CN112805068A - 靶向cd137的抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合人CD137的分离的抗体，及其药物组合物和使用方法。本发明还涉及包含编码所述抗体的核苷酸序列的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞以及生产所述抗体的方法。

Description

靶向CD137的抗体及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种特异性结合人CD137的分离的抗体，及其药物组合物和使用方法。本发明还涉及编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞以及生产所述抗体的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)是受体的蛋白质超家族，其特征在于它们能够通过胞外结构域中富含半胱氨酸的假重复序列(pseudorepeat)与肿瘤坏死因子(TNF)结合(Locksley等人,2001,Cell.104:487–501)。目前，已经鉴定出了27个TNF家族成员。TNFRSF成员及其配体主要在免疫细胞上表达，它们在T细胞介导的免疫应答中发挥免疫调节剂的作用。TNFRSF成员在增强树突状细胞的存活和T细胞的启动能力、效应T细胞的最佳生成、最佳抗体应答以及炎症反应的扩大中发挥作用。
CD137(4-1BB，TNF-受体超家族9，TNFRSF9)是TNFR超家族的表面糖蛋白。它是一种诱导型共刺激性T细胞受体。CD137表达是激活依赖性的，并且涵盖了广泛的免疫细胞子集，包括活化的NK和NKT细胞、调节性T细胞、树突细胞(DC)(包括滤泡DC)、刺激后的肥大细胞、分化髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(Wang等人,Immunol Rev.229(1):192-215(2009))和活化的B细胞(Zhang等人,J Immunol.184(2):787-795(2010))。另外，还在肿瘤脉管系统(Broil K等人,Am J Clin Pathol.115(4):543-549(2001)；Seaman等人,Cancer Cell 11(6):539-554(2007))和动脉粥样硬化内皮细胞(Olofsson等人,Circulation 117(10):1292 1301(2008))上证明了CD137表达。
CD137-配体(CD137L，4-1BBL或tnfsf9)，一种TNF家族的分子，是一种已知的CD137的细胞间天然配体(Alderson,M.R.等人,Eur.J.Immunol.24:2219–2227(1994)；Pollok K.等人,Eur.J.Immunol.24:367-374(1994)；Goodwin,R.G.等人,Eur.J.Immunol.23:2631–2641(1993))。CD137的配体形成同型三聚体，CD137信号传导从细胞表面的连接的分子发生，这些分子被三聚化的配体交联(Won,E.Y.等人,J.Biol.Chem.285:9202–9210(2010))。有人提出，CD137的高阶聚集是介导信号传导所必需的。CD137在其细胞质尾中与衔接子TRAF-2和TRAF-1缔合，导致共免疫沉淀，这在T细胞中CD137激活后有所增强(Saoulli,K.等人,J.Exp.Med.187:1849–1862(1998)；Sabbagh,L.等人,J.Immunol.180:8093–8101(2008))。CD137招募TRAF-1和TRAF-2会导致NF-kB和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶级联反应(包括ERK、JNK和p38 MAP激酶)的下游活化。NF-kB激活导致Bcl-2家族的促存活成员Bfl-1和Bcl-XL上调。促凋亡蛋白Bim以TRAF-1和ERK依赖性方式下调(Sabbagh等人,JImmunol.180(12):8093-8101(2008))。有人提出，CD137的主要作用是将两个或更多个TRAF-2分子彼此紧密地放置(Sanchez-Paulete,A.R.等人,Eur.J.Immunology 46(3):513-522(2016))。基于此，推测驱动CD137信号传导的主要因素是细胞质膜的微片(micropatch)中TRAF-2组装的CD137部分的相对密度(Sanchez-Paulete,A.R.等人,Eur.J.Immunology46(3):513-522(2016))。总体而言，多聚化作用会促进CD137信号传导，有人提出，交联的CD137分子是CD137共刺激活性的关键因素。
CD137共同刺激T细胞以执行效应子功能，例如根除已建立的肿瘤、扩大原发性CD8+T细胞应答和增加抗原特异性CD8+T细胞的记忆库、诱导干扰素-γ(IFN-γ)合成。通过操纵CD137/CD137L相互作用可以潜在地将CD137刺激在CD8+T细胞功能和存活中的关键作用用于治疗肿瘤。实际上，小鼠体内功效研究表明，抗CD137抗体治疗会导致多种肿瘤模型的的肿瘤消退。例如，已证明激动性抗小鼠CD137抗体会诱导针对P815肥大细胞瘤肿瘤和低免疫原性肿瘤模型Ag104的免疫应答(I.Melero等人,Nat.Med.,3(6):682-5(1997))。在一些研究中已经报道了CD137激动剂mAb在单一疗法和组合疗法的预防性和治疗性环境中以及抗肿瘤保护性T细胞记忆应答中的功效(Lynch等人,Immunol Rev.222:277-286(2008))。CD137激动剂还在多种自身免疫模型中抑制自身免疫反应(Vinay等人,J Mol Med 84(9):726-736(2006))。
目前临床上的两种抗CD137抗体是urelumab(Bristol-Myers Squibb)，其是一种完全人源化的IgG4 mAb，和utomilumab(PF-05082566，Pfizer)，其是一种全人IgG2 mAb(Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(101243-8(2016))。尽管利用激动CD137的治疗性抗体是非常有前途的治疗策略，但它还伴随着诸如抗CD137激动剂抗体的低功效、高毒性和不良反应等困难。已证明，CD137激动剂抗体可导致免疫系统和器官功能改变，增加毒性风险。据报道，在幼稚荷瘤小鼠中高剂量的CD137激动剂抗体可诱导T细胞向肝细胞浸润以及天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶升高，这符合肝脏炎症(Niu L等人JImmunol 178(7):4194–4213(2007)；Dubrot J等人,Int J Cancer 128(1):105–118(2011))。针对CD137激动剂抗体的人类治疗用途的初步临床研究还证明了肝酶的升高和肝炎发病率的增加(Sznol M.等人,J Clin Oncol 26(115S):3007(2008)；Ascierto PA等人,Semin Oncol 37(5):508–516(2010)；Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。在先前治疗过的III/IV期黑色素瘤的Bristol-Myers Squibb(BMS)II期抗CD137研究(国家临床试验(NCT)00612664)中，观察到了潜在的致命性肝炎。该研究及其他一些研究(NCT00803374、NCT00309023、NCT00461110、NCT00351325)因不良事件而终止(Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。此类不良事件很可能是由于T细胞的全身过度刺激所致。
因此，在本领域中需要生产改进的治疗性抗人CD137抗体，其具有更高的功效而没有通常抗增殖药的固有副作用，特别是具有与目前可用的CD137抗体相当的较低毒性。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗体，其与人CD137蛋白特异性结合，并且具有用于治疗的有益性质，例如改善的亲和力、功效、安全性和改善的生物物理性质例如改善的溶解性、可显影性(developability)和稳定性。特别地，已经发现CD137抗体在结合后不直接导致CD137信号传导，而是需要依赖于其他细胞表面分子。
一方面，本发明涉及一种新型CD137抗体。
一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或本发明的组合物。
一方面，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者的癌症的本发明的抗体或本发明的组合物。
一方面，本发明涉及本发明的抗体或本发明的组合物在制备用于治疗有此需要的受试者中的癌症的药物中的用途。
另一方面，本发明涉及一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或本发明的组合物。
另一方面，本发明涉及编码本发明的抗体的核酸。
另一方面，本发明涉及包含所述核酸的载体。
另一方面，本发明涉及包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及一种生产本发明的抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。
分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：
1.对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，包括一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，该组CDR相对于一组CDR具有10个或更少的氨基酸取代，在后一组CDR中：
HCDR1'是选自SEQ ID NO：1、4、7和10中的任一个的氨基酸序列；
HCDR2'是选自SEQ ID NO：2、5、8和11中的任一个的氨基酸序列；
HCDR3'是选自SEQ ID NO：3、6、9和12中的任一个的氨基酸序列；
LCDR1'是选自SEQ ID NO：16、19和22中的任一个的氨基酸序列；
LCDR2'是选自SEQ ID NO：17、20和23中的任一个的氨基酸序列；并且
LCDR3'是选自SEQ ID NO：18、21和24中的任一个的氨基酸序列。
2.根据项目1所述的抗体，其包含：一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，该组CDR相对于一组CDR具有10个或更少的氨基酸取代，在后一组CDR中：
HCDR1'如SEQ ID NO：1所示；
HCDR2'如SEQ ID NO：2所示；
HCDR3'如SEQ ID NO：3所示；
LCDR1'如SEQ ID NO：16所示；
LCDR2'如SEQ ID NO：17所示；
LCDR3'如SEQ ID NO：18所示。
3.根据项目1或2所述的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(a)所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且
(b)所述VL依次包括三个互补确定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4.根据项目3所述的抗体，其中
(a)所述HCDR1包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：1、4、7和10中的任一个，优选SEQ ID NO：1；(b)所述HCDR2包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：2、5、8和11中的任一个，优选SEQ ID NO：2；(c)所述HCDR3包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：3、6、9和12中的任一个，优选SEQ ID NO：3；
(d)所述LCDR1包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：16、19和22中的任一个，优选SEQ ID NO：16；(e)所述LCDR2包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：17、20和23中的任一个，优选SEQ ID NO：17；并且(f)所述LCDR3包含选自以下的氨基酸序列，优选由其组成：SEQ ID NO：18、21和24中的任一个，优选SEQ ID NO：18。
5.根据项目3所述的抗体，其中所述抗体包含：(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别为SEQ ID NO：4、5和6的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；LCDR1(c)分别为SEQ ID NO：7、8和9的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别为SEQ ID NO：10、11和12的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
6.根据项目3所述的抗体，其包含：(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由其组成。
7.根据项目3至6中任一项所述的抗体，其中所述VH包括VH3框架FR1、FR2、FR3和FR4。
8.根据项目3至7中任一项所述的抗体，其中所述VL包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4(特别是Vκ1FR4或Vκ3FR4)和VλFR4；特别是包含与选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一项的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选如SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一项所示的VλFR4，优选如SEQ ID NO：33或34所示的VλFR4，更优选如SEQID NO：33所示的VλFR4。
9.根据项目3至8中任一项所述的抗体，其中所述VH包含与选自SEQ ID NO：13、14和15，优选SEQ ID NO：13或15，更优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和/或所述VL包含与选自SEQ ID NO：25、26和27，优选SEQ ID NO：25或27，更优选SEQID NO：25的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
10.根据项目3至9中任一项所述的抗体，其中所述VH包含选自SEQ ID NO：13、14和15中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：13或15，更优选SEQ ID NO：13；和/或所述VL包含选自SEQ ID NO：25、26和27中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：25或27，更优选SEQ ID NO：25。
11.根据前述项目中任一项所述的抗体，其包含：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或(c)SEQ IDNO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体
a)与人CD137结合的解离常数(KD)小于50nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，如通过表面等离振子共振测量的；并且
b)任选地，与食蟹猴CD137结合的KD小于50nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，如通过表面等离振子共振测量的；并且
c)任选地，与urelumab交叉竞争。
13.前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体不抑制CD137与其配体CD137L之间的相互作用，特别是如通过竞争ELISA所测定的。
14.前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合人CD40和/或不结合人OX40，特别是如通过SPR测量的。
15.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
a)当为scFv形式时，所述抗体的解链温度(Tm)为至少50℃，例如至少55℃，优选至少60℃，更优选至少64℃，特别地，如通过差示扫描荧光法测定的，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中；和/或
b)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，在4℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于7％，例如小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，优选小于2％，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中；和/或
d)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，在5个连续的冻融循环后，所述抗体的单体含量损失小于5％，优选小于3％，更优选小于1％，特别地，其中将本发明的所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中。
16.一种分离的抗体，其中所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位位于CD137胞外结构域远端部分，特别是在富含半胱氨酸的结构域CRD1和/或CRD2内，更特别是在SEQ ID NO：32的氨基酸残基24-86内，条件是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
17.前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于替代其他替代其他替代骨架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)，优选Fv或scFv。
18.根据前述项目中任一项所述的抗体，其是单链可变片段(scFv)。
19.根据项目18所述的抗体，其中所述scFv具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，优选SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31，更优选SEQ ID NO：29。
20.根据项目17所述的分离的抗体，17.根据项目14所述的分离的抗体，其中所述抗体是选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的IgG，优选IgG4。
21.根据前述项目中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人源化的。
22.根据前述项目中任一项所述的抗体，其是多特异性分子，特别是具有至少第二功能分子的多特异性分子。
23.根据项目22所述的抗体，其中所述抗体的形式选自由以下组成的组：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三抗体(Fab-(scFv)2)或双抗体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的Fv、scFv、scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD、MATCH和DuoBody。
24.一种药物组合物其包含项目1-23中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
25.项目1-23中任一项所述的抗体，或项目24所述的组合物，其用作药物。
26.项目1-23中任一项所述的抗体，或项目24所述的组合物，其用于制造用于治疗癌症的药物。
27.项目1至23中任一项所述的抗体，或项目24所述的组合物，其用于治疗癌症。
28.项目1-23中任一项所述的抗体或项目24所述的组合物用于治疗有此需要的受试者的癌症的用途。
29.一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的项目1-23中任一项所述的抗体或项目24所述的组合物。
30.一种核酸，其编码项目1至23中任一项所述的抗体。
31.一种载体，其包含项目30的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含项目30所述的核酸或项目31所述的载体。
33.一种生产项目1至23中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养包含项目30所述的核酸或项目31所述的载体的宿主细胞。
34.一种试剂盒，其包含项目1至23中任一项所述的抗体，或项目24所述的组合物。
附图说明
图1衍生自兔IgG克隆38-27-A11和urelumab和utomilumab的表位分箱(binning)结果的热图。结合水平标准化为理论Rmax，以分析物分子(列)与固定分子(行)的百分比(％)表示。无结合(深灰色)表示相同的表位，亮灰色表示次级分子(分析物)可以结合并具有与固定分子不同的另一个表位。
图2在竞争ELISA中，CD137与CD137L的结合无抑制。在评估CD137L与CD137结合的竞争性ELISA中测量的吸光度分别以PRO1359或PRO1360的增加浓度的函数表示。抑制性抗体山羊抗人CD137用作参照。
图3通过流式细胞术(FC)评估PRO1359和PRO1360与人CD137表达Jurkat细胞的结合。所获得的荧光信号的几何平均值表示为分子浓度(以ng/ml为单位)的函数。Urelumab用作参照。
图4(A)CD137的结构。CRD1至4代表富含半胱氨酸的结构域1至4。(B)CD137 ECD的设计构建体。
图5在存在HCC827细胞(被IFNγ(10ng/ml)刺激6小时和24小时)的条件下，在CD137活性测定中测试了三特异性scDb-scFv分子PRO1480和PRO1481。在该实验中，使用PRO885作为参照分子来评估CD137信号传导相对活化。沿每个板取三特异性scDb-scFv分子PRO1186，并将其活性与其他scDb-scFv分子进行比较。在添加Jurkat报告细胞后6h或24h读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合仅具有增加的RLU值的被测分子的浓度。
图6离体T细胞活化测定。将PBMC用10ng/ml SEA刺激，并用连续稀释的scDb-scFv构建体PRO1480处理96小时。通过ELISA定量收获的上清液中的IL-2来评估T细胞的活化。与参照分子的混合物相比，用PRO1480处理导致明显的IL-2分泌。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图7用或不用葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激(96小时，1mg/ml HSA)的人PBMC的IL-2分泌。用10ng/ml SEA刺激PBMC，并用参照分子阿维鲁单抗(avelumab)和urelumab的混合物以及scDb-scFv PRO1480和PRO1186的系列稀释液处理96小时。通过ELISA定量收获的上清液中的IL-2来评估T细胞的活化。与PRO1186处理相比，用PRO1480处理导致明显的IL-2分泌。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图8不同抗CD137抗体片段激活T细胞的效力和最大程度。抗体构建体scDb-scFvPRO1480和PRO1186激活T细胞的效力和最大程度分别由如图7所示的IL-2分泌的曲线下面积(AUC)和刺激II-2分泌的最大值表示。
图9不同抗CD137抗体片段的CD137结合示意图。CD137的胞外结构域(ECD)由四个富含半胱氨酸的结构域(CRD1至4)组成。(A)抗CD137抗体PRO1480结合CD137上的表位，所述表位包含在CRD1和/或CRD2中的ECD的远端部分中；(B)相反，抗CD137抗体PRO1186结合CD137上的表位，所述表位包含在CRD4中靠近细胞的ECD的一部分中。
具体实施方式
本发明提供了与人CD137蛋白特异性结合的抗体，以及药物组合物、生产方法以及使用此类抗体和组合物的方法。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
在第一方面，本发明涉及与人CD137特异性结合的抗体。
一方面，本公开提供了一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，包括一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，该组CDR相对于一组CDR具有10个或更少的氨基酸取代，例如，9个或更少的氨基酸取代，8个或更少的氨基酸取代，7个或更少的氨基酸取代，6个或更少的氨基酸取代，5个或更少的氨基酸取代，4个或更少的氨基酸取代，3个或更少的氨基酸取代，2个或更少的氨基酸取代，1个或0个氨基酸取代，优选0个氨基酸取代，在后一组CDR中：HCDR1'是选自SEQ ID NO：1、4、7和10中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：1；HCDR2'是选自SEQ ID NO：2、5、8和11中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQID NO：2；HCDR3'是选自SEQ ID NO：3、6、9和12中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQ IDNO：3；LCDR1'是选自SEQ ID NO：16、19和22中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：16；LCDR2'是选自SEQ ID NO：17、20和23中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：17；并且LCDR3'是选自SEQ ID NO：18、21和24中的任一个的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO：18。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含：分别与SEQ ID NO：1、2和3的序列具有至少90％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，分别与SEQ ID NO：16和18的序列具有至少90％同一性的LCDR1和LCDR3序列，以及与SEQ ID NO：17的序列具有至少85％同一性的LCDR2序列。
如本文所用，术语“抗体”等包括：完整抗体或其单链；及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完整的完整抗体的一个或多个片段，其保留了与给定的抗原(例如CD137)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含两个Fab片段的二价片段，这两个Fab片段通过铰链区的二硫键连接；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；以及基于替代骨架的结合结构域，包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)。
术语“互补决定区”(“CDR”)是指使用许多著名方案中的任何一种确定边界的氨基酸序列，这些著名方案包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteinsof Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)，以及Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号方案)描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。
在本发明的背景下，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号系统考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中，特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的氨基酸残基4至138和可变重(VH)链的氨基酸残基5至138(在各情况下，均根据Honegger&Plückthun编号)，更优选VL的氨基酸残基3至144和VH的氨基酸残基4至144，并且特别优选的是完整的VL和VH链(VL的1至149位氨基酸和VH的1至149位氨基酸)。也可以将抗原结合部分并入到大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、scDb-scFv、v-NAR和双-scFv中(参见，例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,112636)。可以将抗体的抗原结合部分移植到基于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的骨架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗)。可以将抗原结合部分并入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体结合位点与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及规定标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，优选至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。本发明的抗体对人CD137具有结合特异性。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体对人CD137具有结合特异性，并且不与人CD40结合和/或不与人OX40结合，特别是如通过SPR确定的。
适当地，本发明的抗体是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD137的分离的抗体基本上不含特异性结合除CD137以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合CD137的分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的CD137分子)具有交叉反应性。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体对人CD137和食蟹猴(Macaca fascicularis)(也称为食蟹猴(Cynomolgusmonkey)或“食蟹猴(Cynomolgus)”)CD137具有结合特异性。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
适当地，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指它们的氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的抗体。单克隆抗体组合物对某个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。
本发明的抗体包括但不限于嵌合的和人源化的。
术语“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连，或与一个完全不同的分子相连，该分子赋予嵌合抗体新的特性，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比对人类的抗原性降低。
如本文所用，“人源化”抗体是保留了非人抗体的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及衍生自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如从转化为表达人源化抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)中分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体。
适当地，本发明的抗体是人源化的。适当地，本发明的抗体是人源化的并且包含来源于兔的CDR。
术语“CD137”特别是指具有UniProt ID号Q07011的人CD137，在本文中以SEQ IDNO：32再现。适当地，本发明的抗体靶向CD137，特别是人CD137，如UniProt ID号Q07011所示，其在本文中以SEQ ID NO：32再现。适当地，本发明的抗体靶向人和食蟹猴CD137。本发明的抗体特异性结合CD137。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体对人CD137具有结合特异性，并且不与人CD40结合和/或不与人OX40结合，特别是如通过SPR确定的。优选地，本发明的抗体不阻断CD137/CD137L相互作用。
适当地，本发明的抗体是CD137激动剂。“活化剂”或“活化抗体”或“激动剂”或“激动剂抗体”是通过与其结合的抗原增强或引发信号传导的一种。在本发明的背景下，术语“CD137激动剂”涵盖能够在其CD137-抗原结合片段聚簇时能够激活CD137信号传导的本发明的抗体，例如，其中至少两个所述CD137-抗原结合片段的结合能够使结合的CD137分子多聚化并使它们活化。在一些实施方案中，激动剂抗体在不存在天然配体的情况下激活信号传导。
本发明的抗体包括但不限于如本文所述(包括实施例中)分离的人源化单克隆抗体。此类抗人CD137抗体的实例是其序列列于表1中的抗体。实施例中提供了关于本文所述抗体的生成和表征的其他细节。
对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：(a)所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且(b)所述VL依次包含三个互补确定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。为了清楚起见，CDR区域彼此不连接，但是侧接框架区FR1至FR4。
本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含VH CDR，所述VH CDR具有表1所列的VH CDR中的任一个的氨基酸序列。特别地，本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含一个、两个或三个VH CDR，所述VH CDR具有表1所列的相应VHCDR中的任一个的氨基酸序列。
本发明提供了一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1具有选自SEQID NO：1、4、7和10中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：1；所述HCDR2具有选自SEQ IDNO：2、5、8和11中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：2；所述HCDR3具有选自SEQ IDNO：3、6、9和12中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：3。特别地，本发明提供了抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性，并且包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
本发明还提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含VL CDR，所述VLCDR具有表1所列的VL CDR中的任一个的氨基酸序列。特别地，本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含一个、两个或三个VL CDR，所述VL CDR具有表1所列的VLCDR中的任一个的氨基酸序列。
本发明提供了一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含轻链可变区(VL)，其中所述VL依次包含三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1具有选自SEQID NO：16、19和22中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：16；所述LCDR2具有选自SEQID NO：17、20和23中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：17；所述LCDR3具有选自SEQID NO：18、21和24中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：18。特别地，本发明提供了抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性，并且包含分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
适当地，本发明提供了一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(a)所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1具有选自SEQ ID NO：1、4、7和10中的任一个的氨基酸序列，所述HCDR2具有选自SEQ ID NO：2、5、8和11中的任一个的氨基酸序列，所述HCDR3具有选自SEQ ID NO：3、6、9和12中的任一个的氨基酸序列；并且
(b)所述VL依次包括三个互补确定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1具有选自SEQ ID NO：16、19和22中的任一个的氨基酸序列，所述LCDR2具有选自SEQ ID NO：17、20和23中的任一个的氨基酸序列，所述LCDR3具有选自SEQ ID NO：18、21和24中的任一个的氨基酸序列。
特别地，本发明提供了抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性，并且包含(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及(b)分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍在CDR区中与表1中描述的序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。一方面，本发明的其他抗体包括突变氨基酸序列，其中当与表1中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“相同”或“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。关于核酸、肽、多肽或抗体序列的“百分比(％)同一性”和“同源性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定核酸、肽或多肽序列中的核酸/氨基酸残基相同的核酸/氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2或ALIGN软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参照序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定其他参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。可通过国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件。
也可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被纳入ALIGN程序(2.0版)，其使用PAM120重量残留表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入GCG软件包的GAP程序中(可www.gcg.com上找到)，其使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，否则特定的多肽序列也隐含涵盖其保守修饰的变体。
适当地，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(a)所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，
所述HCDR1具有与SEQ ID NO：1、4、7和10中的任一个，优选SEQ ID NO：1，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列；
所述HCDR2具有与SEQ ID NO：2、5、8和11中的任一个，优选SEQ ID NO：2，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列；
所述HCDR3具有与SEQ ID NO：3、6、9和12中的任一个，优选SEQ ID NO：3，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列；和/或
(b)所述VL依次包括三个互补确定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，
所述LCDR1具有与SEQ ID NO：16、19和22中的任一个，优选SEQ ID NO：16，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列；
所述LCDR2具有与SEQ ID NO：17、20和23中的任一个，优选SEQ ID NO：17，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列；
所述LCDR3具有与SEQ ID NO：18、21和24中的任一个，优选SEQ ID NO：18，具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)分别与SEQ ID NO：1、2和3的序列具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或(b)分别与SEQ ID NO：16、17和18的序列具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和/或分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VH结构域和VL结构域。在本发明的背景下，术语“VH”(可变重链)、“VL”(可变轻链)、“Vκ”和“Vλ”是指根据序列同一性和同源性分组的抗体重链和轻链序列的家族。确定序列同源性的方法，例如通过使用同源性搜索矩阵例如BLOSUM(HeniKoff,S.&HeniKoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)10915-10919)，以及根据同源性对序列进行分组的方法是本领域普通技术人员众所周知的。对于VH、Vκ和Vλ，可以确定不同的亚族，例如，Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中所示，其将VH分组为VH1A、VH1B和VH2至VH6，Vκ分组为Vκ1至Vκ4，Vλ分组为Vλ1至Vλ3。在体内，抗体Vκ链、Vλ链和VH链分别是种系κ链V和J片段、种系λ链V和J片段以及重链V、D和J片段的随机重排的结果。给定的抗体可变链属于哪个亚家族由相应的V片段，特别是由框架区FR1至FR3确定。因此，在本申请中仅以具体的一组框架区HFR1至HFR3为特征的任何VH序列可以与任何HFR4序列结合，例如从重链种系J片段之一中取得的HFR4序列，或从重新排列的VH序列取得的HFR4序列。
适当地，本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VH3结构域。属于VH3家族的VH的一个具体示例由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14表示。特别地，取自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的框架区FR1至FR3属于VH3家族(表1，非粗体标记的前三个区域)。适当地，本文所用的属于VH3家族的VH包含与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的FR1至FR3具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％序列同一性的FR1至FR3。更特别地，取自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的框架区FR1至FR4属于VH3家族(表1，非粗体标记的区域)。适当地，本文所用的属于VH3家族的VH包含与SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14的FR1至FR4具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％序列同一性的FR1至FR4。
适当地，本发明提供了一种特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，优选Vκ1框架FR1至3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4(特别是Vκ1FR4或Vκ3FR4)和VλFR4。合适的Vκ1框架FR1至FR3在SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26中列出(表1，FR区以非粗体标记)。合适的Vκ1框架FR1至FR3包含与对应于FR1至FR3并选自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26(表1，FR区以非粗体标记)的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。
合适的VλFR4如SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39所示。在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一个的氨基酸序列，优选与SEQID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选与SEQ ID NO：33具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4(特别是Vκ1FR4或Vκ3FR4)和VλFR4，特别地，VλFR4包含与选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一个的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选与SEQ ID NO：33具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列，更特别地，VλFR4包含选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选SEQ ID NO：33。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性并且包含VL，所述VL包含：
(i)CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)人Vκ框架区FR1至FR3，特别是人Vκ1框架区FR1至FR3；
(iii)FR4，其选自(a)FR4人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQID NO：33至39，优选SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选SEQ ID NO：33；和(b)基于Vλ的序列，其与最接近的FR4人Vλ种系序列相比，具有一个或两个突变，特别是一个突变，所述最接近的FR4人Vλ种系序列包含选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一个的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选SEQ ID NO：33。
在一个更优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，以及VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中的任一个的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列，特别地，VλFR4如SEQ ID NO：SEQ ID NO：33至SEQID NO：39，优选SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34，更优选SEQ ID NO：33所示。
本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VH结构域。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含(或者，由其组成)表1中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍在VH区中与表1中描述的序列中描述的VH区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的分离的抗体，所述抗体包含表1中列出的VL结构域。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，非CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，非CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍在VL区中与表1中描述的序列中描述的VL区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
适当地，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：15，优选SEQ ID NO：13至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列，并且特别地，其中所述抗体包括分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：13至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述重链可变区包含G51C(AHo编号)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：14至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述重链可变区包含V2S、Y105F和Q141P(AHo编号)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：25或SEQ IDNO：26或SEQ ID NO：27，优选SEQ ID NO：25至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列，并且特别地，其中所述抗体包括分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：25至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含T141C(AHo编号)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：26至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含I2F、M4L和A51P(AHo编号)。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO：13、14和15组成的组，优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO：25、26和27组成的组，优选SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：13、14和15中的任一个，优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：25、26和27中的任一个，优选SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
因此，本发明提供了一种特异性结合人CD137的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：13至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：25至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和/或分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，优选地，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ IDNO：26的VL序列；或(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，与氨基酸序列SEQ ID NO：13至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列，以及与氨基酸序列SEQ ID NO：25至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列；
(b)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，与氨基酸序列SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列，以及与氨基酸序列SEQ ID NO：26至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，优选地，其中所述VH包含V2S、Y105F和Q141P(AHo编号)，并且所述VL包含I2F、M4L和A51P(AHo编号)；或
(c)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，与氨基酸序列SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列，以及与氨基酸序列SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，优选地，其中所述VH包含G51C(AHo编号)，并且所述VL包含T141C(AHo编号)。
在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，与氨基酸序列SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列，以及与氨基酸序列SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，优选地，其中所述VH包含G51C突变(AHo编号)，并且所述VL包含T141C突变(AHo编号)。适当地，本发明的所述抗体被突变以形成在框架区内的人工结构域间二硫键，特别是其中半胱氨酸对取代了所述VH上的Gly 51(AHo编号)和所述VL上的Thr 141(AHo编号)。令人惊讶地发现，包含结构域间二硫键的本发明的这种抗体具有显著提高的热稳定性。
关于二硫桥(“SS桥”或“diS”)的术语“人工的”是指S-S桥不是由野生型抗体天然形成的，而是由亲本分子的工程突变体形成的，其中至少一个外来氨基酸对二硫键做出了贡献。人工二硫桥的定点工程改造明显不同于天然免疫球蛋白或模块化抗体中天然可得的那些，例如WO 2009/000006中描述的那些，因为人工二硫桥的桥墩的至少一个位点通常位于野生型抗体中Cys残基的位置之外，因此提供了框架区内的替代的或另外的二硫键。本发明的人工二硫桥(“结构域间桥”)可以在抗体结构域内进行工程改造，其将稳定β-折叠结构或桥接结构域(“结构域间桥”)或结构域的链(“链间桥”)，以限制本发明的多特异性抗体的结构并支持其与潜在结合伴侣的相互作用。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；
(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或
(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。
在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含SEQID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL。
在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体是表1中描述的抗体。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：30所示。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示。在一个优选的实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：29所示。
本发明的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经突变，但与表1中所述的序列具有至少60、70、80、90或95％同一性的那些抗体。在一个实施方案中，包括当与表1中描述的序列中描述的可变区相比时，可变区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个，同时保留了基本上相同的治疗活性的氨基酸序列。如本文所用，术语“基本上相同的活性”是指由基本上相同的活性表示的活性为针对亲本抗体(例如本发明的抗体，特别是表1中所述的本发明的抗体)确定的活性的至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或甚至至少100％或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如高达200％。
鉴于这些抗体中的每一种都可以与CD137结合并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，因此可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以将来自不同抗体的CDR混合并匹配，但是每种抗体必须包含VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3)以产生本发明的其他的结合CD137的结合分子。可以使用本领域已知的结合测定法和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试这种“混合并匹配的”CD137结合抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，应当将某个具体VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列替换为结构相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，应当将某个具体VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列替换为结构相似的CDR序列。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以通过用来自本文所示的本发明的单克隆抗体的CDR序列的结构上相似的序列来突变一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含与表1中描述的序列同源的氨基酸序列，并且所述抗体与CD137结合，并保留了表1中描述的那些抗体的所需功能特性。
例如，本发明提供了一种分离的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO：13、14和15组成的组，优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO：25、26和27组成的组，优选SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；其中所述抗体与CD137蛋白特异性结合。
在一个实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1所示的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，除了在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置上的氨基酸取代之外，VH和/或VL氨基酸序列可以是相同的。
在一个实施方案中，本发明的抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。
术语“保守修饰的变体”或“保守变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由一个密码子明确规定的每个位置上，可以将该密码子改变为所描述的相应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个所记载的序列中。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”或“保守变体”包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。这些保守修饰的变体是以下的补充并且不排除以下：本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八个组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，例如Creighton,Proteins(1984))。在一个实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。
因此，本发明提供了一种分离的单克隆抗体，其由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中：重链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO：1、4、7、10中的任一个、优选SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；重链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO：2、5、8、11中的任一个、优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；重链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：3、6、9、12中的任一个、优选SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；轻链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO：16、19、22中的任一个、优选SEQ ID NO：16的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；轻链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO：17、20、23中的任一个、优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；并且轻链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：18、21、24中的任一个、优选SEQ ID NO：18的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；其中所述抗体与CD137特异性结合并且能够在有或没有另外的交联的情况下激活CD137信号传导。
在一个实施方案中，本发明的抗体被优化用于在哺乳动物细胞中表达，并且其具有重链可变区和轻链可变区，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。因此，本发明提供了优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：13、14和15的任一个，优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和其保守变体；并且所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：25、26和27中的任一个，优选SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或其保守修饰；其中所述抗体与CD137特异性结合并且能够在有或没有另外的交联的情况下激活CD137信号传导。
在一个实施方案中，本发明的抗体被优化用于在哺乳动物细胞中表达，其具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。
如本文所用，术语“优化的”是指将核苷酸序列改变为使用在生产细胞或生物(通常是真核细胞，例如毕赤酵母属细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人类细胞)中优选的密码子编码氨基酸。对优化的核苷酸序列进行工程改造，以完全或尽可能保留最初由起始核苷酸序列(也称为“亲本”序列)编码的氨基酸序列。本文的优化序列已经被进行了改造，以具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，本文中还设想了这些序列在其他真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为被优化的。
可变区修饰的另一种类型是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以如本文所述和实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能的影响。可以引入保守修改(如上所述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，CDR区中通常不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
“亲和力成熟的”抗体是一种抗体，在其一个或多个可变结构域中具有一个或多个改变，与不具有那些改变的亲本抗体相比，这导致抗体对抗原的亲和力得到改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方案产生亲和力成熟的抗体。例如，Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。高变区(HVR)和/或框架残基的随机诱变描述于例如：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
本发明的抗体可以进一步通过如下方法制备：使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程化修饰的抗体，该修饰的抗体可能具有与起始抗体不同的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来工程化抗体。另外地或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如以改变抗体的效应子功能。
可以执行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，各个抗体之间CDR中的氨基酸序列比CDR之外的序列更具多样性。由于CDR序列对大多数抗体-抗原相互作用负责，因此可以通过构建表达载体来表达模仿特定天然存在抗体的特性的重组抗体，该表达载体包含来自该特定天然存在抗体的CDR序列，并且该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann,L.等人,1998Nature 332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature 321:522-525；Queen,C.等人,1989Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539(Winter)，和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370(Queen等人))。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列或重排的抗体序列的公开参照文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于"VBase"人类种系序列数据库(可在互联网上找到，网址为Internet at www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat,E.A.,等人,1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,等人,1992J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,1994Eur.J Immunol.24:827-836；通过引用的方式将各文献的内容明确地并入本文。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列和重排抗体序列可以在“IMGT”数据库中找到(可以在网上在www.imgt.org获得；参见Lefranc,M.P.等人,1999Nucleic Acids Res.27:209-212；其各自的内容通过引用的方式明确地并入本文)。
用于本发明的抗体的框架序列的实例是与本发明的所选抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些，例如，本发明的单克隆抗体所使用的共有序列和/或框架序列。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列移植到框架区上，该框架区具有与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或者可以将CDR序列移植到与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况下，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370(Queen等人))。
可以使用多种抗体/免疫球蛋白框架或骨架，只要得到的多肽包括至少一个与CD137特异性结合的结合区域即可。这样的框架或骨架包括人免疫球蛋白的五种主要的个体基因型(idiotype)，其抗原结合片段，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化特征。
一方面，本发明涉及一种使用非免疫球蛋白骨架生产基于非免疫球蛋白的抗体的方法，可以将本发明的CDR移植到所述非免疫球蛋白骨架上。可以使用已知的或将来的非免疫球蛋白框架和骨架，只要它们包含对靶CD137蛋白具有特异性的结合区即可。已知的非免疫球蛋白框架或骨架包括但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、锚蛋白(ankyrin)(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、脂质运载蛋白(lipocalin)(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小型模块化免疫药物(smallmodular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、maxybodies(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif)、蛋白质A(Protein A)(Affibody AG,Sweden)和affilin(γ-晶状体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
适当地，本发明的抗体与CD137特异性结合，并以下列参数中的一个或多个为特征：
(i)与人CD137结合的解离常数(KD)小于50nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，如通过表面等离振子共振测量的；
(ii)与人CD137结合的Koff速率为5x10-3 s-1或更低，或10-3s-1或更低，或5x10-4 s-1或更低，或10-4s-1或更低，如通过SPR测量的；
(iii)与人CD137结合的Kon速率为至少104M-1s-1或更高，至少105M-1s-1或更高，至少5x105 M-1s-1或更高，至少106M-1s-1或更高，如通过SPR测量的；
(iv)任选地，与urelumab交叉竞争；并且
(v)任选地，与食蟹猴CD137交叉反应；
(vi)任选地，不抑制CD137与CD137L之间的相互作用，特别是如通过竞争ELISA所测定的。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。
“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体片段和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
本文所用的术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”或“KD”或“KD值”通过使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)使用表面等离子体共振测定法来测量。为了测量亲和力，使用标准的胺偶联方案将对兔IgG Fc区具有特异性的抗体(Bethyl Laboratories，货号A120-111A)固定在传感器芯片(SPR-2Affinity Sensor,High Capacity Amine,SierraSensors)上。B-细胞上清液中的兔单克隆抗体被固定的抗兔IgG抗体捕获。B细胞上清液中的IgG最低浓度要求足以捕获。捕获单克隆抗体后，将人CD137ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)以90nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离5分钟。每个注射循环后，两次注射10mM甘氨酸-HCl使表面再生。使用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)使用一对一Langmuir结合模型计算表观解离速率常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)，并根据相对Chi2(将Chi2标准化为分析物的外推最大结合水平)监控拟合质量，其中相对Chi2是对曲线拟合质量的度量。Chi2的值越小，对于一对一Langmuir结合模型的拟合越准确。如果配体结合的反应单位(RU)为抗体捕获的RU的至少2％，则认为结果有效。配体结合的RU少于2％的抗体捕获的RU的样品被认为CD137与捕获的抗体没有特异性结合。平衡解离常数(KD)计算为比率Koff/Kon。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。
适当地，本发明的抗体对CD137的亲和力可以与CD137L对CD137的亲和力相当或更高。适当地，本发明的抗体对CD137的亲和力可以与urelumab对CD137的亲和力相当或更高。应当理解，CD137结合结构域的较高亲和力可能特别适合用于抗体，其中所述抗体对于CD137是单价的。抗体的结合亲和力可以例如通过解离常数(KD)确定。较低的KD表示较强的亲和力，而较高的KD表示较弱的亲和力。
因此，在合适的实施方案中，本发明的抗体的KD可以为5至50,000pM，5至40,000pM，5至30,000pM，5至20,000pM，5至10,000pM，5至9,000pM，5至8,000pM，5至7,000pM，5至6,000pM，5至5,000pM，特别是如通过SPR所测量的。在另一个实施方案中，本发明的抗体与人CD137结合的KD在10nM至10pM之间，优选在10nM至0.1nM之间，更优选在5nM至1nM之间，特别是如通过SPR所测量的。
在合适的实施方案中，本发明的抗体的KD可以小于约50nM，小于约45nM，小于约40nM，小于约35nM，小于约30nM，小于约25nM，小于20nM，小于约15nM，小于约10nM，小于约9nM，小于约8nM，小于约7nM，小于约6nM，小于约5nM，特别是如通过SPR测量的。适当地，本发明的抗体具有小于10nM的KD，特别是通过SPR测量。优选地，本发明的抗体与人CD137结合的KD小于5nM，特别是如通过SPR测量的。
适当地，本发明的抗体与人CD137结合的Kon率为至少103M-1s-1或更高，至少104M-1s-1或更高，至少5x104 M-1s-1或更高，至少105M-1s-1或更高，至少5x105 M-1s-1或更高，至少106M-1s-1或更高，如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。适当地，本发明的抗体的Kon率为至少105M-1s-1或更高，特别是至少5x105 M-1s-1或更高，如通过SPR所测量的。
适当地，本发明的抗体与人CD137结合的Koff率为10-3s-1或更低，3x10-3 s-1或更低，5x10-3 s-1或更低，10-4s-1或更低，5x10-4 s-1或更低，如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。适当地，本发明的抗体的Koff率为5x10-3 s-1或更低，如通过SPR所测量的。
适当地，本发明的抗体具有有益的生物物理特征。
适当地，当为scFv形式时，本发明的抗体的解链温度(Tm)为至少50℃，例如至少55℃，优选至少60℃，更优选至少65℃，如通过差示扫描荧光法测定的，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中。DSF已在前面进行了描述(Egan等人,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen等人,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)。scFv构建体的热解折叠的转变中点是通过差示扫描荧光法使用荧光染料
Figure BDA0003007813170000401
Orange确定的(参见Wong&Raleigh,Protein Science 25(2016)1834-1840)。在pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中的样品以50μg/mL的最终蛋白质浓度制备，并且含有5x
Figure BDA0003007813170000402
Orange的终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约两个小时。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。
本发明的抗体，特别是当以scFv(单链可变片段)抗体形式表达时，其特征在于：当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将本发明的抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存至少两周，特别是至少4周后，本发明的抗体的单体含量损失小于7％，例如小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，优选小于2％。单体含量的损失由SE-HPLC色谱图的曲线下面积计算确定。SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如USP第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V0)和总渗透体积(VT)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC系统(Hitachi High-TechnologiesCorporation)上进行，该系统配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在4-6℃。对于scFv样品的分析，使用Shodex KW403-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989202)，标准缓冲盐水流动相(50mM磷酸钠pH 6.5，300mM氯化钠)，推荐流速为0.35mL/min。每次注射的目标样品加载量为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V0至VT的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。
此外，本发明的抗体，特别是当以scFv(单链可变片段)抗体形式表达时，其特征在于：当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将本发明的抗体配制在pH6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在5个连续的冻融循环后，抗体的单体含量损失小于5％，优选小于3％，更优选小于1％。
术语“表位”是指抗体可以特异性结合的抗原的局部区域。例如，表位可以是多肽的连续氨基酸，或者例如，表位可以一起来自一个多肽或多个多肽的两个或更多个非连续区域。
在一个实施方案中，本发明的抗体与urelumab交叉竞争与CD137结合。Urelumab，也称为BMS-663513，是来自Bristol-Myers Squibb的完全人源化的IgG4 mAb，并描述于WO2004/010947、US 6,887,673和US 7,214,493，这些文献通过引用的方式整体并入本申请。适当地，根据非限制性理论，本发明的抗体可以与urelumab结合在CD137上相同或重叠的(例如，结构相似或在空间上接近的)表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体不交叉竞争与utomilumab的结合。本发明提供了与不同于utomilumab的表位结合的抗体。utomilumab，也称为PF-05082566，是来自Pfizer的完全人源化的IgG2 mAb，并描述于WO 2012/032433和US 8,821,867，这些文献通过引用的方式整体并入本申请。适当地，根据非限制性理论，本发明的抗体可以与utomilumab结合在CD137上不同的(例如，结构上不同或空间上较远的)表位。如本文所用，术语“识别”是指发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)的抗体。
本发明的抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位位于CD137胞外结构域远端部分，特别是在富含半胱氨酸的结构域1至2(CRD1至2)内，特别是在SEQ ID NO：32的氨基酸残基24-86内，但CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
因此，在另一方面，本公开还提供了与本公开的任何示例性抗体，特别是表1中列出的任何示例性抗体结合相同表位的抗体。本发明提供了分离的抗体，其中所述抗体结合人CD137胞外结构域的表位，所述表位包括CD137胞外结构域的远端部分，特别是位于其内，特别是位于富含半胱氨酸的结构域内，但是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合CRD1和/或CRD2的关键残基，更特别地位于SEQ ID NO：32的氨基酸残基24-86内，但是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
在具体实施方案中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，根据实施例13测定，这一组关键残基包括残基Arg 41、Gln43、Cys45、Pro49、Ser52和Ser80。
在本发明的上下文中，术语“关键残基”是指抗原的残基，其是基于抗体的分子所结合的表位的一部分，并且对于基于抗体的分子及其表位之间的相互作用是至关重要的。特别地，关键残基的特征在于满足以下标准中的一个或多个：(i)当基于抗体的分子与表位结合时，被掩埋至大于50％，(ii)具有特定的侧链氢键相互作用，(iii)参与氢键网络，和/或(iv)与基于抗体的分子的重要结合残基表现出关键的相互作用。在特定的实施方案中，这些标准是根据实施例13中公开的方法确定的。
在具体实施方案中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，所述关键残基还包括残基Ala33、Asn40和Cys48，如根据实施例13测定的。
在具体实施方案中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，所述关键残基还包括残基Pro32、Gly34、Thr35、Ser46、Pro47、Pro50、Cys78和Ser79，如根据实施例13测定的。
在一些实施方案中，分离的抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和/或分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，优选地，其中抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。适当地，抗体具有上文描述的一种或多种生物学特性。
因此，可以基于它们在CD137结合测定中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定其他抗体。在一个具体实施方案中，本公开提供了分离的抗体，其与本公开的任何示例性抗体，特别是与表1中所列的任何示例性抗体竞争或交叉竞争，以与人CD137的相同表位结合。
术语“竞争”或“交叉竞争”和相关术语在本文中可互换使用，是指在标准竞争性结合测定中一种抗体或其他结合剂干扰其他抗体或结合剂与CD137的结合的能力。
可以使用标准竞争结合测定法来确定一种抗体或其他结合剂能够干扰另一种抗体或结合分子与CD137的结合的能力或程度，并因此确定是否可以说是根据本发明的交叉竞争。一种特别合适的定量交叉竞争测定法使用基于FACS或基于AlphaScreen的方法来测量标记的(例如His标记的、生物素化的或放射性标记的)抗体或其片段与另一种抗体或其片段在它们与靶标结合方面的竞争。通常，交叉竞争抗体或其片段，例如，在交叉竞争测定中，将与靶标结合，使得在测定期间并且在存在第二抗体或其片段的情况下，所记录的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的位移高达以给定量存在的待测试潜在交叉阻断抗体或其片段的最大理论位移(例如，需要交叉阻断的冷(例如未标记)抗体或其片段置换)的100％(例如，在基于FACS的竞争测定中)。优选地，交叉竞争抗体或其片段的记录的位移在10％至100％之间，更优选在50％至100％之间。
适当地，本发明的分离的抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、IgG抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于替代骨架的结合结构域，包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)。
适当地，本发明的分离的抗体是Fv片段。适当地，本发明的分离的抗体是scFv片段。“单链Fv”或“scFv”或“sFv”抗体包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间多肽接头，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构(参见，例如，Plückthun,The pharmacology of MonoclonalAntibodies,Vol.113,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315)。在具体实施方案中，所述功能片段为scFv形式，在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其中所述接头包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、8或8，优选n＝4。在特定实施方案中，所述功能片段是scFv形式，其包含根据SEQ ID NO：28的接头。在一个实施方案中，与人CD137特异性结合的本发明的分离的抗体包含与选自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，优选SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31，优选SEQ ID NO：29所示的单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：30所示的单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：31所示的单链可变片段(scFv)。在一个优选的实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：35所示的单链可变片段(scFv)。
适当地，本发明的分离的抗体是IgG抗体同种型。术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG例如IgG1或IgG4)。同种型也包括这些类别之一的修饰形式，其中修饰是为了改变Fc功能，例如，增强或降低效应子功能或与Fc受体的结合。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的IgG，优选IgG4。适当地，本发明的分离的抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：13至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：25至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：26至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。适当地，本发明的分离的抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在另一个具体实施方案中，本发明的分离的抗体是多特异性分子，特别是具有至少第二功能分子的多特异性分子，例如双特异性分子、三特异性分子、四特异性、五特异性或六特异性分子。
如本文所用，术语“多特异性分子”或“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，CD137和不同于CD137的另一个靶标)上的两个或更多个不同表位结合的抗体，或与同一靶标的两个或更多个不同表位结合的抗体。术语“多特异性分子”包括双特异性、三特异性、四特异性、五特异性和六特异性抗体。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与两个不同靶标或相同靶标上的两个不同表位结合的抗体。如本文所用，术语“三特异性抗体”是指与三个不同靶标或相同靶标上的三个不同表位结合的抗体。
可以将本发明的抗体或其抗原结合区衍生化或与另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)连接，以产生与至少两个结合位点和/或不同靶标分子结合的多特异性分子。实际上，本发明的抗体可被衍生化或与不止一个其他功能分子连接，以产生与不止两个不同结合位点和/或靶标分子结合的多特异性分子。为了产生本发明的多特异性分子，可以将本发明的抗体与一个或多个其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，从而产生多特异性分子。
因此，本发明包括多特异性分子，其包含至少一个对CD137的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位存在于不同于CD137的另一种靶分子上。
在没有外源簇的情况下，二价CD137抗体诱导信号传导的能力通常较弱。为了说明，抗CD137抗体utomilumab仅在与抗人F(ab’)2二抗交联或固定在组织培养塑料上时才能够激活CD137信号传导(Fisher等人,Cancer Immunol Immunother 61:1721-1733(2012))。对CD40(TNFRSF5)(TNFRSF的另一个成员)的啮齿类动物拮抗抗体的研究表明，可以通过与Fcγ受体的相互作用部分地实现外源聚集(Li F,Ravetch JV,Science 333(6045):1030–10(2011)；White AL等人,J Immunol 187(4):1754–1763(2011))。但是，与Fcγ受体的相互作用可以通过效应子机制消耗表达CD137的细胞。因此，目前靶向CD137的二价抗体要么是无效的激动剂，要么导致CD137阳性细胞的消耗。适当地，多特异性分子的第二结合特异性能够提供本发明的CD137结合抗体的另外的交联。因此，本发明包括多特异性分子，其包含至少一个对CD137的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于第一靶表位的CD137的另一表位。除了第一和第二靶表位之外，多特异性分子还可以包括第三结合特异性。
在另一个实施方案中，本发明包括针对CD137特异性的单价、二价或多价的多特异性分子，优选单价。
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的分离的抗体是CD137特异性的单价或多价分子，例如二价、三价、四价、五价或六价。
如本文所用，术语“单价分子”或“单价抗体”是指与靶分子(例如CD137)上的单个表位结合的抗体。
术语“多价分子”或“多价抗体”是指具有不止一个价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与相同靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，单个结合分子可以与不止一个靶分子结合，或者与一个靶分子(其包含多个拷贝的表位)上的不止一个结合位点结合。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等。如本文所用，术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合部分的抗体，其中每个都与相同的表位结合。
适当地，本发明的分离的抗体是多特异性分子，例如双特异性分子，和/或多价分子，例如对于CD137特异性分子是单价的，对于CD137特异性分子是二价的，其是选自本领域已知的任何合适的多特异性(例如双特异性)形式的抗体形式，包括但不限于基于以下的形式：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三抗体(Fab-(scFv)2)或双抗体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的Fv、scFv、scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD、MATCH(描述于WO 2016/0202457；Egan T.等人,mAbs 9(2017)68-84)和Duobody(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用接头，该接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生两个抗原结合位点。在具体实施方案中，所述多肽结构包括四(4)个甘氨酸氨基酸残基和一(1)个丝氨酸氨基酸残基的单元(GGGS)n，其中n＝1或2，优选1。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体在例如EP 404097,WO 93/01161,Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)和Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更充分地描述。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别地包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，它们通过接头L1、L2和L3以以下顺序连接VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。
接头L1特别是2-10个氨基酸，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽，并且接头L3特别是1-10个氨基酸，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽。在具体实施方案中，接头L1和/或L3包含四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基的单元(GGGGS)n，其中n＝1或2，优选n＝1。
中间接头L2特别是10-40个氨基酸，更特别地15-30个氨基酸，最特别地20-25个氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝4。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体是scDb-scFv形式的多特异性和/或多价抗体。术语“scDb-scFv”是指抗体形式，其中单链Fv(scFv)片段通过柔性Gly-Ser接头与单链双抗体(scDb)融合。在一个实施方案中，所述柔性Gly-Ser接头是2-40个氨基酸，例如2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10个氨基酸，特别是10个氨基酸氨基酸的肽。在具体实施方案中，所述接头包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝2。
在一个实施中本发明中，分离的抗体是WO 2016/0202457；Egan T.等人,mAbs 9(2017)68-84中描述的MATCH形式的多特异性和/或多价抗体。
本发明的多特异性和/或多价分子可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&
Figure BDA0003007813170000491
-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于生产包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,Methods EnzyMol.121(1986)210-228)。
可以在本发明的多特异性和多价分子中使用的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法通过将成分结合特异性缀合来制备本发明的多特异性分子。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.NO.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,111)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，例如一个。
或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配体X Fab融合蛋白时，此方法是特别有用的。本发明的多特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者可以是包含两个结合决定簇的单链多特异性分子。多特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明的抗体。本发明还提供了一种核酸序列，其编码与CD137蛋白特异性结合的抗体的CDR、VH、VL、全长重链和全长轻链。可以对此类核酸序列进行优化以在哺乳动物细胞中表达。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，即在所述序列中，一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer等人,NucleicAcid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述CD137结合抗体链的区段或结构域。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出CD137抗原结合能力。
本发明还提供了多核苷酸，其编码表1中列出的CD137结合抗体的重链或轻链的至少一个CDR区并且通常编码所有三个CDR区。一些其他多核苷酸编码表1中列出的CD137结合抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。由于密码子的简并性，多种核酸序列将编码所述免疫球蛋白氨基酸序列的每一个。
多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码CD137结合抗体的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Narang等人,1979,Meth.EnzyMol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.EnzyMol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles和Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods和Applications,Innis等人(Ed.),AcademicPress,San Diego,Calif,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods和Applications 1:17,1991。
本发明还提供了用于生产上述CD137结合抗体的表达载体和宿主细胞。
术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。
可以使用各种表达载体来表达编码CD137结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达CD137结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP Epstein Barrvirus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.MicroBiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于要在其中表达所述载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码CD137结合抗体的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止插入序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达CD137结合抗体还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.CellDiffer.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，从而与由插入的CD137结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。通常，在包含在载体中之前，将插入的CD137结合抗体序列与信号序列连接。用于接收编码CD137结合抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区是人的。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
包含和表达CD137结合抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，例如酵母，也可以用于表达本发明的CD137结合多肽。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。
在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的CD137结合多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入包含目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第4版，冷泉港2012)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88-223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达CD137结合抗体链或结合片段的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1-2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术使增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：培养包含编码本发明抗体的核酸或载体的宿主细胞，由此表达本发明的所述抗体或其片段。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物即抗体和多特异性分子可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。
本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained和Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的CD137结合抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将CD137结合抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。
抗体通常被多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中CD137结合抗体的血液水平所指示的。或者，抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。
一方面，本发明提供了一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体，与一种或多种另外的治疗剂，例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法。适当地，本发明的抗CD137抗体可以与选自以下的抑制性(或免疫检查点)分子的抑制剂组合使用：PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ和IDO(吲哚胺-2,3双加氧酶)。抑制性分子的抑制可以通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制来进行。
令人惊奇地发现，当与PDL1抑制剂组合使用时，本发明的抗CD137抗体具有强的有益的协同相互作用和改善的抗增殖活性。因此，本发明提供了一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂，特别是用于治疗或预防增生性疾病。本发明进一步涉及一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂，特别是用于同时、单独或相继用于治疗或预防增生性疾病。
本文将术语“组合”或“药物组合”定义为指一种剂量单位形式的固定组合、非固定组合或针对组合施用的成套试剂盒(kit of parts)，其中治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)可以一起施用、在同一时间独立施用或在允许组合各部分表现出合作(例如协同)作用的时间间隔内分开施用。
术语“固定组合”是指治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)以单一实体或剂型的形式同时施用于患者。
术语“非固定组合”是指在没有特定时间限制的情况下，同时、并行或依次将治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)以单独的实体或剂型施用于患者，其中这样的施用在有此需要的受试者(例如哺乳动物或人)的体内提供两种治疗剂的治疗有效水平。
术语“PDL1”特别是指具有UniProt ID号Q9NZQ7的人PDL1。
术语“阻断剂”或“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制或降低与其结合的靶标分子的生物学活性的剂。在一些实施方案中，抑制剂基本上或完全抑制靶分子的生物学活性。合适的PDL1抑制剂靶向、降低和/或抑制PDL1与其结合伴侣的结合能力，从而干扰PDL1功能。特别地，合适的PDL1抑制剂阻断PDL1与PD-1的相互作用。在一些实施方案中，合适的PDL1抑制剂阻断PDL1与PD-1和B7-1的相互作用。适当地，在本发明的药物组合中使用的PDL1抑制剂是抗PDL1抗体。
如本文所用，术语“协同效应”是指两种治疗剂(例如，(a)本发明的抗CD137抗体和(b)PDL1抑制剂)产生的效果，例如减缓增生性疾病(特别是癌症)或其症状的症状进展，比单独施用每种治疗剂所产生的效果的简单相加更大的作用。例如，可以使用诸如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe可加性方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326(1926))和中值效应方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))之类的合适方法来计算协同效应。上面提到的每个方程式都可以应用于实验数据，以生成相应的图表，以帮助评估药物组合的效果。与上述方程式相关的对应曲线分别是浓度-效果曲线、isobologram曲线和组合指数曲线。通过根据本领域技术人员已知的方法计算组合的协同作用得分，可以进一步显示协同作用。
如本文所用，术语“组合施用”被定义为涵盖将选择的治疗剂施用给单个患者，并且旨在包括其中不一定通过相同的施用途径或在相同时间来施用治疗剂的治疗方案。
术语“组合制剂”在本文中被定义为特别是指“成套试剂盒”，在这种意义上，如上文所定义的治疗剂(a)和(b)可以同时或在不同时间点独立地给药或者通过使用具有突出量的治疗剂(a)和(b)的不同固定组合给药。然后，对于成套试剂盒的任何部分，可以同时或按时间顺序错开(即，在不同的时间点，以相同或不同的时间间隔)施用成套试剂盒的各部分。可以改变组合制剂中待施用的治疗剂(a)与治疗剂(b)的总量之比，例如，以便满足待治疗的患者子群的需求或单个患者的需求。
如本文所用，术语“联合治疗活性”或“联合治疗作用”是指可以以在待治疗的温血动物(尤其是人)中仍然显示出有益(优选协同)相互作用(联合治疗作用)的，治疗剂优选的时间间隔单独(以按时间顺序错开的方式，特别是序列特异性方式)给予治疗剂。是否如此，可以通过追踪血液水平等来确定，表明至少在一定时间间隔内两种治疗剂都存在于待治疗的人的血液中。
本发明的药物组合包含本文所定义的本发明的抗CD137抗体，特别是用于治疗或预防增生性疾病。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：13至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：25至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：26至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，所述IgG4包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
一方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
在另一方面，本发明涉及用于制备用于治疗增生性疾病，特别是癌症的药物的本发明的抗体，或本发明的组合物，或本发明的组合。
一方面，本发明涉及用于治疗增生性疾病，特别是癌症的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
在另一方面，本发明涉及本发明的抗体，或本发明的组合物，或本发明的组合用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病，特别是癌症的用途。
一方面，本发明提供了一种治疗有此需要的受试者的增生性疾病(特别是癌症)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，增生性疾病是癌症。术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体(例如扩散或循环的)肿瘤。如本文所用，术语“癌”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。本文使用的术语“癌症”是指广泛的肿瘤，包括所有实体和血液恶性肿瘤。此类肿瘤的例子包括但不限于：良性或特别是恶性肿瘤、实体瘤、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、腹部癌(例如胃肿瘤)、食道癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、阴道癌、甲状腺癌、黑素瘤(例如不可切除的或转移性黑素瘤)、肾细胞癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤或胃肠道癌尤其是结肠癌或结直肠腺瘤、头颈部肿瘤、子宫内膜癌、Cowden综合征、Lhermitte-Duclos病、Bannayan-Zonana综合征、前列腺增生、赘生物尤其是上皮特征的赘生物优选乳癌癌或鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病(例如费城染色体阳性慢性骨髓性白血病)、急性淋巴细胞性白血病(例如费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病及其任意组合。在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌。
本发明的抗体或本发明的多特异性分子或本发明的组合物或本发明的组合抑制实体瘤的生长，而且也抑制液体瘤的生长。在另一个实施方案中，增生性疾病是实体瘤。术语“实体瘤”尤其是指乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、腹部癌(尤其是胃癌)、子宫颈癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)和头颈部肿瘤。此外，取决于肿瘤类型和所使用的特定组合，可以获得肿瘤体积的减小。本发明的抗体或本发明的多特异性分子或本发明的组合物或本发明的组合还适合于预防患有癌症的受试者中的肿瘤的转移扩散和微转移瘤(micrometastases)的生长或发展。
术语“预防”是指完全抑制疾病的发展或疾病的任何继发作用。如本文所用，术语“预防”包括预防疾病或病况发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的个体中。
在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的本发明的抗体。也在本公开之内的是包含本发明的多特异性分子的试剂盒。也在本公开之内的是包含本发明的药物组合物的试剂盒。试剂盒可以包括一个或多个其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记，治疗剂或可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其他方式偶联的试剂，或放射防护组合物；用于制备用于施用的抗体分子的装置或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者施用的装置或其他材料。在一个具体的实施方案中，试剂盒包含药学有效量的本发明的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒包含药学有效量的冻干形式的本发明的抗体和稀释剂，以及任选地包含使用说明。所述试剂盒还可以包括用于重构的过滤针和用于注射的针。
表1.本发明的CD137抗体的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
Figure BDA0003007813170000631
Figure BDA0003007813170000641
Figure BDA0003007813170000651
Figure BDA0003007813170000661
表2.与本发明有关的其他序列。
Figure BDA0003007813170000662
Figure BDA0003007813170000671
表3.包含本发明的抗体的分子的实例。
Figure BDA0003007813170000672
Figure BDA0003007813170000681
Figure BDA0003007813170000691
Figure BDA0003007813170000701
Figure BDA0003007813170000711
在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表3)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别地涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别地涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用的方式并入本文。
下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实施例
针对人CD137的新型抗体
实施例1：针对人CD137的兔抗体的生成
已经用以重组方式生产和纯化的人CD137胞外结构域(Peprotech，货号310-15-1MG)免疫了兔。在免疫过程中，通过确定多克隆血清抗体依旧能够与抗原产生可检测的结合的每只兔的血清的最大稀释度(滴度)，从而定性评估针对抗原的体液免疫应答的强度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估针对固定化抗原(重组人CD137 ECD)的血清抗体滴度。
实施例2：命中物鉴定和选择。
在命中物鉴定程序中，开发了基于流式细胞术的分选方法，其特异性地检测高亲和力人CD137 ECD结合B细胞，并将其分离。为了鉴定结合CD137的B细胞，用荧光染料R-藻红蛋白(RPE)标记CD137 ECD。由于标记的CD137上的CD137L结合位点和抗CD137抗体的结合位点可能会被大体积的RPE标记物阻断，因此通过流式细胞术证实了抗原决定簇的可及性。将与人IgG1、urelumab、兔多克隆抗人CD137或山羊多克隆抗人CD137的Fc部分融合的CD137LECD捕获在蛋白G珠上，并通过流式细胞术确认了R-PE标记的CD137的结合。荧光强度与固定在珠上的CD137L结合的标记CD137的数量成正比。发现CD137与CD137L和抗CD137抗体的结合，而未检测到RPE标记的CD137与英夫利昔单抗(Infliximab)的结合。
筛选：
在分选活动中分离出表达CD137特异性抗体(IgG)的B细胞。筛选阶段获得的结果是基于用来自抗体分泌细胞(ASC)培养上清的非纯化抗体进行的检测。在高通量ELISA中表征每种细胞培养上清液中的兔单克隆抗体对重组人CD137 ECD的结合。进一步表征结合CD137的上清液对人和食蟹猴CD137的结合动力学。另外，通过竞争ELISA确定了CD137与CD137L以及与urelumab相互作用的中和潜力。还评估了与稳定转导的Jurkat细胞上表达的膜CD137的结合。通过直接ELISA分析上清液的小鼠CD137结合潜力。
直接ELISA
通过添加50μl含有250ng/ml人CD137(Peprotech，货号310-15-1MG)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween20)洗涤3次，并向每个孔中加入270μl封闭缓冲液(PBS，1％BSA，0.2％Tween 20)，在室温下在不振荡的情况下放置1小时。然后，将板以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次，并加入50μl每种上清液，将板在室温下轻轻搅拌孵育1.5小时。以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每个孔中添加1:5’000稀释在封闭缓冲液中的50μl的HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体。在室温下在nutating混合器上孵育1h后，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤三次，然后添加50μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。显影5至10分钟后，通过每孔加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参照波长在450nm读板。
SPR确定对hCD137的亲和力
使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)通过SPR测量抗体对人CD137的结合亲和力。对于亲和力筛选，使用标准胺偶联程序将对兔IgG的Fc区特异性的抗体(BethylLaboratories，货号A120-111A)固定在传感器芯片(MASS-1 Affinity Sensor,HighCapacity Amine,Sierra Sensors)上。B-细胞上清液中的兔单克隆抗体被固定的抗兔IgG抗体捕获。B细胞上清液中的IgG最低浓度要求足以捕获。捕获单克隆抗体后，将人CD137ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)以90nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离5分钟。每个注射循环后，两次注射10mM甘氨酸-HCl使表面再生。使用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)使用一对一Langmuir结合模型计算表观解离速率常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)，并根据相对Chi2(将Chi2标准化为分析物的外推最大结合水平)监控拟合质量，其中相对Chi2是对曲线拟合质量的度量。Chi2的值越小，对一对一Langmuir结合模型的拟合越准确。对于大多数命中物，相对Chi2值低于15％。如果配体结合的响应单位(RU)是抗体捕获的RU的至少2％，则认为结果有效。配体结合的RU少于2％的抗体捕获的RU的样品被认为未显示CD137与捕获抗体的特异性结合。
CD137/CD137L竞争ELISA
通过添加50μl含有50ng/ml CD137 Fc嵌合体(R&D Systems，货号838-4B-100)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween 20)洗涤3次，并向每个孔中加入300μl封闭缓冲液(含有1％BSA和0.2吐温20的PBS)，在室温下在nutating混合器上放置1小时。然后，将阳性对照(中和性山羊抗CD137抗体)在100％阴性上清液中稀释，并将50μl的中和性抗体加入到结合板的相应孔中。另外，将50μl阳性命中物的上清液转移至结合板，并在室温下振荡孵育1小时。然后，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤3次，然后向孔中加入50μl的稀释在封闭缓冲液中的20ng/ml生物素化的重组人CD137配体(Acro Biosystem，货号41L-H5257)。在室温下振荡孵育1h后，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤三次。然后，向ELISA板的每个孔中加入50μl的稀释在封闭缓冲液中的10ng/ml链霉亲和素-poly-HRP。在室温孵育1小时后，将板用450μl洗涤缓冲液洗涤3次，并在添加50μl TMB后显影5至10分钟。最后，通过加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参照波长在450nm读板。
通过SPR确定物种特异性：食蟹猴CD137
还使用与结合人CD137所述相同的SPR设置，但用食蟹猴CD137 ECD(AcroBiosystem，货号41B-C52H4)代替了人CD137 ECD，确定了初筛ELISA中确定的命中物与食蟹猴CD137的结合动力学。
Urelumab竞争ELISA
通过添加50μl含有2μg/ml urelumab(由Evitria，Schlieren，Switzerland生产)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween 20)洗涤3次，并向每个孔中加入300μl封闭缓冲液(含有1％BSA和0.2吐温20的PBS)，在室温下在nutating混合器上放置1小时。然后，将urelumab稀释于95％的阴性上清液(其加标5％生物素化的CD137 ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)(7.5ng/ml)并预孵育1小时)，然后添加到结合板的相应孔中。另外，也将55μl阳性命中物的上清液加标5％生物素化的CD137 ECD(7.5ng/ml)并预孵育1小时，转移至结合板，并在室温下振荡孵育1小时。接下来，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤三次。然后，向ELISA板的每个孔中加入50μl的稀释在封闭缓冲液中的10ng/ml链霉亲和素-poly-HRP。在室温孵育1小时后，将板用450μl洗涤缓冲液洗涤3次，并在添加50μl TMB后显影5至10分钟。最后，通过加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参照波长在450nm读板。
通过FC进行基于细胞的结合测定：人CD137
收获Jurkat野生型(不表达CD137的对照细胞)和Jurkat CD137细胞(克隆C6、1)，并确定细胞数。将细胞悬液以400xg离心5分钟，然后非结合平板中的指定孔中添加40μl在PBS-EB(1x DPBS，2％BCS H.I.，2mM EDTA)中稀释的细胞悬液(40,000个细胞)。根据板布局，将来自阳性命中物的上清液直接转移到96孔板中。将阳性对照样品(urelumab)在PBS-EB中稀释并转移到板上，最终样品为95％的阴性上清液。在4℃孵育1小时后，将板用100μl的PBS-EB洗涤3次。然后，将细胞沉淀物用50μl二抗溶液以2μg/ml的浓度重悬(对于B细胞克隆：AF647标记的山羊抗兔IgG；对于urelumab：PE标记的山羊抗人IgG PE)，并在4℃下孵育1小时。接下来，将细胞再次用100μl的PBS-EB洗涤3次。然后将细胞沉淀用50μl PBS-EB重悬，并用NovoCyte 2060流式细胞仪进行分析。记录每个样品的20,000个事件的PE和AF647的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均值。首先针对非特异性抗体结合(空白和Jurkat野生型细胞结合)校正数据，然后将其标准化为urelumab获得的结合水平。
直接ELISA小鼠CD137
作为鉴定小鼠交叉反应性CD137结合物的第一步，进行了针对小鼠CD137的直接ELISA。为此目的，通过ELISA筛选B细胞克隆的细胞培养上清液中是否存在针对小鼠CD137的抗体。通过添加50μl含有250ng/ml小鼠CD137(Acro Biosystem，货号41B-M52H7)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween 20)洗涤3次，并向每个孔中加入270μl封闭缓冲液(PBS，1％BSA，0.2％Tween 20)，在室温下不振荡放置1小时。然后，将板以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次，并加入50μl每种上清液，将板在室温下轻轻搅拌孵育1.5小时。以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每个孔中添加1：5,000稀释在封闭缓冲液中的50μl的HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体。在室温下在nutating混合器上孵育1h后，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤三次，然后添加50μl TMB。显影5至10分钟后，通过每孔加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参照波长在450nm读板。在该测定中，来自85B细胞克隆的上清液产生了明显高于背景的信号(>0.1OD)。
通过SPR确定物种特异性：小鼠
还确定了与小鼠CD137的结合动力学，使用了与针对与人CD137的结合所描述的相同的设置，但在这种情况下，用小鼠CD137 ECD(Acro Biosystem，货号41B-M52H7)代替人CD137 ECD。
筛选命中的选择
根据B细胞上清液中单克隆抗体的药理特性，选择克隆38-27-A11用于命中物确认分析。表4列出了B细胞上清液中克隆38-27-A11的单克隆抗体的药理特性。在下一步中，使用选定的克隆进行RNA分离和RT-PCR，以扩增兔抗体轻链和重链可变区(38-27-A11)的序列。
表4.B细胞上清液中单克隆抗体的药效特性：38-27-A11。
Figure BDA0003007813170000771
表5. 38-27-A11兔IgG对人CD137亲和力测量的总结。
Figure BDA0003007813170000772
表6. 38-27-A11兔IgG对食蟹猴CD137亲和力测量的总结。
Figure BDA0003007813170000781
实施例4：单克隆抗体38-27-A11的药理学表征
4.1对人和食蟹猴CD137的亲和力
通过SPR测量确定了纯化的单克隆兔抗体38-27-A11与人和食蟹猴CD137的结合动力学(表5和6)。使用Biacore T200 SPR仪器(GE Healthcare)，通过SPR测量了抗体对人CD137的结合亲和力。关于实验设置，使用标准胺偶联方法，将对兔IgG的Fc区特异的抗体(Bethyl Laboratories，货号A120-111A)固定在传感器芯片(CM5芯片，GE Healthcare)上。捕获单克隆抗体后，将人CD137(PeproTech，货号310-15)或食蟹猴CD137(Acro Biosystem，货号41B-C52H4)以90至0.35nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离12分钟。使用一对一的Langmuir结合模型，用Biacore T200软件评估工具(GE Healthcare)计算表观解离常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)。
4.2重组兔IgG 38-27-A11的表位分箱
为了表征重组兔IgG 38-27-A11的结合表位，使用MASS-1仪器(Sierra Sensors)通过SPR进行表位分箱。通过使用这种方法，将兔IgG 38-27-A11在CD137上的结合表位与urelumab和utomilumab进行了映射。使用了一种三明治设置，以检查这些抗体是否阻断彼此与人CD137的结合。将兔IgG 38-27-A11加竞争剂IgG固定在高容量的胺传感器芯片(HCA，Sierra Sensors)上。然后，注射90nM的抗原CD137(PeproTech，货号310-15)，使其捕获在兔IgG 38-27-A11上，然后立即注射22.5的第二种抗体(竞争剂IgG)。确定每种兔IgG上的人CD137捕获水平和第二种结合物应答水平(应答单位，RU)。通过计算理论最大应答(Rmax)(这取决于所涉及的蛋白质的分子量和捕获水平)，确定了捕获的抗原上的蛋白质的相对结合水平(单位为％)。如果分子结合CD137上的相同表位或重叠(例如，在结构上相似或在空间上接近)表位，则不应观察到注射到捕获的CD137上的抗体的结合。因此，当观察到抗体结合时，两个抗体对结合非重叠的表位。确定每个抗体对的相对结合水平(％)。根据定义，结合水平低于10％表示在CD137上具有相同或重叠(例如，结构上相似或在空间上接近)表位，而高于30％则指非重叠的表位。IgG 38-27-A11不与utomilumab竞争对CD137的结合，表明不重叠的表位，而与urelumab竞争对CD137的结合，表明相同或重叠的表位(图1)。
4.3通过NF-kB报告基因检测CD137信号传导的激活
在NF-kB报告基因试验中评估了激活CD137聚集和随后CD137信号传导的效力。在该测定中，评估了NF-kB Jurkat报告细胞中CD137信号传导的激活。通过测量Jurkat报告细胞系中，由CD137诱导的NF-kB活化所驱动的荧光素酶表达来报告CD137信号传导的活性。此外，通过二价抗CD137兔IgG的结合，促进了CD137的聚集，而CD137的聚集是信号通路激活所需的。
详细地，将50,000个表达CD137的NF-kB报告基因Jurkat细胞(Promega)接种在96孔白色细胞培养板中。在测定缓冲液中制备了9,000至1.37ng/ml范围的兔IgG的三倍系列稀释液。向每种稀释液中加入2.5倍过量的交联抗体(山羊抗兔IgG Fc特异性抗体，Bethyl，货号A120-111A)。还在没有交联剂的情况下测量了每种兔IgG的最高浓度，以确定没有进一步聚集的抗体结合是否足以诱导CD137信号传导。将Urelumab作为阳性对照，包括在每个平板上，并且通过向每个稀释液中添加1.25过量的交联剂(兔抗人IgG Fc特异性抗体，Bethyl，货号A80-304A)来实现urelumab的交联。在不添加交联剂的情况下，也测量了urelumab的最高浓度，如对兔IgG所做的一样。将制备好的重组IgG和urelumab的系列稀释液添加到报告基因细胞中，并在37℃的潮湿细胞培养箱中孵育6小时。通过添加荧光素酶试剂来检测荧光素酶表达，并在抗CD137 IgG添加6小时后通过发光阅读器读取荧光素酶表达。通过将测试样品的相对发光单位(RLU)标准化为使用交联剂以最高浓度测量的lumlumab的RLU来分析数据。将标准化数据绘制为兔IgG浓度的函数，并通过使用S形四参数拟合进行拟合。报道了NF-kB信号的最大激活(相对于urelumab)、EC50值和相对EC50值(相对于urelumab)(表7)。
表7.在38-27-A11兔IgG的NF-kB报告基因检测中激活CD137信号的能力。
Figure BDA0003007813170000801
实施例5：兔IgG 38-27-A11的人源化
基于在命中物筛选期间获得的数据，通过将CDR移植到基于VH3的框架上从而将CD137结合剂38-27-A11人源化(表8)。根据AHo人源化方案，全移植物指定CDR移植片段和框架残基(CDR移植片段和可能与抗原接触的所有兔残基(根据AHo)的移植仅限于在交界面形成后溶剂可及性变化>20％的残基，以减少突变总数(兔框架残基))。
表8.兔IgG 38-27-A11的人源化。
Figure BDA0003007813170000802
设计密码子优化的核苷酸序列，并合成相应的基因，并将其克隆到哺乳动物表达载体中。表9总结了scFv分子的制备。使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过蛋白质L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
实施例6：人源化scFv的药效学表征
6.1对人CD137的亲和力
在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析确定了人源化scFvsPRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)对人CD137的亲和力。在该实验中，使用GE Healthcare的Human Antibody Capture试剂盒(货号BR-1008-39)捕获了Fc标记的人CD137(R&D Systems，货号838-4B-100)。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。使用相对于捕获的CD137的剂量响应多循环动力学测定法将scFv作为分析物注入，其中分析物的浓度范围为0.19至45nM(三倍稀释步进)，稀释于运行缓冲液中。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用1：1结合模型拟合获得的传感图。数据示于表10。
6.2物种交叉反应(通过SPR测定与食蟹猴CD137的结合)
用食蟹猴Fc标记的CD137(R&D Systems，货号9324-4B-100)以与用于测量与人CD137的结合的相似测定法测量了与食蟹猴CD137的交叉反应性。表11总结了scFvsPRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)的亲和力。
6.3通过竞争ELISA测定CD137/CD137L相互作用的中和
为了显示抗人CD137 scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11sc03)不会干扰CD137L与CD137的结合，采用了竞争性ELISA。使用商业抑制性多克隆抗CD137山羊抗体(Antibodies online，货号ABIN636609)作为参照。关于实验设置，将50ng/ml的人CD137(用Fc标记，R&D Systems，货号838-4B-100)在ELISA板上包被过夜，并向ELISA板中加入scFv的从50μg/ml开始、三倍步进的系列稀释液。之后，添加生物素化的CD137L(CD137L的内部生物素化，Acro Biosystem，货号41L-H5257)，并通过添加链霉亲和素-HRP检测结合的配体。最后，添加了HRP底物TMB。显影5分钟后，用1M HCl溶液终止反应。在450nm和690nm处测量吸光度作为参照波长。数据示于表12。
表9.ScFv生产总结表。
Figure BDA0003007813170000821
表10.scFv对人CD137的亲和力。
Figure BDA0003007813170000822
表11.scFv对食蟹猴CD137的亲和力
Figure BDA0003007813170000831
6.4通过流式细胞术确定与人CD137表达细胞的结合
确定PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)与人CD137表达细胞的结合力。将50,000个表达CD137的Jurkat细胞(或作为参照细胞系的缺乏CD137表达的Jurkat细胞)分配到圆底非组织培养处理的96孔板中。通过以400x g离心5分钟，将细胞用100μl PBS洗涤两次。将细胞重悬于100μl的测试scFv以及对照IgG urelumab的五倍步进的系列稀释液中，该系列稀释液是在染色缓冲液(PBS，2％BCS热灭活，2mM EDTA)中制备的，浓度范围为10,000至0.64ng/ml(对于scFvs：从381.19至0.02nM)。在nutating混合器上于4℃孵育1小时后，将细胞用100μl染色缓冲液洗涤3次，并以400x g离心5分钟。然后，将用scFv处理过的细胞重悬于100μl含0.5μg/ml APC标记的蛋白质-L的染色缓冲液中，并将用urelumab(人IgG4)处理过的细胞重悬于100μl含2μg/ml APC标记的山羊抗人IgG的染色缓冲液中。将板在nutating混合器上于4℃孵育1小时，然后用100μl染色缓冲液洗涤3次，然后重悬于最终体积为50μl的染色缓冲液中。最后，使用Novocyte流式细胞仪系统(ACEABioscience)通过流式细胞术分析每孔20,000个事件的APC信号。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参照分子urelumab的IC50进行校准(相对EC50：EC50,urelumab/EC50，测试scFv)。数据总结在表13和图3中。
6.5通过SPR测试对CD137与CD40和OX40的选择性
除了对食蟹猴CD137的交叉反应性之外，还需要抗人CD137 scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)与人CD137结合而不与TNFR超家族的其他成员(如CD40和OX40)结合的选择性。因此，测试了PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)与人CD40和OX40的结合。在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析确定了scFv与人Fc标记的CD40(AcroBiosystems，货号CD0-H5253)和人Fc标记的OX40(Acro-Biosystems，货号OX0-H5255)的结合。在该实验中，使用GE Healthcare的AntibodyCapture试剂盒捕(货号BR-1008-39)获了Fc标记的CD40和OX40。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。将scFv作为分析物注入，使用在运行缓冲液中稀释的高浓度180nM分析物。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用1：1结合模型拟合获得的传感图。数据总结于表14。
表12.所选scFvs抑制CD137和CD137L之间相互作用的效力。
Figure BDA0003007813170000841
表13.测试scFv对细胞CD137结合效力的总结。
Figure BDA0003007813170000842
Figure BDA0003007813170000851
表14.通过SPR测试ScFv与人CD40和OX40的结合。
Figure BDA0003007813170000852
实施例7：人源化scFv的生物物理表征
纯化后，使用离心浓缩管将scFvs PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)浓缩至>10mg/mL(表15)。对scFv进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(含有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液，pH6.4)中，并在-80℃、4℃和40℃储存四周。至少在每次研究的一周、两周和完成后，通过SE-HPLC峰面积的积分来评估制剂中单体和低聚物的比例。
表16比较了研究的第7天和第28天得出的终点测量值。此外，还针对冷冻-融化(F/T)循环评估了scFv分子的相容性(胶体稳定性)。为了进行F/T稳定性评估，采用与存储稳定性研究相同的分析方法(SE-HPLC,UV-Vis)和参数(单体含量％和单体损失％)来监测分子随着五个F/T循环的质量。
表17示出了随着五个重复F/T循环的单体含量损失(％)。重复F/T循环后，没有一个分子的单体含量损失>2％。通过使用荧光染料SYPRO orange评估了分子的热解折叠。制备了相关赋形剂条件下的样品，并在qPCR仪中进行了测定。使用该软件的自定义染料校准程序检测了荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算解折叠转变的中点(Tm)。报告的Tm是三个测量值的平均值。
表18显示了在通用缓冲液(50mM，pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)中配制的分子的解链温度。使PRO1359(38-27-A11 sc02)和PRO1360(38-27-A11 sc03)进行短期pH应力稳定性研究，其中将scFv分子以1mg/ml配制在一组pH值在3.5和7.5之间的水性(柠檬酸)缓冲体系中。在各自的缓冲系统中于4℃和40℃储存2周后，分析单体含量(％)和单体损失％。
表19示出了研究过程中单体含量、单体损失、浓度和浓度损失的列表总结。
表15.制备结构域用于稳定性研究。
Figure BDA0003007813170000861
表16.scFv结构域的4周稳定性研究。
Figure BDA0003007813170000862
表17.在28d天的时间内对F/T稳定性的评估。
Figure BDA0003007813170000871
*F/T后的单体损失％
表18.scFv结构域的差示扫描荧光法。
Figure BDA0003007813170000872
表19.pH稳定性评估的表格总结。
Figure BDA0003007813170000873
Figure BDA0003007813170000881
实施例8：通过溶液中CD137 ECD变体的复合物形成分析的表位作图。
在这项研究中，根据各种CD137 ECD变体的注释结构基序，即富含半胱氨酸的结构域(CRD)和靠近膜的茎，设计了各种CD137 ECD变体(UniProtKB，Q07011；图4A)：
>sp|Q07011|CD137 ECD|aa 24-186胞外结构域*
LQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICS CRD1：24至46位氨基酸
PCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAEC CRD2：47至86位氨基酸
DCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCK CRD3：87至118位氨基酸
DC CFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNG TKERDVVCGP CRD4：119至160位氨基酸
SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQ 茎：161至186位氨基酸
*CD137(UniProt登录号：Q07011；CD137的完整序列参见SEQ ID NO：32)的胞外结构域，范围为24至186位氨基酸，由4个富含半胱氨酸的结构域(CRD1至4个)和一个与膜相邻的茎组成。带下划线的残基指示utomilumab的表位位于其中的氨基酸序列(WO 2012/032433)。
基序组合(图4B)在N末端连接PreScission蛋白酶位点(3C位点)和人铰链-Fc结构域。膜近端基序CRD4和茎始终总是排外地内置在一起。结合分析中总共包括八个CD137 ECD变体和PRO1480(图4，表20)。使用瞬时CHOgro表达系统(Mirus)在FreeStyle CHO-S细胞中进行蛋白质表达。对目的基因进行了哺乳动物表达优化，合成并克隆到标准pcDNA3.1载体中。信号序列源自小鼠重链IgG。将表达培养物在37℃下分批培养6至7天(细胞活力<70％)，或在37℃下培养一天，然后将温度转为32℃持续5至6天。离心分离培养上清液，然后0.45μm过滤。通过Protein L亲和层析(针对PRO1480)或Protein A亲和层析(针对CD137 ECD变体)，然后进行尺寸排阻层析，从澄清的培养上清液中捕获目标蛋白。在结合实验中，将PRO1480与每个CD137 ECD变体以等摩尔比，以比KD高至少500倍的浓度孵育。通过SE-HPLC对复合物相对于单个蛋白质的保留时间偏移分析进行结合评价——是或否。结果总结在表21中。
表20.表达构建体序列。
Figure BDA0003007813170000891
Figure BDA0003007813170000901
Figure BDA0003007813170000911
表21.PRO1480与各种CD137 ECD变体结合的总结。
Figure BDA0003007813170000912
包含本发明抗体的多特异性分子
表3包括了包含本发明抗体的示例性多特异性分子。PRO1480和PRO1481分别来自38-27-A11 sc02和38-27-A11 sc03。
实施例9：对PDL1、CD137、HSA和MSA的亲和力。
使用Biacore T200设备(GE Healthcare)通过SPR测量确定了对PDL1的亲和力。在该实验中，使用GE Healthcare(货号BR-1008-39)的Human Antibody Capture试剂盒捕获来自不同物种的带有Fc标签的PDL1。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。对于所有形式，使用剂量响应多循环动力学测定法将多特异性分子作为分析物注入，其中分析物的浓度范围为0.18至45nM(二倍稀释步进)，稀释于运行缓冲液中。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用一对一的Langmuir结合模型计算表观解离常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)。使用与PDL1相同的设置确定对不同物种的CD137的亲和力，不同的是固定抗体捕获了不同物种的CD137-Fc嵌合蛋白。含Fc的形式被对人IgG的Fc区具有特异性的抗体直接捕获。测试了PDL1胞外结构域或CD137胞外结构域(范围从90到0.35nM)的两倍系列稀释液与生物传感器芯片上捕获的IgG的结合。每个注射循环后，用一次注射3M MgCl2溶液使表面再生。使用Biacore T200设备(GE Healthcare)通过SPR测量确定了分子与不同物种的血清白蛋白(SA)的亲和力。使用胺偶联化学试剂将SA直接偶联至CM5传感器芯片(GE Healthcare)。在执行再生搜寻和表面性能测试以找到最佳测定条件后，测量剂量响应，并将获得的结合曲线进行双参照(空参照通道和零分析物进样)并使用1：1Langmuir模型拟合以获取动力学参数。该测定在pH 5.5的1X PBS-Tween缓冲液中进行。
表22汇总了获得的数据。对源自克隆38-27-A11的CD137特异性人源化构建体的结合动力学的测量显示出几乎相同的亲和力(比较表22中的克隆38-27-A11的CDR移植片段、PRO1480和STR移植片段PRO1481)。
实施例10：通过使用表达CD137的转NF-kB Jurkat报告细胞系的基于细胞的测定对抗PDL1xCD137分子的CD137激动作用的评估。
在该测定中，评估了Jurkat细胞中CD137信号传导的激活。通过测量Jurkat报告细胞系中，由CD137诱导的NF-kB活化所驱动的荧光素酶表达来报告CD137信号传导的活性。荧光素酶的表达与CD137的活性直接相关。而且，随后在Jurkat细胞和表达PDL1的细胞系之间形成免疫突触会促进激活信号传导途径所需的CD137的聚集。因此，报告细胞系上CD137的聚集和激活需要PDL1表达。将HCC827细胞用10ng/ml IFNγ刺激24小时以增加PDL1表达，接种于96孔培养板上，每孔25,000个细胞。然后，制备抗PDL1xCD137分子以及竞争剂urelumab的系列稀释液，并将其添加到细胞。接下来，在含有或不含25mg/ml HSA的测定培养基中制备Jurkat报告细胞，并以每孔40,000个细胞的细胞密度添加。添加Jurkat细胞后6或24小时，通过添加荧光素酶试剂来检测荧光素酶的表达，并由发光读取器读取。通过将测试样品的相对发光单位(RLU)相对于PRO885(图5)测得的RLU进行标准化来分析数据，从而得到CD137信号传导的相对激活值。如图5和表23所示，衍生自克隆38-27-A11的scDb-scFvsPRO1480和PRO1481能够刺激CD137信号传导。
表22.不同形式对不同物种的PDL1、CD137和血清白蛋白的亲和力。
Figure BDA0003007813170000931
NA：不适用
TBD：待确定
NB：无显著结合
ND：未确定
表23.PDL1 x CD137多特异性构建体激活NF-kB报告基因。
Figure BDA0003007813170000932
ND：未确定
&：IC50，PRO1186(ng/ml)/IC50，测试分子(ng/ml)
实施例11：使用超抗原SEA刺激的人PBMC在基于细胞的测定中对同时发生的PDL1阻断和CD137刺激的刺激作用的评估。
在该实验中，评估了PD-1/PDL1抑制和CD137激动的协同作用。该测定法使用了外周血单个核细胞(PBMC)，这些外周血单个核细胞(PBMC)经超抗原葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)刺激，以分别诱导
NA：不适用PDL1在抗原呈递细胞(APC)和T细胞上的表达以及CD137在T细胞上的表达。通过应用抗PDL1xCD137分子，同时靶向了两个T细胞调节信号传导途径：通过三特异性抗PDL1xCD137xHSA分子(PRO1480)介导的免疫突触的形成来抑制抑制性PD-1/PDL1途径以及激活CD137途径。通过白介素2(IL-2)的分泌评估T细胞的活化，并与参照分子阿维鲁单抗和urelumab的混合物介导的PDL1抑制介导的效应进行比较。
通过密度梯度离心从新鲜的人全血中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。然后，使用抗CD56抗体和MACS细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)去除PBMC中的NK细胞。接下来，向96孔板中每孔添加100,000个PBMC，然后添加PRO1480或urelumab和阿维鲁单抗的组合在测定缓冲液(含有浓度为10ng/ml的SEA)中的系列稀释液。在37℃和5％CO2下孵育96小时后，收集细胞上清液，并使用BioLegend的IL-2人ELISA MAX测定法，根据试剂盒说明，定量培养上清液中的人白细胞介素2(IL-2)水平。从IL-2标准曲线中插值IL-2浓度，反向计算，并绘制阿维鲁单抗/urelumab组合和PRO1480浓度曲线，以计算EC50值。
如图6所示，在通过加入PRO1480而同时阻断PD-1/PDL1相互作用并刺激CD137之后，T细胞分泌IL-2。与阿维鲁单抗和urelumab的组合相比，PRO1480显示出更高的T细胞活化性和更好的效力。该发现表明，与参照分子阿维鲁单抗和urelumab的混合物相比，三特异性抗PDL1xCD137xHSA scDb-scFv PRO1480能够诱导更强的T细胞刺激。
实施例12：同时发生PDL1阻断和CD137刺激的刺激作用的表位依赖性。
通过比较具有不同抗CD137抗体片段的两种构建体的刺激作用来重复实施例11。如图7所示，其显示了来自三到四个独立实验系列中单个代表性实验的数据，在通过添加PRO1480和PRO1186而同时阻断PD-1/PDL1相互作用并刺激CD137之后，T细胞分泌IL-2(参见实施例10)。与靶向CD137 ECD的CRD4上的膜近端表位的PRO1186(参见图9(B))相比，PRO1480靶向CD137 ECD的CRD1和CRD2上的膜远端表位(参见图9(A))，其显示出更高的最大T细胞活化性，这可以由IL-2分泌更高和效力更高证明(图8，其显示了所述的三至四个独立实验系列的合并结果)。该发现表明，与靶向非远端表位的分子相比，靶向膜远端表位的三特异性抗PDL1xCD137xHSAscDb-scFv PRO1480能够诱导更强的T细胞共刺激。
实施例13：表位的确定
PRO1359单独和与4-1BB的ECD结合时的结构测定。
在CHO细胞中瞬时表达scFv(PRO1359)，并使用Capto-L树脂(GE-Healthcare)从收获物中纯化。使用Superdex 75尺寸排阻色谱柱(GE-Healthcare)将蛋白质精制至高单体含量。
表达4-1BB(Uniprot：Q07011)的残基24-160，具有N端分泌序列和C端无铰链Fc标签，包括IdeS切割位点[Novarra,S.,等人,A hingeless Fc fusion system for site-specific cleavage by IdeS.mAbs,2016.8(6):p.1118-1125]。在CHO细胞中瞬时表达融合蛋白，并使用蛋白A树脂(GE Healthcare)从细胞上清液中捕获。在37℃用IdeS切割Fc标签，并使用蛋白A珠去除。
抗4-1BB scFv PRO1359的结晶
将抗4-1BB scFv在25mM Hepes，100mM NaCl，pH 6.7中浓缩至10mg/ml。通过坐滴蒸汽扩散技术以母液与蛋白质的比例为1：1来筛选结晶条件。在0.1M Tris pH 8.5、2MNH4H2PO4中长出晶体，并通过向母液中添加100％乙二醇至终浓度20％进行冷冻保护。
抗4-1BB scFv PRO1359与4-1BB的ECD的复合物的结晶。
通过混合等摩尔比的两种蛋白质，然后在50mM Hepes，100mM NaCl，pH 6.7中用Superdex 75尺寸排阻色谱柱进行复合纯化，从而形成复合物。
将对应于复合物的级分浓缩至10mg/ml。在20℃在0.1M乙酸钠、pH 5.5、22％PEG2000 MME、0.17M至0.23M乙酸钙以及等体积的母液和复合物中通过坐滴蒸汽扩散来生长初始晶体。使用SeedBeads(Hampton Research)将晶体压碎，并在随后的结晶筛选中用作晶体种子。
最终晶体在20℃的0.1M Tris乙酸盐pH 8.5、1M甲酸钠、25％PEG2000MME中生长，母液与蛋白质与种子的比例为1：1：0.125。将晶体在80mM Tris乙酸盐pH 8.5、0.8M甲酸钠、22.4％PEG2000 MME、20％乙二醇中冷冻保护，并在液氮中冷冻。
衍射实验及结构解析
在瑞士维林根的Paul-Scherrer研究所的Swiss Light Source处收集了单独的scFv以及与4-1BB结合的本地数据集。scFv在空间群P65中结晶并使用XDS进行了处理，分辨率为
Figure BDA0003007813170000961
该复合物在空间群I222中结晶，并使用XDS进行了处理，分辨率为
Figure BDA0003007813170000962
[Kabsch,W.,XDS.Acta Crystallographica Section D,2010.66(2):p.125-132.]。
通过使用内部研发的scFv模型，用Phaser进行分子替换，解析了scFv的结构[McCoy,A.J.,等人,Phaser crystallographic software.Journal of AppliedCrystallography,2007.40(4):p.658-674]。使用scFv apo结构和4-1BB简化模型(pdb代码：6BWV，链D)通过分子置换，解析了复合物的结构。
优化
使用Refmac对结构进行了优化[Murshudov,G.N.,A.A.Vagin,and E.J.Dodson,Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method.ActaCrystallographica Section D,1997.53(3):p.240-255.]。在Coot中执行了人工模型的建立[Emsley,P.,等人,Features and development of Coot.Acta CrystallographicaSection D,2010.66(4):p.486-501.]。
将apo结构优化至分辨率为
Figure BDA0003007813170000964
残基1-110和128-251由电子密度很好地界定，最终Rwork/Rfree值为15.8％/18％。类似地，将复合物结构优化至分辨率为
Figure BDA0003007813170000963
对于CD137，在电子密度中可见残基24-158，而残基139-149和156-158仅被很弱地界定。scFv良好地界定了残基3-109和131-252。将复合物优化至Rwork/Rfree值为19.2％/23.5％。
交界面说明
CD137表位
使用欧洲生物信息学研究所的PISA服务分析了结合交界面[Krissinel,E.andK.Henrick,Inference of Macromolecular Assemblies from CrystallineState.Journal of Molecular Biology,2007.372(3):p.774-797.]。CD137的表位位于第一和第二半胱氨酸富集结构域(CRD)中。结合scFv时掩埋的可及表面积为
Figure BDA0003007813170000971
(参见表26)。关键残基在表24中列出。氢键网络汇总在表25中。
表24.参与与scFv结合的CD137残基
Figure BDA0003007813170000981
表25.CD137和PRO1359之间的氢键概述
Figure BDA0003007813170000991
*如果突变为丙氨酸，亲和力降低>1000倍
表26.结合交界面的总结
Figure BDA0003007813170000992
Figure BDA0003007813170001001
SEQUENCE LISTING
<110> 努玛治疗有限公司
<120> 靶向CD137的抗体及其使用方法
<130> 115159P877PC
<150> EP18199334.6
<151> 2018-10-09
<150> EP19166283.2
<151> 2019-03-29
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Tyr Pro Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn Trp Thr
1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu
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<223> 基于人工抗体的序列
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Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Tyr
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<223> 基于人工抗体的序列
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Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn Trp Thr Lys
1 5 10 15
Gly
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<223> 基于人工抗体的序列
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Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp
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Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn Trp Thr
1 5 10 15
Lys
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<223> 基于人工抗体的序列
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Gly Gly Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 14
Glu Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 15
<211> 122
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp Ala Asn
50 55 60
Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 17
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 18
Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp Gly Asn Ala
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 19
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
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<210> 20
<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 20
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
1 5 10
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 21
Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp Gly Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 22
Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 23
Ser Ala Ser
1
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 24
Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp Gly Asn
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<213> 人工序列
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<223> 基于人工抗体的序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp
85 90 95
Gly Asn Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
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Asp Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp
85 90 95
Gly Asn Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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<211> 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp
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Gly Asn Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 29
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Asp
85 90 95
Gly Asn Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
145 150 155 160
Ala Asn Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp
180 185 190
Ala Asn Trp Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp
225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 30
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 30
Asp Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Asn Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Ser Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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225 230 235 240
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 31
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Asn Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
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Ala Asn Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Asp
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195 200 205
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210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Trp Tyr Ser Gly Trp Gly Gly Asp
225 230 235 240
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 32
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
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35 40 45
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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<213> 智人
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<211> 11
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<213> 智人
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<400> 39
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 40
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Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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325 330 335
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340 345 350
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
370 375 380
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
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<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 41
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Phe Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Tyr Pro Cys Trp Val Arg Gln Ala
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Phe Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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340 345 350
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<210> 42
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 42
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660 665 670
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675 680 685
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740 745 750
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<210> 43
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 43
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Val Tyr Gly Tyr Ala Asn Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
260 265 270
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
275 280 285
Ser Gln Ser Ile Asn Asn Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
290 295 300
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
305 310 315 320
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
325 330 335
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
340 345 350
Ser Ser Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
355 360 365
Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
370 375 380
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val
385 390 395 400
Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser Asp Tyr Trp Ile Tyr Trp Ile Arg Gln
405 410 415
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Gly Gly Ser
420 425 430
Ser Gly Asn Thr Gln Tyr Ala Ser Trp Ala Gln Gly Arg Val Thr Ile
435 440 445
Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val
450 455 460
Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Val Asp
465 470 475 480
Tyr Gly Gly Ala Thr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
485 490 495
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Val Met Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
515 520 525
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg Ser Ala Trp Tyr Gln
530 535 540
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys
545 550 555 560
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
565 570 575
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
580 585 590
Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala Phe Gly
595 600 605
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
610 615 620
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
625 630 635 640
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
645 650 655
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile
660 665 670
Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys
675 680 685
Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
690 695 700
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
705 710 715 720
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
725 730 735
Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
740 745 750
Leu Val Thr Val Ser Ser
755
<210> 44
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人工抗体的序列
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ile Ile Thr Asp
85 90 95
Ile Asp Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
115 120 125
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser
130 135 140
Phe Ser Asn Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145 150 155 160
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser
180 185 190
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Asp Ala Val Tyr Gly
210 215 220
Tyr Ala Asn Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
260 265 270
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile
275 280 285
Asn Asn Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
290 295 300
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
305 310 315 320
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
325 330 335
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Tyr Gly
340 345 350
Asn Tyr Gly Asp Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
370 375 380
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser
385 390 395 400
Phe Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
405 410 415
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Val Ala Gly Ser Val Asp Ile Thr
420 425 430
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser
435 440 445
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
450 455 460
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Ala Tyr Ser Asp Ala Phe
465 470 475 480
Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
485 490
<210> 45
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 45
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe
20 25 30
Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser
35 40 45
Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys
50 55 60
Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala
65 70 75 80
Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser
85 90 95
Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly
100 105 110
Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile
115 120 125
Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val
130 135 140
Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp
145 150 155 160
Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu
165 170 175
Pro Gly His Ser Pro Gln Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu Glu
180 185 190
Val Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
195 200 205
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
210 215 220
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
225 230 235 240
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
245 250 255
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
260 265 270
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
275 280 285
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
290 295 300
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
305 310 315 320
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
325 330 335
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
355 360 365
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
370 375 380
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
385 390 395 400
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
405 410 415
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425
<210> 46
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 46
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe
20 25 30
Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln
35 40 45
Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
50 55 60
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
65 70 75 80
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
85 90 95
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
100 105 110
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
115 120 125
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
130 135 140
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
145 150 155 160
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
165 170 175
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
180 185 190
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
195 200 205
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
210 215 220
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
245 250 255
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 47
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 47
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe
20 25 30
Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser
35 40 45
Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys
50 55 60
Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala
65 70 75 80
Glu Cys Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys
85 90 95
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
100 105 110
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
115 120 125
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
130 135 140
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
145 150 155 160
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
165 170 175
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
180 185 190
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
210 215 220
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
225 230 235 240
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
245 250 255
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
260 265 270
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
275 280 285
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
290 295 300
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310 315
<210> 48
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 48
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe
20 25 30
Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser
35 40 45
Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys
50 55 60
Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala
65 70 75 80
Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser
85 90 95
Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly
100 105 110
Cys Lys Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 49
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 49
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln
20 25 30
Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg
35 40 45
Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly
50 55 60
Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys
65 70 75 80
Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly
85 90 95
Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys
100 105 110
Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp
115 120 125
Val Val Cys Gly Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 50
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 50
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys
20 25 30
Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys
35 40 45
Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly
50 55 60
Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu
65 70 75 80
Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Leu Glu Val
85 90 95
Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
115 120 125
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
130 135 140
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
145 150 155 160
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
165 170 175
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
180 185 190
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
195 200 205
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
210 215 220
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
225 230 235 240
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
245 250 255
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
290 295 300
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 51
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 51
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly
20 25 30
Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu
35 40 45
Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Leu Glu Val
50 55 60
Leu Phe Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
65 70 75 80
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
85 90 95
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
100 105 110
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
115 120 125
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
130 135 140
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
145 150 155 160
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
165 170 175
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
180 185 190
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
195 200 205
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
210 215 220
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
225 230 235 240
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
245 250 255
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
260 265 270
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
275 280 285
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290 295
<210> 52
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体，包含CD137胞外结构域
<400> 52
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln
20 25 30
Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg
35 40 45
Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly
50 55 60
Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys
65 70 75 80
Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Leu Glu Val Leu Phe
85 90 95
Gln Gly Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325

Claims (19)

1.对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含：分别与SEQ ID NO：1、2和3的序列具有至少90％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，分别与SEQ ID NO：16和18的序列具有至少90％同一性的LCDR1和LCDR3序列，以及与SEQ ID NO：17的序列具有至少85％同一性的LCDR2序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含：分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变区，其包含与选自SEQID NO：13、14和15，优选SEQ ID NO：13和15，更优选SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：25、26和27，优选SEQ ID NO：25和27，更优选SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其包含：(a)SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；(b)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：26的VL序列；或(c)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列。
5.前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体不抑制CD137与其配体CD137L之间的相互作用，特别是如通过竞争ELISA所测定的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(i)与人CD137结合的解离常数(KD)小于50nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，如通过表面等离振子共振测量的；
(ii)任选地，与食蟹猴CD137结合的KD小于50nM，特别是小于10nM，更特别是小于5nM，如通过表面等离振子共振测量的；
(iii)任选地，不结合人CD40和/或不结合人OX40，特别是如通过SPR测量的；
(iv)当为scFv形式时，所述抗体的解链温度(Tm)为至少50℃，例如至少55℃，优选至少60℃，更优选至少64℃，如通过差示扫描荧光法测定的，特别地，其中将所述抗体配制在pH6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中；
(v)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，在4℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于7％，例如小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，优选小于2％，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中；和/或
(vi)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，在5个连续的冻融循环后，所述抗体的单体含量损失小于5％，优选小于3％，更优选小于1％，特别地，其中将本发明的所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中。
7.前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述分离的抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于替代骨架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody Technology)，优选Fv或scFv。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述scFv具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，优选SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31，更优选SEQ ID NO：29。
9.一种分离的抗体，其中所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位位于CD137胞外结构域远端部分，特别是在富含半胱氨酸的结构域CRD1和/或CRD2内，更特别是在SEQ ID NO：32的氨基酸残基24-86内，条件是CD137的氨基酸残基Asn42不是结合的关键残基。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，包括残基Arg 41、Gln43、Cys45、Pro49、Ser52和Ser80，如根据实施例13测定的。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体，其中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，这一组关键残基还包括残基Ala33、Asn40和Cys48，如根据实施例13测定的。
12.根据权利要求11所述的分离的抗体，其中，所述抗体在一个表位处结合人CD137胞外结构域，所述表位的特征是一组关键残基，这一组关键残基还包括残基Pro32、Gly34、Thr35、Ser46、Pro47、Pro50、Cys78和Ser79，如根据实施例13测定的。
13.前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是多特异性分子，特别是具有至少第二功能分子的多特异性分子。
14.一种药物组合物其包含权利要求1至13中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
15.权利要求1至13中任一项所述的抗体，或权利要求14所述的组合物，其用作药物。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，或权利要求14所述的组合物，其用于制造用于治疗癌症的药物。
17.一种核酸，其编码权利要求1至13中任一项所述的抗体。
18.一种生产权利要求1至13中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码权利要求1至13中任一项所述的抗体的核酸或载体。
19.一种试剂盒，其包含权利要求1至13中任一项所述的抗体，或权利要求14所述的组合物。
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