CN110172099B - 抗lag-3人源化单克隆抗体分子，抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

抗lag-3人源化单克隆抗体分子，抗原结合片段及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗人LAG‑3抗体、其抗原结合片段及其医药用途。具体地，本发明涉及包含所述抗人LAG‑3抗体CDR区的鼠源抗体，嵌合抗体、人源化抗体，全人源化抗体，包含所述抗体及其抗原结合片段单独和或联合其它药物，包含PD‑1抗体的联合，激活人T细胞作用，以及其单独和或包含所述抗体、抗原结合片段的药物组合物，特别是和PD‑1抗体组合作为抗癌药物的用途，尤其是和PD‑1抗体药物联合用于肿瘤免疫治疗提高PD‑1抗体疗效，以及治疗PD‑1耐药的肿瘤病人。

Description

抗LAG-3人源化单克隆抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
技术领域
本发明涉及一种新的抗人LAG-3单克隆抗体，人源化单克隆抗体，抗原结合片段以及其单独或者联合PD-1抗体的用途，包含所述LAG-3抗体的CDR区的鼠源抗体，鼠源抗体可变区和人抗体恒定区的嵌合抗体、人源化抗体，全人源化抗体，以及包含所述抗体及其抗原结合片段激活人T细胞作用，以及其单独或药物组合物，特别是和PD-1抗体组合作为抗癌药物的用途。
背景技术
肿瘤治疗领域近年取得的重大突破当推肿瘤免疫治疗药物发现并上市。针对免疫检查点细胞程序性死亡受体-1（PD-1）及其受体PD-L1为靶点的抗体药物自2014年起，先后已经有5款药物被批准上市。其中BMS的Opdivo和Merck 的Keytruda 近期（2018.6,2018.7）分别获批在中国上市。 这几款抗体药物2017年销售总额已接近100亿美元大关。遗憾的是PD-1/PD-L1抗体药物只能对部分病人有效，还有大量的病人没有办法从这些药物中获益。此外，开始对PD-1抗体药物治疗有效的病人中，有些病人会产生耐药性。因此探索新的治疗方法，寻找新的肿瘤免疫治疗药物以及药物联合，是巨大的尚未满足病人临床治疗之急需。
T细胞是免疫治疗的中心，能否有效地调控T细胞是免疫治疗能否有效的关键因素之一。 PD-1抗体药物就是针对T细胞免疫检查点以恢复T细胞的免疫功能而发挥抗肿瘤作用。 寻找适合的和PD-1抗体联合的药物，组合方式以更好发挥PD-1抗体疗效，是提高PD-1抗体疗效、克服耐药性的方式之一。在可能的药物组合中，新的免疫检查点抗体和PD-1抗体药物组合是可能的方向之一。事实上，抗PD-1抗体Opdivo 和抗CTLA-4 （细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4）抗体联用已经被批准用于治疗黑色素瘤。最近（2018年ASCO年会）又有新的免疫检查点抗体联合治疗提高PD-1抗体疗效的临床数据公布。
围绕着PD-1展开联合治疗，试图提高PD-1抗体免疫治疗疗效，克服耐药性的众多新的免疫检查点靶点中，淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte Activation Gene 3，LAG-3，CD223)是很有希望的新靶点之一。LAG-3是免疫球蛋白超基因家族的一员，其在结构上以及遗传上与CD4有关。类似于CD4，LAG-3己被证明与MHC II类分子进行相互作用。它同 CTLA-4和PD-1一样，是T细胞负性共刺激分子(抑制共受体)， 是一种独立的负调节分子。LAG-3分子负调节T细胞扩增和控制记忆性T细胞。这种调节功能不是与CD4分子竞争性的结合MHCII类分子。树突状细胞膜表面的LAG-3分子则参与活化DC，还可以通过与T细胞表面的MHCII类分子相互结合促进细胞因子分泌，具有调节树突状细胞的能力，是一种抗原提呈细胞(APC)的活化剂。
LAG-3在不同细胞，包括T细胞，B细胞，NK细胞，浆细胞样DC等中表达, 在激活T细胞中高表达。高表达的LAG-3和MHCII结合，抑制了T细胞活性，增强肿瘤免疫逃逸和调节T细胞（Treg）进入肿瘤微环境。同时表达LAG-3是记忆T细胞的特征之一。因此，LAG-3抑制剂的研究成为肿瘤免疫治疗的热点。 特别是新的抗LAG-3抗体，以及其和PD-1抗体联合，提高PD-1抗体疗效的研究，尤为引起关注。临床数据支持抗LAG-3抗体单独或和PD-1抗体联用具有显著的抑制肿瘤的功效。在多种癌症类型的患者中，如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)表达LAG-3，这与癌细胞侵略性的临床特征关联。阻断LAG-3则可以逆转LAG-3对T细胞的抑制作用，恢复CD8+ T细胞增值和活性，并减少调节性T细胞数量，还可提高T细胞免疫应答的敏感度。和PD-1抗体的阻断作用协同恢复T细胞免疫功能抑制肿瘤。
BMS开发的抗人LAG-3抗体BMS-986016用于癌症治疗，处于临床I/II期， 是目前研发进展最快的抗LAG-3抗体。最新的数据（2017.9公布）显示BMS-986016联合PD-1抗体，有效率比PD-1抗体单独疗效提高了3倍 （由5%提高到18%）。这些数据表明在PD-1信号抑制的基础上联用T细胞受体其它通路抑制剂，比如抗LAG-3抗体能显著增强PD-1抗体的疗效。可以预见抗LAG-3抗体，特别是联合PD-1抗体，将在肿瘤的免疫治疗方面发挥重要作用，为巨大的未满足的肿瘤患者临床需求提供新的治疗选择。
本领域已有的抗LAG-3抗体类型有限，需要更好的抗LAG-3抗体，人源化抗体，包括结合活性更好，结合特点差异化，和PD-1联合更好的激活T细胞的抗LAG-3抗体，以期能在临床上看到更好的临床药效或者满足更多的不同病人的临床需求。
本发明通过大量的优化创新筛选，得到优选抗人LAG-3的抗体，包括具有共同特点的一类至少两个抗体，这类抗体轻、重链同源性高，且具有共同的结合活性好的特点。本发明提供了一类结合人LAG-3的鼠源抗体，人源化抗体等。它们和人LAG-3结合活性更好，和非人灵长类LAG-3结合具有不同于人LAG-3的结合特点或位点，单独或联合PD-1抗体均显示很好的激活人T细胞活性功能，和PD-1抗体联合提高PD-1抗体激活T细胞活性。本发明抗体这些特点为其单独或者联合PD-1抗体在临床上提高PD-1抗体疗效，克服PD-1抗体治疗产生的耐药性等提供了更好的选择和可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中，针对LAG-3抗体临床治疗可选择的抗体数量少，提供一种结合活性更好，结合特性不同的抗人LAG-3抗体，这类抗体单独或者联合PD-1抗体激活人T细胞活性好，为肿瘤治疗提供了不同的选择和更好的药效。还可通过联合PD-1抗体，提高PD-1抗体单独的疗效，克服PD-1抗体产生的耐药性等。
发明人通过用LAG-3抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创造性地建立抗原位点特异筛选方法，包括设立不同的ELISA筛选，针对LAG-3不同的胞外区域，包括完整的LAG-3胞外区（ECD），和部分胞外区域1、2 (Domain 1 and 2, 简称D12)，ECD以及D12的单体和二聚体形式的抗原ELISA筛选，得到一类至少两株分泌抗人LAG-3单克隆抗体的杂交瘤克隆。从中提取了抗体序列，所得两株抗体序列高度同源，结合活性相似。创造性地人源化方法对所发现的鼠源抗LAG-3抗体进行人源化设计，包括在众多的可能影响活性的氨基酸位点上，设计不同回复突变组合，进行高效筛选， 得到了一类人源化抗人LAG-3抗体，其结合活性好，和非人灵长类LAG-3不同的结合特性，反应了该抗体不同的结合位点特点，单独或者和PD-1抗体联合能有效地激活人T细胞，提高单独PD-1抗体激活人T细胞的活性。本发明所述新的抗人LAG-3抗体这些特点使其单独和联合PD-1抗体可能提高PD-1抗体临床疗效，克服PD-1抗体临床治疗耐受等。
本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明提供一种能和人淋巴细胞活化基因-3(hLAG-3)蛋白特异结合的抗体分子或其结合片段，其包含至少1个选自以下抗体互补性决定区（CDR）序列或其突变序列：
对于轻链可变区(VL)：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 23或SEQ IDNO: 24所示的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 25所示的VLCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸序列；
对于重链可变区(VH)：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO: 15、SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30所示的VHCDR3氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 11所示的VLCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 25所示的VLCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 21所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 22所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 29所示的VHCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 30所示的VHCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 9 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 11 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 12 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 10 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 11 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 12 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 23 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 25 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 26 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 24 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 25 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 26 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 13 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 15 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 13 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 16 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 14 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 15 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 14 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 16 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 18 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 15 的 VHCDR15 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 18 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 16 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 13 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 19 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 14 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 19 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 20 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 22 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 21 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 22 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 17 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 27 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 28 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 29 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO: 27 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 28 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 30 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 15所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 14所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 22所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 9所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 21所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 22所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 22所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 10所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 12所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 21所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 22所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:25所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 29所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:25所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 30所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 24所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:25所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 29所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 24所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO:25所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 26所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 27所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 28所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 30所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述的LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，所述鼠源LAG-3抗体分子或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 1或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 3或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其重链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 2或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其重链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 4或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 1或其变异序列，且重链可变区碱基序列为 SEQ ID NO: 2或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 3或其变异序列，且重链可变区碱基序列为 SEQ ID NO: 4或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 5或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 6或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 8或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 5或其变异序列，且重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 5或其变异序列，且重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7或其变异序列，且重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7或其变异序列，且重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种LAG-3抗体或其结合片段，所述LAG-3抗体分子或其结合片段包含鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和鼠或人抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区等；所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区等。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种LAG-3抗体或其结合片段，所述抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 5或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 7或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 5或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成，且重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 5或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成，且重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 7或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成，且重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 7或其变异序列和SEQ ID NO: 31或其变异序列组成，且重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8或其变异序列和SEQ ID NO: 32或其变异序列组成。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的LAG-3抗体或其结合片段为嵌合抗体，所述LAG-3嵌合抗体或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的LAG-3抗体或其结合片段为人源化的抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述人源化LAG-3抗体或其结合片段，所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区框架FR序列选自人种系轻链序列，包含IGKV2-40*01(F), IGKV2D-40*01(F), IGKV2-28*01(F), IGKV2-29*02(F), IGKV2-29*03(F),IGKV2/OR22-4*01(P), IGKV2D-28*01(F), IGKV2D-29*02(F), IGKV2-29*01(P), IGKV2D-29*01(F)等，优选IGKV2-28*01(F)。 J基因例如hJK1, hJK2.1, hJK2.3,hJK2.4, hJK3, hJK4.1, hJK4.2, hJK5等，优选hJK4.1；FR序列区可以有多于10个氨基酸位点回复突变，优选 0-10个回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区CDR序列, 分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-8所列重链CDR序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区序列包含任选自SEQ ID NO: 33-37或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区框架FR序列选自人种系重链序列，包含IGHV1-58*01(F), IGHV1-58*02(F), IGHV1-3*01(F), IGHV1-3*02(F), IGHV1-1*01(F), IGHV1-18*01(F), IGHV1-18*03(F), IGHV1-18*04(F), IGHV1-24*01(F), IGHV1-46*01(F)等,优选IGHV1-18*01(F)。J基因例如hJh1, hJh2, hJh3.1, hJh3.2, hJh4.1,hJh4.2, hJh4.3, hJh5.1, hJh5.2, hJh6.1, hJh6.2等，优选hJH4.1。FR序列区可以有多于10个氨基酸位点回复突变，优选0-10个回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区CDR序列, 分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-8所列重链CDR序列或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区序列包含任选自SEQ ID NO: 38-57或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体包含任选自SEQ ID NO: 33-37或其变体序列的轻链可变区和任选自 SEQ ID NO: 38-57或其变体序列的重链可变区的组合。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体包含任选自SEQ ID NO: 33-37或其变体序列的轻链可变区和任选自 SEQ ID NO: 38-57或其变体序列的重链可变区的组合，优选地，所述组合列于表9。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自人κ或λ链恒定区或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自人抗体IgG1, IgG2, IgG4, IgG4重链恒定区或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60或与其具有至少85 %序列同源性的全长轻链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自SEQ ID NO: 59，SEQ ID NO: 61，或SEQ ID NO: 62或与其具有至少85%序列同源性的全长重链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段任选自人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 58 和SEQ ID NO: 59。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段任选自人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 60 和 SEQ ID NO: 61。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段任选自人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 58 和 SEQ ID NO: 62。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的LAG-3抗体或其结合片段为人源化抗体，所述LAG-3人源化抗体或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段，其中所述的LAG-3抗体或其结合片段包含半抗体或半抗体的抗原结合片段，优选地，包含Fab、F( ab”)2、Fv或单链Fv 片段(scFv) 。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和人LAG-3 胞外区单体（-his tagged monomer）有很强的结合活性，优选地，ELISA检测 EC50 小于0.5nM。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和人LAG-3胞外区二聚体单体（- Fc tagged dimer）有很强的结合活性，优选地，ELISA检测 EC50 小于 1nM。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和人LAG-3 胞外区domain 1 和2 单体（- his taggedhLAG3-D12 monomer）有很强的结合活性，优选地，ELISA检测 EC50 小于 1nM。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和人LAG-3 胞外区domain 1 和2 二聚体（- Fctagged hLAG3-D12 dimer）有很强的结合活性，优选地，ELISA检测 EC50 小于 1nM。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段具有阻止人LAG-3和人MHCII结合的活性。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和食蟹猴（cynomolgus）LAG-3胞外区的结合活性比和人LAG-3胞外区结合活性弱，ELISA检测EC50弱100倍以上。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和食蟹猴（cynomolgus）LAG-3胞外区的结合活性弱，Biacore检测KD 在 10-8 M 以上。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和小鼠（mouse）LAG-3胞外区没有结合活性，ELISA检测不到结合活性。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段和人LAG-3的亲和力（Biacore检测KD）强，优选地，KD在 10-9M范围或更低。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段能单独激活人T细胞，优选地，激活人T细胞释放细胞因子，包括IL-2。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的LAG-3抗体或其结合片段,其中所述的LAG-3抗体或其结合片段单独和/或同PD-1抗体联合能激活人T细胞，优选地，能激活混合淋巴细胞反应（MRL assay）中T细胞活性，在MLR assay中增加T细胞释放细胞因子，包括增加IL-2的释放。
本发明进一步提供一种DNA分子，其编码上述LAG-3抗体分子或其结合片段。
本发明进一步提供一种表达载体，表达上述任一LAG-3抗体分子或其结合片段的DNA分子。
本发明进一步提供一种生产抗体的方法，包含用表达载体转化表达上述LAG-3抗体分子或其结合片段的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，更优选为CHO细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，其包含在本发明一个优选的实施方案中，包含所述任一LAG-3抗体或其结合片段和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，包括以有效的治疗癌症的量，向需要其的对象施用在本发明一个优选的实施方案中，提供上述所述任一LAG-3抗体分子或其结合片段或药物组合物， 优选地，所述方法包括包含本发明抗体分子或其结合片段的任何组合，更优选地，为上述任一抗体分子或其结合片段和PD-1的抗体或抗体药物组合。
本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，包括和本发明所述抗体联合治疗方法。
本发明进一步提供一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的包含LAG-3抗体治疗癌症的方法，所述癌症优选为肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌结肠直肠癌、肝癌，胰腺癌，膀胱癌，白血病等或癌症的转移性病灶。
附图说明
图1本发明抗人LAG-3抗体mab7c，mab12c和人LAG-3的结合活性（ELISA）。
图2a 本发明抗人LAG-3嵌合抗体、人源化抗体和人LAG-3蛋白特异结合活性。
图2b 本发明抗人LAG-3人源化抗体和人LAG-3阳性细胞的特异结合活性。
图3a 本发明抗人LAG-3人源化抗体阻止hLAG-3和MHCII的结合活性。
图3b 本发明抗人LAG-3人源化抗体激活人T细胞活性。
图4 本发明抗人LAG-3人源化抗体单独和联合PD-1抗体激活异体T细胞活性（混合淋巴细胞反应活性）。
具体实施方式
为了更容易理解本发明，描述实施例子之前，先对本发明某些技术和科学术语做说明。
除显而易见在本发明申请文件中的它处另有明确定义，本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J. biol. Chem., 1968, 243: 3557中所述。
术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3或LAG-3基因以及其表达产物，LAG-3蛋白。术语“LAG-3”包括变体、同种型、同源物、直向同源物和旁系同源物。对人LAG-3蛋白特异的抗体可以，例如，在某些情况下与来自除了人之外的物种的LAG-3蛋白具有交叉反应。在其它实施方案中，对人LAG-3蛋白特异的抗体可对人AG-3蛋白是完全特异的，并且不表现物种交叉反应或其他类型的交叉反应性，或者可与来自某些其他物种而不是所有其他物种的LAG-3蛋白交叉反应(例如，与猴LAG-3而不与小鼠LAG-3交叉反应)。术语“人LAG-3”指的是人序列LAG-3，如Genbank登录号为NP_002277的人LAG-3的完整氨基酸序列。术语“小鼠LAG-3”指的是小鼠序列LAG-3，如Genbank登录号为NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在现有技术中也称为，例如，CD223。人LAG-3序列可以具有例如保守突变或在非保守区中的突变而不同于Genbank登录号NP_002277的人LAG-3，并且LAG-3与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3具有基本上相同的生物功能。例如，人LAG-3的生物功能为具有在LAG-3的胞外结构域中的表位，其被本公开的抗体特异性结合，或者人LAG-3的生物功能为与MHC II类分子结合。
人LAG-3胞外区（ECD）有四个loop （或称区域、domain）, 包括loops 1, 2, 3, 4或者区域1， 2， 3，4 (D1, D2, D3, D4)。信号肽 1-22aa，之后 D1:23-171aa; D2: 172-261aa; D3: 262-352aa; D4: 353-434aa。
本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为µ链，δ链γ，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG 可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中的每类Ig都可以有κ型或λ型轻链。
术语“抗体”描述了包含至少一个来源于抗体的抗原结合位点(例如，VH/VL区或Fv、或CDR )的多肽。抗体包括已知形式的抗体。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、或嵌合抗体。抗体也可以是Fab、Fab’2、ScFv、纳米抗体、或者单域抗体。抗体还可以是任何下列同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE。抗体可以是天然存在的抗体或可以是已改变(例如，通过突变、缺失、置换、与非抗体部分的偶联)的抗体。例如，抗体可以包括一个或多个变异氨基酸(与天然存在的抗体相比)，所述氨基酸改变了抗体的性质(例如，功能性质)。例如，本领域已知多种这样的改变，它们影响例如在患者中针对抗体的半衰期、效应子功能、和/或免疫应答。抗体这一术语也包括这样的人工多肽构建体，其包含至少一个来源于抗体的抗原结合位点。
本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ型轻链或其变体。本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1, 2, 3, 4或其变体。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区（V区）；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区（C区）。可变区包括3个高变区（HVR）和4个序列相对保守的骨架区（FR）。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区（CDR）。每条轻链可变区（LCVR）和重链可变区（HCVR）由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指VLCDR1，VLCDR2，和VLCDR3；重链的3个CDR区指VHCDR1，VHCDR2和VHCDR3。
本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则（VLCDR1-3，VHCDR1-3），Chothia，AbM, Contact以及CCG的编号规则。本发明抗体轻链、重链的CDR区分别按照Kabat, Chothia, AbM, 或Contact等编号规则定义各CDR序列。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人LAG-3的单克隆抗体。制备时用LAG-3抗原注射试验对象为鼠，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源LAG-3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ型轻链恒定区或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1,IgG2, IgG3或 IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体（chimeric antibody）”，是将鼠源抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆到人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核细胞，工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的LAG-3嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ型轻链及其变体可变区。 所述的LAG-3嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1, IgG2, IgG3, IgG4或其变体的重链FR区。人抗体的恒定区可选自人IgG1, IgG2, IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人 IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC（antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）IgG1。可通过对IgG上Fc段的修饰，可降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1 的N297A，L234A，L235A； IgG2/4 chimera，IgG4的F235E, 或L234A/E235A 突变。
术语“人源化抗体（humanized antibody）”，也称为CDR移植抗体（CDR-graftedantibody），是指将小鼠的CDR序列，特别地，本发明所述LAG-3抗体的CDR是按Kabat,Chothia, AbM， Contact或CGG等编号规则定义的各CDR序列，移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗抗体反应。人抗体种系序列可以从ImMunoGeneTics (IMGT)的网站或NCBI网站等来源得到。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的LAG-3人源化抗体小鼠的CDR 1-3序列选自轻链CDR 1-3 依次 SEQ ID NO: 9或10或23或24，11或25，12或26； 重链CDR 1-3依次SEQ ID NO：13或14或18或20或21或27，15或16或19或22或28, 17或29或30。
人源化抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，在一个优选实施例子中来源于人种系轻链IGKV2-28*01(F) 和hJK4.1的组合序列。在一优选实施例子中，抗体重链可变区上FR区序列为人种系重链IGHV1-18*01(F) 和hJH4.1的组合。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，对所述的人抗体种系可变区FR区可进行最少回复突变，回复突变的位点可以是10个以上，优选0-10个，以保持活性。
本发明“全人源化抗体”指抗体中除CDR序列来源于鼠源抗体外，其它序列为人抗体种系序列。包含上述人源化方法得到的抗体，人源化过程中，轻和/或重链的回复突变位点数为0，即轻和/或重链FR区包括J区，为完整的人抗体种系序列。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F（ab’）2片段，以及与人LAG-3结合的Fv片段scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体（single chain antibody）或单链Fv（scFv）。单链抗体也可以用于双特异抗体。本发明的术语“与LAG-3结合”，指能与人LAG-3相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
抗体分子包含双体抗体(diabody) 和单链分子以及抗体的抗原结合片段 (例如，Fab 、F(ab' )2 和Fv)。 抗体分子包含一条重链和一条轻链(称作半抗体)或由其组成。Fab'、F(ab’) 2、Fc、Fd、Fv、单链抗体 (例如scFv) 、单一可变结构域抗体、双体抗体(Dab)(双价和双特异性)和嵌合 (例如，人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体产生，或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体分子。这些功能性抗体片段保留选择性地与其相应抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别，包括但不限于IgG 、IgA 、IgM、IgD和IgE并且来自任何抗体亚类(例如， IgG1 、IgG2 、IgG3 和IgG4)。抗体分子的制备可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。抗体可以具有例如选自IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 的重链恒定区。抗体还可以具有例如选自κ或λ型轻链。术语"免疫球蛋白(I g)” 在本发明中与术语"抗体"互换地使用。
本发明所公开的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规四链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体，或将来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、山羊、兔和牛。根据一些方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称作缺少轻链的重链抗体。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。 这种VHH 分子可以衍生自骆驼科 ( Camelidae )物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼) 中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体，这类VHH也被考虑。VH 区和VL 区可以再划分为超变区，称作"互补性决定区"(CDR) ，其间插有更保守的区域，称作"框架区" (FR) 。框架区和CDR 的范围己有多种方法定义。
本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。本发明所述载体的宿主细胞，可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero 细胞、Hela细胞、COS 细胞、CHO细胞、HEK293 细胞、BHK细胞、合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。
单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术（如CDR-grafting），或其它现有技术进行重组得到。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知并能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
PD-1 (蛋白质程序性死亡1) 是CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于活化的B细胞、T细胞、和髓样细胞上。CD28、ICOS和CTLA-4均具有未成对的半胱氨酸残基，可以同二聚化。PD-1则是以单体存在，缺乏在其它CD28家族成员特征性的未成对半胱氨酸残基。
PD-1基因编码一种55kDa I型跨膜蛋白，属于Ig基因超家族的部分。PD-1尽管结构上与CTLA-4相似，但缺乏对于B7-1和B7-2结合关键的基序。PD-1有PD-L1和PD-L2两种配体。PD-1和配体结合显示出下调T细胞活化。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖降低、以及癌性细胞的免疫逃避 (Blank C. 等,CancerImmunol. Immunother. 2005; 54: 307-314)。免疫抑制可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用而得到逆转，与PD-1属于CD28家族的抑制性成员这一点一致的。PD-1和其它T细胞活性抑制成员共同抑制会产生T细胞活性逆转的叠加作用。
术语“程序性死亡1”、“细胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，且包括人PD1的变体、同种型、物种同源物、以及与PD1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以GenBank登录号U64863找到。
术语“PD-1抗体”包含至少一个来源于抗体的PD-1结合位点(例如，VH/VL区或Fv、或CDR )的多肽。抗体包括已知形式的抗体。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体。包含本领域公知的PD-1抗体Opdivo, Keytruda。以及又已知公开的序列表达纯化的抗体。公开序列来源于专利和/或者其它公开的数据库，例如www.drugbank.ca 。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称作“治疗有效量”）可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征（例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等）的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。
整个说明书和权利要求书中使用的术语 “基本上由……组成”或其变形，或其变体表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性” 、“变异序列”、“变异” 是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体占据时，例如两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的同源位置数除以比较的位置数×100。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60%同源。
本发明使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。还应当理解的是，由于突变存在，后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本发明使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指以微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA所述扩增的程序或技术。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、细胞提取的基因组DNA、噬菌体或质粒序列等。本发明使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”、“任选地”、“任意”或 “任一”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
本发明所用， "一个" 和"一种"在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语"或"在本发明中用来意指术语"和/或"并且与之互换使用。"约"和"大约"应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其30% 范围内和更一般在其10% 范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85% 、90% 、95% 或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语 "基本上相同"在本发明中用来指同第一氨基酸序列。
“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物、抗体或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物(即抗体或抗体部分) 以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。
本发明所述的方法、组合物、联合治疗可以与其他活性剂或治疗方式，所述的方法包括向对象以有效治疗或预防疾病 (例如，癌症)的量，施用本发明所述的抗LAG-3 抗体分子，任选地，与PD-1 、PD-L1、PD-L2 、Tim-3 、CEACAM-1 和/或CEACAM-5 或CTLA-4抗体 的一种或多种抑制剂的组合，还包括施用抗LAG-3抗体分子、额外的活性剂或全部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量。抗LAG-3抗体，额外的活性剂或全部的施用量或剂量比单独 (例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量低，例如，至少20% 、至少30% 、至少40% 或至少50%。
"保守性氨基酸置换"是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸，具有酸性侧链的氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸，具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺，谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有自分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、组氨酸、异亮氨酸) ，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质" (如果为单链) 在本发明中互换地使用。术语"核酸"、"核酸序列“ ，"核苷酸序列"或"多核苷酸序列"和"多核苷酸"互换使用。术语"分离的"指从其原始或原初环境 (例如，如天然存在，天然环境) 取出的物质。
术语"竞争"或"交叉竞争"在本发明中可互换地用来指抗体分子干扰抗LAG-3抗体分子与靶(例如，人LAG-3) 结合的能力。对结合作用的干扰可以是直接或间接的(例如，通过抗体分子或靶的变构调节作用)。可以使用竞争结合测定法(例如， FACS 测定法、ELISA或BIACORE测定法)确定抗体分子能够干扰另一种抗体分子与其靶结合的程度并且是否因此可以称它为竞争。术语"表位"指抗原(例如，人LAG-3) 中与抗体分子特异性相互作用的部分。
此外，正如本发明的实施例中描述的那样，抗LAG-3抗体可以激活T细胞。在某些实施方案中，本发明中描述的抗LAG-3抗体分子适用于剌激所要的免疫应答，例如抗癌症细胞或病原体的免疫应答。本发明中描述的抗LAG-3抗体可以被用来治疗免疫病症，尤其是与T淋巴细胞有关的病症，包括但不限于慢性炎性疾病和癌症。以及抑制肿瘤细胞生长的方法，包括将治疗有效量的本发明中所述的抗LAG-3抗体分子施用于受试者，或者和PD-1抗体联合施用于受试者。该方法适用于癌症治疗。在将LAG-3抗体组合一种或多种活性剂施用时，该组合可以以任何顺序或同时施用癌症类型。在某些方面中，提供在治疗对象(例如，减少或缓解)过度增生性病状或疾病(例如，癌症) ，例如，实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤或转移性病灶的方法。该方法包括向对象单独或与其它活性剂或治疗方式组合地施用本发明所述的一种或多种抗LAG-3抗体分子。
如本发明所用，术语"癌", ”癌症”，“癌症病人” 意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌(包括腺癌和鳞状细胞癌) ，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀肮上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，如在肺、食道、皮肤、头部和颈部区域、口腔、肛门和子宫颈中。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明所述的方法和组合物治疗或预防。针对LAG-3 的抗体分子可以与免疫原性剂如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、细胞和用编码免疫剌激性细胞因子的基因转染的细胞组合。
组合进一步包括免疫检查点调节物的抑制物或激活物(例如，Tim-3 抑制物, 抗TIM-3抗体分子)、PD-L1抑制物(例如，抗PD-L1抗体分子)、PD-1 抑制物(例如抗PD-1 抗体分子) ，或CTLA-4抑制物(例如，抗CTLA-4抗体)或其任意组合。LAG-3阻断作用也可以与标准癌症治疗组合。LAG-3阻断作用可以有效地与化疗方案组合。在这些情况下，可以减少施用的化疗药物剂量。组合物可以与一者或多者组合施用，免疫调节剂 (例如，共刺激分子的激活物或抑制性分子的抑制物) ; 疫苗或其他形式的细胞免疫疗法。
抗LAG-3抗体分子的示例性非限制组合和用途包括抗LAG-3抗体分子与共剌激分子或抑制性分子(例如，共抑制性配体或受体) 的调节物组合施用。 抗LAG-3抗体分子与调节物(例如，共刺激分子的激动剂) 组合施用。和共剌激分子的激动剂选自OX40、 CD27、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB( CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)。与免疫检查点分子(或免疫抑制性分子)的抑制剂组合施用抗LAG-3 抗体分子。
术语"免疫检查点"是指在免疫细胞的细胞表面上的一组分子，其可以充当"闸"以下调或抑制免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答。免疫检查点分子包括但是不同限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、B7-H1、B7-H3、OX40、4-1BB(CD137)、CD40、TIM-3等等。可用于与本发明中描述的抗LAG-3分子组合的可以充当免疫检查点分子的抑制剂的免疫治疗剂包括但是不同限于PD-L1、PD-L2、 CTLA-4 、Tim-3、 VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CEACAM (例如CEACAM-l、CEACM-3 和/或CEACAM-5) 和/或TGFR beta 的抑制剂。可以通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制来对免疫抑制性分子进行抑制。免疫检查点分子(例如PD-1、Tim-3、CEACAM- 1/-5) 可以调节T细胞功能而促进肿瘤的免疫逃避。与抗Tim-3抗体或其抗原结合片段组合施用抗LAG-3抗体分子，与抗PD-1 抗体或其抗原结合片段组合施用抗LAG-3 抗体分子。与抗TIM-3抗体和抗PD-1抗体或其抗原结合片段组合施用抗LAG-3抗体分子。施用双特异性抗体，其包括抗LAG-3抗体分子和抗PD-1或抗TIM-3抗体或其抗原结合片段， 或LAG-3抗体和Tim-3抗体或其抗原结合片段。
使用单独的或与另一种免疫调节剂(例如抗Tim-3 ，抗PD-1或抗PD-L1抗体分子)组合的抗LAG-3抗体分子来治疗肾癌，例如肾细胞癌(RCC) (例如，透明细胞肾细胞癌(CCRCC) 或转移性RCC。抗LAG-3抗体分子可以与以下一者或多者组合施用: 基于免疫的策略(例如，白介素2或干扰素α) 、靶向药物(例如，VEGF抑制剂如针对VEGF的单克隆抗体);VEGF酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼、拉帕替尼、达沙替尼、阿帕替尼；RNAi 抑制剂或VEGF信号传导的下游介导物的抑制剂，例如，雷帕霉素，哺乳动物靶(mTOR) 的抑制剂。
可以利用本发明中公开的抗体分子抑制其生长的示例性的癌症包括典型地对免疫疗法应答的癌症, 或/和对PD-1抗体免疫应答的癌症。适合治疗的癌症的非限定性的实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌 (例如非小细胞肺癌)。另外，可以利用本发明中描述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。癌症包括但是不同限于基底细胞癌、胆道癌、膀肮癌、骨癌、大脑和CNS癌症、原发性CNS淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、头部和颈部癌症、胃癌、肾癌、喉癌、血病 (包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性或急性白血病)、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)、淋巴瘤，包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、黑素瘤，例如皮肤或眼内的恶性黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌; 卵巢癌，胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、肝癌、肛区癌症、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、脊椎轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波因肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的症，以及其它癌和所述癌症的组合。
具体实施例子
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：抗原，抗体的克隆，表达和纯化
本发明所用的抗原或购自如下不同公司：北京百普赛斯生物科技有限公司LAG-3-his （货号：LA3-H5222），cyno-LAG-3-mFc （货号LA3-C52A0）或北京义翘神州科技有限公司LAG-3-his （货号：16498-H08H），LAG-3-hFc（货号：16498-H05H ），cyno-LAG-3-his（货号90841-C08H） 或由本发明表达纯化得到。表达的人LAG-3蛋白序列为NCBI ReferenceSequence: NP_002277.4，全长1-525 氨基酸, 其中1-22位为信号肽；胞外（ECD）区域为23-422位氨基酸；胞外(ECD)区域23-239位氨基酸的第一，第二区域（dormain #1 and #2，D12）D12-his, D12-hFc。鼠LAG-3 his tagged (mLAG-3-his) 的序列来自NCBI gi|148667361|gb|EDK99777.1的胞外区（ECD）23-406位氨基酸。Macaca LAG-3 his tagged (cynoLAG-3-his)的序列NCBI号NP_001271679.1，其胞外区（ECD）23-434位氨基酸。
本发明所用抗体，包括阳性对照抗体Ref (即BMS-986016, 序列来自WO2014008218A1, LAG3.5， #12 轻链，#14 重链），和 PD-1抗体nivolumab（序列来自WO2013019906），Pembrolizumab（序列从www.drugbank.ca得到）均由本发明表达纯化。
表达所用pTT5载体（Biovector，Cat#: 102762）。将所表达的重组蛋白，抗体轻、重链序列克隆到pTT5载体上，经瞬时转染HEK293E细胞 (Life Technologies Cat. No.11625019) 表达，后纯化得到。
具体地，293细胞在Gibco FreeStyle 293 Expression Medium（Gibco，Cat#12338018）培养基扩培。瞬转开始之前， 调节细胞浓度至 6~8×105 cell /ml，1% FBS（Aus Gene X FBS Excellent 供应商：AusGeneX，China， Cat# FBSSA500-S），37℃ 8% CO2摇床培养 24h，再次镜检存活率 > 95%，细胞浓度在1.2×106 cell/ml。
准备300ml 培养体系细胞，15ml Opti-MEM（Gibco，Cat#31985070） 溶入重链、轻链质粒各150ug (如果是重组蛋白，单个质粒用量为300ug)， 0.22 µm 过滤除菌。 再取15ml Opti-MEM 溶入1mg/ml PEI （Polysciences, Inc, Cat# 23966-2 ）600ul后静置5min。 把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10 min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液， 37℃ 8% CO2 摇床培养 5天收样，3300G 10 min 取上清进行纯化。
抗体或-Fc融合蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质，用PBS pH7.4平衡含有Protein A （Mabselect, GE Healthcare Life Science, Cat# 71-5020-91 AE）的重力柱（生工生物，Cat# F506606-0001），2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS（生工生物，Cat#B548117-0500）冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度，分装、储存备用。
His Tagged 蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质。平衡镍柱（Ni smart beads6FF常州天地人和生物科技有限公司 Cat# SA036010 ）: 用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBSpH7.4溶液平衡镍柱， 2-5倍柱体积冲洗。 将样品上清过柱。 漂洗杂蛋白：使用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4溶液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4洗脱目的蛋白。 buffer 置换：将洗脱的目的蛋白过超滤管12000 g 10min离心（超滤管 Merck Millipore Cat#UFC500308），再补加1ml PBS，测定浓度，分装、储存备用。
实施例2：人LAG-3 高表达细胞株（hLAG-3+细胞）构建及结合活性（ELISA）检测
本发明所用的人LAG-3 高表达细胞株通过公司稳定细胞株构建平台完成。具体步骤如下： 实验开始第1天， 将293T 细胞 (中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 Cat#GNHu17) 接种于两个6 cm 培养皿，每个培养皿里的细胞数达到7.5×105。 第2天将包裹质粒（pGag-pol, pVSV-G等BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心）和克隆有人LAG-3基因的质粒pBabe-hLAG-3各4µg 加入OPTI-MEM （Thermofisher Scientific Cat#31985070），使最终体积为200µl，另准备200µl OPTI-MEM加入36µl转染试剂fectin （上海源培生物科技股份有限公司 Cat#F210），二者混匀，室温放置5min，然后将混合物（每皿各200µl）滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4ml DMEM高糖培养基（上海源培生物科技股份有限公司/源培生物： Cat#L130KJ）。第4天将CHO-K1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 Cat#SCSP-507）接种于10cm 培养皿，使细胞数达到5×105。第5天收集293T细胞上清（病毒），用0.45µm滤膜过滤至培养好的CHO-K1细胞，同时加入10ug/ml polybrene （上海翊圣生物科技有限公司 Cat# 40804ES76），混匀后放置培养箱，3~4h后换成DMEM/F12 10% FBS 培养基 （源培生物，Cat#L310KJ）。第7天将CHO-K1细胞传代，第8天传代的细胞开始加入10ug/ml puromycin进行筛选（源培生物，Cat#S250J0）。2-3天细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。
本实施例子所用的人LAG-3 （pBabe-hLAG-3）的氨基酸序列NP_002277.4之全序列1-525氨基酸，其中1-22位为信号肽序列，即第23-525位为本发明构建CHO-K1 hLAG-3+细胞系所表达的蛋白序列。
细胞结合活性(ELISA)检测：
将上述实施例得到的细胞人LAG-3高表达的单克隆细胞株扩培后，按10x104/孔铺96孔板，37°C培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液（上海碧云天生物技术有限公司 Cat#P0098）100ul/孔，室温固定半小时。PBS（源培生物，Cat# B320）洗一遍后230ul 5%牛奶37°C 封闭2小时, PBST洗3遍。每孔加入50ul，10ug/ml，5倍梯度稀释的待测样品。 37°C 孵育1小时，后PBST洗5遍。加Anti-human HRP（Jackson Immuno Research，Cat# 109-035-003） 1:2500 50ul/孔37°C 孵育1小时，后PBST洗5遍， 每孔加入50ul TMB （SurmodicCat# TTMB-1000-01）显色，加入50µl/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪 ( MultiskanGO Thermo型号51119200) 读数，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例3：抗LAG-3抗体和LAG-3结合实验（ELISA）
用pH7.4的PBS缓冲液将LAG-3-his， LAG-3-D12-his， 猴LAG-3-his (cyno LAG-3-his)或者mLAG-3-his等重组蛋白 稀释至1ug/ml， 2ug/ml (hLAG-3 D12-his), 或者5ug/ml (cyno LAG-3-his) 浓度，以50ul/孔的体积加入96孔酶标板（Corning, CLS3590-100EA）中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶（光明脱脂奶粉）封闭液230ul/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜（16-18小时）进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液（PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20）洗板5次后，加入50ul/孔上清（含检测抗体）或10ug/ml 起始，5倍梯度稀释的待测抗体， 37℃ 孵育1小时， PBST洗板5次，加入50ul/孔 1：2500稀释的Anti-mouse or human HRP二抗（Jackson ImmunoResearch，Cat# 115-035-003 or 109-035-003），37℃孵育1小时。 用PBST洗板5次后，加入50µl/孔TMB显色底物（KPL, 52-00-03），室温孵育10-15min，加入50µl/孔1M H2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪 （ThermoFisher, 51119200）在450nm处读取吸收值，根据OD值挑选结合活性高的克隆或者计算EC50值（对浓度已知的抗体）。
实施例4：抗LAG-3抗体阻止LAG-3和Daudi细胞结合活性实验
将Daudi细胞株 (ATCC, CCL-213) 扩培后，按2x105/孔铺96-well plate，1600rpm 离心10 min后，用免疫染色固定液（上海碧云天生物技术有限公司 Cat#P0098）100ul/孔室温固定半小时。PBS（源培生物，Cat# B320）洗一遍后230ul 5%牛奶37°C 封闭2小时, PBST洗3遍。每孔加入25ul，100ug/ml，3倍梯度稀释的待测样品和25ul 2.5ug/ml的bio-LAG3-mFc (北京义翘生物科技有限公司，16498-H05H)。37°C 孵育1小时，后PBST洗5遍。加入50ul/孔 1：1000稀释的streptavidin-HRP二抗（genscript, M00091），37°C 孵育1小时，后PBST洗5遍， 每孔加入50ul TMB （Surmodic Cat# TTMB-1000-01）显色，加入50µl/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪 ( MultiskanGO Thermo 型号51119200) 读数，Graphpadprism 5进行数据分析。
实施例 5 抗人LAG-3抗体 亲和力（KD）测定（Biacore）
用Biacore T200，GE Healthcare仪器测定本发明抗体和人LAG-3的亲和力。用pH7.4的运行缓冲液HBS-EP+（10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 和 0.05% 的 P20），先将Protein A (Thermo Pierce, Cat# 21181) 偶联到生物传感芯片CM5 (Cat. # BR-1005-30，GE) 上, 将芯片用新配制的50 mM NHS（N-hydroxysuccinimide）和200mM EDC (1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 激活, 然后注入pH4.0 10 mM NaAC 配制的 10 ug/ml的Protein A。 待测抗浓度为 5ug/ml，抗原LAG-3-his 浓度梯度 0 nM, 1.875nM， 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 和30nM， 流速 30ul/分钟, 结合时间 180秒，解离时间 300秒。实验后，用10mM Glycine-HCl, pH 1.5, 30 ul/min, 30s清洗芯片。 实验数据用Biacore T200 evaluation version 3.0 (GE) 软件以1:1Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值KD。
实施例6：抗人LAG-3抗体的发现
本发明用人LAG-3重组蛋白作为抗原，免疫小鼠，筛选融合杂交瘤，从数百万株杂交瘤克隆中筛选，优化，意外发现两株和hLAG-3结合活性非常好（EC50比阳性对照抗体Ref好5倍）的杂交瘤细胞株。本发明进一步筛选得到单克隆细胞株，从中得到的鼠源抗体。该抗体经计算机优化，人源设计后得到人源化抗体。人源化抗体同样保持和hLAG-3很好的结合活性。更意外的是，其和非人灵长类LAG-3（cyno-LAG-3-his）结合活性弱，显示有独特的结合位点。和PD-1抗体联合激活人T细胞显示更好的活性。
具体地，实验用SJL小鼠，雌性，4周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京) 2016-0011。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25 ℃；湿度40-60 %。小鼠分成3只/组/笼。用实施例1准备的抗原进行免疫。佐剂为TiterMax (Sigma-Aldrich, T2684)。抗原与佐剂比例为1:1。100 ul/25ug/只首免，100 ul/12.5ug/只二免、三免，小腿肌肉注射。融合前3天，100ul/25ug/只加强免疫。免疫时间为第0、14、28、42、56天 和 59天（加强免疫）。于第22，36，50，64天，用上述实施例3的ELISA方法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞 (ATCC® CRL-8287™ ) 进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板，后筛选，优选克隆。
对杂交瘤细胞株进行初次筛选，用实施例子3 的ELISA方法检测杂交瘤细胞株分泌上清中的抗体和人LAG-3的结合活性，并选择活性好的克隆，取上清用实施例4所述方法检测所分泌的抗体阻止hLAG-3和Daudi细胞的结合活性（Blocking活性），优选克隆，进一步有限稀释得到单克隆抗体细胞株，部分结果见表1 。
表1 杂交瘤融合筛选单克隆细胞活性
Figure 913399DEST_PATH_IMAGE001
表1中列出了部分筛选数据。数据显示，在融合杂交瘤初始筛选结合活性好，比如表中编号 #1-7， #10克隆中， 2F9、5E6显示了比较好的blocking 活性（数值越低，表明blocking活性越好）。对这两个克隆进行多次有限稀释，每一次稀释7-10天待克隆增值后，用ELISA方法重新检测各个克隆所分泌抗体（上清）的结合活性和blocking活性。初始筛选中blocking活性不好的克隆均丢弃，例如表中的#1-6 均丢弃。经过多次有限稀释后，意外发现，分别从2F9和5E6中筛选得到的单克隆细胞株2F9A3C7C3（编号 #7）， 5E6C12C10F5（编号 #12）所分泌上清保持了很好的结合活性及Blocking活性。从这两株单克隆中提取抗体序列，即为本发明优选鼠源mab7，和mab12抗体序列。
实施例7：本发明鼠源抗人LAG-3抗体mab7、mab12抗体序列提取、分析鉴定
从杂交瘤优选得到的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员常用的方法。具体地，收集上述单克隆细胞株，扩增培养后，取1 x 106个细胞，用Trizol（Invitrogen, 15596-018）提取RNA (按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA并反转录成cDNA，反转录试剂盒购自生工生物技术（上海）股份有限公司，Cat # B532435。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物测序，分别得到mab7，mab12抗体轻、重链可变区碱基/编码序列（如下）。所用引物参阅Novagen 发表的手册 TB326 Rev. C0308。
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab7轻链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：
atgaagtttgctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcggtgatgttttgat gacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcatt gtacatagtgatgacaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctaca aagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagat cagcagagtggagtctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcgcatgttcctccgacgttcggtgga ggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctaccccagagacatacatgtccct (SEQ ID NO:1)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab7重链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：
atgaaatgcacctgggtttttctcttcctcctctcaggaactgcaggtgtccactctgagttccagct gcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggcgcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttatttattc actgactataacatgaactgggtgaagcagagcaatggaaagagccttgagtggattggagtaattgatcctaact atggtactattacctacaatcagaagttcaagaacaaggccgcattgactgtagaccaatcttccagcacagccta cttacacctcaacagcgtgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagctattactacggcagtgaggtat tttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctgtcaagggctattcctagccagaaagtga (SEQ ID NO: 2)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab12轻链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：
tatgaagtttgctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgttttga tgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatccagtcagagcat tgtacatagtgatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac aaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaaga tcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttcctccgacgttcggtgg aggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctaccccagaggacaaccaatgcccg (SEQ ID NO:3)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆mab12重链可变区碱基序列 (划线部分为编码序列)：
Atgaaatgcacctgggtttttctcttcctcctctcaggaactgcaggtgtccactctgagttccagct gcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggcgcttcagtgaaaatgtcctgcaaggcttccggttactcattc actgactacaacatgaactgggtgaagcagagcaatggaaagagccttgagtggattggagtaattgatcctaact atggtactattacctacaatcagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagaccaatcttccagcacagccta catccagctcaatagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagttattactacggcagtgaggtac tttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctgggtgtggagatacaactggttcctctgtgactctgggagcctgtcaaggggttactccccgaattcaagttccc (SEQ ID NO: 4)
本发明所得到的上述鼠源单克隆抗体mab7轻、重链可变区的碱基序列所编码的氨基酸序列为如下SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6。
本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab7轻链可变区氨基酸序列:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVESEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 5)
本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的鼠源单克隆抗体mab7重链可变区氨基酸序列:
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYLFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKAALTVDQSSSTAYLHLNSVTSEDSAVYYCAAITTAVRYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 6)
本发明所得到的上述鼠源单克隆抗体mab12轻、重链可变区的碱基序列所编码的氨基酸序列为如下SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8。
本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab12轻链可变区氨基酸序列:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 7)
本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的鼠源单克隆抗体mab12重链可变区氨基酸序列:
EFQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYIQLNSLTSEDSAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 8)
本发明上述抗体轻、重链可变区序列和IgG不同型的恒定区，例如人hIgG1,hIgG2, hIgG3, hIgG4，人轻链κ、λ型； 鼠mIgG1, mIgG2, mIgG3，鼠轻链κ、λ型等重组表达纯化得到完整的人鼠嵌合抗体，鼠抗体。 本发明以重链恒定区为hIgG4, 轻链κ 型为例子，按实施例1表达纯化方法得到嵌合抗体， 用实施例子3之方法检测了本发明上述可变区得的嵌合抗体mab7c, mab12c和hLAG-3的结合活性，并和对照抗体比较，结果见图1，表2。
表2 本发明抗体mab7c, mab12c活性分析
样品名称 hLAG-3结合活性（ELISA）, EC50, nM 阻止hLAG-3和Daudi 细胞（MHCII）结合活性，IC50, nM
mab7c 0.14 0.58
mab12c 0.25 0.79
Ref 0.84 1.5
图1，表2 结果表明，本发明mab7c, mab12c的EC50 分别为0.14, 0.25 nM。同一实验下的阳性对照分子(Ref)的EC50 = 0.84nM。 这一结果表明本发明发现的抗体的结合活性比阳性分子要强 3-5倍，是一类（至少本发明的两个抗体）结合活性更好的抗体。
用实施例子4之方法检测了mab7c, mab12c阻止hLAG-3和daudi 细胞（MHCII）的结合活性，结果发现这两个抗体活性 IC50 为 0.58 – 0.79 nM, 比对照分子(IC50= 1.5nM)强1倍以上。
特别意外地，分析上述mab7, mab12可变区的序列发现，mab7 和mab12 轻链序列只有2个氨基酸不同 （序列中划线部分），其中一个在轻链的CDR区（CDR1），另一个在RF3区。两序列同源性高达 98%。mab7 和mab12重链有8个氨基酸不同（序列中划线部分），其中有3个在重链CDR区（CDR1, CDR2, CDR3各一个），其余在FR区。两序列同源性高达 93%。
这些结果表明，本发明发现一类抗体（至少包括mab7和mab12），其轻、重链可变区高度同源。 轻、重链同源性均在90%以上，且具有共同的结合特性，即非常好的和hLAG-3的结合活性（ELISA），其结合活性比目前的临床分子（本发明中用的Ref）要强3-5倍。而且，都具有很好的抑制hLAG-3和daudi细胞（MHCII）结合的活性，且抑制作用IC50 均优于对照分子。
实施例 8: 本发明鼠源抗体人源化
本发明意外发现的鼠源抗体mab7, mab12具有共同的和特异抗原hLAG-3强结合活性，阻止hLAG-3和daudi细胞（MHCII）结合的活性（功能活性）。且都优于本领域已有的分子（本发明的对照Ref）。 显示所述抗体可用于针对LAG-3靶点的肿瘤治疗单克隆抗体药物开发，其更加强的特异结合，能达到不一样或者更好的治疗效果。为了避免用于药物开发过程中的免疫原性等方面的风险，本发明对鼠源mab7抗体，以及和其类似的mab12抗体进行了人源化设计和筛选，以及序列优化。具体过程描述如下。
抗体的CDR定义本领域还有多种不同的方法，这些标记CDR方法可总结如下表3。
表3 本领域抗体CDR定义不同方法汇总*
Loop CCG定义 Kabat定义 AbM 定义 Chothia定义 Contact定义
轻链CDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
轻链CDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L45-L55
轻链CDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
重链CDR1 H26-35 H31-35 H26-35 H26-32 H30-35
重链CDR2 H50-65 H50-65 H50-58 H52-56 H47-H58
重链CDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
*更多信息可以参阅网站：http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef 。
上述所述鼠源抗人hLAG-3抗体mab7，mab12可变区按照表3各种定义方法，其CDR序列标记/注释如下。
表4本发明抗hLAG-3 (anti-hLAG-3)抗体mab7和mab12按CCG定义的 CDR序列
抗体 mab7/mab12 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHSD<u>D</u>NTYLE (SEQ ID NO: 9) 或者RSSQSIVHSD<u>G</u>NTYLE (SEQ ID NO: 10) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
轻链CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 11)
轻链CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 12)
重链CDR1 GY<u>L</u>FTDYNMN (SEQ ID NO: 13) 或者GY<u>S</u>FTDYNMN (SEQ ID NO: 14) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
重链CDR2 VIDPNYGTITYNQKFK<u>N</u> (SEQ ID NO: 15)或者 VIDPNYGTITYNQKFK<u>G</u> (SEQ ID NO: 16) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
重链CDR3 ITTAVRYFDY (SEQ ID NO: 17)
表5本发明抗人抗体按Kabat定义CDR序列
抗体 mab7/mab12 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHSD<u>D</u>NTYLE (SEQ ID NO: 9) 或者RSSQSIVHSD<u>G</u>NTYLE (SEQ ID NO: 10) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
轻链CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 11)
轻链CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 12)
重链CDR1 DYNMN (SEQ ID NO: 18)
重链CDR2 VIDPNYGTITYNQKFK<u>N</u> (SEQ ID NO: 15)或者 VIDPNYGTITYNQKFK<u>G</u> (SEQ ID NO: 16) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
重链CDR3 ITTAVRYFDY (SEQ ID NO: 17)
表6本发明抗体按AbM定义CDR序列
抗体 mab7/mab12 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHSD<u>D</u>NTYLE (SEQ ID NO: 9) 或者RSSQSIVHSD<u>G</u>NTYLE (SEQ ID NO: 10) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
轻链CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 11)
轻链CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 12)
重链CDR1 GY<u>L</u>FTDYNMN (SEQ ID NO: 13) 或者GY<u>S</u>FTDYNMN (SEQ ID NO: 14) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
重链CDR2 VIDPNYGTIT (SEQ ID NO: 19)
重链CDR3 ITTAVRYFDY (SEQ ID NO: 17)
表7本发明抗体按Chothia定义CDR序列
抗体 mab7/mab12 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHSD<u>D</u>NTYLE (SEQ ID NO: 9) 或者RSSQSIVHSD<u>G</u>NTYLE (SEQ ID NO: 10) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
轻链CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 11)
轻链CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 12)
重链CDR1 GY<u>L</u>FTDY (SEQ ID NO: 20) 或者GY<u>S</u>FTDY (SEQ ID NO: 21) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
重链CDR2 DPNYGT (SEQ ID NO: 22)
重链CDR3 ITTAVRYFDY (SEQ ID NO: 17)
表8本发明抗体按Contact定义CDR序列
抗体 mab7/mab12 CDRs
轻链CDR1 VHSD<u>D</u>NTYLEWY (SEQ ID NO: 23) 或者VHSD<u>G</u>NTYLEWY (SEQ ID NO: 24) ，划线部分为mab7 和mab12的不同
轻链CDR2 KLLIYKVSNRF (SEQ ID NO: 25)
轻链CDR3 FQGSHVPP (SEQ ID NO: 26)
重链CDR1 TDYNMN (SEQ ID NO: 27)
重链CDR2 WIGVIDPNYGTIT (SEQ ID NO: 28)
重链CDR3 A<u>A</u>ITTAVRYFD (SEQ ID NO: 29) 或者A<u>V</u>ITTAVRYFD (SEQ ID NO: 30)，划线部分为mab7 和mab12的不同
对本发明鼠源抗体mab7, mab12的CDR序列做上述分析、标记、定义后，如本领域许多文献公示的方法进行人源化。将鼠源抗体序列和人抗体种系数据库（v-base）比较，找出同源性高的人抗体轻、重链种系，在此基础上，计算机建模，模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点，回复突变关键位点和组合，筛选出活性优选的人源化抗体分子。
具体地，通过序列同源性比较分析，发现和mab7，mab12轻链同源性比较好的人抗体种系包含有IGKV2-40*01(F), IGKV2D-40*01(F), IGKV2-28*01(F), IGKV2-29*02(F),IGKV2-29*03(F),IGKV2/OR22-4*01(P), IGKV2D-28*01(F), IGKV2D-29*02(F), IGKV2-29*01(P), IGKV2D-29*01(F) 等。进一步比较、分析，优选人抗体种系轻链IGKV2-28*01(F)。序列比对发现mab7， mab12 轻链的 J 基因区和人抗体种系hJK1, hJK2.1, hJK2.3,hJK2.4, hJK3, hJK4.1, hJK4.2, hJK5同源性高，进一步比较、分析，优选hJK4.1用于maab7, mab12轻链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
通过序列同源性比较分析，发现和mab7, mab12重链同源性比较好的人抗体种系包含有IGHV1-58*01(F), IGHV1-58*02(F), IGHV1-3*01(F), IGHV1-3*02(F), IGHV1-1*01(F), IGHV1-18*01(F), IGHV1-18*03(F), IGHV1-18*04(F), IGHV1-24*01(F), IGHV1-46*01(F) 等。 进一步比较、分析，优选人种系重链IGHV1-18*01(F) 序列用于本发明抗体人源化。 序列比对发现和mab7, mab12 的重链J基因区和人抗体种系重链J基因hJh1,hJh2, hJh3.1, hJh3.2, hJh4.1, hJh4.2, hJh4.3, hJh5.1, hJh5.2, hJh6.1, hJh6.2等同源性高，进一步比较、分析，优选hJh4.1用于本发明鼠源抗体mab7, mab12重链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
将本发明抗体以mab7，mab12的 CDR区（见上述CDR之定义）移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与IgG轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，筛选这些突变以及突变组合，看对抗体活性的影响，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到结构、活性等优化的抗体分子序列，即完成本发明鼠源抗体的人源化。
以下结合mab7的具体序列，以hIgG4重链，κ型轻链（序列如下）为例子进行说明。
人抗体轻链恒定区κ链：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 31)
人IgG4的重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 32)
本发明人源化轻链可变区优选序列：
>pG812
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 33)
>pG813
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 34)
>pG814
DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 35)
>pG815
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 36)
>pG816
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 37)
本发明人源化重链可变区优选序列：
> pG822
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 38)
> pG823
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 39)
> pG824
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 40)
> pG825
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATMTTDQSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41)
> pG826
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYIELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)
> pG827
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTVDQSTSTAYIELRSLRSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43)
>pG828
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYIELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 44)
>pG829
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTTDQSTSTAYIELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 45)
>pG830
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTTDQSTSTAYIELRSLTSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 46)
>pG831
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTVDQSTSTAYIELRSLRSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 47)
>pG832
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTVDQSTSTAYIELRSLRSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 48)
>pG833
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTVDQSTSTAYIELRSLTSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49)
>pG834
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGKGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTVDQSTSTAYIELRSLTSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50)
>pG835
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGKGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTVDQSTSTAYIELRSLTSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51)
>pG836
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGKGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTTDQSTSTAYIELRSLTSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52)
>pG837
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGKGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNKATLTTDQSTSTAYIELRSLTSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53)
>pG838
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYIELRSLRSDDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 54)
>pG839
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWMGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTVDQSTSTAYIELRSLRSEDTAVYYCAVITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 55)
>pG840
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYIELRSLRSDDTAVYYCAAITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 56)
>pG841
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYLELRSLRSDDTAVYYCAAITTAVRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 57)
本发明鼠源抗体轻链的人源化序列中含有不同的回复突变，回复突变位点数目可以是10个或更多，优选0-10个，如上述所列序列。 这些任意序列与人抗体轻链恒定区κ链或λ链的恒定区序列组合得到本发明抗体的轻链序列, 比如本发明轻链用κ型轻链恒定区，如上所列序列。同样，人源化所用重链可变区也有不同数目的回复突变，回复突变位点数目可以是10个或更多，优选0-10个，如上述所列重链可变区序列。这些含不同数量回复突变的重链可变区序列，同任选人IgG1, 2, 3, 4链恒定区序列重组得到本发明的重链序列，比如本发明重链用hIgG4 作为恒定区序列为例子加以说明。
本发明部分优化人源化抗体序列，以及所表达的抗体的活性评估（本发明实施例子3之ELISA检测方法）结果如下表 。
表 9 本发明人源化抗体序列（人κ型轻链, hIgG4重链恒定区为例子）
Figure 517687DEST_PATH_IMAGE002
*: NB, 没有结合；**: ND, 活性比mab7c 弱100-倍以上 。
上述结果表明，从本发明鼠源嵌合抗体mab7c, mab12c结合活性比对照分子好3-5倍，而且，mab7c 的轻链和mab12c的重链，mab7c重链和mab12c的轻链组成的抗体Ab812,Ab813显示了同样的结合活性, EC50分别为 0.15和0.17nM。这说明本发明所发现的一类鼠源抗体（至少有两个抗体）序列具有同样的结合特点。
由本发明抗体鼠源序列得到的上述人源化抗体分子保留了和hLAG-3的结合活性，更佳地，很多分子恢复到了和鼠源抗体mab7c, mab12c同样的结合活性, 其中Ab835,ab836, ab837, ab839, ab845, ab846, ab847,ab848等抗体的结合活性, 和mab7c没有差别, 甚至优于mab12c。 不仅如此，这些优选抗体的结合活性比对照抗体Ref强5倍以上，见上表（Ab835 EC50=0.12 nM vs Ref E50 =0.77nM），或图2a。这和人源化之前的鼠源抗体mab7c的活性比Ref强的特性是一致的，即本发明人源化优选抗体保留了之前鼠源抗体的结合活性。
更加特别地，用实施例子2所述的hLAG-3阳性细胞系，检测了本发明人源化抗体的结合活性，结果表明，本发明抗体和hLAG-3阳性（hLAG-3+）细胞的结合活性同样明显优于阳性抗体Ref。 图2b 显示Ab835和hLAG-3阳性细胞的结合活性EC50 = 0.41nM, 比阳性分子Ref的结合活性EC50=2.3 nM强4倍。这一结果表明，本发明抗体，人源化抗体，人源化优选抗体分子不仅同hLAG-3蛋白，而且和hLAG-3+细胞的结合活性均比对照抗体Ref 强3-5倍。
表9所述部分优选人源化抗体的轻、重链氨基酸（包括恒定区）序列如下。
人源化Ab835 抗体氨基酸序列：
轻链:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDDNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 58)
重链：
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人源化Ab846抗体氨基酸序列：
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人源化Ab854抗体氨基酸序列：
轻链:
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重链：
QFQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTDYNMNWVKQAPGQGLEWIGVIDPNYGTITYNQKFKNRATLTTDQSTSTAYLELRSLRSDDTAVYYCAAITTAVRYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 62) 。
实施例 9: 本发明人源化抗人LAG-3抗体，优选抗体结合活性综合评价
为了进一步评估本发明人源化抗体和LAG-3结合活性，以本发明人源化优选抗体Ab835为例子，将其和对照抗体Ref进行了平行/重复结合活性（ELISA）评价，实验方法同上述实施例子3。结果见下表。
表10 本发明抗体和LAG-3结合活性（EC50, nM） 或者Biacore(nM) 综合评价
抗体样品 hLAG-3-his结合活性 hLAG-3-hFc结合活性 hLAG-3-D12-his结合活性 hLAG-3-D12-hFc结合活性 猴（cyno）LAG-3-his 结合活性 猴（cyno）LAG-3-hisBiacore检测活性# 猴（cyno）LAG-3-hFc 结合活性 鼠mLAG-3-his结合活性
Ab835 0.12 0.59 0.6 0.8 350 ND# 39 不结合
Ref 0.58 2.4 4.6 3.2 25 12.0 47 不结合
#: Biacore方法同实施例子5，但在running buffer中加500mM NaCl。ND，未能检测到结合信号。
上述结果表明本发明鼠源抗体、及其人源化抗体，优选抗体和人LAG-3-his （单体）, 人LAG3-hFc (二聚体)， 人LAG-3 细胞外loop 1 和loop2 的his 形式（单体），即hLAG-3-D12-his (单体), 以及hLAG-3-D12-hFc (二聚体)形式，都有很好的结合，且其结合活性均比对照抗体Ref要强3-6倍。
此外，本发明抗体和对照抗体同食蟹猴LAG-3 (cynomolgus, cyno-LAG-3-his,购自北京义翘神州科技有限公司, 90841-C08H) 的结合力（ELISA）比同人LAG-3的结合要弱10倍以上。更特别的是，Biacore则检测不到Ab835和cyno-LAG-3-his的结合，即使在Running buffer加了500mM NaCl的高盐条件下也未能看到Ab835和cyno-LAG-3-his的结合。
为了进一步检测本发明抗体和猴LAG-3的结合活性，用cyno-LAG3-hFc包板进行了ELISA检测。具体的，用pH7.4的PBS缓冲液将cyno LAG3-hFc （购自北京百普赛斯生物科技有限公司, 目录号LA3-C5252），稀释至5 ug/ml，50ul/孔的体积加入96孔酶标板（Corning,CLS3590-100EA）中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶（光明脱脂奶粉）封闭液230ul/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜（16-18小时）进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液（PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20）洗板5次后，加入50ul/孔100ug/ml 起始，3倍梯度稀释的Biotin labeled的待测抗体（Biotin Labeling Kit-NH2,同仁化学研究所, Lot. LK740。抗体标记按试剂盒说明书操作）， 37℃ 孵育1小时，PBST洗板5次，加入50ul/孔 1：1000稀释的streptavidin-HRP二抗（金斯瑞生物科技有限公司，南京, 目录号： M00091），37℃孵育1小时。 用PBST洗板5次后，加入50µl/孔TMB显色底物（KPL, 52-00-03），室温孵育5-10min，加入50µl/孔1M H2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪 （ThermoFisher, 51119200）在450nm处读取吸收值，根据OD值计算EC50值。结果（见表10）表明本发明抗体和cyno-LAG-3-hFc （二价形式）的结合活性优于对照抗体。没有看到和cyno-LAG-3-his的弱结合或者不结合作用。 这些数据表明本发明抗体和对照抗体有不一样的结合特点。
此外，表10结果显示本发明抗体和对照抗体一样都不和鼠LAG-3结合。
实施例 10: 本发明抗LAG-3抗体功能活性评价
为了评价本发明抗体用于肿瘤治疗，特别是肿瘤免疫治疗领域的作用，以Ab835为例子，从多方面对本发明抗体的功能活性进行了评价，包括Biacore （实施例子5之方法）检测和hLAG-3的结合和解离速度（见下表11）， 阻止hLAG-3和MHCII结合活性（实施例子4之方法），结果见图3a, 以及激活人T细胞释放细胞因子（T 细胞激活实验）的活性等, 实验方法如下，结果见图3b。
表11 本发明抗体Ab835的 Biacore 亲和力分析
抗体 抗原 Ka(1/ms) Kd(1/s) KD (nM)
Ab835 人LAG-3-his 4.02E+06 2.07E-03 0.52
LAG-3抗体激活人T细胞实验：
实验当天，收集人PBMC (由健康志愿者捐献外周血液中分离)，用含10% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1x106 cell/ml，加入96孔板，85ul/孔，放入培养箱。用培养基配制超抗原（SEB，购自北京康博贝宁科技有限公司），使初始浓度为2ug/ml，每孔加入5ul（使终浓度为100ng/ml）。用培养基按比例配制待测样品，包括阴性抗体，对照抗体。每孔加入10ul，使待测抗体在100ul 体系中的浓度为需要的浓度梯度。细胞培养板置于37℃，5% CO2培养箱孵育3天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出80μl上清进行人IL-2的检测。
IL-2 ELISA检测, 按照试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司; cat:EHC003.96）说明书进行操作，步骤如下:
a.将取出的细胞培养上清以25倍 （不同次实验稀释倍数有不同）稀释后加入酶标板中（100ul/well）；标准品用标本通用稀释液稀释成不同浓度梯度：1000pg/ml、500 pg/ml、 250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.25 pg/ml、15.625 pg/ml，每孔加100μl；空白孔加标本通用稀释液。
b.封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育90分钟。
c.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl生物素抗体工作液，空白孔加生物素化抗体稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育60分钟。
d.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl酶结合工作液，空白孔加酶结合稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，避光孵育30分钟。
e.洗板5次，每次3分钟， 每孔加入100μl显色底物TMB，37℃，避光孵育15分钟 。
f.加入终止液，100μl/孔，混匀后，3分钟内，酶标仪读OD450。
g.结果分析：计算IL-2值，并和空白对照相比，换算成增加百分比（%）来评估样品激活人T细胞活性。
表11结果表明，本发明抗人LAG-3抗体和特异抗原人LAG-3的结合常数（Ka），解离常数(Kd)，以及亲和力KD(0.52 nM)均在合适的治疗性抗体药物所需的合适范围内。特别地，本发明抗体阻断MHCII和人LAG-3的结合IC50 ab835 =2.27nM vs Ref = 2.76nM（图3a）, 以及其阻止LAG-3和MHCII结合从而激活人T细胞活性（释放IL2）EC50 ab835=1.74ug/ml vs Ref=1.56 ug/ml (图3b) 等功能活性至少和临床分子（对照Ref）相当。
实施例 11：本发明抗LAG-3抗体单独和联合PD-1抗体在混合淋巴细胞反应(MLRassay)中的活性检测
用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR assay）检测IL-2分泌的方法来评估了本发明系列抗体在激活人T细胞的活性。即由本发明分离的人血细胞PBMC(由健康志愿者捐献外周血液中分离)诱导得到树突细胞（DC），用得到的DC刺激来自不同志愿者的T细胞。具体地，树突细胞 (Dentritic cells, DC) 培养：在实验第1天，用RPMI1640培养基，接种PBMC于6孔板，每孔2ml，1x106/ml，37 ℃、5% CO2培养箱培养2小时后，轻轻吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入2ml培养基和100ng/ml GM-CSF （Peprotech, Cat#:300-03）和 100 ng/ml IL-4 （Peprotech, Cat#: 200-04），继续培养2天后， 每孔补加1ml新鲜培养基。第5天，每孔补加3μl 100μg/ml的TNF-α，使终浓度为100ng/ml （TNF- α 购自Peprotech, Cat#: AF-300-01A），继续培养2天, 所得树突细胞（DC）用于如下实验。
DC刺激T 细胞（MLR）assay: 用10 ng/ml anti-CD3抗体（Miltenyl Biotec，Cat#: 130-093-387）, 按100ul/well 包被 96-well细胞培养板，37 ℃孵育2小时，用PBS洗一遍。收集上述培养第7天的DC细胞，离心，重悬于10% FBS 的RPMI 1640培养基，计数，配成配成5x104 cell/ml，按90ul/well加入上述anti-CD3 包被好的96-孔板中。取来自不同志愿者的PBMC细胞， 计数，配成5x105 cell/ml， 按90ul/well加入上述anti-CD3 包被并铺有DC细胞的96-孔板中。 用PBS按比例配制待测样品，包括阴性抗体，对照抗体，PD-1抗体（根据Keytruda和/或Opdivo公开的序列，由本发明按实施例1克隆、表达纯化得到）加入上述96孔板中，20ul/孔单独抗体，或者抗LAG-3抗体+ PD-1抗体（1ug/ml）各10ul/孔。使待测抗体在200ul 体系中的浓度为需要的浓度梯度。对照组 = 90 ul PBMC细胞+ 90 ul DC+20ulPBS。细胞培养板置于37℃，5% CO2培养箱孵育3天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出150μl上清进行人IL-2的检测。
IL-2 ELISA检测, 按照试剂盒（上海欣奥盛生物科技有限公司cat: EHC003.96）说明书进行操作，步骤如下:
a.将取出的细胞培养上清加入酶标板中（100ul/well）；标准品用标本通用稀释液稀释成不同浓度梯度：1000pg/ml、500 pg/ml、 250 pg/ml、 125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.25pg/ml、15.625 pg/ml，每孔加100μl；空白孔加标本通用稀释液。
b.封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育90分钟。
c.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl生物素抗体工作液，空白孔加生物素化抗体稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育60分钟。
d.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl酶结合工作液，空白孔加酶结合稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，避光孵育30分钟。
e.洗板5次，每次3分钟， 每孔加入100μl显色底物TMB，37℃，避光孵育15分钟 。
f.加入终止液，100μl/孔，混匀后，3分钟内，酶标仪读OD450。
g.结果分析：计算IL-2值，并和空白对照相比，换算成增加百分比（%）来评估本发明抗体的活性。结果见图4。
图4结果表明， 对照抗体Ref 和本发明抗人LAG-3抗体Ab835单独在低浓度的时候看不到刺激IL-2分泌的变化，只有到高达10ug/ml的时候，能看到IL-2的分泌量增加了大约20%。 当加入1ug/ml PD-1抗体（本发明表达的Keytruda）的时候，刺激T细胞分泌IL-2有了30% - 40%的增加, 图中的 (0.4 ug/m Ref + PD-1) vs 0.4 ug/ml Ref, 以及 (0.4ug/ml ab835 + PD-1) vs 0.4 ug/ml ab835)。在有1mg/ml PD-1抗体的情况下，增加LAG-3抗体的量，即Ref 或ab835, 都能看到比较好的刺激T细胞分泌IL-2量的增加，且呈剂量依赖。
2 ug/ml ab835 +1 ug/ml PD-1抗体激活T 细胞释放IL-2增加比例接近60%， 这比同剂量的Ref + 1 ug/ml PD-1抗体激活T细胞活性（45%）要稍好点。而单独2 ug/mlab835和Ref都看不到IL-2增加。
10 ug/ml ab835 +1 ug/ml PD-1抗体激活T 细胞释放IL-2增加比例接近80% 比单独10ug/ml ab835提高了40%多。而且，这比同剂量Ref+PD-1抗体增加的比例（60%）要强。
综合本发明数据表明，发明人通过创新性筛选，意外发现了一类（至少两株）抗人LAG-3抗体，它们结合活性好，和非人灵长类LAG-3结合特性特别，并且单独或者和PD-1抗体联合均能有效地激活人T细胞，可提高单独PD-1抗体激活人T细胞的活性。本发明抗体比目前临床上的抗体（对照抗体Ref）有更好的活性，以及不同的结合特点，更好的联合PD-1抗体激活细胞的活性，使其适合用于针对人LAG-3靶点抗体药物开发，并且作为候选药物可单独或者联合，特别是联合PD-1抗体治疗肿瘤提供了新的，甚至是更好的选择。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 抗LAG-3人源化单克隆抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途
<130> 2018--7-31
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> Mus musculus
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<400> 31
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
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325
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<213> artificial, humanized
<400> 33
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<213> artificial, humanized
<400> 55
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Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445

Claims (19)

1.一种LAG-3抗体分子，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL包含如SEQID NO:9所示的VLCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列和如SEQ IDNO:12所示的VLCDR3氨基酸序列；和，所述VH包含如SEQ ID NO:13所示的VHCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:15所示的VHCDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO:17所示的VHCDR3氨基酸序列；或
所述VL包含如SEQ ID NO:10所示的VLCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:11所示的VLCDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO:12所示的VLCDR3氨基酸序列；和，所述VH包含如SEQ ID NO:14所示的VHCDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:16所示的VHCDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO:17所示的VHCDR3氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的LAG-3抗体分子，其中所述LAG-3抗体分子为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO:5、或如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或，所述鼠源抗体分子的重链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的LAG-3抗体分子，其中，所述鼠源抗体分子的轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，和所述鼠源抗体分子的重链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或，所述鼠源抗体分子的轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和所述鼠源抗体分子的重链可变区氨基酸序列为如SEQID NO:8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的LAG-3抗体分子，其中所述LAG-3抗体分子还包含鼠或人抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区；所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
5.根据权利要求4所述的LAG-3抗体分子，其中所述LAG-3抗体分子为由鼠源抗体分子的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体分子。
6.根据权利要求5所述的LAG-3抗体分子，其中所述嵌合抗体分子的轻链氨基酸序列由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成；所述嵌合抗体分子的重链氨基酸序列由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成；或
所述嵌合抗体分子的轻链氨基酸序列由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成，所述嵌合抗体分子的重链氨基酸序列由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1所述的LAG-3抗体分子，其中所述LAG-3抗体分子为人源化抗体分子。
8.根据权利要求7所述的LAG-3抗体分子，所述人源化抗体分子的轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述人源化抗体分子的重链可变区序列包含如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50-57中任一个所示的氨基酸序列；或，
所述人源化抗体分子的轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述人源化抗体分子的重链可变区序列包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或，
所述人源化抗体分子的轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，所述人源化抗体分子的重链可变区序列包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或，
所述人源化抗体分子的轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述人源化抗体分子的重链可变区序列包含如SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50-54所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的LAG-3抗体分子，其中所述人源化抗体分子的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区；和/或包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。
10.根据权利要求9所述的LAG-3抗体分子，其特征在于，所述人源化抗体分子的轻链为SEQ ID NO:58的序列和重链为SEQ ID NO:59的序列；或，
所述人源化抗体分子的轻链为SEQ ID NO:60的序列和重链为SEQ ID NO:61的序列；或，
所述人源化抗体分子的轻链为SEQ ID NO:58的序列和重链为SEQ ID NO:62的序列。
11.根据权利要求1所述的LAG-3抗体分子，其中所述LAG-3抗体分子包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
12.一种DNA分子，其编码权利要求1至11中任一项所述的LAG-3抗体分子。
13.一种表达载体，其表达权利要求12所述的DNA分子。
14.一种生产抗体的方法，其包括用表达载体转化可表达权利要求1至11中任一项所述的LAG-3抗体分子的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的生产抗体的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
16.根据权利要求15所述的生产抗体的方法，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的LAG-3抗体分子和任选地药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。
18.根据权利要求1至11中任一项所述的LAG-3抗体分子或者权利要求17所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物上的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，所述癌症为肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、白血病，或癌症的转移性病灶。
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