係為選自SEQ ID Nos：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列；LCDR1’係為選自SEQ ID Nos：16、19和22中任一者的胺基酸序列；LCDR2’係為選自SEQ ID Nos：17、20和23中任一者的胺基酸序列；以及LCDR3’係為選自SEQ ID Nos：18和21中任一者的胺基酸序列。
項目2. 如項目1所述之抗體，其包含：一組CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中此組CDR具有從一組CDR中10個或更少的胺基酸取代，其中：HCDR1’係如SEQ ID No：1所示；HCDR2’係如SEQ ID No：2所示；HCDR3’係如SEQ ID No：3所示；LCDR1’係如SEQ ID No：16所示；LCDR2’係如SEQ ID No：17所示；LCDR3’係如SEQ ID No：18所示。
項目3. 如項目1或項目2所述之抗體，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：(a)所述VH依次包含三個互補決定區域(complementary determining regions，CDRs)HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及 (b)所述VL依次包括三個互補決定區域(complementary determining regions，CDRs)LCDR1，LCDR2和LCDR3。
項目4. 如項目3所述之抗體，其中：(a)所述HCDR1係包含選自SEQ ID NO：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：1，所述HCDR1係較佳地由選自SEQ ID NO：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：1；(b)所述HCDR2係包含選自SEQ ID NO：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：2，所述HCDR2係較佳地由選自SEQ ID NO：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：2；(c)所述HCDR3係包含選自SEQ ID NO：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：3，所述HCDR3係較佳地由選自SEQ ID NO：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：3；(d)所述LCDR1係包含選自SEQ ID NO：16、19和22中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：16，所述LCDR1係較佳地由選自SEQ ID NO：16、19和22中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：16；(e)所述LCDR2係包含選自SEQ ID NO：17、20和23中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：17，所述LCDR2係較佳地由選自SEQ ID NO：17、20和23中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：17；(f)所述LCDR3係包含選自SEQ ID NO：18和21中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：18，所述LCDR3係較佳地由選自SEQ ID NO：18和21中任一者的胺基酸序列所組成，較佳地為SEQ ID NO：18。
項目5. 如項目3所述之抗體，其中所述抗體包含：(a)分別為SEQ ID NO：1、2和3之HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：16、17和18之LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分別為SEQ ID NO：4、5和6之HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：19、20和21之LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分別為SEQ ID NO：7、8、9之HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：16、17和18之LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。(d)分別為SEQ ID NO：10、11和12之HCDR1，HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：22和23之LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
項目6. 如項目3所述之抗體，其包含：(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成；(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：2的胺基酸序列所組成；(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：3的胺基酸序列所組成；(d)LCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：16的胺基酸序列所組成；(e)LCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：17的胺基酸序列所組成；(f)LCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列，其較佳地由SEQ ID NO：18的胺基酸序列所組成。
項目7. 如項目3至6中任一項目所述之抗體，其中所述VH包含VH3構架FR1、FR2、FR3和FR4。
項目8. 如項目3至7中任一項目所述之抗體，其中所述VL包含Vκ構架FR1、FR2和FR3以及包含構架FR4，其中Vκ構架較佳地為Vκ1或Vκ3 FR1至FR3，較佳地為Vκ1 FR1至FR3，其中構架FR4係選自Vκ FR4和Vλ FR4，其中Vκ FR4較佳地為Vκ1 FR4或Vκ3 FR4；較佳地，Vλ FR4包含與選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39的胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%一致性的胺基酸序列，Vλ FR4較佳地如SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一者所示，Vλ FR4較佳地如SEQ ID NO：33或34所示，Vλ FR4更較佳地如SEQ ID NO：33所示。
項目9. 如項目3至8中任一項目所述之抗體，其中所述VH包含與選自SEQ ID NO：13、14和15(較佳地為SEQ ID NO：13或15，更較佳地為SEQ ID NO：13)所組成的群組的胺基酸序列具有至少90%一致性的胺基酸序列；和/或所述VL包含與選自SEQ ID NO：25、26和27(較佳地為SEQ ID NO：25或27，更較佳地為SEQ ID NO：25)所組成的群組的胺基酸序列具有90%一致性的胺基酸序列。
項目10. 如項目3至9中任一項目所述之抗體，其中所述VH包含選自SEQ ID NO：13、14和15中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：13或15，更較佳地為SEQ ID NO：13；和/或所述VL包含選自SEQ ID NO：25、26和27中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：25或27，更較佳地為SEQ ID NO：25。
項目11. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。
項目12. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其中所述抗體：a)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之小於50nM的解離常數(KD)與人類CD137結合，特別是以小於10nM的解離常數(KD)，更特別是以小於5nM的解離常數(KD)；以及b)可選地，以表面電漿子共振(surface plasmon resonance)所測量之小於50nM的KD與食蟹猴(Cynomolgus)CD137結合，特別是以小於10nM的KD，更特別是以小於5nM的KD；以及c)可選地，與烏瑞魯單抗(urelumab)交叉競爭。
項目13. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其中所述抗體係不抑制CD137與其配體CD137L之間的相互作用，特別是藉由競爭ELISA(competition ELISA)所測量。
項目14. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其中所述抗體係不結合至人類CD40和/或不結合至人類OX40，特別是藉由表面電漿子共振(SPR)所測量。
項目15. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其中所述抗體：a)當為scFv形式時，具有藉由微差掃描螢光分析法(differential scanning fluorimetry)所測量之至少50℃(例如至少55℃，較佳地至少60℃，更較佳地至少64℃)的熔融溫度(Tm)，特別是其中所述抗 體係於pH 6.4的50mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製；和/或b)當為scFv形式時，且當本發明的抗體的起始濃度為10mg/ml時，在4℃下儲存至少兩週之後，特別是至少四週之後，單體含量的損失小於7%，例如小於6%、小於5%、小於4%、小於3%，較佳地小於2%，特別是其中本發明的抗體係於pH 6.4的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製；和/或d)當為scFv形式時，且當本發明的抗體的起始濃度為10mg/ml時，在五個連續的凍融循環之後，單體含量的損失小於5%，較佳地小於3%，更較佳地小於1%，特別是其中本發明的抗體係於pH 6.4的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製。
項目16. 一種分離的抗體，其中所述抗體係於CD137細胞外結構域的遠端部分中的抗原決定基上與人類CD137細胞外結構域結合，特別是在富含半胱胺酸的區域CRD1和/或CRD2之內，更特別是在SEQ ID NO：32的胺基酸殘基24-86之內。
項目17. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其中所述抗體係選自下述所組成的群組：單株抗體、嵌合抗體、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基於替代支架的結合域(binding domains)，其中基於替代支架的結合域(binding domains)係包括但不限於基於錨蛋白的結構域、fynomer、avimer、anticalins、纖連蛋白以及內置於抗體恆定區的結合位點(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)，較佳地為Fv或scFv。
項目18. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其係為單鏈可變片段(scFv)。
項目19. 如項目18所述之抗體，其中所述scFv具有選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所組成的群組的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31，更較佳地為SEQ ID NO：29。
項目20. 如項目17所述之分離的抗體，其中所述抗體係選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4所組成的群組的IgG，較佳地為IgG4。
項目21. 如前述項目中任一項目所述之分離的抗體，其中所述抗體係為人源化的(humanized)。
項目22. 如前述項目中任一項目所述之抗體，其係為多特異性分子(multispecific molecule)，特別是具有至少第二功能分子的多特異性分子(multispecific molecule)。
項目23. 如項目22所述之抗體，其中所述抗體的形式係選自下述所組成的群組：單鏈雙功能抗體(single-chain diabody，scDb)、串聯scDb(Tandab)、線性二聚scDb(LD-scDb)、圓形二聚scDb(CD-scDb)、雙特異性T細胞接合子(BiTE；串聯di-scFv)、串聯三-scFv、三體(Fab-(scFv)2)或雙體(Fab-(scFv)l)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合(Morrison L)或IgG CL-scFv融合(Morrison H))、三功能抗體(triabody)、scDb-scFv、雙特異性Fab2、雙微型抗體(di-miniantibody)、四功能抗體(tetrabody)、scFv-Fc-scFv融合、scFv-HSA-scFv融合、雙功能抗體(di-diabody)、DVD-Ig、COVD、 IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合，例如bsAb(scFv連接至輕鏈C末端)、Bs1Ab(scFv連接至輕鏈的N端)、Bs2Ab(scFv連接至重鏈的N端)、Bs3Ab(scFv連接至重鏈的C端)、Ts1Ab(scFv同時連接至重鏈和輕鏈的N端)、Ts2Ab(與重鏈C末端連接的dsscFv)、基於異二聚體Fc結構域的雙特異性抗體，例如孔中球抗體(Knob-into-Hole antibodies，KiHs)；Fv、scFv、scDb、串聯di-scFv、串聯tri-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2以及與異二聚體Fc結構域或任何其他異二聚體結構域(MATCH和DuoBodies鏈)的N端和/或C端融合之COVD。
項目24. 一種藥物組合物，包含項目1-23中任一項目所述之抗體和醫藥上可接受的載體。
項目25. 如項目1-23中任一項目所述之抗體或如項目24所述之組合物，係用作藥物。
項目26. 如項目1-23中任一項目所述之抗體，或如項目24所述之組合物，係用於製造用於治療癌症的藥物。
項目27. 如項目1-23中任一項目所述之抗體或如項目24所述之組合物，係用於治療癌症。
項目28. 如項目1-23中任一項目所述之抗體或如項目24所述之組合物在需要其的受試者中治療癌症的用途。
項目29. 一種在有其需要的受試者中治療癌症的方法，此方法包括向此受試者施用治療有效量的如項目1-23中任一項目所述之抗體或如項目24所述之組合物。
項目30. 一種核酸，係編碼如項目1-23中任一項目所述之抗體。
項目31. 一種載體，係包含如項目30所述之核酸。
項目32. 一種宿主細胞，係包含如項目30所述之核酸或如項目31所述之載體。
項目33. 一種製備如項目1-23中任一項目所述之抗體的方法，此方法包括培養包含如項目30所述之核酸或如項目31所述之載體的宿主細胞的步驟。
項目34. 一種套組，係包含如項目1至23中任一項目所述之抗體或如項目24所述之組合物。
第1圖繪示兔IgG選殖38-27-A11與烏瑞魯單抗(urelumab)和烏托米單抗(utomilumab)之抗原決定基結合結果的熱區圖(heatmap)。結合水準係標準化為理論Rmax，以分析物分子(列)與固定分子(行)的百分比(%)表示。沒有結合(深灰色)代表相同的抗原決定基，亮灰色代表次要分子(分析物)可以結合並具有與固定分子不同的另一個抗原決定基。
第2圖繪示在競爭型ELISA中CD137與CD137L結合係不具有抑制作用。在競爭型ELISA中評估CD137L與CD137結合之吸光度分別代表PRO1359或PRO1360濃度增加的功能。抑制性抗體山羊抗人類CD137係用作參考。
第3圖繪示如藉由流式細胞儀(FC)所評估之PRO1359和PRO1360 與人類CD137(表現Jurkat細胞)的結合。獲得的螢光信息的幾何平均值代表為分子濃度的函數，單位為ng/ml。烏瑞魯單抗(urelumab)係用作參考。
第4A圖繪示CD137的結構。CRD1-4代表富含半胱胺酸的結構域1-4。第4B圖繪示CD137 ECD設計的構建體。
第5A圖及第5B圖繪示以IFNγ(10ng/ml)刺激分別為6小時和24小時的HCC827細胞存在之下，三特異性scDb-scFv分子PRO1480和PRO1481係測試於CD137活性試驗中。在此實驗中，PRO885係作為參考分子來評估CD137信息傳導的相對活化。將三特異性scDb-scFv分子PRO1186放在每個盤上，以比較相對於其他scDb-scFv分子之其活性。添加Jurkat報告子細胞6小時或24小時之後讀取發光量，以及具有增加的相對發光單位(RLU)值的被測分子的濃度僅使用Sigmoidal 4PL fit(GraphPad Prism)來擬合。
第6圖繪示體外T細胞活化試驗。PBMC係藉由10ng/ml SEA來刺激，並藉由連續稀釋的scDb-scFv構建體PRO1480處理96小時。藉由收穫的上清液中IL-2之定量(通過ELISA)來評估T細胞的活化。相較於參考分子的混合物，使用PRO1480處理可產生明顯的IL-2分泌。使用sigmoidal 4PL fit(GraphPad Prism)來擬合數據。
第7圖繪示具有或不具有葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)刺激的人類PBMC之IL-2分泌(96小時，1mg/ml HSA)。PBMC係藉由10ng/ml SEA來刺激，並用序列稀釋的參考分子阿維魯單抗(avelumab)和烏瑞魯單抗(urelumab)的混合物以及 scDb-scFv PRO1480和PRO1186的混合物處理96小時。藉由收穫的上清液中IL-2之定量(通過ELISA)來評估T細胞的活化。相較於使用PRO1186的治療，使用PRO1480的治療導致明顯的IL-2分泌。使用sigmoidal 4PL fit(GraphPad Prism)來擬合數據。
第8圖繪示藉由不同的抗CD137抗體片段之活化T細胞的潛力和最大程度。抗體構建體scDb-scFv PRO1480和PRO1186對T細胞活化的潛力和最大程度係分別由IL-2分泌的曲線下面積(AUC)(如第7圖所示)以及II-2分泌的最大刺激所表示。
第9A圖及第9B圖繪示不同抗CD137抗體片段的CD137結合的示意圖，其中CD137的細胞外結構域(ECD)係由四個富含半胱胺酸的結構域(CRD1-4)所組成。第9A圖繪示抗CD137抗體PRO1480與CD137上的抗原決定基結合，此抗原決定基係包含在CRD1和/或CRD2中的ECD的遠端部分中。相反地，第9B圖繪示抗CD137抗體PRO1186與CD137上的抗原決定基結合，此抗原決定基係包含在CRD4中靠近細胞的ECD的部分中。
本發明提供特異性結合人類CD137蛋白的抗體以及此抗體和組合物之藥物組合物、製備方法以及使用方法。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域具有通常知識者通常理解的相同含義。
除非另有說明，否則詞語「包括/包含」在本文中以其開放式和非限制性的含義使用。對於這樣的下文的實施例，詞語「包括/包含」因此包括較窄的詞語「由……組成(consisting of)」。
在描述本發明的上下文中(特別是在以下申請專利範圍的上下文中)，詞語「一」以及「該」和類似的元件符號應被解釋為涵蓋單數和復數，除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾之外。舉例而言，詞語「一細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。當複數形式用於化合物(compounds)、鹽(salts)及類似物時，這也被認為是指一單一化合物(single compound)、鹽(salt)或類似物等。
在第一方面中，本發明涉及特異性結合人類CD137的抗體。
在一方面中，本揭露提供一種分離的抗體，具有對人類CD137的結合特異性，其包含一組CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中此組CDR具有從一組CDR中10個或更少的胺基酸取代，例如9個或更少的胺基酸取代、8個或更少的胺基酸取代、7個或更少的胺基酸取代、6個或更少的胺基酸取代、5個或更少的胺基酸取代、4個或更少的胺基酸取代、3個或更少的胺基酸取代，2個或更少的胺基酸取代、1個或0個胺基酸取代，較佳地為0個胺基酸取代，其中HCDR1’係選自SEQ ID Nos：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：1；HCDR2’係選自SEQ ID Nos：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：2；HCDR3’係選自SEQ ID Nos：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列，較佳地為 SEQ ID NO：3；LCDR1’係選自SEQ ID Nos：16、19和22中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：16；LCDR2’係選自SEQ ID Nos：17、20和23中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：17；LCDR3’係選自SEQ ID NO：18和21中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：18。
如本文所使用之術語「抗體(antibody)」和其類似物係包括：完整抗體(whole antibodies)或其單鏈；和其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分(antigen-binding portion)」)或其單鏈；和包含抗體CDR、VH區或VL區的分子(包括但不限於多特異性抗體)。天然存在的「完整抗體」係為醣蛋白，其包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈係由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區所組成。重鏈恆定區係由三個結構域CH1、CH2和CH3所組成。每條輕鏈係由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區所組成。輕鏈恆定區係由一個結構域CL組成。VH和VL區可以進一步細分為高變異區和散佈的較保守區，高變異區又被稱為互補決定區(CDR)，較保守區又被稱為構架區(framework regions，FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區係包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(例如效應細胞(effector cells))的各種細胞和典型補體系統的第一組分(C1q)。
如本文所使用之術語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」、「其抗原結合片段(antigen-binding fragment thereof)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」或其類似物係指完好的完整抗體的一或多個片段，其係保留與給定的抗原(例如CD137)特異性結合的能力。抗體的抗原結合功能可藉由完整抗體的片段來執行。抗體的術語「抗原結合部分(antigen binding portion)」所涵蓋之結合片段的實例包括Fab片段，係為由VL、VH、CL和CH1結構域所組成的單價片段；F(ab)2片段，係包含兩個在鉸鏈區(bivalent fragment)藉由二硫鍵連接的Fab片段的二價片段；Fd片段，係由VH和CH1結構域所組成；Fv片段，係由抗體單臂的VL和VH結構域所組成；以及基於其他支架的結合域，包括但不限於基於錨蛋白的結構域(ankyrin-based domains)，fynomerFd、avimerFd、anticalinsFd、纖連蛋白以及內置於抗體恆定區的結合位點(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)
術語「互補決定區(Complementarity Determining Regions，CDRs)」係為具有邊界的胺基酸序列，其係使用許多眾所周知的方案中的任一種來確定，包括由Kabat等人所述的方案(Kabat et al.(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，「Kabat」編號方案)、Al-Lazikani等人所述的方案(Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948，「Chothia」編號方案)、ImMunoGenTics(IMGT)編號的方案(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003) (「IMGT」編號方案)、以及Honegger & Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670中所述的編號方案。舉例而言，關於典型形式，在Kabat方案中，重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基係編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基係編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia方案中，VH中的CDR胺基酸係編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3))；和VL中的胺基酸殘基係編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。藉由同時結合Kabat方案和Chothia方案的CDR，CDR係由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和24-34(LCDR1)與人VL中的胺基酸殘基50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)所組成。在IMGT方案中，VH中的CDR胺基酸殘基係編號約為26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，以及VL中的CDR胺基酸殘基係編號約為27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根據「Kabat」編號)。在IMGT方案中，可使用程序IMGT/DomainGap Align來確定抗體的CDR。
在本發明的上下文中，除非另外特別指出，否則使用由Honegger&Plückthun(「AHo」)所建議的編號系統(Honegger & Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，根據AHo編號方案，將以下殘基定義為CDR，以下殘基係為：LCDR1(也被稱為CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也被稱為CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也被稱為CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也被稱為CDR-H1)：H27-H42； HCDR2(也被稱為CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也被稱為CDR-H3)：H108-H138。為了清楚起見，根據Honegger&Plückthun的編號系統係考量了長度分佈(length diversity)並提供序列中的空隙，其中長度分佈係被發現於在不同的VH和VL亞家族的天然抗體中，特別是在CDR中。因此，在給定的抗體可變區域(given antibody variable domain)中，通常胺基酸殘基不會佔據所有位置1到149(positions 1 to 149)。
較佳地，「抗原結合區(antigen-binding region)」至少包含可變輕(VL)鏈的胺基酸殘基4至138和可變重(VH)鏈的胺基酸殘基5至138(在每個情況下根據Honegger&Plückthun編號)，更較佳地包含VL的胺基酸殘基3至144和VH的胺基酸殘基4至144，以及特別較佳地包含完整的VL鏈和VH鏈(VL的胺基酸位置1至149和VH的胺基酸位置1至149)。抗原結合部分也可被合併至大型抗體(maxibodies)、小型抗體(minibodies)、體內抗體(intrabodies)、雙功能抗體(diabodies)、三功能抗體(triabodies)、四功能抗體(tetrabodies)、scDb-scFv、v-NAR和bis-scFv(參見，例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,1126,36)。可基於例如III型纖連蛋白(Fn3)的多肽將抗體的抗原結合部分移植到支架中(參見美國專利號6,703,199，其係描述了纖連蛋白多肽單抗)。可將抗原結合部分合併至包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，此對串聯Fv區段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata et al.,1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；and U.S.Pat.No.5,641,870)。
如本文所使用之術語「結合特異性(binding specificity)」係指一個別的抗體結合位與一抗原決定位(antigenic determinant)進行反應而不與不同的抗原決定位進行反應的能力。如本文所使用之術語「特異性結合(specifically binds to)」或「特異於(specific for)」係指例如靶標與抗體之間的結合的可測量和可再現的相互作用，其係在包括生物分子的非均質分子群體存在的情況下確定靶標的存在。舉例而言，特異性結合靶標(可為抗原決定基(epitope))的抗體係為以相較於結合至其他抗體具有更大的親和力、結合性、更容易、和/或持續時間更長的方式結合至這個標靶的抗體。在其最典型的形式(及當定義的參照未提及時)，「特異性結合(specific binding)」係指區分有關靶標(target of interest)和無關分子之抗體的能力，例如根據本領域已知特異性試驗來確認上述抗體的能力。此類方法係包括但不限於西方墨點法、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面電漿子共振)試驗和胜肽掃描。舉例而言，可進行標準的ELISA試驗。可藉由標準顯色(例如具有辣根過氧化物的二次抗體和具有過氧化氫的四甲基聯苯胺)進行評分。某些槽孔中的反應藉由光密度(例如於450nm)進行評分。典型背景(=陰性反應)係可能約為0.1OD；典型陽性反應係可能約為1OD。這意味著陽性評分和陰性評分之間的比率可為10倍或更高。在另一範例中，可進行SPR試驗，其中背景和信息之間的至少10倍的差異代表為特異性結合，較佳地背景和信息之間的至少100倍的差異代表為特異性結合。一般而言，結合特異性的確定並非藉由使用單一參考分子來進行，而是藉由使用一組大約三到五個不相關的分子(例如奶粉、輸鐵蛋白、或 其類似物)來進行。本發明的抗體對人類CD137具有結合特異性。在一具體實施例中，本發明的抗體具有對人類CD137的結合特異性，並且不與人類CD40結合和/或不與人類OX40結合，特別是藉由SPR所測定。
適當地，本發明的抗體係為分離的抗體。如本文所使用之術語「分離的抗體(isolated antibody)」係指實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如特異性結合CD137的分離的抗體係實質上不含特異性結合除CD137以外的抗原的抗體)。然而，特異性結合CD137的分離的抗體可能與其他抗原(例如來自其他物種的CD137分子)具有交叉反應性。因此，在一實施例中，本發明的抗體對人類CD137和獼猴(也被稱為食蟹猴(Cynomolgus monkey)或「食蟹猴(Cynomolgus)」)CD137具有結合特異性。此外，分離的抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物質。
適當地，本發明的抗體係為單株抗體。如本文所使用之術語「單株抗體(monoclonal antibody)」或「單株抗體組合物(monoclonal antibody composition)」係指其胺基酸序列實質上相同或源自相同遺傳來源的抗體。單株抗體組合物係顯示出對一特定抗原決定基(epitope)的一結合特異性和親和力，或對複數個抗原決定基(epitope)的複數個結合特異性和親和力。
本發明的抗體係包括但不限於嵌合的(chimeric)和人源化的(humanized)。
術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係為一抗體分子，其中(a)恆定區或其之一部分係被改變、置換或交換，使得抗原結合位 (可變區)係連接至不同或改變的類別、效應功能、和/或物種、或賦予嵌合抗體新特性完全不同分子(酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)的恆定區；或(b)可變區或其之一部分係被具有不同或改變的抗原特異性的可變區而改變、置換或交換。舉例而言，小鼠抗體係可藉由用來自人免疫球蛋白的恆定區置換其之恆定區來修飾。由於被人類恆定區所置換，因此相較於原始小鼠抗體，嵌合抗體可保留其識別抗原的特異性，並同時降低對人的抗原性。
如本文所使用之「人源化(humanized)」抗體係為保留非人抗體的反應性並同時在人類中免疫性較低的抗體。舉例而言，這可藉由保留非人類CDR區並用其人類對應物(即恆定區和構架部分的可變區)置換抗體的其餘部分來實現。可在人構架序列和衍生自另一哺乳動物物種的生殖系的CDR序列之內進行另外的構架區修飾。本發明的人源化抗體可包含未由人類序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變(random or site-specific mutagenesis in vitro)或藉由體內體細胞突變(somatic mutation in vivo)，或藉由保守取代以促進穩定性或製備，從而引入之突變)。參見例如Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855,1984；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1988；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498,1991；and Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994.。人類工程技術的其他例子包括但不限於美國專利第5,766,886號中所揭露的Xoma技術。
如本文所使用之術語「重組人源化抗體(recombinant humanized antibody)」係包括藉由重組方式所製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，例如從轉化成表現人源化抗體的宿主細胞中分離出的抗體(例如從轉染瘤中分離出的抗體)，以及包括藉由涉及將人類免疫球蛋白基因的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他方式所製備、表現、產生或分離的抗體。
適當地，本發明的抗體係為人源化的(humanized)。適當地，本發明的抗體係為人源化的(humanized)，並且包含衍生自兔的CDR(rabbit-derived CDRs)。
術語「CD137」係特別指具有如本文SEQ ID NO：32所示之UniProt ID編號Q07011的人類CD137。適當地，本發明的抗體係靶向CD137，特別是如本文SEQ ID NO：32所示之UniProt ID編號Q07011所示的人類CD137。適當地，本發明的抗體係靶向人和食蟹猴(獼猴)CD137。本發明的抗體係特異性結合CD137。在一具體實施例中，本發明的抗體具有對人類CD137的結合特異性並且不與人類CD40結合和/或不與人類OX40結合，特別是藉由SPR所測定。較佳地，本發明的抗體係不阻斷CD137/CD137L的相互作用。
適當地，本發明的抗體係為CD137促進劑。「活化劑(activator)」或「活化抗體(activating antibody)」或「促進劑(agonist)」或「促進抗體(agonist antibody)」係為藉由其結合的抗原增強或引發信息傳導之一者。在本發明的上下文中，術語「CD137促進劑(CD137 agonist)」係涵蓋能夠在其CD137-抗原結合片段聚集時能夠活化 CD137信息傳導的本發明的抗體，例如其中至少兩個所述CD137的結合-抗原結合片段係允許結合的CD137分子的多聚化(multimerization)及其活化(activation)。在一些實施例中，促進抗體在天然配體不存在的情況下活化信息傳導。
本發明的抗體包括但不限於如包括在實施例的本文所述之分離的人源化單株抗體。這樣的抗人類CD137抗體的實例係為由表1係出其序列的抗體。與本文所述抗體的製備和特徵有關的其他細節係提供於實施例中。
對人類CD137具有結合特異性之本發明的分離的抗體係包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：(a)所述VH依次包含三個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及(b)所述VL依次包含三個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3。為了更清楚地說明，CDR區係不連接至彼此，而是由構架區FR1至FR4所環繞(flanked)。
本發明提供了特異性結合CD137蛋白的抗體，所述抗體包含VH CDR，其中所述VH CDR具有表1中所列出的任何VH CDR的胺基酸序列。具體而言，本發明提供了特異性結合CD137蛋白的抗體，所述抗體包含一個、兩個或三個VH CDR，其中所述VH CDR具有表1中所列出的任何對應VH CDR的胺基酸序列。
本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的分離的抗體，其係包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH依次包含三個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1具有選自SEQ ID Nos：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：1，所述HCDR2 具有選自SEQ ID Nos：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列。較佳地為SEQ ID NO：2，所述HCDR3具有選自SEQ ID Nos：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：3。具體而言，本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的抗體，其係分別包含SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
本發明還提供了特異性結合CD137蛋白的抗體，所述抗體包含VL CDR，其中所述VL CDR具有表1中所列出的任何VL CDR的胺基酸序列。具體而言，本發明提供了特異性結合CD137蛋白的抗體，所述抗體包含一個、兩個或三個VL CDR，其中所述VL CDR具有表1中所列出的任何VL CDR的胺基酸序列。
本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的分離的抗體，其係包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL依次包含三個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1具有選自SEQ ID Nos：16、19和22中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：16，所述LCDR2具有選自SEQ ID Nos：17、20和23中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：17，所述LCDR3具有選自SEQ ID Nos：18和21中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：18。具體而言，本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的抗體，其係分別包含SEQ ID NO：16、17和18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
適當地，本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的分離的抗體，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中： (a)所述VH依次包含三個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1具有選自SEQ ID Nos：1、4、7和10中任一者的胺基酸序列，所述HCDR2具有選自SEQ ID Nos：2、5、8和11中任一者的胺基酸序列，所述HCDR3具有選自SEQ ID Nos：3、6、9和12中任一者的胺基酸序列；以及(b)所述VL依次包含三個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1具有選自SEQ ID Nos：16、19和22中任一者的胺基酸序列，所述LCDR2具有選自SEQ ID Nos：17、20和23中任一者的胺基酸序列，所述LCDR3具有SEQ ID Nos：18和21中任一者的胺基酸序列。
具體而言，本發明提供了對人類CD137具有結合特異性的抗體，並且包含(a)分別由SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3序列，以及(b)分別由SEQ ID NO：16、17和18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本發明的其他抗體包括已突變的胺基酸，但具有對於表1中所示的CDR區域中的序列之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。在一方面中，本發明的其他抗體包括突變的胺基酸序列，其中相較於表1中所示的CDR區域中的序列，本發明的突變的胺基酸序列在CDR區中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變。
在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，術語「相同(identical)」或「一致性(identity)」係指相同的兩個或更多個序列或 子序列。關於核酸、胜肽、多肽或抗體序列的「百分比(%)一致性(Percent(%)identity)」和「同源性(homology)」係定義為：在比對序列且若需要引入控隙以達成最大百分比一致性且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分後，候選序列中與特定核酸中的核酸/胺基酸殘基一致之核酸/胺基酸殘基的百分比。為了確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可藉由本領域技術範圍內的各種方式來實現，舉例而言，使用例如BLAST、BLAST-2或ALIGN軟體之類的公眾可獲得的電腦軟體。本領域技術人員可確定用於測量比對的合適參數，包括在被比對的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。
序列比較時，典型地，一個序列充當與測試序列比較的參考序列。使用序列對比演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法接著基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。
適於確定序列一致性百分比和序列相似性的演算法的兩個示例係為BLAST和BLAST 2.0演算法，BLAST演算法係描述於Altschul等人的文獻(Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977)，以及BLAST 2.0演算法係描述於Altschul等人的文獻(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403-410,1990)。用以進行BLAST分析的軟體可經由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)被大眾取得。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比也可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)的演算法(其已被併入ALIGN程序(2.0版)中)來確定、使用PAM120權重殘基表(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)演算法(其已併入GCG套裝軟體(可在全球資訊網gcg.com獲得)之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及空隙權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
術語「胺基酸」係指天然存在的和合成的胺基酸以及以類似於天然存在的胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸係為由遺傳密碼編碼的胺基酸以及後來被修飾的那些胺基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。在本文中可互換使用之術語「多肽」和「蛋白質」係指胺基酸殘基的聚合物。此術語係適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係為對應的天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，此術語係也適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另有說明，否則特定的多肽序列也隱含涵蓋其保守修飾的變異體。
適當地，對人類CD137具有結合特異性的本發明的分離的抗體包括：重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：(a)所述VH依次包含三個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3， 所述HCDR1具有與SEQ ID NO：1、4、7和10中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：1；所述HCDR2具有與SEQ ID NO：2、5、8和11中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：2；所述HCDR3具有與SEQ ID NO：3、6、9和12中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：3；和/或(b)所述VL依次包括三個互補確定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1具有與SEQ ID NO：16、19和22中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：16；所述LCDR2具有與SEQ ID NO：17、20和23中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：17；所述LCDR3具有與SEQ ID NO：18和21中任一者之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：18。
在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(a)具有分別與SEQ ID NO：1、2和3的序列之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或有分別與SEQ ID NO：16、17和18的序列之至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(a)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和/或分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在又一實施例中，本發明提供了特異性結合CD137(例如人類CD137蛋白)的分離的抗體，其中所述抗體包含VH結構域和VL結構域。在本發明的上下文中，術語「VH」(可變重鏈(variable heavy chain))、「VL」(可變輕鏈(variable light chain))、「Vκ」和「Vλ」係指根據一致性和同源性的抗體重鏈和輕鏈序列的家族。用於確定序列同源性的方法(舉例而言，係藉由使用同源性搜索矩陣，例如BLOSUM(Henikoff,S.& Henikoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)10915-10919))和用於根據同源性對序列進行分組的方法係為本領域普通技術人員眾所周知的。為了鑑別出VH、Vκ和Vλ不同的亞家族，係例如Knappik等人之文獻(Knappik et al.,J.Mol.Biol. 296(2000)57-86)中所示，其係將VH分組為VH1A、VH1B和VH2至VH6，將Vκ分組為Vκ1至Vκ4，以及將Vλ分組為Vλ1至Vλ3。在體內，抗體Vκ鏈、Vλ鏈和VH鏈係分別為種系κ鏈V和J片段、種系λ鏈V和J片段以及重鏈V的D和J片段之隨機重排的結果。給定的抗體可變鏈所屬之亞家族係由對應的V區段所確定，特別是由構架區FR1至FR3所確定。因此，任何VH序列(其特點在於，在本申請中僅有特定的一組構架區HFR1至HFR3)可與任何HFR4序列組合，例如從重鏈種系J區段之一者中所獲得之HFR4序列，或取自重新排列的VH序列之HFR4序列。
適當地，本發明提供了特異性結合CD137(例如人類CD137蛋白)的分離的抗體，其中所述抗體包含VH3結構域。屬於VH3家族的VH的具體例係由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所表示。特別地，取自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的構架區FR1至FR3係屬於VH3家族(表1，非粗體標記的前三個結構域)。適當地，如本文所使用之屬於VH3家族的VH係包含與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的FR1至FR3具有至少85%、較佳至少90%、更較佳至少95%序列一致性的FR1至FR3之VH。更特別地，取自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的構架區FR1至FR4係屬於VH3家族(表1，非粗體標記的結構域)。適當地，本文所使用之屬於VH3家族的VH係包含與SEQ ID NO：13的FR1至FR4具有至少85%、較佳至少90%、更較佳至少95%序列一致性的FR1至FR4之VH。
適當地，本發明提供了特異性結合CD137(例如人類CD137蛋白)的分離的抗體，其中所述抗體包含Vκ構架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1或Vκ3構架，較佳地為Vκ1構架FR1至3 FR3，以及包含選自Vκ FR4的FR4，特別是Vκ1 FR4或Vκ3 FR4和Vλ FR4。適當的Vκ1構架FR1至FR3係由SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26中所表示(表1，非粗體標記的FR區域)。適當的Vκ1構架FR1至FR3包含與對應FR1至FR3的胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%一致性並取自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的胺基酸序列(表1，非粗體標記的FR區域)。
適當的Vλ FR4係如SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39所表示。在一實施例中，本發明提供了特異性結合CD137(例如人類CD137蛋白)的分離的抗體，其中所述抗體包含Vλ FR4，其包含與選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一者的胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%一致性的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更較佳地為SEQ ID NO：33。
在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(i)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(ii)VH3結構域構架序列FR1至FR4；以及(iii)包含VL構架的VL結構域，其中VL構架包含Vκ構架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1或Vκ3 FR1至FR3，較佳地為Vκ1 FR1至FR3， 以及包含選自Vκ FR4的構架FR4，特別是Vκ1 FR4或Vκ3 FR4和Vλ FR4，特別是Vλ FR4，其包含與選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一者的胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更較佳地為SEQ ID NO：33，更特別是包含與選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一者的胺基酸序列的Vλ FR4，較佳地為包含胺基酸序列SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的Vλ FR4，更較佳地為SEQ ID NO：33。
在一實施方案中，因此本發明提供了一種對人類CD137具有結合特異性並且包含VL的抗體，包括：(i)CDR結構域CDR1、CDR2和CDR3；(ii)人類Vκ構架區FR1至FR3，特別是人類Vκ1構架區FR1至FR3；(iii)FR4，其係選自(a)FR4的人類Vλ生殖系序列，特別是選自以下所列出的Vλ生殖系序列：SEQ ID NO：33至39，較佳地為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更較佳地為SEQ ID NO：33；(b)基於Vλ的序列，其相較於FR4的最接近的人類Vλ生殖系序列具有一個或兩個突變，特別是具有一個突變，其中所述FR4包含選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更較佳地為SEQ ID NO：33。
在一更較佳實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(i)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列； (ii)VH3結構域構架序列FR1至FR4；以及(iii)包含VL構架的VL結構域，其中VL構架包含Vκ1構架FR1、FR2和FR3，以及VL構架包含Vλ FR4，其包含與選自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一者的胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%一致性的胺基酸序列，特別是SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39所示的Vλ FR4，較佳地為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更較佳地為SEQ ID NO：33。
本發明提供了特異性結合CD137(例如人類CD137蛋白)的分離的抗體，其中所述抗體包含表1中所列的VH結構域。
本發明還提供了與CD137特異性結合的分離的抗體，其中所述抗體包含表1中所列出的VH胺基酸序列(或由其組成)，其中構架序列(例如非CDR的序列)中突變不超過約10個胺基酸(其中作為各種非限制性實例，突變係為添加、取代或缺失)。
本發明還提供了與CD137特異性結合的分離的抗體，其中所述抗體包含表1中所列出的VH胺基酸序列，其中構架序列(例如非CDR的序列)中突變不超過約20個胺基酸(其中作為各種非限制性實例，突變係為添加、取代或缺失)。
本發明的其他抗體包括已突變的胺基酸，但在VH區中具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性，其中VH區係由表1中所述序列所示。
本發明提供了與CD137蛋白特異性結合的分離的抗體，所述抗體包含表1中所列出的VL結構域。
本發明還提供了與CD137特異性結合的分離的抗體，其中所述抗體包含表1中所列出的VL胺基酸序列，其中構架序列(例如非CDR的序列)中突變不超過約10個胺基酸(其中作為各種非限制性實例，突變係為添加、取代或缺失)。
本發明還提供了與CD137特異性結合的分離的抗體，其中所述抗體包含表1中所列出的VL胺基酸序列，其中構架序列(例如非CDR的序列)中突變不超過約20個胺基酸(其中作為各種非限制性實例，突變係為添加、取代或缺失)。
本發明的其他抗體包括已突變的胺基酸，但在VL區中具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性，其中VL區係由表1中所述序列所示。
適當地，本發明提供了特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15(較佳地為SEQ ID NO：13)具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列，以及特別是其中所述抗體包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在一實施例中，本發明提供了分離的抗體或特異性結合人類CD137的抗體，其中所述抗 體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少90%一致性的胺基酸序列，以及其中所述重鏈可變區包含G51C(AHo編號)。在又一實施例中，本發明提供了特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少90%一致性的胺基酸序列，以及其中所述重鏈可變區包括V2S、Y105F和Q141P(AHo編號)。
在又一實施例中，本發明提供了特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27(較佳地為SEQ ID NO：25)具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列，以及特別是其中所述抗體包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一實施例中，本發明提供了一種特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少90%一致性的胺基酸序列，以及其中輕鏈可變區包含T141C(AHo編號)。在又一實施例中，本發明提供了特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少90%一致性的胺基酸序列，以及其中所述輕鏈可變區包括I2F、M4L和A51P(AHo編號)。
本發明還提供了特異性結合CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：13、14和15(較佳地為SEQ ID NO：13)所組成的群組的胺基酸序列具有至少660%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列；以及包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：25、26和27(較佳地為SEQ ID NO：25)所組成的群組的胺基酸序列具有至少660%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列。
在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：13、14和15中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：13；以及輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：25、26和27中任一者的胺基酸序列，較佳地為SEQ ID NO：25。
因此，本發明提供了特異性結合人類CD137的分離的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列；以及包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地為至少90%)一致性的胺基酸序列，其中所述抗體包含分別為SEQ ID NOs：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和/或包含SEQ ID NOs： 16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，較佳地其中所述抗體包含分別為SEQ ID NOs：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和包含SEQ ID NOs：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在又一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的分離的抗體包含：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。在一較佳實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的分離的抗體包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列。
在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(a)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列，和與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列；(b)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列，和與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少60%、70%、80%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列，較佳地所述VH包含V2S、Y105F和Q141P(AHo編號)以及所述VL包含I2F、M4L和A51P(AHo編號)；或(c)分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列，和與胺基酸序列SEQ ID NO：27具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列，較佳地所述VH包含G51C(AHo編號)以及所述VL包含T141C(AHo編號)。
在一較佳實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列、包含與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列和包含與胺基酸序列SEQ ID NO：27具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列，較佳地所述VH包含G51C突變(AHo編號)以及所述VL包含T141C突變(AHo編號)。適當地，本發明的所述抗體係突變以在構架區域內形成人工域間雙硫鍵(artificial interdomain disulfide bridge)，特別是其中一對的半胱胺酸(cysteines)取代所述VH上的Gly 51(AHo編號)和所述VL上的Thr 141(AHo編 號)。令人驚訝地，包含域間雙硫鍵(interdomain disulfide bridge)之本發明的這種抗體具有顯著提高的熱穩定性。
關於雙硫鍵(「S-S鍵」或「diS」)的術語「人工的」係指S-S鍵不是由野生型抗體(wild-type antibody)所天然地形成，而是由親本分子(parent molecule)的工程突變異體所形成，其中至少一外來胺基酸係有助於雙硫鍵結。人工雙硫鍵的定點工程(site-directed engineering)係明顯不同於天然免疫球蛋白或那些可從模塊化抗體中天然獲得(例如WO 2009/000006中所述的那些)，因為人工雙硫鍵(artificial disulfide bridge)的鍵結(bridge piers)之至少一個位點通常是除了在野生型抗體中的Cys殘基的位置之外，因此還提供了在框架區內的替代或另外的雙硫鍵。可在抗體結構域(「域內橋(intradomain bridge)」)之內將本發明的人工雙硫鍵進行工程化，其中抗體結構域(「域內橋(intradomain bridge)」)係將穩定β-折疊結構或橋接結構域(「域間橋(interdomain bridge)」)或結構域鏈(「鏈間橋(interchain bridge)」)，以限制本發明的多特異性抗體的結構並支持其與潛在結合搭檔的相互作用。
在一實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包括：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。
在一較佳實施例中，對人類CD137具有結合特異性的本發明的抗體包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL。
在一實施例中，特異性結合CD137的抗體係為表1中所述的抗體。在一實施例中，特異性結合CD137的抗體係如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示。在一實施例中，特異性結合CD137的抗體係如SEQ ID NO：30所示。在一實施例中，特異性結合CD137的抗體係如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示。在一較佳實施例中，特異性結合CD137的抗體係如SEQ ID NO：29所示。
本發明的其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被突變的抗體，但其係與表1中所述的序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性。在一實施例中，其包括突變的胺基酸序列，其中當與表1中所述的序列中描述的可變區相比時，在可變區中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸被突變，同時實質上保留相同的治療活性。如本文所使用之術語「實質上相同的活性」係指一活性，其係由至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少100%、或至少110%、或至少120%、或至少130%、或至少140%、或至少150%、或至少160%、或至少170%、或至少180%、或至少190%之實質上相同的活性所表示，例如200%的針對親本抗體(parent antibody)(例如本發明的抗體，特別是表1中所述之本發明的抗體)所測定的活性。
鑒於這些抗體都可與CD137結合，且抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區域提供，VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3 序列可「混合(mixed)和匹配(matched)」(亦即，來自不同抗體的CDR可混合和匹配，儘管每個抗體必須包含一個VH CDR1、2和3以及一個VL CDR1、2和3來產生本發明的其他結合CD137的結合分子)。這種「混合和匹配」的CD137結合抗體可使用該領域中已知的結合試驗和示例中描述的內容(例如ELISAs)進行測試。當混合和匹配VH CDR序列時，應該用結構相似的CDR序列替換特定VH序列中的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同樣地，當混合和匹配VL CDR序列時，應該用結構相似的CDR序列替換特定VL序列中的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。可藉由來自如本案所示的CRD序列中的結構相似序列來突變一或多個VH和/或VL CDR區域序列，以產生新穎的VH和VL序列，係對該領域技術人員而言為顯而易見的。
在又一實施例中，本發明提供了一種抗體，其包含與表1中所述序列同源的胺基酸序列，而且所述抗體結合CD137，並保留了表1中所述的那些抗體的所需功能特性。
舉例而言，本發明提供了包含重鏈可變區和輕鏈可變區的分離的單株抗體，其中所述重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：13、14和15(較佳地為SEQ ID NO：13)的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、或至少95%一致性的胺基酸序列；輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：25、26和27(較佳地為SEQ ID NO：25)的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、或至少95%一致性的胺基酸序列；其中所述抗體係特異性結合人類CD137蛋白。
在一實施例中，VH和/或VL胺基酸序列可與所列序列具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一實施例中，除了在不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸位置上的胺基酸取代之外，VH和/或VL胺基酸序列可為相同的。
在一實施例中，本發明的抗體具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中這些CDR序列中的一者或多者係具有基於本文所述的抗體或其保守修飾之特定的胺基酸序列，以及其中所述抗體保留了本發明之結合CD137的抗體的所需功能特性。
術語「經保守修飾之變異體(conservatively modified variant)」或「保守變異體(conservative variants)」適用於胺基酸與核酸序列。相對於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼一致或基本上一致胺基酸序列之彼等核酸，或其中核酸不依照實質上一致序列來編碼胺基酸序列。由於遺傳密碼之簡併，因此許多在功能上相同之核酸編碼任何指定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸藉由密碼子說明之每一位置上，密碼子可在不改變所編碼之多肽的情況下改變成任一個所述對應密碼子。此類核酸變異為「靜默變異(silent variations)」，其為一種保守修飾型變異。本文中編碼多肽之每一核酸序列亦描述核酸之每一可能的靜默變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG之外)可經修飾以產生功能上相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之各種靜默變異隱含於各所述序列中。
就多肽序列而言，「經保守修飾之變異體」包括使得胺基酸經化學上類似胺基酸取代的針對多肽序列之個別取代、缺失或添加。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表在此項技術中已熟知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多形性變異體、種間同源物及對偶基因。以下八個群組含有彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」係用於指胺基酸修飾，其不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵。
因此，本發明提供了分離的單株抗體，其係由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區所組成，其中：重鏈可變區CDR1包含選自SEQ ID NO：1、4、7、10(較佳地為SEQ ID NO：1)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地重鏈可變區CDR1係由選自SEQ ID NO：1、4、7、10(較佳地為SEQ ID NO：1)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；重鏈可變區CDR2包含選自SEQ ID NO：2、5、8、11(較佳地為SEQ ID NO：2)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地重鏈可變區CDR2係由選自SEQ ID NO：2、5、8、11(較佳地為SEQ ID NO：2)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；重鏈可變區 CDR3包含選自SEQ ID NO：3、6、9、12(較佳地為SEQ ID NO：3)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地重鏈可變區CDR3係由選自SEQ ID NO：3、6、9、12(較佳地為SEQ ID NO：3)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；輕鏈可變區CDR1包含選自SEQ ID NO：16、19、22(較佳地為SEQ ID NO：16)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地輕鏈可變區CDR1係由選自SEQ ID NO：16、19、22(較佳地為SEQ ID NO：16)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；輕鏈可變區CDR2包含選自SEQ ID NO：17、20、23(較佳地為SEQ ID NO：17)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地輕鏈可變區CDR2係由選自SEQ ID NO：17、20、23(較佳地為SEQ ID NO：17)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；輕鏈可變區CDR3包含選自SEQ ID NO：18、21(較佳地為SEQ ID NO：18)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體，較佳地輕鏈可變區CDR3係由選自SEQ ID NO：18、21(較佳地為SEQ ID NO：18)中任一者的胺基酸序列或其保守變異體所組成；其中所述抗體係特異性結合CD137，並且能夠於存在或不存在額外交聯反應(cross-linking)的情況下活化CD137信息傳導。
在一實施例中，本發明的抗體係最佳化以在哺乳動物細胞中表現並具有重鏈可變區和輕鏈可變區，其中這些序列中的一者或多者具有基於本文所述的抗體或其保守修飾之特定胺基酸序列，以及其中抗體保留本發明的結合CD137的抗體的所需功能特性。因此，本發明提供了最佳化以在哺乳動物細胞中表現的分離的單株抗體，其包 含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：13、14、15(較佳地為SEQ ID NO：13)中任一者的胺基酸序列及其保守修飾；輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：25、26和27(較佳地為SEQ ID NO：25)中任一者的胺基酸序列及其保守修飾；其中所述抗體係特異性結合CD137，並能夠於存在或不存在額外交聯反應(cross-linking)的情況下活化CD137信息傳導。
在一實施例中，本發明的抗體係最佳化以在哺乳動物細胞中表現並具有全長重鏈序列和全長輕鏈序列，其中這些序列中的一者或多者具有基於本文所述的抗體或其保守修飾之特定胺基酸序列，以及其中抗體保留本發明之結合CD137的抗體的所需功能特性。
如本文所使用之術語「最佳化」，係意謂使用生產細胞或生物體(通常為真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中的較佳密碼子改變可編碼胺基酸序列的核酸序列。最佳化核酸序列經工程改造可完全地或儘可能多地保留初始核酸序列最初所編碼之胺基酸序列，其亦稱為「親本(parental)」序列。本文中之最佳化序列已經工程改造以具有哺乳動物細胞中之較佳密碼子。然而，本文中亦預想此等序列在其他真核細胞或原核細胞中之最佳化表現。由最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為最佳化。
可變區修飾之另一類型為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內的胺基酸殘基發生突變以藉此改良所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR介導突變誘發以引入突變且對抗體結合的影響或所關注之其 他功能特性可在如本文所述及實例所提供之活體外或活體內分析中進行評價。可引入保守性修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外，典型地，不超過一個、兩個、三個、四個或五個變化的殘基於CDR區之內。
「親和力成熟」抗體係在一或多個可變域中具有一或多個改變的抗體，相較於不具有那些改變的親本抗體，其導致抗體對抗原的親和力得到改善。在一實施例中，親和力成熟的抗體對標靶抗原具有奈米莫耳(nanomolar)或甚至皮莫耳(picomolar)的親和力。親和力成熟的抗體係可藉由本領域已知方法來產生。舉例而言，Marks等人(1992)Bio/Technology 10：779-783係描述藉由VH和VL結構域改組的親和力成熟。高變區(HVR)和/或構架殘基的隨機誘變係描述於例如Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813；Schier等人(1995)Gene 169：147-155；Jackson等人(1995)J.Immunol.154(7)：3310-9；以及Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889-896。
本發明之抗體可進一步使用具有本文所示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質來製備以對經修飾之抗體進行工程改造，該經修飾之抗體相對於初始抗體可具有改變之特性。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或在一或多個構架區內)的一或多個殘基而經工程改造。另外地或可替代地，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基(例如以改變抗體之效應功能)而經工程改造。
可進行之可變區工程改造之一種類型為CDR移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)的胺基酸殘基與靶抗原相互作用。出於此原因，與CDR外部之序列相比，CDR內部之胺基酸序列在個別抗體之間更多樣化。由於CDR序列引起大部分抗體-抗原相互作用，因此可藉由構建表現載體來表現模擬天然存在之特定抗體的重組抗體，該等表現載體包括移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的來自天然存在之特定抗體的CDR序列(參見例如Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
此類構架序列可獲自包括生殖系抗體基因序列或重組抗體序列之公共DNA資料庫或公開參考文獻。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可發現於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可獲得於全球資訊網mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836；該等各文獻之內容明確地以引用的方式併入本文中。舉例而言，人類重鍊和輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列和重組抗體序列可 發現於「IMGT」資料庫(可獲得於全球資訊網www.imgt.org；參見Lefranc，MP等人，1999 Nucleic Acids Res.27：209-212；該等各文獻之內容明確地以引用的方式併入本文中)。
用於本發明抗體之構架序列之一個實例為結構上類似於本發明之所選抗體所使用之構架序列的構架序列，例如本發明之單株抗體所使用之共同序列及/或構架序列。VH CDR1、2及3序列以及VL CDR1、2及3序列可移植至序列與構架序列所來源之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之序列一致的構架區，或CDR序列可移植至相較於生殖系序列含有一或多種突變之構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，在構架區內之殘基突變有益於維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
只要產生的多肽包括至少一個與CD137特異性結合的結合區，就可使用多種抗體/免疫球蛋白構架或支架。此類構架或支架包括人類免疫球蛋白的五種主要獨特型、其抗原結合片段、以及包括其他動物物種的免疫球蛋白，較佳地具有人源化方面。
在一方面中，本發明係關於使用本發明之CDR可移植於其上之非免疫球蛋白骨架產生基於非免疫球蛋白之抗體。可使用已知或未來的非免疫球蛋白構架及支架，只要其包含特異性針對標靶CD137蛋白之結合區即可。已知非免疫球蛋白構架或支架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體 (Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、最大抗體(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白質A(Affibody AG,Sweden)及阿菲林(affilin)(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
適當地，本發明的抗體係與CD137特異性結合，且其特徵在於下列參數中的一者或多者：(i)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之小於50nM的解離常數(KD)來結合至人類CD137，特別是小於10nM的解離常數(KD)，更特別是小於5nM的解離常數(KD)；(ii)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之5x10-3s-1或更少、或10-3s-1或更少、或5x10-4s-1或更少、或10-4s-1或更少的Koff率來結合至人類CD137；(iii)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之至少104M-1s-1或更大、至少105M-1s-1或更大、至少5x105M-1s-1或更大、至少106M-1s-1或更大的Kon率來結合至人類CD137；(iv)可選地，與烏瑞魯單抗(urelumab)交叉競爭；以及(v)可選地，與食蟹獼猴(Macaca fascicularis(Cynomolgus))CD137交叉反應；(vi)可選地，特別是藉由競爭型ELISA(competition ELISA)測定，不抑制CD137和CD137L之間的相互作用，。
如本文所用，術語「親和力」係指位於單一抗原位點處抗體與抗原之間相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體的分子)的單一結合位點與其結合搭檔(例如抗原)之間的非共價相互作用的總和強度。除非另有說明，否則如本文所用，「結合親和力」、「結合至」、「結合」或「與...結合」係指反應結合配對(例如抗體片段和抗原)之間1：1相互作用的內在結合親和力。分子X與其搭檔Y的親和力通常可用解離常數(KD)表示。親和力可藉由本領域已知的常規方法來測量，包括本文所述的那些。低親和力抗體通常會緩慢結合抗原並易於解離，而高親和力抗體通常會更快地與抗原結合並保持更長結合時間。測量結合親和力的多種方法是本領域已知的，任何一種方法均可用於本發明之目的。下文係描述用於測量結合親和力(亦即結合強度)之具體說明性和示例性實施例。
如本文所用之術語「Kassoc」、「Ka」或「Kon」意指特定抗體-抗原相互作用之結合速率，而如本文所用之術語「Kdis」、「Kd」或「Koff」意指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。在一實施例中，如本文所用之術語「KD」意指解離常數，其獲自Kd與Ka之比率(亦即Kd/Ka)且以莫耳濃度(M)表示。根據本發明之「KD」或「KD值」或「KD」或「KD值」是藉由使用MASS-1 SPR儀器(Sierra Sensors)使用表面電漿子共振試驗(surface-plasmon resonance assays)所測量 的。為了測量親和力，使用標準胺-耦聯方法(standard amine-coupling procedure)，將對兔IgGs Fc區特異的抗體(Bethyl Laboratories，目錄號A120-111A)固定在感測器晶片(SPR-2 Affinity Sensor，High Capacity Amine，Sierra Sensors)上。固定的抗兔IgG抗體係捕捉B細胞上清液中的兔單株抗體。需要足以被捕捉的B細胞上清液中的IgG最低濃度。捕捉單株抗體之後，將人類CD137 ECD(Peprotech，目錄號310-15-1MG)以90nM的濃度注入流動池中經歷3分鐘，然後使從感測器晶片上的IgG中所捕捉之蛋白質進行解離5分鐘。每個注射循環之後，兩次注射10mM甘胺酸-HCl即可再生表面。表觀解離(kd)及締合(ka)速率常數以及表觀解離平衡常數(KD)使用MASS-1分析軟件(Analyzer，Sierra Sensors)係使用一對一朗謬結合模型(one-to-one Langmuir binding model)和基於相對Chi2(將Chi2標準化為分析物的最大外推結合水平)(這是對曲線擬合質量的測量)進行監測的擬合。Chi2的值越小，擬合至一對一朗謬結合模型(one-to-one Langmuir binding model)則越準確。若配體結合之反應單位(RU)係為抗體捕捉之RUs的至少2%，則認為結果係為有效的。具配體結合之RU小於抗體捕捉之RU之2%的樣本視為不顯示CD137與所捕捉抗體之特異性結合。平衡解離常數(KD)以比率koff/kon計算。參見例如Chen等人之文獻(Chen et al,J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。
適當地，本發明的抗體對CD137的親和力可與CD137L對CD137的親和力相當或更高。適當地，本發明的抗體對CD137的親和力可與尿嘧啶對CD137的親和力相當或更高。應當理解，CD137結 合結構域的較高親和力可能特別適合用於抗體，其中所述抗體對於CD137係為單價的。抗體的結合親和力可例如藉由解離常數(KD)來確定。較低的KD表示較強的親和力，而較高的KD表示較弱的親和力。
因此，在合適的實施方案中，本發明的抗體可具有介於5pM至50,000pM之間、5pM至40,000pM之間、5pM至30,000pM之間、5pM至20,000pM之間、5pM至10,000pM之間、5pM至9,000pM之間、5pM至8,000pM之間、5pM至7,000pM之間、5pM至6,000pM之間、5pM至5,000pM之間的KD，特別是藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量。在另一實施例中，本發明的抗體以介於10nM和10pM之間的KD、較佳地介於10nM和0.1nM之間的KD、更較佳地介於5nM和1nM之間的KD來結合至人類CD137，特別是藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量。
在一合適實施例中，本發明的抗體可具有小於約50nM、小於約45nM、小於約40nM、小於約35nM、小於約30nM、小於約25nM、小於20nM、小於大約15nM、小於大約10nM、小於大約9nM、小於大約8nM、小於大約7nM、小於大約6nM、小於大約5nM的KD，特別是藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量。適當地，本發明的抗體具有小於10nM的KD，特別是藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量。較佳地，本發明的抗體以小於5nM的KD來結合至人類CD137，特別是藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量。
適當地，本發明的抗體以藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之至少103M-1s-1或更大、至少104M-1s-1或更大、至少5x104M-1s-1或更大、至少105M-1s-1或更大，至少5x105M-1s-1或更大、至少106M-1s-1或更大的Kon率來結合至人類CD137。適當地，本發明的抗體具有藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之至少105M-1s-1或更大的Kon率，特別是具有至少5x105M-1s-1或更大的Kon率。
適當地，本發明的抗體以藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之10-3s-1或更小、3x10-3s-1或更小、5x10-3s-1或更小、10-4s-1更小、5x10-4s-1或更小的Koff率來結合至人類CD137。適當地，本發明的抗體具有通過SPR測量的5x10-3s-1或更小的Koff率。
適當地，本發明的抗體具有有益的生物物理特性。
適當地，當以scFv形式存在時，本發明的抗體具有藉由微分掃瞄螢光檢測法(differential scanning fluorimetry)所測定之至少50℃、例如至少55℃、較佳地至少60℃、更較佳地至少65℃的解鏈溫度(Tm)，特別是其中所述抗體係在pH 6.4下的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液中加入150mM NaCl。DSF已描述於前文(Egan,et al.,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen,et al.,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)。scFv構築體的熱展開轉變中點(midpoint of transition for the thermal unfolding)係使用螢光染料SYPRO®Orange(參見Wong&Raleigh，Protein Science 25(2016)1834-1840)藉由微分掃瞄螢光檢測 法(differential scanning fluorimetry)所測定。在pH 6.4的檸檬酸磷酸鹽緩衝液中製備的樣本的最終蛋白質濃度係為50μg/mL，最終濃度係為5xSYPRO®Orange，總體積係為100μl。將25微升的製備樣本一式三份地(in triplicate)添加到白壁AB基因PCR板(white-walled AB gene PCR plates)中。試驗係於用作熱循環儀的qPCR機中進行，並使用軟體的自定義染色校準程序(software’s custom dye calibration routine)檢測螢光發光量。包含測試樣本的PCR板係於25℃到96℃之間以1℃的增量來進行升溫，每升溫1℃，暫停30秒。總試驗時間約兩個小時。Tm係由GraphPad Prism軟體計算，採用數學二階導數法計算曲線拐點。報告的Tm係為三次測量的平均值。
本發明的抗體，特別是當以scFv抗體形式(單鏈可變片段)表現時，當本發明的抗體初始濃度為10mg/ml時，特別是其中本發明的抗體係在pH 6.4下的50mm磷酸檸檬酸鹽緩衝液中加入150mm NaCl來製備，其特徵在於存儲至少兩週後的單體含量損失(特別是至少4週後4℃)係小於7%，例如小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、較佳地小於2%。單體含量損失係藉由SE-HPLC色譜圖(SE-HPLC chromatograms)的曲線計算下的面積所確定。反相高效液相色譜法(SE-HPLC)係為一種根據美國藥典第621章(USP chapter 621)所概述之基於固相和液相流動相的分離技術。此方法係利用疏水性固定相(hydrophobic stationary phase)和水性流動相(aqueous mobile phase)根據分子的尺寸和形狀來分離分子。分子的分離係發生於特定色譜柱的空隙體積(V0)與總滲透體積(VT)之間。藉由反相高效液相色譜法 (SE-HPLC)的測量是在Chromaster HPLC系統(Hitachi High-Technologies Corporation)上進行的，此系統配備了自動樣本注射和設置為280nm檢測波長的UV檢測器。此設備係藉由軟體EZChrom Elite(Agilent Technologies，版本3.3.2 SP2)所控制，此軟件還支持所產生的色譜圖的分析。蛋白質樣本係藉由離心處理並於注射前保持在4-6℃的自動進樣器中。對於scFv樣本的分析，將管柱Shodex KW403-4F(Showa Denko Inc.,# F6989202)與標準的緩衝鹽水流動相(在pH 6.5下50mM的磷酸鈉中加入300Mm的NaCl)一起使用，建議流速為0.35mL/min。每次注射的目標樣本的負載量係為5μg。用UV檢測器在280nm波長處檢測樣本，並藉由合適的軟體套件記錄數據。在V0至VT之範圍內分析所產生的色譜圖，從而排除具有>10分鐘洗脫時間之矩陣相關的峰。
此外，本發明的抗體，特別是當以scFv(單鏈可變片段)抗體形式表現時，當本發明的抗體的起始濃度係為10mg/ml時，特別是其中本發明的抗體係在Ph 6.4下的50mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液中加入150mM NaCl來製備，在連續五個凍融循環後的單體含量損失係小於5%，較佳地小於3%，更較佳地小於1%。
術語「抗原決定基」(epitope)係指能夠特異性結合至抗體之抗原的局部區域。抗原決定基可例如為多肽的連續胺基酸，或抗原決定基可例如為一起來自一或多個多肽中之兩個或更多個非連續區域。
在一實施例中，本發明的抗體與烏瑞魯單抗(urelumab)交叉競爭來結合CD137。烏瑞魯單抗(urelumab，又被稱為BMS-663513)係來自Bristol-Myers Squibb的完全人源化的IgG4 mAb，並描述於WO 2004/010947、US 6,887,673和US 7,214,493中，在此藉由引用將其全部內容併入本申請中。適當地，根據非限制性理論，本發明的抗體可能與烏瑞魯單抗(urelumab)結合在CD137上相同或重疊的(例如結構相似或空間上接近的)抗原決定基。
在一實施例中，本發明的抗體不與烏托米單抗(utomilumab)交叉競爭來結合CD137。本發明提供了與不同於烏托米單抗(utomilumab)的抗原決定基結合之抗體。烏托米單抗(utomilumab，又被稱為PF-05082566)係來自Pfizer的完全人類IgG2 mAb，並描述於WO 2012/032433和US 8,821,867中，在此藉由引用將其全文併入本申請中。適當地，根據非限制性理論，本發明的抗體可而結合至CD137上與烏托米單抗不同(例如結構上不同或空間上較遠)的抗原決定基。如本文所用，術語「識別」係指發現並與其構象抗原決定基相互作用(例如結合)的抗體。
本發明的抗體係在位於CD137細胞外結構域的遠端部分中的抗原決定基處結合至人類CD137細胞外結構域，特別是在富含半胱胺酸的結構域1至2(CRD1至2)之內，特別是在SEQ ID NO：32的胺基酸殘基24-86之內。
因此，在另一方面，本揭露內容還提供了結合至如本揭露內容的任何示例性抗體(特別是表1中所列出的任何示例性抗體)之相 同的抗原決定基。本揭露內容提供了一種分離的抗體，其中所述抗體在位於CD137細胞外結構域的遠端部分(特別是在富含半胱胺酸的結構域CRD1和/或CRD2之內，更特別是在SEQ ID NO：32的胺基酸殘基24-86之內)的抗原決定基處結合至人類CD137細胞外結構域。在一些實施例中，分離的抗體係包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和/或包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，較佳地其中抗體係包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。適當地，抗體具有上文所述之一或多種生物學特性。
其他抗體因此可基於其在CD137結合試驗中與本發明的其他抗體交叉競爭(例如以統計學上顯著的方式競爭性地抑制其結合)之能力加以鑑別。在一特定實施例中，本揭露內容提供了一種分離的抗體，其係與本揭露內容的任何示例性抗體(特別是表1中所列出的任何示例性抗體)競爭或交叉競爭而結合至人類CD137之相同的抗原決定基。
術語「競爭」(compete)或「交叉競爭」(cross-compete)及本文中可互換使用的相關術語，係指在標準競爭性結合試驗中抗體或其他結合劑之干擾其他抗體或結合劑結合至CD137的能力。
抗體或其他結合劑能夠干擾另一種抗體或結合分子與CD137結合之能力或程度，且因此可藉由標準競爭結合試驗(standard competition binding assays)來確定其是否可為根據本發明之交叉競爭 (cross-compete)。一種特別合適的定量交叉競爭測定法係使用基於FACS或基於AlphaScreen的方法來測量標記的(例如His標記的、生物素化的、或放射性標記的)抗體或其片段與另一種抗體或其片段之間它們與標靶的結合。一般而言，交叉競爭抗體或其片段是例如將在交叉競爭試驗中與標靶結合之抗體，使得在試驗期間並且存在第二抗體或其片段之情況下，藉由存在於給定量之待測試的潛在交叉阻斷抗體或其片段，根據本發明之免疫球蛋白單一可變結構域或多肽之記錄的位移係高達最大理論位移(例如需要交叉阻斷(cross-blocked)之冷(例如未標記)抗體或其片段的位移)的100%(例如基於FACS的競爭試驗)。較佳地，交叉競爭抗體或其片段具有在10%至100%之間的記錄位移，更較佳地為在50%至100%之間的記錄位移。
適當地，本發明之分離的抗體係選自下述所組成的群組：單株抗體、嵌合抗體、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB以及基於替代支架的結合域(binding domains)，其中基於替代支架的結合域(binding domains)係包括但不限於基於錨蛋白的結構域、fynomer、avimer、anticalins、纖連蛋白以及內置於抗體恆定區的結合位點(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)
適當地，本發明之分離的抗體係為Fv片段。適當地，本發明之分離的抗體係為scFv片段。「單鏈Fv」或「scFv」或「sFv」抗體係包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域係存在於單一個多肽鏈中。一般而言，scFv多肽還包含位於VH和VL結構域之間的多肽連接體(polypeptide linker)，其中多肽連接體使scFv能夠形成所需的 抗原結合結構(參見例如Plückthun,The pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315)。在一特定實施例中，所述功能性片段(functional fragment)係為包含位於VH和VL結構域之間的多肽連接體(polypeptide linker)之scFv形式，其中所述連接體包含四個(4)甘胺酸胺基酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS)n中一或多個單元，其中n=1、2、3、4、5、6、8或8，較佳地n=4。在一特定實施例中，所述功能性片段(functional fragment)係為包含根據SEQ ID NO：28的連接體之scFv形式。在一實施例中，本發明之分離的抗體係特異性結合至人類CD137，本發明之分離的抗體係包含與選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31(較佳地為SEQ ID NO：29)所組成的群組的胺基酸具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之分離的抗體係為如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31(較佳地為SEQ ID NO：29)所示的單鏈可變片段(scFv)。在一實施例中，本發明之分離的抗體係為如SEQ ID NO：30所示的單鏈可變片段(scFv)。在一實施例中，本發明之分離的抗體係為如SEQ ID NO：31所示的單鏈可變片段(scFv)。本發明之分離的抗體係為如SEQ ID NO：35所示的單鏈可變片段(scFv)。
適當地，本發明之分離的抗體係為IgG抗體同種型。術語「同種型」(isotype)係指由重鏈恆定區基因所提供的抗體類別(例如 IgM、IgE和例如為IgG1或IgG4的IgG)。同種型還包括這些類別之一者中的修飾形式，其中修飾可改變Fc功能以例如增強或降低效應子功能(effector functions)或與Fc受體的結合。在一實施例中，本發明之分離的抗體係為選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(較佳地為IgG4)的IgG。適當地，本發明之分離的抗體係為IgG4，其包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：13具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之VH序列和包含與SEQ ID NO：25具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之VL序列。在一更具體實施例中，本發明的抗體係為IgG4，其包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：14具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之重鏈序列和包含與SEQ ID NO：26具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之輕鏈序列。適當地，本發明之分離的抗體係為IgG4，其包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和 LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：15具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之VH序列和包含與SEQ ID NO：27具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳地至少90%)一致性的胺基酸序列之VL序列。
在另一特定實施例中，本發明之分離的抗體係為多特異性分子，特別是具有至少第二功能分子的多特異性分子，例如雙特異性分子、三特異性分子、四特異性分子、五特異性分子或六特異性分子。
如本文所用，術語「多特異性分子」或「多特異性抗體」係指結合到至少兩個或更多個不同靶標(例如CD137和不同於CD137的另一靶標)上之兩個或更多個不同抗原決定基的抗體，或結合到同一靶標之兩個或多個不同抗原決定基的抗體。術語「多特異性分子」包括雙特異性、三特異性、四特異性、五特異性和六特異性抗體。如本文所用，術語「雙特異性抗體」係指結合到兩個不同靶標上或相同靶標上之兩個不同抗原決定基的抗體。如本文所用，術語「三特異性抗體」係指結合到三個不同靶標上或相同靶標上之三個不同抗原決定基的抗體。
本發明的抗體或其抗原結合區可被衍生或連結至另一功能性分子(例如另一胜肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配體))以產生結合到至少兩個結合位點和/或不同標靶分子的多特異性分子。實 際上，本發明的抗體可被衍生或連結至超過一個其他功能性分子以產生結合到超過兩個不同結合位點和/或標靶分子的多特異性分子。為了製備本發明的多特異性分子，本發明的抗體可被功能性地連結(例如藉由化學耦合、遺傳融合、非共價結合或其他方式)至一或多個其他結合分子(例如另一抗體、抗體片段、胜肽、或結合模擬物)，從而產生多特異性分子。
因此，本發明包括多特異性分子，其包含對於CD137之至少一個第一結合特異性和包含對於第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。舉例而言，第二標靶抗原決定基係存在於不同於CD137的另一標靶分子上。
在缺乏外源性聚集(exogenous clustering)的情況下，二價CD137抗體誘導信息傳導的能力通常較弱。為了說明，抗CD137抗體烏托米單抗(anti-CD137 antibody utomilumab)僅在交聯至抗人類F(ab’)2二次抗體或固定至組織培養塑料上時才能夠活化CD137信息傳導(Fisher at al.,Cancer Immunol Immunother 61：1721-1733(2012))。對於CD40(TNFRSF5)(TNFRSF的另一個成員)的囓齒類動物拮抗抗體之研究係揭示外源性聚集(exogenous clustering)可藉由與Fcγ受體的相互作用而部分地實現(Li F,Ravetch JV,Science 333(6045)：1030-10(2011)；White AL,et al.,J Immunol 187(4)：1754-1763(2011))。然而，與Fcγ受體的相互作用可藉由效應子機制(effector mechanisms)耗盡CD137表現細胞。因此，目前靶向CD137的二價抗體係為無效的促進劑或係導致CD137陽性細胞的耗盡。適當地，多特異性分子的第二 結合特異性係能夠提供本發明之CD137結合抗體的額外交聯。因此，本發明包括多特異性分子，其包含對於CD137之至少一個第一結合特異性和對於第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。舉例而言，第二標靶抗原決定基係為不同於第一標靶抗原決定基之CD137的另一抗原決定基。除了第一和第二標靶抗原決定基之外，多特異性分子還可包括第三結合特異性。
在另一實施例中，本發明包括對於CD137特異性之單價、二價或多價的多特異性分子，較佳地為單價。
在本發明之另一具體實施例中，本發明之分離的抗體係為對於CD137特異性之單價或多價的分子，例如二價、三價、四價、五價或六價。
如本文所用，術語「單價分子」或「單價抗體」係指結合至例如CD137的標靶分子上的單一個抗原決定基的抗體。
術語「多價分子」或「多價抗體」係指具有超過一個化合價(valency)的單一個結合分子，其中「化合價」(valency)被描述為與相同標靶分子上的抗原決定基結合之抗原結合部分的數量。因此，單一個結合分子可結合至超過一個標靶分子，或結合至包含抗原決定基多個拷貝的標靶分子上的超過一個結合位點。多價抗體的實例包括但不限於二價抗體、三價抗體、四價抗體、五價抗體等。如本文所用，術語「二價抗體」(bivalent antibody)係指具有兩個抗原結合部分的抗體，每個抗原結合部分係結合至相同的抗原決定基。
適當地，本發明之分離的抗體係為多特異性分子(例如雙特異性分子和/或多價分子(例如對於CD137特異性分子為單價的，對於CD137特異性分子為二價的))，其係選自任何合適的多特異性抗體的抗體形式，例如本領域已知的雙特異性形式，包括但不限於基於單鏈雙功能抗體(single-chain diabody，scDb)、串聯scDb(Tandab)、線性二聚scDb(LD-scDb)、圓形二聚scDb(CD-scDb)、雙特異性T細胞接合子(BiTE；串聯di-scFv)、串聯三-scFv、三體(Fab-(scFv)2)或雙體(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合(Morrison L)或IgG CL-scFv融合(Morrison H))、三功能抗體(triabody)、scDb-scFv、雙特異性Fab2、雙微型抗體(di-miniantibody)、四功能抗體(tetrabody)、scFv-Fc-scFv融合、scFv-HSA-scFv融合、雙功能抗體(di-diabody)、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合，例如bsAb(scFv連接至輕鏈C末端)、Bs1Ab(scFv連接至輕鏈的N端)、Bs2Ab(scFv連接至重鏈的N端)、Bs3Ab(scFv連接至重鏈的C端)、Ts1Ab(scFv同時連接至重鏈和輕鏈的N端)、Ts2Ab(與重鏈C末端連接的dsscFv)、基於異二聚體Fc結構域的雙特異性抗體，例如孔中球抗體(Knob-into-Hole antibodies，KiHs)；Fv、scFv、scDb、串聯di-scFv、串聯tri-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2以及與異二聚體Fc結構域或任何其他異二聚體結構域(MATCH(描述於WO 2016/0202457；Egan T.,et al.,mAbs 9(2017)68-84))和DuoBodies(藉由Duobody技術所製備之雙 特異性IgG))的N端和/或C端融合之COVD(MAbs.2017 Feb/Mar；9(2)：182-212.doi：10.1080/19420862.2016.1268307)。
術語「雙功能抗體」(diabodies)係指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其片段包含與同一多肽鏈(VH-VL)中的VL連結的VH。藉由使用連接體(其係太短而不允許同一鏈上的兩個結構域之間的配對)，這些結構域係被迫與另一鏈的互補結構域配對以產生兩個抗原結合位點。在一特定實施例中，所述多肽連接體系包含四個(4)甘胺酸胺基酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS)n之單元，其中n=1或2，較佳地為1。雙功能抗體可為二價或雙特異性的。雙功能抗體係更完整地描述於例如EP404097、WO 93/01161、Hudson等人之文獻(Hudson et al.,Nat.Med.9：129-134(2003))、以及Holliger等人之文獻(Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))。三功能抗體(triabodies)和四功能抗體(tetrabodies)亦描述於Hudson等人之文獻(Hudson et al.,Nat.Med.9：129-134(2003))。
雙特異性scDb(特別是雙特異性單體scDb)係特別地包含藉由連接體L1、L2和L3以VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB的順序連接之兩個可變重鏈結構域(variable heavy chain domains，VH)或其片段和兩個可變輕鏈結構域(variable light chain domains，VL)或其片段，其中VLA和VHA結 構域係共同地形成第一抗原的抗原結合位點，而VLB和VHB係共同地形成第二抗原的抗原結合位點。
連接體L1係特別是2-10個胺基酸的胜肽，更特別是3-7個胺基酸，最特別是5個胺基酸，以及連接體L3係特別是1-10個胺基酸的胜肽，更特別是2-7個胺基酸，最特別是5個胺基酸。在一特定實施例中，連接體L1和/或L3係包含四個(4)甘胺酸胺基酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS)n之單元，其中n=1或2，較佳地n=1。
中間連接體L2係特別是10-40個胺基酸，更特別是15-30個胺基酸，最特別是20-25個胺基酸的胜肽。在一特定實施例中，所述連接體L2係包含四個(4)甘胺酸胺基酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS)n之一或多個單元，其中n=1、2、3、4、5、6、7或8，較佳地n=4。
在本發明之一實施例中，分離的抗體係為scDb-scFv形式的多特異性和/或多價抗體。術語「scDb-scFv」係指一抗體形式，其中單鏈Fv(scFv)片段係藉由柔性Gly-Ser連接體與單鏈雙抗體(scDb)融合。在一實施例中，所述柔性Gly-Ser連接體係為2-40個胺基酸的胜肽，例如2個至35個胺基酸、2個至30個胺基酸、2個至25個胺基酸、2個至20個胺基酸、2個至15個胺基酸、2個至10個胺基酸，特別是10個胺基酸。在一特定實施例中，所述連接體係包含一或多個單元，此單元具有四個(4)甘胺酸胺基酸殘基和一個(1)絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS)n，其中n=1、2、3、4、5、6、7或8，較佳地n=2。
在本發明之一實施例中，分離的抗體係為WO 2016/0202457和Egan等人之文獻(Egan T.,et al.,mAbs 9(2017)68-84)中所述的MATCH格式之多特異性和/或多價抗體。
本發明之多特異性和/或多價分子係可使用本領域已知任何方便的抗體製備方法來製備(關於製備雙特異性構建體，參見例如Fischer,N.& Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；關於雙特異性雙抗體和串聯scFv，參見例如Hornig,N.& Färber-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用於製備本發明的雙特異性構建體的合適方法的實例還主要包括Genmab(參見Labrijn et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)以及Merus(參見Kruif et al.,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技術。製備包含功能性抗體Fc部分的雙特異性抗體的方法在本領域中亦為已知的(參見例如Zhu et al.,Cancer Lett.86(1994)127-134)；以及Suresh et al.,Methods Enzymol.121(1986)210-228)。
可使用於本發明之多特異性和多價分子的其他抗體係為鼠源性(murine antibodies)、嵌合抗體(chimeric antibodies)和人源化單株抗體(humanized monoclonal antibodies)。
使用本領域已知的方法，本發明的多特異性分子可藉由接合(conjugate)組分結合特異性來製備。舉例而言，雙特異性分子的每種結合特異性可分別地製備，之後彼此接合。當結合特異性係為蛋白質或胜肽時，可使用多種耦合劑(coupling agents)或交聯劑(cross-linking agents)進行共價接合(covalent conjugation)。交聯劑的 實例係包括蛋白A、碳二亞胺(carbodiimide)、N-琥珀醯亞胺基-5-乙醯基硫代乙酸酯(N-succinimidyl-5-acetyl-thioacetate，SATA)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)、鄰苯二甲醯亞胺(o-phenylenedimaleimide，oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)和磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate，sulfo-SMCC)(參見例如Karpovsky et al.,1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,M A et al.,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus等人之文獻(Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan et al.,1985 Science 229：81-83)和Glennie等人之文獻(Glennie et al.,1987 J.Immunol.139：2367-2375)。接合劑(conjugating agents)係為SATA和磺基-SMCC，兩者均可獲得自Pierce Chemical Co.(Rockford，111)。
當結合特異性係為抗體時，其係可藉由兩條重鏈的C末端鉸鏈區的巰基鍵(sulfhydryl bonding)來結合。在一特別實施例中，在接合之前，鉸鏈區(hinge region)係修飾成包含奇數個(例如一個)巰基殘基(sulfhydryl residues)。
可替代地，兩個或更多個結合特異性可編碼於相同的載體中並表現和裝配於相同的宿主細胞中。當雙特異性分子為mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab’)2或配體X Fab融合蛋白時，此方法係特別有用。本發明的多特異性分子可為包含一單鏈抗體和一結合決 定區(binding determinant)之一單鏈分子，或可為包含兩個結合決定區(binding determinant)之一單鏈多特異性分子。製備多特異性分子的方法係描述於例如美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；和美國專利第5,482,858號。
可藉由例如酵素免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、FACS分析、生物性測定(例如抑制生長)或西方墨點法來確認該雙重專一性分子與其特定標靶的結合。這些方法通常使用對感興趣之複合物具有專一性的標記試劑(例如抗體)，來偵測特別感興趣的蛋白質-抗體複合物是否存在。
在另一方面，本發明提供了編碼本發明抗體的核酸。本發明還提供了編碼抗體的CDR、VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈之核酸序列，其中此抗體係與CD137蛋白特異性結合。此類核酸序列可最佳化以在哺乳動物細胞中表現。
術語「核酸」在本文中可與術語「聚核苷酸」互換使用且係指呈單股或雙股形式之一或多個去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵聯的核酸，該等核酸為合成的、天然存在的及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合特性，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。此類類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另外指 明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指定之序列。特定言之，如下詳述，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
本發明提供了實質上純化的核酸分子，其編碼包含上述CD137結合抗體鏈的區段或結構域的多肽。當從合適的表現載體表現時，由這些核酸分子編碼的多肽能夠表現出CD137抗原結合能力。
本發明還提供了多核苷酸，其編碼表1中列出的CD137結合抗體的重鏈或輕鏈的至少一個CDR區和通常所有三個CDR區。一些其他的多核苷酸編碼全部或實質上所有的可變區。表1中列出了結合CD137的抗體的重鏈和/或輕鏈的序列。由於密碼子的簡併性，多種核酸序列係編碼每個免疫球蛋白胺基酸序列。
聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼CD137結合抗體之現有序列(例如如下文實例中所述之序列)之PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，例如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯法；及美國專利第4,458,066號之固體載體法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如以下文獻中所述進行：例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明中還提供了用於產生上述CD137結合抗體的表現載體和宿主細胞。
術語「載體」意指聚核苷酸分子，其能夠傳輸其已連接之另一聚核苷酸。一種載體類型為「質體」，其係指其中可連接其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一種載體類型為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因組。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引與其可操作地連接的基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，重組DNA技術中所用之表現載體通常呈質體形式。在本發明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括發揮相等功能之該等其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)。
術語「可操作地連接」係指兩個或超過兩個聚核苷酸(例如DNA)片段之間的功能關係。典型地，術語係指轉錄調節序列相對於 所轉錄序列的功能關係。舉例而言，啟動子或增強子序列若其在適當宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接於轉錄序列之啟動子轉錄調節序列在實體上鄰接於所轉錄序列，亦即其為順式作用。然而，例如增強子之一些轉錄調節序列無需在實體上鄰接於或緊鄰於其增強轉錄之編碼序列。
不同表現載體可用於表現編碼CD137結合抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。基於病毒之表現載體與非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、游離型載體，其典型地具有用於表現蛋白質或RNA及人類人工染色體的表現卡匣(參見例如Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現CD137結合聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之許多其他載體。適用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP埃-巴二氏病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒載體及勝利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)之載體。參見Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視欲表現載體之預定宿主細胞而定。典型地，表現載體含有啟動子及可操作地連接於編碼CD137結合抗體之 聚核苷酸的其他調節序列(例如增強子)。在一實施例中，誘導性啟動子用於防止所插入之序列表現，在誘導條件下除外。誘導性啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉形之生物體培養物可在使群體不偏向表現產物被宿主細胞良好耐受的非誘導條件下擴增。除啟動子之外，其他調節元件亦可為CD137結合抗體之有效表現所必需或需要的。此等元件典型地包括ATG起始密碼子及相鄰的核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包括適於所用細胞系統之增強子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40增強子或CMV增強子可用於增強哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信息序列位置以與由所插入之CD137結合抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更通常，所插入之CD137結合抗體序列在包含於載體中之前連接至與信息序列。待用於接收編碼CD137結合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其一部分。此類載體允許可變區以與恆定區形成之融合蛋白形式表現，從而產生完整抗體或其抗原結合片段。典型地，此類恆定區為人類恆定區。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指重組表現載體已引入其中之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而出現在後代中，所以此類後代可能實際上不與親本細胞一致，然而仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」範疇內。
含有及表現CD137結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明聚核苷酸之原核宿主。適用之其他微生物宿主包括桿菌(例如枯草桿菌(Bacillus subtilis))，及其他腸內菌科(例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))，及多種假單胞菌種。在此等原核宿主中，亦可產生表現載體，其典型地含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。另外，將存在任何數目之多種熟知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子典型地控制表現(視情況與操縱序列一起控制表現)，且具有用於起始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。例如酵母之其他微生物亦可用於表現本發明之CD137結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表現及產生本發明之CD137結合多肽。舉例而言，其可為表現內源免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株或含有外源表現載體之哺乳動物細胞株。此等細胞包括任何正常死亡或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已開發出能夠分泌完整免疫球蛋白之多種適合宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cells)、骨髓瘤細胞株、經轉形之B細胞及融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物用於表現多肽之用途一般性論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，例如複製起點、啟動子及增強子(參見例如Queen等人， Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及必需的處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA拼接位點、聚腺苷酸化位點，及轉錄終止子序列)。此等表現載體通常含有源於哺乳動物基因或源於哺乳動物病毒之啟動子。適合啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素(tetracycline)誘導性CMV啟動子(例如人類即刻早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.4th edition,Cold Spring Harbor 2012)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導轉形、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒(virosome)、免疫脂質體、聚陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強性吸收，及離體轉導。就長期高產率生產重組蛋白質而言，通常需要穩定的表現。舉例而言，穩定表現CD137結合抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體製備，本發明之表現載體含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記基因。在引入載體之後，可允許細胞在豐富培養基中生長1-2天，隨後將豐富培養基與選擇性培養基交換。 可選標記之目的為賦予選擇耐藥性，且其存在允許成功表現所引入序列的細胞在選擇性培養基中生長。經穩定轉染之耐藥性細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。因此，本發明提供了一種製備本發明之抗體的方法，其中所述方法包括：培養宿主細胞之步驟，其中此步驟中的此宿主細胞係包含編碼本發明抗體的核酸或載體之宿主細胞，故本發明之所述抗體或其片段係可表現出。
在另一方面，本發明涉及醫藥組合物，其包含本發明之抗體和醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑增強或穩定組合物，或可用於促進組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。
本發明之醫藥組合物可藉由本領域中已知之多種方法投藥。投藥途徑及/或模式根據所要結果來變化。投藥可為靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投藥，或鄰近靶點投與。醫藥上可接受之載劑應適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或輸液)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體及多特異性分子)可用保護化合物不受酸作用及可使化合物不活化之其他天然條件影響的物質塗佈。
本發明之醫藥組合物可根據本領域中熟知且常規實施之方法製備。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。典型地，本發明之醫藥組合物中使用治療上有效劑量或靈驗劑量的CD137結合抗體。CD137結合抗體藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥上可接受之劑型。調整劑量方案以得到最佳所需響應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情形之緊急程度所指示而依比例減少或增加劑量。就投藥簡易性及劑量之均一性而言，非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上不連續單元；各單元含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療效果之預定量活性化合物。
可改變本發明醫藥組合物中活性成分的實際劑量水準，以便使得活性成分的量有效達成針對特定患者、組合物及投藥模式之所要治療反應，而不會對患者產生毒性。所選劑量水準視多種藥物動力學因素而定，其包括本發明所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、大體健康狀況及先前病史及其類似因素。
抗體通常多次投與。單次劑量之間隔時間可依週、月或年算。如藉由量測患者血液中之CD137結合抗體含量所指示，間隔時間亦可為不規則的。此外，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在此情況下，需要降低投藥的頻率。劑量及頻率視患者中抗體之半衰期 變化。一般而言，人源化抗體顯示的半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥劑量及頻率可視治療是否為預防或治療而變化。在預防性應用中，在長時間段內，在相對不頻繁之間隔時間投與相對低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要在相對較短之間隔時間投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者疾病症狀顯示部分或完全改善。其後，可向患者投與預防性療法。
在一方面中，本發明提供了一種藥物組合，其包含如本文所定義之本發明的抗CD137抗體，具有一或多種其他治療劑，例如一或多種抗癌劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、激素治療、疫苗和/或其他免疫療法。適當地，本發明的抗CD137抗體可與選自PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRbeta和IDO(引哚胺-2,3雙加氧酶)的抑制性(或免疫檢查點)分子的抑制劑組合使用。抑制分子的抑制可藉由在DNA、RNA或蛋白質水準上的抑制來進行。
令人驚奇地發現，當與PDL1抑制劑組合使用時，本發明的抗CD137抗體具有強益的協同相互作用(strong beneficial synergistic interaction)和改善的抗增殖活性(improved anti-proliferative activity)。因此，本發明提供了一種藥物組合，其包含如本文所定義之本發明的抗CD137抗體和PDL1抑制劑，特別是用於治療或預防增生性疾病。本發明進一步涉及藥物組合，其包含如本文 所定義之本發明的抗CD137抗體和PDL1抑制劑，特別是同時地、分別地或相繼地用於治療或預防增生性疾病。
本文所定義之術語「組合」或「藥物組合」係指以單位劑型的固定組合、非固定組合或用於組合投藥的套組，其中治療劑例如抗本發明的CD137抗體和PDL1抑制劑可一起地、或同時獨立地或分開地投藥於允許組合搭檔(combination partners)表現出協同作用(例如協同作用)的時間間隔內。
術語「固定組合」(fixed combination)係指一種治療劑，例如本發明的抗CD137抗體和PDL1抑制劑以單一實體或劑型之形式同時投藥於患者。
術語「非固定組合」係指一種治療劑，例如本發明的抗CD137抗體和PDL1抑制劑以單一實體或劑型之形式在無特定時間限制下一起地、同時地或連續地投藥於患者，其中這種投藥提供了有其需要的受試者(例如哺乳動物或人類)的身體中之兩種藥物的治療有效水準。
術語「PDL1」特別是指具有UniProt ID號Q9NZQ7的人類PDL1。
術語「阻斷劑」(blocker)或「抑制劑」(inhibitor)或「拮抗劑」(antagonist)係指抑制或降低其結合的標靶分子的生物學活性的試劑。在一些實施例中，抑制劑係實質上或完全地抑制標靶分子的生物學活性。適當的PDL1抑制劑係靶向、降低和/或抑制PDL1與其結合搭檔的結合能力，從而干擾PDL1功能。特別地，適當的PDL1抑制劑 阻斷PDL1與PD-1的相互作用。在一些實施例中，適當的PDL1抑制劑阻斷PDL1與PD-1和B7-1的相互作用。適當地，在本發明的藥物組合中所使用的PDL1抑制劑係為抗PDL1抗體。
如本文所使用之術語「協同效應」係指兩種治療劑諸如(例如)(a)本發明的抗CD137抗體和(b)PDL1抑制劑產生例如減慢增生性疾病、特定言之癌症或其症狀之症狀性進展的作用，該作用優於單獨投與之各藥物之作用之簡單相加。協同效應可例如使用例如Sigmoid-Emax方程式(Holford,N.H.G.及Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6：429-453(1981))、Loewe相加方程式(equation of Loewe additivity)(Loewe,S.及Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326(1926))及中效方程式(median-effect equation)(Chou,T.C.及Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22：2755(1984))之合適的方法來計算。上文所提及之各方程式可應用於實驗資料以產生幫助評估藥物組合之作用的對應圖表。與上文所提及之方程式相關之對應圖表分別為濃度-作用曲線、等效線圖曲線及組合指數曲線。協同作用可進一步藉由根據本領域技術人員已知的方法計算組合的協同作用得分來示出。
如本文所用，術語「組合投藥」(combined administration)係定義為涵蓋將選擇的治療劑給單一患者的投藥，且欲意包括其中不一定以相同投藥途徑或同時地投予治療劑的治療方案。
術語「組合製劑」在本文中在如下意義上定義為特別指「分裝部分之套組」：如上所定義之治療劑(a)及(b)可獨立地或藉由使 用不同固定組合以治療劑(a)及(b)之區別量進行投藥，亦即同時或在不同時間點進行投藥。分裝部分之套組的分裝部分可隨後例如同時或按時間交錯投藥，亦即對於分裝部分之套組的任何分裝部分在不同時間點且以相等或不同時間間隔投藥。欲在組合製劑中投與之治療劑(a)與治療劑(b)之總量的比率可變化，例如以滿足欲進行治療之患者子群的需要或單個患者之需要。
如本文所使用之術語「聯合治療活性」或「聯合治療作用」意謂治療劑可按其所偏好之時間間隔分別地(以時間錯開之方式，特別是序列特異性之方式)進行投藥，以使得待治療之個體(尤其人類)仍顯示(較佳協同)相互作用(聯合治療作用)。不管此情況是否可尤其藉由根據治療劑之血液含量確定，顯示兩種治療劑至少在某些時間間隔期間皆存在於待治療之人類之血液中。
本發明的藥物組合係包含本文所定義之本發明的抗CD137抗體，特別是用於治療或預防增生性疾病。在一較佳實施例中，本發明的藥物組合係包含本發明的抗體，其中所述抗體係包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：13具有至少為60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之VH序列，以及包含與SEQ ID NO：25具有至少為60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之VL序列。在 另一實施例中，本發明的藥物組合物係包含本發明的抗體，其中所述抗體係為IgG4，其包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：14具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之重鏈序列，以及包含與SEQ ID NO：26具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之輕鏈序列。在另一實施例中，本發明的藥物組合物係包含本發明的抗體，其中所述抗體係為IgG4，其包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，包含與SEQ ID NO：15具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之VH序列，以及包含與SEQ ID NO：27具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(較佳至少90%)一致性的胺基酸序列之VL序列。
在一方面中，本發明涉及用作藥物之本發明的抗體、或本發明的組合物、或本發明的組合。
在另一方面中，本發明涉及用以製備用於治療增生性疾病(特別是癌症)的藥物之本發明的抗體、或本發明的組合物、或本發明的組合。
在一方面中，本發明涉及用於治療增生性疾病(特別是癌症)之本發明的抗體、或本發明的組合物、或本發明的組合。
在另一方面中，本發明涉及用於在有其需要的受試者中治療增生性疾病(特別是癌症)之本發明的抗體、或本發明的組合物或、本發明的組合。
在一方面中，本發明提供了一種用於有其需要的受試者中治療增生性疾病(特別是癌症)的方法，該方法包括向該受試者投予治療有效量之本發明的抗體、或本發明的組合物、或本發明的組合。
術語「受試者」包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除另有說明外，術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「治療」(treatment；treating；treat；或treated)等係指獲得期望的藥理和/或生理作用。就部分或完全治癒疾病和/或歸因於該疾病或延遲疾病進展的不良影響而言，該作用係可為治療性的。如本文所用，「治療」係涵蓋於例如人類的哺乳動物中之對疾病的任何治療，並且包括：(a)抑制疾病，即阻止其發展；(b)減輕疾病，即造成疾病消退。
術語「治療有效量」或「有效量」係指當投藥於哺乳動物或其他受試者以治療疾病時足以實現對於疾病之有效的這種治療之藥劑量。「治療有效量」係根據待治療的受試者之藥劑、疾病及其嚴重程度和年齡、體重等而變化。
在一實施例中，增生性疾病係為癌症。術語「癌症」係指一疾病，其特徵在於異常細胞的快速且不受控制的生長。癌細胞可局部地擴散，也可藉由血液和淋巴系統擴散到身體的其他部位。術語「腫瘤」和「癌症」在本文中可互換使用，舉例而言，兩個術語均涵蓋固體和液體，例如擴散或循環的腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」係包括惡變前以及惡性癌症和腫瘤。本文所使用之術語「癌症」係指廣泛範圍的腫瘤，包括所有實體的和血液惡性的腫瘤。此類腫瘤的實例包括(但不限於)：良性腫瘤(或特別是惡性腫瘤)、實體瘤、腦癌、腎癌、肝癌、腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌(例如胃腫瘤)、食道癌、卵巢癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、陰道癌、甲狀腺癌、黑素瘤(例如無法切除或轉移性黑色素瘤)、腎細胞癌、肉瘤、膠質母細胞瘤、多發性骨髓瘤或胃腸道癌(特別是結腸癌或結腸直腸腺瘤)、頸部和頭部之腫瘤、子宮內膜癌、考登氏症候群(Cowden syndrome)、萊爾米特-杜伯斯病(Lhermitte-Duclos disease)、班-佐症候群(Bannayan-Zonana syndrome)、前列腺癌增生(prostate hyperplasia)、贅生物、特別是具有上皮特徵的贅生物、較佳地為乳癌或鱗狀細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病(例如費城染色體-陽性慢性骨髓性白血病(Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia))、急性淋巴細胞白血病(例如費城染色體-陽性急性淋巴細胞白血病(Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia))、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、漿細胞骨髓 瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、白血病及其任意組合。在一較佳實施例中，所述癌症係為肺癌，較佳地為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。在另一實施例中，所述癌症係為結腸直腸癌。
本發明的抗體、或本發明的多特異性分子、或本發明的組合物、或本發明的組合係抑制實體瘤的生長，但也抑制液體腫瘤的生長。在另一實施例中，增生性疾病係為實體瘤。術語「實體瘤」特別是指乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、胃癌(特別是胃癌)、子宮頸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌和小細胞肺癌)和頭頸部腫瘤。此外，視腫瘤類型及所使用之特定組合而定，可獲得降低的腫瘤體積。本發明的抗體、或本發明的多特異性分子、或本發明的組合物、或本發明的組合也適於患有癌症的受試者之預防腫瘤的轉移擴散和微轉移的生長或發展。
術語「預防」係指完全抑制疾病的發展、或完全抑制疾病的任何副作用。如本文所用，術語「預防」係包括預防疾病、或預防可能較容易患有此疾病但尚未被診斷為患有此疾病的個體中發生之情形。
在另一方面中，本發明涉及包含本文所述之本發明的抗體的套組。包含本發明的多特異性分子的套組亦在本揭露內容之內。包含本發明的藥物組合物的套組亦在本揭露內容之內。套組可包括一或多個其他元件，包括：使用說明書；其他試劑，例如標記、治療劑或可用於螯合或以其他方式耦合之試劑、結合至標記或治療劑之抗體 或放射性保護組合物；用於製備投藥用的抗體分子之裝置或其他材料；醫藥上可接受的載體；以及用於向受試者投藥之裝置或其他材料。在一具體實施例中，套組包含藥學有效量之本發明的抗體。在另一實施例中，套組包含藥學有效量之冷凍乾燥形式的本發明的抗體以及包含稀釋劑，以及任選地包含使用說明書。所述套組還可包括用於復原(reconstitution)的過濾針和用於注射的針。
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在本申請的全文中，如果說明書的內容(例如表1至表3)與序列表之間存在差異，則以說明書的內容為準。
應理解，為清楚起見而於分開的實施例的內文中所述之本發明的某些特徵也可提供於單一個實施例中的組合。相反地，為了簡潔起見，在單一個實施例的內文中所述之本發明的各種特徵也可分別地或以任何適當子組合地提供。與本發明有關的實施例之所有組合係被本發明特別地涵蓋並揭露於在本文中，如同每個和各個組合係個別地且明確地揭露一般。此外，各個實施例及其元件之所有子組合也被本發明明確地涵蓋並揭露於本文中，如同每個和各個這樣的子組合係個別地且明確地揭露於本文中一般。
本發明的範圍係不受本文所述之具體實施例的限制。實際上，根據前文所述，除了本文所述的此些之外，本發明的各種修改若對於本領域技術人員而言係為顯而易見的。這樣的修改則意味著落入所附申請專利範圍的範圍之內。
在各自的專利法允許的範圍之內，本文所引用之所有專利、申請案、刊物、測試方法、文獻、以及其他資料係藉由引用而併入本文中。
下列實施例舉例說明了上述發明，但並不意味著以任何方式限制本發明的範圍。相關領域技術人員已知的其他測試模型也可確定所請求的發明的有益效果。
實例
針對人類CD137之新穎抗體
實例1：針對人類CD137之兔抗體的產生。
用經純化之重組性人類CD137細胞外結構域(Peprotech,cat.310-15-1MG)對兔進行免疫接種。在免疫接種期間，藉由測定仍可偵測到產生多株血清抗體與抗原之結合的各兔血清之最大稀釋度(效價)來定性評定針對抗原之體液免疫反應的強度。使用酵素免疫吸附測定(ELISA)來評定針對固定化抗原(重組性人類CD137 ECD)的血清抗體效價。
實例2：命中鑑別(hit identification)及分選(selection)。
在命中鑑別(hit identification)程序之中，開發了一種基於流動式細胞測量儀的分選程序，此程序係專門偵測並允許與B細胞結合之高親和力的人類CD137 ECD之分離。為了鑑別與B細胞結合之CD137，使用螢光染料R-藻紅蛋白(RPE)來標記CD137 ECD。由於標記的CD137上之CD137L結合位點和抗CD137抗體的結合位點可能會被龐大的RPE標記所阻斷，因此藉由流動式細胞測量儀來確定抗原決定基之可及性。與人類IgG1、烏瑞魯單抗(urelumab)、兔多株抗人類CD137、或山羊多株抗人類CD137的Fc部分融合之CD137L ECD係被捕捉於蛋白G珠上，並藉由流動式細胞測量儀來確認R-PE標記的 CD137之結合。螢光強度係正比於固定至珠子上之與CD137L結合之標記CD137的數量。在未偵測到RPE標記的CD137與英利昔單抗(infliximab)的結合之情況下，發現CD137係結合至CD137L和抗CD137抗體。
篩選(screening)：在分選活動(sorting campaign)中分離出表現CD137特異性抗體(IgG)的B細胞。在篩選階段(screening phase)所獲得的結果係基於對於來自抗體分泌細胞(ASC)的培養上清液之非純化抗體所進行的測定。每個細胞培養上清液中的兔單株抗體係特徵在於對於結合至重組性人類CD137 ECD的高通量ELISA。CD137結合上清液係進一步特徵在於與人類和食蟹猴CD137的結合動力學。此外，與CD137L和烏瑞魯單抗(urelumab)之CD137的相互作用的中和潛力係藉由競爭型ELISA來確定。亦評定表現於穩定轉換的Jurkat細胞上之與膜CD137的結合。藉由直接型ELISA分析上清液的小鼠CD137結合潛力。
直接型ELISA
ELISA盤係藉由添加50μl含有250ng/ml人類CD137(Peprotech，目錄號310-15-1MG)的PBS在4℃下過夜而進行塗佈。第二天，盤係以溢流模式使用每孔300μl洗滌緩衝液(PBS，0.005%Tween 20)來洗滌3次，並於每孔中添加270μl阻斷緩衝液(PBS，1%BSA，0.2%Tween 20)於室溫、無振盪下經歷1小時。之後，盤係以溢流模式使用300μl洗滌緩衝液來洗滌3次並添加50μl每種上清液，盤係於室溫、溫和攪拌下培育1.5小時。在以溢流模式使用300μl洗滌緩 衝液下洗滌3次之後，添加50μl的阻斷緩衝液中1：5’000稀釋的HRP耦合山羊抗兔IgG抗體於每個孔中。在室溫下於章動混合器(nutating mixer)上培育1小時後，在添加50μl TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)之前，盤係每個孔中以溢流模式使用300μl洗滌緩衝液洗滌3次。顯影5至10分鐘後，藉由添加50μl 1M HCl於每個孔中來終止酶促反應，以及盤係讀數為450nm(使用690nm作為參考波長)。
藉由SPR之對hCD137的親和力
藉由使用MASS-1 SPR儀器(Sierra Sensors)的SPR量測抗體對人類CD137之結合親和力。關於親和力篩選，使用標準胺耦聯程序將對兔IgG之Fc區(Bethyl Laboratories，目錄號A120-111A)具有特異性的抗體固定於感測器晶片(MASS-1親和力感測器，高容量胺，Sierra Sensors)上。藉由固定的抗兔IgG抗體捕捉B細胞上清液中之兔單株抗體。B細胞上清液中的IgG最低濃度係足以被捕捉。在捕捉單株抗體之後，將人類CD137 ECD(Peprotech，目錄號310-15-1MG)以90nM之濃度注入至流槽中歷經3分鐘，且使感測器晶片上由IgG捕捉到的蛋白質解離5分鐘。在各注射循環之後，藉由10mM甘胺酸鹽酸鹽之兩個注射使表面再生。採用MASS-1分析軟體(分析器，Sierra Sensors)，使用一對一朗謬結合模型(one-to-one Langmuir binding model)，計算表觀解離(kd)及締合(ka)速率常數以及表觀解離平衡常數(KD)，且基於相對Chi2(Chi2針對外推得到的最大分析物結合量標準化)監控擬合品質，相對Chi2係曲線擬合品質之量度。Chi2的值越小，擬合至一對一朗謬結合模型(one-to-one Langmuir binding model)則越準確。就大多數 命中而言，相對Chi2值係低於15%。若配體結合之反應單位(RU)係為抗體捕捉之RU的至少2%，則認為結果係為有效的。配體結合之RU小於抗體捕捉之RU之2%的樣本視為不顯示CD137與所捕捉抗體之特異性結合。
CD137/CD137L競爭型ELISA
ELISA盤係藉由添加50μl含有250ng/ml CD137 Fc嵌合體(R&D Systems，目錄號838-4B-100)的PBS在4℃下過夜而進行塗佈。第二天，盤係以溢流模式使用每孔450μl洗滌緩衝液(PBS，0.005%Tween 20)來洗滌3次，並於每孔中添加300μl阻斷緩衝液(PBS，1%BSA和0.2%Tween 20)於室溫、章動混合器(nutating mixer)下經歷1小時。之後，將陽性對照(中和山羊抗CD137抗體)稀釋於100%陰性上清液中，並將50μl中和抗體添加至結合盤的對應孔中。此外，將50μl陽性命中的上清液轉移至結合盤，並在室溫下振盪培育1小時。接下來，將ELISA盤以溢流模式使用每孔450μl洗滌緩衝液洗滌3次，然後將50μl的阻斷緩衝液中稀釋的20ng/ml生物素化的重組性人類CD137配體(Acro Biosystem，目錄號41L-H5257)稀釋於孔中。在室溫下振盪培育1小時之後，ELISA盤係以溢流模式使用每孔450μl洗滌緩衝液來洗滌3次。之後，將50μl的阻斷緩衝液中稀釋的10ng/ml鏈黴親和素-聚-HRP(streptavidin-poly-HRP)添加於ELISA盤的每個孔中。在室溫下培育1小時之後，盤係使用450μl洗滌緩衝液來洗滌3次，並在添加50μl TMB之後顯影5至10分鐘。最後，藉由添加50μl的1M HCl來終止酶促反應，以及盤係讀數為450nm(使用690nm作為參考波長)。
藉由SPR之物種特異性：cyno
還使用針對結合至人類CD137所述之相同的SPR設置，但將人類CD137 ECD替換成食蟹猴CD137 ECD(Acro Biosystem，目錄號41B-C52H4)，針對初篩ELISA中鑑別的命中來確認關於食蟹猴CD137的結合動力學。
烏瑞魯單抗競爭型ELISA(urelumab competition ELISA)
ELISA盤係藉由添加50μl含有2μg/ml烏瑞魯單抗(由Evitria,Schlieren,Switzerland製備)的PBS在4℃下過夜而進行塗佈。第二天，盤係以溢流模式使用每孔450μl洗滌緩衝液(PBS，0.005%Tween 20)洗滌3次，之後將300μl阻斷緩衝液(具有1%BSA和0.2 Tween 20的PBS)添加於每個孔中於室溫、章動混合器(nutating mixer)上經歷1小時。隨後，將烏瑞魯單抗稀釋於所添加的95%陰性上清液中，並與7.5ng/ml的5%生物素化CD137 ECD(Peprotech，目錄號310-15-1MG)一起預培育1小時，並添加於結合盤中之對應的孔。此外，亦添加55μl陽性樣本的上清液，並與7.5ng/ml的5%生物素化CD137 ECD一起預培育1小時，並之後轉移至結合板，並於室溫、振動下培育1小時。接下來，ELISA盤係以溢流模式使用每孔450μl洗滌緩衝液洗滌3次。然後，將50μl的阻斷緩衝液稀釋的10ng/ml鏈黴親和素-聚-HRP(streptavidin-poly-HRP)添加於ELISA盤的每個孔中。在室溫下培育1小時之後，盤係使用450μl洗滌緩衝液來洗滌3次，並在添加50μl TMB之後顯影5至10分鐘。最後，藉由添加50μl的1M HCl來終止酶促反應，以及盤係讀數為450nm(使用690nm作為參考波長)。
藉由FC之基於細胞的結合試驗：人類CD137
捕捉Jurkat野生型(不表現CD137的對照細胞)和Jurkat CD137細胞(選殖C6,1)，並確定細胞數。將細胞懸液以400xg離心5分鐘，然後將40μl的在PBS-EB中稀釋的細胞懸液(40,000個細胞)(1x DPBS，2%BCS H.I.，2mM EDTA)添加於非結合盤中的指定孔中。根據盤佈局，將來自陽性命中的上清液直接轉移到96孔盤中。將陽性對照樣本(烏瑞魯單抗，urelumab)在PBS-EB中稀釋，然後轉移到盤中，最終樣本為95%陰性上清液。在4℃下培育1小時後，將盤用100μl的PBS-EB洗滌3次。然後，將細胞沉澱係以2μg/ml濃度使用50μl二次抗體溶液而重新懸浮(對於B細胞選殖：AF647標記的山羊抗兔IgG；對於烏瑞魯單抗(urelumab)：PE標記的山羊抗人類IgG)，並在4℃下培育1小時。接下來，使用100μl的PBS-EB再次洗滌細胞3次。細胞沉澱係隨後重新懸浮於50μl PBS-EB中，並藉由NovoCyte 2060流式細胞儀進行分析。記錄每個樣本之20,000個事件之PE和AF647的螢光強度，並計算螢光強度MFI的幾何平均值。數據係首先針對非特異性抗體結合(空白和Jurkat野生型細胞結合)來校正，並隨後將其標準化為針對烏瑞魯單抗(urelumab)的結合水準。
直接型ELISA小鼠CD137
作為鑑別小鼠交叉反應性CD137結合物的第一步，進行了針對小鼠CD137的直接型ELISA。為了此目的，藉由ELISA篩選B細 胞選殖的細胞培養上清液中是否存在針對小鼠CD137的抗體。ELISA盤係藉由添加50μl含有250ng/ml小鼠CD137(Acro Biosystem，目錄號41B-M52H7)的PBS在4℃下過夜而進行塗佈。第二天，盤係以溢流模式使用每孔300μl洗滌緩衝液(PBS，0.005%Tween 20)洗滌3次，並添加270μl阻斷緩衝液(PBS，1%BSA，0.2%Tween 20)於每個孔中於室溫下振盪1小時。然後，盤係以溢流模式使用300μl洗滌緩衝液洗滌3次，添加50μl每種的上清液，以及盤係於室溫溫和攪拌下培育1.5小時。在以溢流模式使用300μl洗滌緩衝液洗滌3次之後，將50μl在阻斷緩衝液中1：5,000稀釋的HRP耦聯的山羊抗兔IgG抗體添加於每個孔中。在室溫下於章合混合器(nutating mixer)上培育1小時之後，在加入50μl TMB之前，盤係以溢流模式使用每孔300μl洗滌緩衝液洗滌3次。顯影5至10分鐘之後，藉由每孔添加50μl的1M HCl來終止酶促反應，以及盤係讀數為450nm(使用690nm作為參考波長)。
在此試驗中，來自85個B細胞克隆的上清液係產生明顯地高於背景信息(>0.1OD)的信息。
藉由SPR之物種特異性：小鼠
還使用針對結合至人類CD137所述之相同的SPR設置，但將人類CD137 ECD替換成小鼠CD137 ECD(Acro Biosystem，目錄號41B-M52H7)，來確定關於小鼠CD137的結合動力學。
篩選命中的分選(Selection of Screening Hits)
基於B細胞上清液中單株抗體的藥理特性，選擇克隆38-27-A11來用於命中確認分析。表4示出了選殖38-27-A11單株抗體在B細胞上清液中的藥理特性。在下一步中，將所選選殖(clone)用於 RNA分離和RT-PCR以擴增兔抗體輕和重鏈可變區(38-27-A11)的序列。
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實例4：單株抗體38-27-A11的藥理學特徵
4.1 人類和食蟹猴CD137的親和力
藉由SPR測量(表5和表6)來確定純化的單株兔抗體38-27-A11之與人類和食蟹猴CD137的結合動力學。使用Biacore T200 SPR儀器(GE Healthcare)，藉由SPR來測量抗體對人類CD137的結合親和力。關於實驗設置，使用標準胺偶合方法(standard amine-coupling procedure)將對兔IgG(Bethyl Laboratories，目錄號A120-111A)的Fc區特異的抗體固定至感測器晶片(CM5晶片，GE Healthcare)上。固定的抗-兔IgG抗體係捕捉兔單株抗體。捕捉單株抗體之後，將人類CD137(PeproTech，目錄號310-15)或食蟹猴CD137(Acro Biosystem，目錄號41B-C52H4)以90nM至0.35nM之濃度注入流槽中歷經3分鐘，並使在感測器晶片上由IgG捕捉到的蛋白質解離12分鐘。採用Biacore T200軟體評估工具(GE Healthcare)，使用一對一朗謬結合模型(one-to-one Langmuir binding model)，計算表觀解離(kd)及締合(ka)速率常數以及表觀解離平衡常數(KD)。
4.2重組兔IgG 38-27-A11的抗原決定基分倉(epitope binning)
為了表現出重組兔IgG 38-27-A11的結合抗原決定基，使用MASS-1儀器(Sierra Sensors)藉由SPR來進行抗原決定基分倉(epitope binning)。藉由使用這種方法，兔IgG 38-27-A11在CD137上的結合抗原決定基係定位於針對烏瑞魯單抗和烏托米單抗的區域(By using this approach,the binding epitopes of the rabbit IgG 38-27-A11 on CD137 were mapped against urelumab and utomilumab.)。夾心裝置(sandwich setup)係用於檢驗抗體是否阻斷另一者與人類CD137的結合。兔IgG 38-27-A11加上競爭IgG係固定在高容量胺感測器晶片(HCA，Sierra Sensors)上。然後，90nM抗原CD137(PeproTech，目 錄號310-15)係被注入並被捕捉於兔IgG 38-27-A11上，隨後立即注射22.5nM第二抗體(競爭IgG)。確定每個兔IgG上人類CD137的捕捉水準和第二種結合物反應水準(反應單位，RU)。藉由計算理論最大反應(Rmax)(此最大反應取決於所涉及蛋白質的分子量和捕捉水準)，從而確定了蛋白質在捕捉抗原上的相對結合水準(%)。如果分子結合至CD137上相同抗原決定基或重疊的(例如結構相似或空間上接近的)抗原決定基，則不應觀察到注射至捕捉的CD137上之抗體的結合。因此，當觀察到抗體的結合時，兩抗體對(antibody pairs)係結合至非重疊的抗原決定基。確定每個抗體對的相對結合水準(%)。根據定義，低於10%的結合水準係表示在CD137上相同或重疊(例如結構相似或空間上接近)，而高於30%的結合水準則代表非重疊的抗原決定基。IgG 38-27-A11係不與烏托米單抗(utomilumab)競爭來結合至CD137(代表不重疊的抗原決定基)，而與烏瑞魯單抗(urelumab)競爭來結合至CD137(代表相同或重疊的抗原決定基)(第1圖)。
4.3藉由NF-kB報告子基因分析(NF-kB reporter gene assay)來活化CD137信息傳導
在NF-kB報告子基因分析(NF-kB reporter gene assay)中評估了活化CD137簇和隨後CD137信息傳導之潛力。在此分析中，評估了NF-kB Jurkat報告子細胞中CD137信息傳導的活化。藉由測量螢光素酶表現來報告CD137信息傳導的活性，其中此螢光素酶表現係由Jurkat報告子細胞系中的CD137誘導NF-kB活化所驅動的。此外，藉 由二價抗CD137兔IgG的結合，係促進了信息傳導途徑所必需的CD137的聚集。
更詳細而言，50,000個表現CD137的NF-kB報告子基因Jurkat細胞(Promega)的細胞係接種於96孔白細胞培養盤中。在分析緩衝液中製備了9,000ng/ml至1.37ng/ml的範圍之三倍兔IgG的序列稀釋液。對於每個稀釋，添加過量2.5倍的交聯抗體(山羊抗兔IgG Fc特異性抗體，Bethyl，目錄號A120-111A)。在沒有交聯劑的情況下亦測量了每個兔IgG的最高濃度，以確定是否沒有足以誘導CD137信息傳導之進一步聚集的抗體結合。每個盤上係包括烏瑞魯單抗(urelumab)(作為陽性對照)，以及藉由在每個稀釋中添加1.25過量的交聯劑(兔抗人類IgG Fc特異性抗體，Bethyl，目錄號A80-304A)來實現烏瑞魯單抗(urelumab)的交聯。亦於不添加交聯劑之情況下，測量了烏瑞魯單抗(urelumab)的最高濃度，如同對兔IgG所操作一般。重組IgG和烏瑞魯單抗(urelumab)之製備的序列稀釋液係添加於報告子基因細胞中，並在37℃的潮濕細胞培養箱中培育6小時。藉由添加螢光素酶試劑來檢測螢光素酶表現，並在添加抗CD137 IgG 6小時後藉由發光讀數器來讀取螢光素酶表現。藉由測試樣本的相對發光單位(RLU)標準化至以最高濃度由交聯劑所測定的烏瑞魯單抗(urelumab)的相對發光單位，從而分析數據。標準化的數據係繪示成兔IgG濃度的函數，並藉由使用S形四參數(sigmoidal 4-parameter)擬合來進行擬合標準化的數據。NF-kB信息的最大活化(相對於烏瑞魯單抗(urelumab))、EC50值和相對EC50值(相對於烏瑞魯單抗(urelumab))係被報告(表7)。
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實例5：兔IgG 38-27-A11的人源化
基於在命中篩選(hit screening)期間所獲得的數據，藉由將CDR移植到基於VH3的框架上來使CD137結合物38-27-A11人源化(表8)。按照AHo人源化方案，完全移植係指CDR移植加上框架殘基(CDR移植加上可能接觸抗原的所有兔殘基的移植(根據AHo)係僅限於界面形成後溶劑可及性變化>20%的殘基，以減少突變總數(兔框架殘基))。
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設計密碼子最佳化的核苷酸序列，並合成對應的基因，並將對應的基因選殖於哺乳動物表現載體中。表9總結了scFv分子的製造。使用CHOgro瞬時轉染套組(Mirus)在CHO-S細胞中來表現哺乳動物構建體。培養物係於37℃下表現5-7天(細胞活力<70%)之後藉由離心來穫得，以及蛋白質係藉由蛋白L親和層析法(Protein L affinity chromatography)從澄清的培養上清液中純化，如果需要，係透過藉由尺寸排阻層析法(size-exclusion chromatography)的拋光步驟(polishing step)。為了控制製造材料的品質，使用了標準分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
實例6：人源化scFv的藥效學特性
6.1 對於人類CD137的親和力
人源化scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)對人類CD137的親和力係藉由在T200設備(Biacore，GE Healthcare)上進行SPR分析來確定。在此實驗中，使用來自GE Healthcare(目錄號BR-1008-39)的人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture kit)來捕捉Fc標記的人類CD137(R&D Systems，目錄號838-4B-100)。在每個分析物注射週期之後，抗人類Fc特異性IgG得到再生，並捕捉新的抗原。使用捕捉的CD137上的劑量反應多週期動力學試驗，以電泳緩衝液(running buffer)中稀釋的0.19nM至45nM(三倍稀釋步驟)的分析物濃度範圍，注入scFv以作為分析物 (analyte)。締合時間(association time)和解離時間(dissociation time)係分別設置為300秒和720秒。使用1：1結合模型來擬合獲得的感測圖。數據係示於表10中。
6.2 物種交叉反應(藉由SPR與食蟹猴CD137結合)
用食蟹猴Fc標記的CD137(R&D Systems，目錄號9324-4B-100)來測量與食蟹猴CD137的交叉反應性，其中係使用用於測量與人類CD137結合之相似試驗。表11係總結對於scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)所獲得之親和力。
6.3 藉由競爭型ELISA來中和CD137/CD137L相互作用
為了示出抗人類CD137 scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)不干擾CD137L與CD137的結合，係採用了競爭型ELISA。商業抑制性多株抗CD137山羊抗體(Antibodies online，目錄號ABIN636609)係用作為參考。關於實驗設置，將50ng/ml的人類CD137(具有Fc的標記，R&D Systems，目錄號838-4B-100)塗在ELISA盤上過夜，以及將從50μg/ml開始序列稀釋三倍的scFvs序列稀釋液添加於ELISA盤。之後，添加生物素化的CD137L(CD137L的內部生物素化(in-house biotinylation)，Acro Biosystem，目錄號41L-H5257)，並藉由添加鏈黴親和素-HRP(streptavidin-poly-HRP)來檢測結合的配體。最後，添加了HRP基板TMB。顯影5分鐘之後，用1M HCl溶液終止反應。吸光度係量測於450nm和690nm處，以作為參考波長。數據係示於表12。
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6.4 藉由流式細胞儀來結合至人類CD137表現細胞
確定了對PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)之人類CD137表現細胞的結合潛力。將50,000個表現CD137的Jurkat細胞(或作為缺乏CD137表現之參考細胞系Jurkat細胞)係分配至圓底非組織培養物處理的96孔盤。使用100μl PBS以400 x g離心5分鐘來洗滌細胞兩次。將細胞重新懸浮於100μl五倍步驟的序列稀釋液中，其中此五倍步驟的序列稀釋液係製備於測試的scFvs和對照IgG烏瑞魯單抗(urelumab)之染色緩衝液(PBS，2%BCS熱滅活，2mM EDTA)中，且細胞係從10,000ng/ml至0.64ng/ml(對於scFvs：從381.19nM至0.02nM)。在4℃下於章動混合器(nutating mixer)上培育1小時之後，使用100μl染色緩衝液以400 x g離心5分鐘來洗滌細胞3次。然後，經scFvs處理過的細胞係重新懸浮於100μl含0.5μg/ml APC標記的蛋白L的染色緩衝液中，以及經烏瑞魯單抗(urelumab)(人類IgG4)處理過的細胞係重新懸浮於100μl含APC標記的2μg/ml山羊抗人類IgG的染色緩衝液中。盤係在4℃下於章動混合器(nutating mixer)上培育1小時，隨後使用100μl染色緩衝液洗滌3次，並之後重新懸浮於最終體積為50μl的染色緩衝液中。最後，藉由使用Novocyte流式細胞儀系統(ACEA Bioscience)的流式細胞儀來分析每孔20,000個事件的APC信息。每個盤上的各個EC50值係相對於在每個盤上一起採集的參考分子烏瑞魯單抗(urelumab)的EC50來進行校準(相對EC50：EC50，烏瑞魯單抗/EC50，測試的scFv)。數據係總結於表13和第3圖中
6.5. 藉由SPR之CD137相對於CD40和OX40之選擇性
除了與食蟹猴CD137具有交叉反應性之外，係期望抗人類CD137 scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)對於人類CD137(且不對於TNFR超家族(例如CD40和OX40)的其他成員)具有結合的選擇性。因此，測試了PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)對於人類CD40和OX40之結合。藉由在T200設備(Biacore，GE Healthcare)上的SPR分析來確定scFv與人類Fc標記的CD40(AcroBiosystems，目錄號CD0-H5253)和人類Fc標記的OX40(Acro-Biosystems，目錄號OX0-H5255)之結合。在此實驗中，使用來自GE Healthcare(目錄號BR-1008-39)的人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture kit)來捕捉Fc標記的CD40和OX40。在每個分析物注射週期之後，抗人類Fc特異性IgG得以再生，並捕捉新的抗原。使用在電泳緩衝液(running buffer)中稀釋的高濃度180nM分析物，注入scFv以作為分析物。締合時間(association time)和解離時間(dissociation time)係分別設置為300秒和720秒。使用1：1結合模型來擬合獲得的感測圖。數據係總結於表14中。
Figure 108136280-A0305-02-0119-25
Figure 108136280-A0305-02-0120-26
Figure 108136280-A0305-02-0120-27
Figure 108136280-A0305-02-0121-28
實例7：人源化scFv的生物物理特性
scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)係經純化後使用離心濃縮管而濃縮至>10mg/mL(表15)。
對ScFvs進行穩定性研究，例如四週的穩定性研究，其中scFvs係配製成10mg/ml的水性緩衝液(50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液中加入150mM NaCl，pH 6.4)並於-80℃、4℃和40℃下儲存四週。最起碼地，在一週、兩週和每次研究結束之後，藉由SE-HPLC峰面積的積分來評估製劑中單體和低聚物的比例。表16比較了本研究第7天(d7)和第28天(d28)的終點測量值。此外，scFv分子的相容性係藉由凍-融(F/T)循環(膠體穩定性)來評估。為了進行F/T穩定性評估，採用與存儲穩定性研究相同的分析方法(SE-HPLC，UV-Vis)和參數(%單體含量和%單體損失)來監測五個F/T循環以上分子的品質。表17係示出在五個重複的F/T循環中以%計的單體含量之過程。重複的F/T循環之後，沒有一個分子的單體含量損失>2%。
藉由使用螢光染料SYPRO orange來評估分子的熱解折疊。相關賦形劑條件之下的樣本係被製備出，且試驗係於qPCR儀中進行了。使用軟體的自定義染色校準程序(software’s custom dye calibration routine)可檢測到螢光發光量。包含測試樣本的PCR盤係以1℃的增量來從25℃到96℃的升溫。展開轉變(unfolding transition，Tm)的中點係由GraphPad Prism軟體計算，採用數學二階導數法計算曲線拐點。報告的Tm係為三次測量的平均值。表18係示出在通用緩衝液(pH 6.4的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液，150mM NaCl)中所製備之分子的熔解溫度(melting temperatures)。
對PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)進行了短期pH應力穩定性研究(short-term pH stress stability study)，其中scFv分子係以1mg/ml之形式配製成pH值在3.5和7.5之間的一組水溶液(磷酸鹽-檸檬酸鹽)緩衝液系統。在各自的緩衝液系統中分別於4℃和40℃下儲存2週之後，分析單體含量百分比(%)和單體損失百分比(%)。表19係示出整個研究過程中單體含量、單體損失、濃度和濃度損失之列表總結。
Figure 108136280-A0305-02-0123-29
Figure 108136280-A0305-02-0124-30
Figure 108136280-A0305-02-0124-31
Figure 108136280-A0305-02-0125-32
Figure 108136280-A0305-02-0125-140
 *F/T時的單體損失百分比%
Figure 108136280-A0305-02-0125-34
Figure 108136280-A0305-02-0125-35
Figure 108136280-A0305-02-0126-36
Figure 108136280-A0305-02-0127-37
實例8：藉由溶液中CD137 ECD變體的複合體分析(complex formation analysis)之抗原決定基定位(epitope mapping)
在這項研究中，各種CD137 ECD變體係基於具有註釋的結構基序(annotated structural motifs)來設計，其中具有註釋的結構基序係為富含半胱胺酸的結構域(CRD)和靠近膜的柄(stalk)(UniProtKB，Q07011；第4A圖)：>sp|Q07011|CD137 ECD|aa 24-186細胞外結構域*[SEQ ID NO：45]
CRD1：胺基酸24至46(LQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICS)
CRD2：胺基酸47至86(PCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAEC)
CRD3：胺基酸87至118(DCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCK)
CRD4：胺基酸119至159(DC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP)
柄(stalk)：胺基酸160至186(SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQ)
* CD137的細胞外結構域(UniProt登錄號：Q07011)(涵蓋胺基酸24至186)係由4個富含半胱氨酸的結構域(CRD1至4)和靠近膜的柄(stalk) 所組成。具有底線的殘基係代表具有烏托米單抗(utomilumab)的抗原決定基位於其中之胺基酸序列(WO 2012/032433)。
基序組合(motif combinations)(第4B圖)係於N末端處附著至PreScission蛋白酶位點(3C位點)和人類鉸鏈-Fc結構域。膜近端基序CRD4和柄(stalk)係總是完全內建在一起(exclusively built in together)。結合試驗(第4圖，表20)中總共包含八個CD137 ECD變體和PRO1480。使用瞬時CHOgro表現系統(Mirus)在FreeStyle CHO-S細胞中來表現蛋白質。感興趣之基因係最佳化以利哺乳動物表現，並合成和選殖感興趣之基因到標準pcDNA3.1載體中。信息序列係源自於小鼠重鏈IgG。表現培養物係於在37℃下分批地培育6天至7天(細胞活力<70%)，或於37℃下分批地培育一天，隨後溫度係偏移至32℃經歷5天至6天。培養物上清液係藉由離心來分離，然後以0.45μm過濾。藉由針對於PRO1480的蛋白L親和層析法(Protein L affinity chromatography)或對於CD137 ECD變體的蛋白A親和層析法(Protein A affinity chromatography)，然後藉由拋光尺寸排阻層析法(polishing size-exclusion chromatography)從澄清的培養上清液中捕捉感興趣之蛋白質。在結合實驗中，PRO1480係相對於每個CD137 ECD變體具有等莫爾比和至少500倍KD以上濃度之方式來培育。藉由結合物相對於各個蛋白質的SE-HPLC的保留時間偏移分析來進行結合評價(是或否)。結果係總結於表21中。
Figure 108136280-A0305-02-0128-38
Figure 108136280-A0305-02-0129-39
Figure 108136280-A0305-02-0130-40
Figure 108136280-A0305-02-0131-41
Figure 108136280-A0305-02-0131-42
Figure 108136280-A0305-02-0132-43
包含本發明抗體的多特異性分子
包含本發明的抗體的示例性多特異性分子係包括於表3中。PRO1480和PRO1481係分別衍生自38-27-A11 sc02和38-27-A11 sc03。
實例9：對PDL1、CD137、HSA和MSA的親和力。
藉由使用Biacore T200設備(GE Healthcare)的SPR測量來確定對PDL1的親和力。在此實驗中，使用來自GE Healthcare(目錄號BR-1008-39)的人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture kit)來捕捉不同物種之Fc標記的PDL1。在每個分析物注射週期之後，抗人類Fc特異性IgG得到再生，並捕捉新的抗原。對於所有形式而言，使用劑量反應多週期動力學試驗，以電泳緩衝液(running buffer)中稀釋的0.18nM至45nM(兩倍稀釋步驟)的分析物濃度範圍，注入多特異性分子以作為分析物(analyte)。締合時間(association time)和解離時間(dissociation time)係分別設置為300秒和720秒。使用一對一朗謬結合 模型(one-to-one Langmuir binding model)，計算表觀解離(kd)及締合(ka)速率常數以及表觀解離平衡常數(KD)。使用與PDL1相同的設置來確認不同物種對CD137的親和力，不同的是固定抗體係捕捉不同物種的CD137-Fc嵌合蛋白。
對人類IgG的Fc區特異之抗體係直接捕捉含有Fc的形式。從90nM至0.35nM之間的PDL1細胞外結構域或CD137細胞外結構域之兩倍系列稀釋液係用於測試生物感測器晶片上所捕捉的IgG之結合。每個注射循環之後，一次注入3M MgCl2溶液，表面即可再生。
藉由使用Biacore T200設備(GE Healthcare)的SPR測量來確定分子與不同物種的血清白蛋白(SA)的親和力。使用胺偶聯化學，使SA直接地偶聯至CM5感測器晶片(GE Healthcare)。在進行再生搜尋和表面性能測試以找出最佳測定條件之後，測量了劑量反應，以及所獲得之結合曲線係進行了雙參考(空參考通道和零分析物注射)並且使用1：1朗謬模型(Langmuir model)進行擬合，以獲取動力學參數。此試驗係進行於pH值為5.5的1 X PBS-Tween緩衝液中。
數據係總結於表22中。源自選殖38-27-A11的CD137特異性人源化構建體之結合動力學測量係顯示出幾乎相同的親和力(在表22中比較選殖38-27-A11、PRO1480和STR移植物之CDR移植物(compare CDR graft of clone 38-27-A11,PRO1480,and STR graft PRO1481))。
實例10：藉由使用表現CD137的轉基因NF-kB Jurkat報告子細胞系之基於細胞的試驗，評估抗PDL1xCD137分子的CD137促進作用。
在此試驗中，評估了Jurkat細胞中CD137信息傳導的活化。藉由測量螢光素酶表現來報告CD137信息轉導的活性，其中此螢光素酶表現係由Jurkat報告子細胞系中的CD137誘導的NF-kB活化所驅動的。螢光素酶之表現係直接相關於CD137之活性。此外，藉由隨後在Jurkat細胞和表現PDL1的細胞系之間形成免疫突觸，促進了信息傳導途徑的活化所需之CD137的聚集。因此，在報告子細胞系上CD137的聚集和活化係需要PDL1表現。
使用10ng/ml IFNγ刺激24小時以增加PDL1表現的HCC827細胞，係以每孔25,000個細胞接種於96孔培養盤上。然後，製備抗-PDL1xCD137分子和競爭物烏瑞魯單抗(competitor urelumab)的序列稀釋液，並將其添加至細胞中。接下來，Jurkat報告子細胞係製備於含有或不含有25mg/ml HSA的試驗培養基中，並以每孔40,000個細胞的細胞密度來添加。藉由添加螢光素酶試劑來檢測螢光素酶的表現，並在添加Jurkat細胞後6或24小時之後使用發光讀數器來讀取螢光素酶表現。藉由測試樣本的相對發光單位(RLU)標準化至針對PRO885所測量的相對發光單位(RLU)，從而分析數據(第5圖)，產生CD137信息傳導的相對活化值。如第5圖和表23所示，源自選殖38-27-A11的scDb-scFvs PRO1480和PRO1481能夠刺激CD137信息傳導。
Figure 108136280-A0305-02-0135-45
 NA：不適用TBD：待確認NB：沒有顯著結合ND：不確認
Figure 108136280-A0305-02-0136-46
 NA：不適用ND：不確認&：IC50,PRO1186(ng/ml)/IC50，測試分子(ng/ml)
實例11：在使用超抗原SEA刺激的人類PBMC之基於細胞的試驗中，評估伴隨的PDL1阻斷和CD137刺激之刺激作用。
在此實驗中，評估PD-1/PDL1抑制和CD137促進的協同作用。此試驗使用外周血單核細胞(PBMC)，其中外周血單核細胞(PBMC)係由超抗原葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)所刺激，以分別在抗原呈遞細胞(APC)和T細胞上誘導PDL1的表現以及在T細胞上誘導CD137的表現。藉由應用抗PDL1xCD137分子，可同時靶向兩個T細胞調節信息傳導途徑：抑制PD-1/PDL1途徑 之抑制作用以及藉由三特異性抗PDL1xCD137xHSA分子(PRO1480)所介導的免疫突觸的形成之CD137途徑的活化作用。T細胞的活化係藉由白介素2(IL-2)的分泌來進行評估，並相較於參考分子阿維魯單抗(avelumab)和烏瑞魯單抗(urelumab)的混合物所介導之PDL1抑制介導的作用來進行比較。
外周血單核細胞(PBMC)係藉由密度梯度離心而從新鮮的人類全血中分離出。然後，使用抗CD56抗體和MACS細胞分離套組(Miltenyi Biotec)去除PBMC中的NK細胞。接下來，將每孔100,000個PBMC添加至96孔盤中，隨後在含有10ng/ml濃度的SEA的試驗緩衝液中添加PRO1480的連續稀釋液或添加烏瑞魯單抗(urelumab)和阿維魯單抗(avelumab)的組合稀釋液。在37℃和5%CO2下培育96小時之後，收集細胞上清液，並根據套組說明書，使用BioLegend的IL-2人類ELISA MAX試驗來定量培養上清液中的人白細胞介素2(IL-2)水平。從IL-2標準曲線內插IL-2濃度，針對阿維魯單抗(avelumab)/烏瑞魯單抗(urelumab)組合和PRO1480濃度來反算並作圖，以計算EC50值。
如第6圖所示，T細胞分泌出IL-2，隨後藉由添加PRO1480而阻斷PD-1/PDL1相互作用和刺激CD137。相較於阿維魯單抗(avelumab)和烏瑞魯單抗(urelumab)的組合，PRO1480顯示出更高的T細胞活化性和更好的潛力。此發現代表，相較於參考分子阿維魯單抗(avelumab)和烏瑞魯單抗(urelumab)的混合物，三特異性抗PDL1xCD137xHSA scDb-scFv PRO1480能夠誘導更強的T細胞刺激。
實例12：伴隨的PDL1阻斷和CD137刺激之刺激作用的抗原決定基依賴性。
藉由比較兩種具有不同抗CD137抗體片段的構建體的刺激作用來重複實例11。如第7圖所示，其顯示了來自三個到四個獨立實驗系列中單個代表性實例之數據，T細胞分泌出IL-2，隨後藉由添加PRO1480和PRO1186同時阻斷PD-1/PDL1相互作用和刺激CD137(請參見範例10)。相較於靶向CD137 ECD的CRD4上的膜近端抗原決定基的PRO1186(參見第9B圖)，靶向CD137 ECD的CRD1和CRD2上的膜遠末端抗原決定基的PRO1480(參見第9A圖)係藉由更多IL-2分泌和優越潛力而顯示出更高的最大T細胞活化(第8圖，其顯示所述三個至四個單獨實驗系列之合併結果)。該發現代表，相較於靶向非遠端抗原決定基之分子，靶向膜遠末端抗原決定基的三特異性抗PDL1xCD137xHSA scDb-scFv PRO1480能夠誘導出更強的T細胞共刺激。
實例13：抗原決定基之測定
單獨的PRO1359之結構測定及PRO1359與4-1BB的ECD結合之結構測定。
scFv(PRO1359)係於CHO細胞中瞬時表現，並使用Capto-L樹脂(GE-Healthcare)從收穫物中純化。使用Superdex 75尺寸排阻層析管柱(GE-Healthcare)將蛋白質拋光至高單體含量。
4-1BB(Uniprot：Q07011)的殘基24-160係表現以具有IdeS切割位點的N端分泌序列和C端無鉸鏈Fc標籤[Novarra,S.,et al.,A hingeless Fc fusion system for site-specific cleavage by IdeS.mAbs, 2016.8(6)：p.1118-1125]。融合蛋白係於CHO細胞中瞬時表現，並使用蛋白A樹脂(GE Healthcare)從細胞上清液中捕捉。Fc標籤係於37℃下藉由IdeS來切割，並使用蛋白A珠粒去除。
抗4-1BB scFv PRO1359之結晶
將抗4-1BB scFv濃縮至pH 6.7的10mg/ml的25mM Hepes、100mM NaCl中。藉由坐滴蒸氣擴散技術(sitting drop vapor diffusion technique)以母液與蛋白質的比例為1：1之方式來篩選結晶條件。晶體係生長於0.1M Tris pH 8.5、2M NH4H2PO4中，並藉由向母液中添加100%乙二醇至最終濃度的20%來進行冷凍保護。
抗4-1BB scFv PRO1359與4-1BB的ECD的複合物之結晶。
藉由混合等莫耳比率的兩種蛋白質，然後使用Superdex 75尺寸排阻層析管柱在50mM Hepes、100mM NaCl、pH 6.7中進行複合物純化，以形成複合物。
將對應於復合物的級分濃縮至10mg/ml。藉由在20℃下0.1M乙酸鈉、pH 5.5、22%PEG2000 MME、0.17M至0.23M乙酸鈣以及等體積的母液和複合物中之坐滴蒸氣擴散(sitting drop vapor diffusion)，從而使初始晶體生長。使用SeedBeads(Hampton Research)以將晶體壓碎，並在隨後的結晶篩選中用作晶種。
最終晶體係生長於20℃、0.1M Tris-醋酸鹽pH 8.5、1M Na-甲酸酯、25%PEG2000 MME中，其中母液/蛋白質/晶種的比例為 1：1：0.125。將晶體在80mM Tris-乙酸鹽pH 8.5、0.8M甲酸鈉、22.4%PEG2000 MME、20%乙二醇中冷凍保護，並在液態氮中冷凍。
繞射實驗及結構解決方案
在瑞士維勒根的Paul-Scherrer研究所的瑞士光源(Swiss Light Source)處收集了單獨的scFv之本機數據庫以及scFv與4-1BB結合之本機數據集。scFv係結晶於空間群P65中，並使用XDS進行處理，以具有1.6Å的分辨率。此複合物係結晶於空間群I222中，並使用XDS進行處理，以具有2.2Å的分辨率[Kabsch,W.,XDS.Acta Crystallographica Section D,2010.66(2)：p.125-132.]。
scFv的結構藉由使用內部scFv模型的Phaser分子置換來解決[McCoy,A.J.等人，Phaser crystallographic software.Journal of Applied Crystallography,2007.40(4)：p.658-674]。使用scFv apo結構和4-1BB簡化模型(pdb代碼：6BWV，鏈D)藉由分子置換來解決複雜結構。
細化(Refinement)
使用Refmac將結構細化[Murshudov,G.N.,A.A.Vagin,and E.J.Dodson,Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method.Acta Crystallographica Section D,1997.53(3)：p.240-255.]。手動模型構建係於Coot中執行[Emsley,P.,et al.,Features and development of Coot.Acta Crystallographica Section D,2010.66(4)：p.486-501.]。
將apo結構細化至1.6Å的分辨率，其中殘基1-110和128-251係很好地由電子密度和15.8%/18%的最終Rwork/Rfree值所定義。類似地，將復雜結構細化至2.2Å的分辨率。對於CD137，殘基24-158係可見於電子密度中，其中殘基139-149和156-158僅有弱定義。對於殘基3-109和131-252，scFv係具有良好定義。將此複合物細化至19.2%/23.5%的Rwork/Rfree值。
抗原專一性說明(Interface description)
CD137抗原決定基
使用歐洲生物信息學研究所的PISA服務來分析結合專一性(binding interface)[Krissinel,E.and K.Henrick,Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State.Journal of Molecular Biology,2007.372(3)：p.774-797.]。CD137的抗原決定基係位於第一個和第二個富含半胱胺酸的結構域(CRD)之內。與scFv結合後隱蔽的可達表面積為750Å2(請參閱表3)。關鍵殘基係列於表24。
Figure 108136280-A0305-02-0141-47
Figure 108136280-A0305-02-0142-48
<110> Numab治療公司(Numab Innovation AG)
<120> 靶向CD137的抗體及其使用方法
<130> 115159P877EP
<140> EP18199334.6
<141> 2018-10-09
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
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<210> 3
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<213> 人工序列
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<223> 基於人工抗體的序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 基於人工抗體的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
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<210> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
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<210> 9
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<213> 人工序列
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<223> 基於人工抗體的序列
<400> 9
Figure 108136280-A0305-02-0145-60
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 10
Figure 108136280-A0305-02-0145-61
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 11
Figure 108136280-A0305-02-0146-62
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 12
Figure 108136280-A0305-02-0146-63
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 13
Figure 108136280-A0305-02-0146-64
Figure 108136280-A0305-02-0147-65
<210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 14
Figure 108136280-A0305-02-0147-66
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 15
Figure 108136280-A0305-02-0147-67
Figure 108136280-A0305-02-0148-68
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 16
Figure 108136280-A0305-02-0148-69
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 17
Figure 108136280-A0305-02-0148-70
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 18
Figure 108136280-A0305-02-0149-71
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 19
Figure 108136280-A0305-02-0149-72
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 20
Figure 108136280-A0305-02-0149-73
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 21
Figure 108136280-A0305-02-0149-75
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 22
Figure 108136280-A0305-02-0150-76
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 23
Figure 108136280-A0305-02-0150-77
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 24
Figure 108136280-A0305-02-0150-78
<210> 25
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 25
Figure 108136280-A0305-02-0150-79
Figure 108136280-A0305-02-0151-80
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 26
Figure 108136280-A0305-02-0151-81
<210> 27
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 27
Figure 108136280-A0305-02-0152-82
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 28
Figure 108136280-A0305-02-0152-83
<210> 29
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 29
Figure 108136280-A0305-02-0153-84
Figure 108136280-A0305-02-0154-85
<210> 30
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 30
Figure 108136280-A0305-02-0154-86
Figure 108136280-A0305-02-0155-87
<210> 31
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 31
Figure 108136280-A0305-02-0155-88
Figure 108136280-A0305-02-0156-89
<210> 32
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Figure 108136280-A0305-02-0156-90
Figure 108136280-A0305-02-0157-91
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Figure 108136280-A0305-02-0158-92
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Figure 108136280-A0305-02-0158-93
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Figure 108136280-A0305-02-0158-94
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Figure 108136280-A0305-02-0158-95
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Figure 108136280-A0305-02-0158-96
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Figure 108136280-A0305-02-0159-97
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Figure 108136280-A0305-02-0159-98
<210> 40
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 40
Figure 108136280-A0305-02-0159-99
Figure 108136280-A0305-02-0160-100
Figure 108136280-A0305-02-0161-101
Figure 108136280-A0305-02-0162-102
<210> 41
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 41
Figure 108136280-A0305-02-0163-103
Figure 108136280-A0305-02-0164-104
Figure 108136280-A0305-02-0165-105
Figure 108136280-A0305-02-0166-106
<210> 42
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 42
Figure 108136280-A0305-02-0166-107
Figure 108136280-A0305-02-0167-108
Figure 108136280-A0305-02-0168-109
Figure 108136280-A0305-02-0169-110
<210> 43
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 43
Figure 108136280-A0305-02-0169-111
Figure 108136280-A0305-02-0170-112
Figure 108136280-A0305-02-0171-113
Figure 108136280-A0305-02-0172-114
Figure 108136280-A0305-02-0173-115
<210> 44
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人工抗體的序列
<400> 44
Figure 108136280-A0305-02-0173-116
Figure 108136280-A0305-02-0174-117
Figure 108136280-A0305-02-0175-118
<210> 45
<211> 163
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Figure 108136280-A0305-02-0175-119
Figure 108136280-A0305-02-0176-121
<210> 46
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 46
Figure 108136280-A0305-02-0176-122
Figure 108136280-A0305-02-0177-123
Figure 108136280-A0305-02-0178-124
<210> 47
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 47
Figure 108136280-A0305-02-0178-125
Figure 108136280-A0305-02-0179-126
<210> 48
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 48
Figure 108136280-A0305-02-0180-127
Figure 108136280-A0305-02-0181-128
<210> 49
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 49
Figure 108136280-A0305-02-0181-129
Figure 108136280-A0305-02-0182-130
Figure 108136280-A0305-02-0183-131
<210> 50
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 50
Figure 108136280-A0305-02-0183-132
Figure 108136280-A0305-02-0184-133
<210> 51
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 51
Figure 108136280-A0305-02-0185-134
Figure 108136280-A0305-02-0186-135
<210> 52
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 52
Figure 108136280-A0305-02-0186-136
Figure 108136280-A0305-02-0187-137
<210> 53
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD137細胞外結構域的人工構建體
<400> 53
Figure 108136280-A0305-02-0188-138
Figure 108136280-A0305-02-0189-139

Claims (17)

  1. 一種分離的抗體，具有對人類CD137的結合特異性，包含一重鏈可變區包含分別為SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列以及一輕鏈可變區包含分別為SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；其中所述重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：13、14和15所組成的群組的胺基酸序列具有至少90%一致性的胺基酸序列，其中所述輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：25、26和27所組成的群組的胺基酸序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述之分離的抗體，其包含：(a)SEQ ID NO：13之重鏈可變區(VH)序列和SEQ ID NO：25之輕鏈可變區(VL)序列；(b)SEQ ID NO：14之重鏈可變區(VH)序列和SEQ ID NO：26之輕鏈可變區(VL)序列；或(c)SEQ ID NO：15之重鏈可變區(VH)序列和SEQ ID NO：27之輕鏈可變區(VL)序列。
  3. 如請求項1所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體係不抑制CD137與其配體CD137L之間的相互作用，其中係藉由競爭型ELISA所測定。
  4. 如請求項1所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體：(i)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之以小於50nM的解離常數(KD)與人類CD137結合；(ii)以表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之小於50nM的KD與食蟹猴CD137結合；(iii)不與人類CD40結合和/或不與人類OX40結合，其中係藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所測定；(iv)當為scFv形式時，具有藉由微差掃描螢光分析法(differential scanning fluorimetry)所測量之至少50℃的熔融溫度(Tm)，其中所述分離的抗體係於pH 6.4的50mM磷酸檸檬酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製；(v)當為scFv形式時，且當所述分離的抗體的起始濃度為10mg/ml時，在4℃下儲存至少兩週之後，單體含量的損失小於7%，其中所述分離的抗體係於pH 6.4的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製；和/或(vi)當為scFv形式時，且當所述分離的抗體的起始濃度為10mg/ml時，在五個連續的凍融循環之後，單體含量的損失小於5%，其中所述分離的抗體係於pH 6.4的50mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液和150mM NaCl中配製。
  5. 如請求項1所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體係選自下述所組成的群組：單株抗體、嵌合抗體、Fab、Fv、scFv、 dsFv、scAb、STAB和基於替代支架的結合域(binding domains)，其中基於替代支架的結合域(binding domains)係包括但不限於基於錨蛋白的結構域、fynomer、avimer、anticalins、纖連蛋白以及內置於抗體恆定區的結合位點。
  6. 如請求項5所述之分離的抗體，其中所述scFv具有選自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所組成的群組的胺基酸序列。
  7. 如請求項1所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體係在一抗原決定基處與人類CD137細胞外結構域結合，該抗原決定基位於該CD137細胞外結構域的遠端部分，且在SEQ ID NO：32的胺基酸殘基24-86之內。
  8. 如請求項7所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體在該抗原決定基處與人類CD137細胞外結構域結合，所述抗原決定基包含殘基Gly34、Thr35、Cys45、Pro47、Cys48和Ser80。
  9. 如請求項7所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體在該抗原決定基處與人類CD137細胞外結構域結合，所述抗原決定基更包含殘基Pro37、Arg41、Ser46、Pro50和Thr81。
  10. 如請求項7所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體在該抗原決定基處與人類CD137細胞外結構域結合，所述抗原決定基包含殘基Asn30、Pro32、Ala33、Gly34、Thr35、Phe36、Asn40、Arg41、Asn42、Gln43、Cys45、Ser46、Pro47、Cys48、Pro49、Pro50、Asn51、Ser52、Cys65、Glu77、Cys78、Ser79、Ser80和Thr81。
  11. 如請求項1所述之分離的抗體，其中所述分離的抗體係為一多特異性分子(multispecific molecule)。
  12. 一種藥物組合物，包含如請求項1所述之分離的抗體和一醫藥上可接受的載體。
  13. 如請求項1所述之分離的抗體或如請求項12所述之藥物組合物，係用作一藥物。
  14. 如請求項1所述之分離的抗體或如請求項12所述之藥物組合物，係用於製備用於治療癌症的一藥物。
  15. 一種核酸，係編碼如請求項1所述之分離的抗體。
  16. 一種製備如請求項1所述之分離的抗體的方法，該方法包括培養一宿主細胞的步驟，其中該宿主細胞包含編碼如請求項1所述之分離的抗體的一核酸或一載體。
  17. 一種套組，係包含如請求項1所述之分離的抗體或如請求項12所述之組合物。
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