CN116355095A - 靶向tigit的抗体和双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其包括轻链可变区和/或重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合人TIGIT，并具有阻断PVR和TIGIT结合的功能；所述轻链可变区包含：如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR3；所述重链可变区包含：如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的CDR3。所述靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体具有相比于现有技术更好的亲和力和更好的功能。

Description

靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体及其应用。
背景技术
TIGIT(含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是一种抑制性受体蛋白，也称为WUCAM、Vstm3或VSIG9，与CD155等蛋白结构相似，统称为CD155家族。TIGIT是Ⅰ型跨膜蛋白，在T细胞(包括活化的T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞和滤泡性T辅助细胞)和NK细胞上表达，在抑制T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫功能活性方面起着重要作用。成熟人TIGIT的氨基酸序列含有223个氨基酸(aa)残基(NCBI登录号：NM_173799)。成熟人TIGIT的细胞外结构域(ECD)由以下组成：120个氨基酸残基，其具有V型Ig样结构域、随后是21个氨基酸跨膜序列、和具有基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的82个氨基酸细胞质结构域。在ECD内，人TIGIT分别与小鼠和食蟹猴具有59％和87％的序列同源性。
已知TIGIT与脊髓灰质炎病毒受体(PVR；CD155)、nectin2(CD112)CD96、CD226之间保持着一种“多对多”的相互作用关系。TIGIT参与了一个复杂的调控网络，设计多个受体、一个竞争性共刺激受体(CD226)和多个配体(如CD155、CD112)。这些配体主要在APC(如树突细胞和巨噬细胞)和肿瘤细胞上表达。作为免疫“检查点”分子，Tigit在被其配体CD155和CD112结合时启动免疫细胞中的抑制性信号传导。Tigit与CD155的结合亲和力(Kd：约1nM)远远高于CD112，并且TIGIT:CD112相互作用在介导抑制性信号时是否在功能上相关仍有待确定。
TIGIT通过多种机制潜在地抑制固有和适应性免疫：1.TIGIT-CD155结合后，表达CD155的树突状细胞(DC)可能具有致耐受性，降低IL-12的产生和IL-10的增加；2.TIGIT抑制NK细胞脱颗粒、细胞因子生成和NK细胞介导的肿瘤细胞毒性，TIGIT作用于Tregs，增强免疫抑制功能和稳定性。3.TIGIT可以破坏细胞表面的DNAX辅助分子1(DNAM-1)顺式二聚化，从而阻止DNAM-1与CD155的相互作用。TIGIT阻碍CD155介导的CD226活化。4.与DNAM-1相比，TIGIT以更高的亲和力结合CD155，因此可能会于DNAM-1竞争而与CD155相互作用。5.TIGIT还可以通过其胞质尾部直接将抑制信号传递给T细胞和NK细胞。
TIGIT和其它这样的共-抑制性分子(例如，CTLA-4、PD-1、Lag3和BTLA)在肿瘤细胞逃脱免疫监视中起作用。类似于其它共-抑制性受体例如CTLA-4、PD-1和BTLA，TIGIT可起“关闭”免疫反应的作用。在小鼠模型中，PD-L1和TIGIT二者的抗体阻断导致协同提高CD8+T细胞介导的肿瘤排斥。Grogan et al.(2014)J.Immunol.192(1)Suppl.203.15；Johnstonet al.(2014)Cancer Cell 26:1-15。在黑素瘤的动物模型中得到类似结果。
TIGIT在多种肿瘤浸润淋巴细胞中表达上调，例如黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、急性髓细胞性白血病(AML)和多发性骨髓瘤等。TIGIT的高表达与肿瘤进展、预后不良相关。有研究发现在结直肠癌组织中发现TIGIT和CD155的阳性表达率与肿瘤分化程度、病理分期及淋巴结转移相关。Wang等2018，ClinImmunol,190:64-73在AML患者中发现PD-1+和TIGIT+CD8+T细胞的频率增加，CD226+CD8+T细胞降低。进一步分析显示，PD-1+和TIGIT+和CD226 low CD8+T细胞亚群与诱导化疗失败和FLT3-ITD突变相关，而后者与预后不良相关。Hutten等2018，Biol Blood Marrow Transplant,24(4):666-677在接受同种异体干细胞移植患者中检测T细胞亚群免疫检查点的表达谱，与处在缓解期患者相比，术后复发患者PD-1、TIGIT和KLRG-1在MiHA反应性CD8+T细胞上共表达更高。Liu等2019，CancerImmunol Immunother,68(12):2041-2054研究发现乙型肝炎病毒致肝细胞癌(HBV-HCC)患者PD-1和TIGIT在CD4+、CD8+T细胞的表达显著上调，晚期和进展期患者PD-1+TIGIT+CD8+T细胞群升高，并且与总生存率和无进展生存率呈负相关。这些研究显示出TIGIT对患者预后评估的参考价值，为TIGIT作为免疫治疗靶标提供了重要依据。
因此，TIGIT是被寄予厚望的新的靶点，与PD-L1联合是未来有前途的抗癌治疗策略。已有的抗体绝大部分为靶向TIGIT靶点的单克隆抗体或者抗TIGIT单抗与其他靶点单抗联合使用，存在成本高，副作用大，临床效果有限等问题，而仅有的双特异性抗体BMS/Agenus的AGEN1777和信达/礼来的IBI321双特异抗体仅处于临床试验早期阶段。
发明内容
针对现有技术中已有抗体绝大部分为靶向TIGIT靶点的单克隆抗体或者抗TIGIT单抗与其他靶点单抗联合使用，存在成本高，副作用大，临床效果有限的缺陷，且尚无进入后期临床试验的TIGIT双特异性抗体。本发明提供了一种靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体及其应用。所述靶向TIGIT的抗体能很好地结合人TIGIT蛋白和hTIGIT+细胞，与两个靶点抗原的亲和力强，能有效的阻断人TIGIT和人PVR的结合，能协同增强T细胞活性，促进IL-2释放，且协同作用优于联合给药组；可有效地抑制肿瘤细胞的生长；亦能和非人灵长类TIGIT结合，特别是为联合PD-1抗体治疗肿瘤提供了新的，甚至是更好的选择。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其包括轻链可变区和/或重链可变区；所述轻链可变区包含：如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR3；所述重链可变区包含：如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQID NO:9所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的CDR3，上述CDR是以CCG定义的CDR序列，以CCG和其他定义确定的CDR序列信息见下表a-e。
表a本发明抗TIGIT抗体mab22按CCG定义的CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 GFTFSSYTMS(SEQ ID NO:8)
重链CDR2 EISSSGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:9)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表b本发明抗TIGIT抗体mab22按Kabat定义CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 SYTMS(SEQ ID NO:11)
重链CDR2 EISSSGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:9)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表c本发明抗TIGIT抗体mab22按AbM定义CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 GFTFSSYTMS(SEQ ID NO:8)
重链CDR2 EISSSGGSTY(SEQ ID NO:12)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表d本发明抗TIGIT抗体mab22按Chothia定义CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 GFTFSSY(SEQ ID NO:13)
重链CDR2 SSSGGS(SEQ ID NO:14)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表e本发明抗TIGIT抗体mab22按Contact定义CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 VHNSGNTYLEWY(SEQ ID NO:15)
轻链CDR2 LLIYKVSNRF(SEQ ID NO:16)
轻链CDR3 FQFSHVPR(SEQ ID NO:17)
重链CDR1 SSYTMS(SEQ ID NO:18)
重链CDR2 LVAEISSSGGSTY(SEQ ID NO:19)
重链CDR3 ARPGLGAWFA(SEQ ID NO:20)
在本发明一较佳实施方案中，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23-25或其突变所示的氨基酸序列；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述结合蛋白对TIGIT的结合。
在本发明一较佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:26-27或其突变所示的氨基酸序列；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述结合蛋白对TIGIT的结合。
优选地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本发明一较佳实施方案中，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段是抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。优选地，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区。更优选地，所述人源抗体轻链恒定区为κ或者λ型轻链恒定区，和/或，所述人源抗体重链恒定区为hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4的重链恒定区或其突变。
在本发明一较佳实施方案中，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其突变，和/或，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其突变。
优选地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中，所述第一蛋白功能区为如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段；所述第二蛋白功能区为非靶向TIGIT的抗体。优选地，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区分别选自免疫球蛋白、scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2，且所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区中至多只有一个蛋白功能区为免疫球蛋白。更优选地，当所述第二功能区的结构为免疫球蛋白时，所述免疫球蛋白的恒定区包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区。进一步更优选地，所述人抗体轻链恒定区为κ链或者λ链，所述人抗体重链恒定区为hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4或其突变。
在本发明一较佳实施方案中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scFv，所述scFv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接。
优选地，所述scFv通过连接子与所述免疫球蛋白连接，所述连接子优选为(G4S)w，所述w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4。
更优选地，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
在本发明一较佳实施方案中，所述连接子为(G4S)3，和/或，所述scFv的数量为两个，且两个scFv对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；所述scFv连接免疫球蛋白的重链。
优选地，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，所述scFv的轻链可变区的C末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的N末端连接，所述scFv的重链可变区的C末端通过所述连接子与所述免疫球蛋白重链的N末端连接；或，所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，所述scFv的轻链可变区的N末端与所述连接子连接，所述连接子再与重链可变区的C末端连接，所述scFv的重链可变区的N末端与所述免疫球蛋白重链的C末端连接。
在本发明一较佳实施方案中，所述第二蛋白功能区靶向PD-1/PD-L1、Claudin18.2、TIM-3或LAG-3。
优选地，所述第二蛋白功能区为靶向PD-1/PD-L1的抗体。
更优选地，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab。
进一步更优选地，当所述scFv连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端时，所述重链的C末端由K突变为A；和/或，所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv或其突变，其中，所述scFv的轻链可变区为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab的重链可变区，所述突变优选与原氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，并且保持或改善了所述抗体的功能。
在本发明一较佳实施方案中，所述靶向TIGIT的双特异性抗体选自以下组：
(i)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv，所述连接子为(G4S)3；
其中，所述scFv的数量为两个；所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scFv的重链可变区的C末端通过(G4S)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端，且所述C末端由K突变为A；或，
(ii)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv，所述连接子为(G4S)3；
其中，所述scFv的数量为两个；所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scFv的重链可变区的N末端分别通过(G4S)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端。
在本发明一具体实施方案中，所述靶向TIGIT的双特异性抗体包括以下氨基酸序列：
氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:33所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:34所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:35所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:36所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:37所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:38所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:39所示的含重链的氨基酸序列。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种分离的核酸，其编码如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种包含根据技术方案之三所述的分离的核酸的表达载体。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种宿主细胞，其包含根据技术方案之四所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：一种靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体的制备方法，其包含培养如技术方案之五所述的宿主细胞，从培养物中获得所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之七为：一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之八为：一种药物组合物，其包含如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、如技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、和/或如技术方案之七所述的抗体药物偶联物。
优选地，所述药物组合物还包含靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab和/或Avelumab。
更优选地，所述药物组合物包含靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、和靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Atezolizumab。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之九为：一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A包含如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、如技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、和/或如技术方案之七所述的抗体药物偶联物；
药盒B包含靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab和/或Avelumab。
优选地，所述药盒A包含靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述药盒B包含靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Atezolizumab。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十为：如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、技术方案之七所述的抗体药物偶联物、技术方案之八中所述的药物组合物和/或如技术方案之九所述的药物组合在制备诊断、治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
优选地，所述癌症为实体肿瘤或液体肿瘤，所述实体肿瘤例如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、肝癌、上皮鳞状细胞癌、食道癌、直肠癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤，所述液体肿瘤例如急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十一为：如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、技术方案之七所述的抗体药物偶联物、技术方案之八中所述的药物组合物和/或如技术方案之九所述的药物组合在诊断、治疗和/或预防癌症中的应用。
优选地，所述癌症包括实体肿瘤和/或液体肿瘤，所述实体肿瘤例如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、肝癌、上皮鳞状细胞癌、食道癌、直肠癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤，所述液体肿瘤例如急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十二为：用于诊断、治疗和/或预防癌症的如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、技术方案之七所述的抗体药物偶联物、技术方案之八中所述的药物组合物和/或如技术方案之九所述的药物组合。
优选地，所述癌症包括实体肿瘤和/或液体肿瘤，所述实体肿瘤例如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、肝癌、上皮鳞状细胞癌、食道癌、直肠癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤，所述液体肿瘤例如急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十三为：一种如技术方案之一所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如技术方案之二所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体的制剂，
所述制剂包括柠檬酸-柠檬酸钠、吐温80和所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。优选地，所述制剂还包括精氨酸、谷氨酸和海藻糖中的一个或多个。
在本发明一具体实施方案中，所述制剂的pH为5.5-6.5。
在本发明一优选实施方案中，所述制剂包括20mM的柠檬酸-柠檬酸钠、50mM的精氨酸、50mM的谷氨酸、200mM的海藻糖、0.02％的吐温80和14.2mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0。
在本发明一具体实施方案中，所述制剂包括20mM的His-HCI、50mM的精氨酸或谷氨酸、200mM的海藻糖、0.02％PS80和11.4mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0。
在本发明一具体实施方案中，所述制剂包括20mM的His-HCI、125mM的甘氨酸、125mM的海藻糖、0.02％PS80和11mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0。
在本发明一具体实施方案中，所述制剂包括20mM的His-HCI、50mM的精氨酸盐酸盐、150mM的海藻糖、0.02％吐温80和11.6mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0。
本发明中，“靶向TIGIT”和“抗TIGIT”均指对TIGIT具有结合特异性，可以互相替代使用。
应了解，本发明“第一”、“第二”均无实际意义，仅为区分相同的术语。在提及scFv或细胞因子或细胞因子受体或Fab’或F(ab’)2的数量时，“一对”和“两个”、“两对”和“四个”具有相同的含义。在提及轻链或重链或轻链可变区或重链可变区的数量时，“一个”和“一条”、“两个”和“两条”具有相同的含义。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”，通常是指由两对多肽链(每对具有一条轻(L)链和一条重(H)链)组成的免疫球蛋白。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域[称为互补决定区(CDR)]，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对应的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat EA.Et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991)]，或Chothia&Lesk 1987)].Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:877-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9或12个。例如在本发明的双特异性抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的N端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见Fundamental Immunology,Ch.7，Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其全文通过引用合并入本文。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链结合片段(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“Fab”意指由VL、VH、CL和CH1(或者CH)结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2”意指包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链结合片段(例如，scFv)，其中VL和VH通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见例如Bird等人，Science242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
本领域技术人员可使用常规技术(例如重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得其抗原结合片段(例如上述抗体片段)，并且用与筛选完整抗体的方式相同的方式对抗原结合片段进行特异性筛选。
如本文中所使用的，术语“分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞和HEK 293细胞等的人或动物细胞。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数(KD)，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于约10-5M，例如小于约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。例如用KINEXA方法在KINEXA 400仪器上检测到的抗体和细胞结合的亲和力。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所述靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体具有相比于现有技术更好的亲和力，和更好的功能。本发明所述靶向TIGIT的抗体人源化程度高，免疫原性低，与非人灵长类抗原结合，临床前安全性评价便利。本发明所述双特异抗体的结构简单，类似常规抗体IgG的结构的双特异抗体，使得纯化简单易行；分子稳定，为后期开发提供极大便利；表达量高，成本低；保留了双靶点的结合及阻断活性；增强T细胞功能活性及小鼠体内药效较佳，优于联合给药。
附图说明
图1为本发明部分优选人源化抗体阻断hTIGIT与PVR结合的活性。
图2为本发明部分优选双特异抗体SDS-PAGE图。
图3为本发明优选双特异抗体40℃处理28天后SDS-PAGE检测结果。
图4为本发明优选双特异性抗体诱导活化T细胞释放IL-2的活性。
图5为本发明优选人源化抗体和双特异抗体抗肿瘤活性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：抗原，抗体的克隆，表达和纯化
本发明所用的抗原或购自如下公司：北京义翘神州科技有限公司cyno TIGIT-hFc(Cat#MB12OC2203)，mouse TIGIT-his(Cat#MB09AP0804)，或泰州市百英生物科技有限公司PD-L1/mFc(Cat#1576)，或由本发明表达纯化得到。表达的人TIGIT(-his、-Fc Tag或者-mFctag)序列为NCBI Reference Sequence：NP_776160.2，全长244个氨基酸,其中1-21位氨基酸为信号肽；胞外(ECD)区域为22-141位氨基酸；胞外(ECD)区域32-42位氨基酸为同源二聚体形成区，39-127位氨基酸为Ig区，32位和101位为糖基化位点。表达的恒河猴TIGIT(RhTIGIT-mFc tag)序列为NCBI Reference Sequence:XP_014985302.2，全长为245个氨基酸，其中1-21位氨基酸为信号肽；39-128位氨基酸为Ig区。
人CD155(PVR，hFc tag)蛋白序列为GenBank:AAA36462.1，全长392个氨基酸,其中1-20位氨基酸为信号肽；胞外(ECD)区域为21-343位氨基酸。其中43-142位氨基酸为Ig1_PVR_like区，145-240位氨基酸为Ig2_Nectin-2_like区。
人PD-1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_005009.2，全长288个氨基酸，其中第1-20位为信号肽；ECD为第21-167位氨基酸。
人PD-L1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_054862.1，全长290个氨基酸，其中第1-18位为信号肽；ECD为第19-239位氨基酸。
本发明所用hFc tag抗原均是在C-端连接IgG1 Fc区域，his tag抗原为在C-端连接6×his。mFc tag抗原均是在C-端连接mIgG2a Fc区域。
本发明所用抗体，包括阳性对照抗体Ref1(即罗氏RG6058,序列来自WO2015009856A2，#19轻链，#17重链)和阳性对照抗体Ref2(即BMS的22G2,序列来自WO2016/106302A1，#9轻链，#7重链)均由本发明表达纯化。
表达所用pTT5载体(Bio Vector，Cat#102762)。将所表达的重组蛋白，抗体轻、重链序列克隆到pTT5载体上，经瞬时转染HEK293E细胞(Life Technologies，Cat#11625019)表达，后纯化得到。
具体地，293细胞在SMM 293-TⅡExpression Medium(北京义翘神州科技股份有限公司，Cat#M293TⅡ)培养基中扩培。瞬转开始48h前，调节细胞浓度至1×106cells/ml，于摇床中培养48h，培养条件为36.5℃，6％CO2，120rpm。转染前再次镜检存活率>95％，细胞浓度在4×106cells/mL。
准备300mL细胞，15mL Gibco FreeStyle 293Expression Medium(Gibco，Cat#12338018)溶入重链、轻链质粒分别为90μg和60μg(如果是重组蛋白，单个质粒用量为150μg)，0.22μm过滤除菌。再取15mL FreeStyle 293Expression Medium溶入1mg/mL PEI(Polysciences Inc，Cat#23966-2)600μL后静置5min。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，37℃，8％CO2摇床培养5天收样，8000g离心10min取上清进行纯化。
抗体或-Fc融合蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质，用PBS pH7.4平衡含有Protein A(Mabselect,GE Healthcare Life Science，Cat#71-5020-91AE)的重力柱(生工生物，Cat#F506606-0001)，2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱，控制流速，保留时间为5min。用5-10倍柱体积的PBS(生工生物，Cat#B548117-0500)冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度。
His Tagged蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质；平衡镍柱(Ni smart beads6FF，常州天地人和生物科技有限公司，Cat#SA036010)，用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)溶液平衡镍柱，2-5倍柱体积冲洗。将待纯化上清过柱。控制流速，使其保留时间为5min。漂洗杂蛋白：使用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)溶液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mM咪唑0.5M NaCl的PBS(pH7.4)洗脱目的蛋白。
Buffer置换：将洗脱、中和后的hFc/mFc tag或洗脱的his tag蛋白过超滤管，12000g离心10min，(超滤管，Merck Millipore，Cat#UFC500308)，如体积较大，可反复离心直至所有蛋白均浓缩，加入PBS，离心2次，尽量去除残留的buffer，将超滤管倒置在新的收集管中，低速离心1min后，再补加1mL PBS，测定浓度，分装、储存备用。
实施例2：过表达细胞株构建及细胞活性(ELISA)检测
本发明所用的过表达细胞株CHO-K1-T1001系本发明人通过本公司的稳定细胞株构建平台自行构建完成，具体构建过程如下：实验开始第1天，将293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#GNHu17)接种于两个6cm培养皿，7.5×105细胞/皿。第2天将包装质粒pGag-pol和pVSV-G(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人TIGIT基因的质粒pTBE1001各4μg加入OPTI-MEM(Thermofisher Scientific，Cat#31985070)，使最终体积为200μL，另准备200μL OPTI-MEM加入36μL转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#F210)，二者混匀，室温放置5min，然后将混合物(每皿各200μL)滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4mL DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#L130KJ)。第4天将5×105个CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Cat#SCSP-507)接种于10cm培养皿。第5天收集293T细胞上清(病毒)，用0.45μm滤膜过滤至CHO-K1细胞，同时加入10μg/mL polybrene(上海翊圣生物科技有限公司，Cat#40804ES76)，混匀后放置培养箱，3～4h后将培养基换为含10％FBS的DMEM/F12(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#L310KJ)。第7天将细胞传代，从第8天开始，细胞中加入10μg/mL puromycin进行筛选(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#S250J0)。2-3天后细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。
本实施例子所用的人TIGIT(pTBE1001)的氨基酸序列NP_776160.2，全长244个氨基酸,其中1-21位为信号肽；第22-244位为本发明构建CHO-K1 TIGIT+细胞系所表达的蛋白序列。
TIGIT+细胞结合活性(ELISA)检测：
将上述实施例得到的人TIGIT过表达的单克隆细胞株扩培后，按10×104细胞/孔铺96孔板，37℃培养箱过夜贴壁后去除上清，每孔加入100μL免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司，Cat#P0098)，室温固定半小时。100μL 1×PBS(上海源培生物科技股份有限公司，Cat#B320)洗一次，加入230μL 5％牛奶，37℃封闭3小时，230μL0.05％PBST洗3次。每孔加入50μL，10μg/mL起始，5倍梯度稀释的待测抗体或阳性对照抗体。37℃孵育1小时，230μL 0.05％PBST洗5次。加Anti-human HRP(Jackson Immuno Research，Cat#109-035-003)1:2500，50μL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗5遍，每孔加入50μL TMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)，室温显色，加入50μL/孔1MH2SO4终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119300)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例3：抗TIGIT/PD1/PD-L1抗体和TIGIT/PD1/PD-L1结合实验(ELISA)
用pH7.4的PBS缓冲液将人TIGIT-hFc、TIGIT-his、恒河猴猴TIGIT-mFc(RhTIGIT-mFc)、食蟹猴TIGIT-hFc(cyno TIGIT-hFc)、小鼠TIGIT-his(muTIGIT-his)或PD1和PD-L1等重组蛋白稀释至5μg/mL或2μg/mL，以50μL/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat#CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μL/孔，37℃孵育箱中孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(1×PBS，pH7.4，含0.05％Tweeen20)洗板5次后，每孔加入50μL上清(含检测抗体)或10μg/mL起始，5倍梯度稀释的待测抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，加入1：2500稀释的Anti-mouse Fc-HRP或Anti-human Fc-HRP二抗(JacksonImmuno Research，Cat#115-035-003或109-035-003)，50μL/孔，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，每孔加入50μL TMB显色底物(KPL，Cat#52-00-03)，室温显色10-15min，每孔加入50μL 1MH2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher,型号：51119300)读OD450，根据OD值挑选结合活性高的克隆或者计算EC50值(对浓度已知的抗体)。
实施例4：抗TIGIT抗体阻止TIGIT和CD155结合活性实验
用pH7.4的PBS缓冲液将人TIGIT-hFc稀释至5μg/mL，以50μL/孔加入96孔酶标板(Corning，Cat#CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用1×PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液230μL/孔，37℃孵育箱中封闭3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(1×PBS，pH7.4，含0.05％Tweeen20)洗板5次后，稀释Bio-CD155至4μg/mL，取30μL Bio-CD155和30μL上清(含检测抗体)或30μL 100μg/mL起始，3倍梯度稀释的待测抗体混匀后，取50μL至包被的TIGIT-hFc板中，37℃孵育箱孵育1小时，洗板5次后每孔加入50μL 1：1000稀释的streptavidin-HRP二抗(genscript，Cat#M00091)，37℃孵育1小时，后PBST洗5遍，每孔加入50μL TMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo，型号：51119300)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例5：抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD1和PD-L1结合活性实验
用pH7.4的PBS缓冲液将人PD1稀释至2μg/mL，以50μL/孔加入96孔酶标板(Corning，Cat#CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用1×PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液230μL/孔，37℃孵育箱中封闭3小时或4℃过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(1×PBS，pH7.4，含0.05％Tweeen20)洗板5次后，稀释PD-L1/mFc至0.4μg/mL，取30μL稀释的PD-L1/mFc和30μL适当浓度起始，3倍梯度稀释的待测抗体混匀后，取50μL至包被的PD1板中，37℃孵育箱中孵育1小时，洗板5次后每孔加入50μL1：2500稀释的Goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP二抗(Jackson，Cat#115-035-003)，37℃孵育1小时，后PBST洗5遍，每孔加入50μL TMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)显色，加入50μL/孔1M H2SO4终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119300)读OD450，Graphpadprism5进行数据分析。
实施例6：双夹心ELISA方法检测双特异抗体同时结合PD-L1和TIGIT活性
用pH7.4的PBS稀释LT023(TIGIT/his，上海健信生物医药科技有限公司自产)至7μg/mL，加至96孔ELISA板，100μL/孔，4℃过夜孵育。弃去液体后，PBST(1×PBS，pH7.4，含0.05％Tweeen20)洗板1次，250μL/孔。用230μL 5％的脱脂乳，37℃封闭3h。弃去封闭液，PBST洗板3次，250μL/孔。96孔ELISA板封闭的同时，稀释待测抗体，起始浓度为10μg/mL，5倍梯度稀释，稀释7个点，第8个点以稀释液为空白对照，将稀释好的待测抗体按100μL/孔加至ELISA板中，1个复孔，37℃孵育1.5h。PBST洗板4次后，将PD-L1/mFc用抗体稀释液稀释至0.1μg/mL，加至ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗板4次，用抗体稀释液将anti-mFc-HRP(Jackson Immuno Research，Cat#115-035-003)按1：2500的比例稀释，加至ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗板4次，加入TMB(Surmodic，Cat#TTMB-1000-01)显色液100μL/孔，室温显色8min后，加入1M的H2SO4 100μL/孔以终止反应。酶标仪MultiskanGO(Thermo，型号：51119300)读OD450，Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例7：抗人TIGIT抗体的发现
本发明用人TIGIT-his(北京义翘神州生物技术有限公司，Cat#10917-H08H)作为抗原，弗式佐剂免疫A/J小鼠4次后充免，三天之后电融合并筛选融合杂交瘤，从数千株杂交瘤克隆中筛选，意外发现该次融合中多达467株杂交瘤克隆和TIGIT有较好的结合活性。本发明用实施例4中的方法进一步筛选得到能很好地阻断TIGIT和PVR结合的单克隆细胞株，从中得到鼠源抗体。具体地，实验用A/JGpt小鼠，雌性，4周龄，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，动物品系编号：N000018。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。小鼠分成3只/组/笼。用购买的TIGIT-his抗原进行免疫。首免佐剂为弗式完全佐剂(Sigma-Aldrich，Cat#SIGMA F5506-10M)，从二免开始佐剂为弗式不完全佐剂(Sigma-Aldrich，Cat#SIGMA F5881-10M)。抗原与佐剂比例为1：1。100μL/25μg/只首免，100μL/12.5μg/只二免、三免、四免，小腿肌肉注射。融合前3天，100μL/25μg/只加强免疫。免疫时间为第0、14、28、42和56天(加强免疫)。于第36，50天，用上述实施例3的ELISA方法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure BDA0003436690930000172
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板，筛选，优选克隆。
对杂交瘤细胞株进行初次筛选，用实施例3的ELISA方法检测杂交瘤细胞株分泌上清中的抗体和人TIGIT的结合活性，并选择活性好的克隆，取上清用实施例4所述方法检测所分泌的抗体阻断hTIGIT和hPVR的结合活性(Blocking活性)，发现有56株克隆均具有很好的阻断效果，部分结果见表1。本发明综合结合活性及阻断活性，优选14株杂交瘤细胞株进行3轮有限稀释，且每轮有限稀释均利用实施例2、实施例3和实施例4中的方法进行优选，最终得到6株单克隆细胞株，结果如表2所示。
表1杂交瘤融合筛选单克隆细胞结合活性及阻断活性(OD450)
Figure BDA0003436690930000171
Figure BDA0003436690930000181
表1中列出了部分初次筛选数据。数据显示，很多杂交瘤融合细胞在初始筛选时表现出了很高的结合活性及很好的阻断效果(接近ref甚至更好，ELISAbinding值越高表示亲和力越好，blocking数值越低，表明blocking活性越好)，比如3A10、6H4、7H4、11A4、17A10和23H3等克隆。对优选的14株克隆(包括以上6株)进行多次有限稀释，每一轮稀释后7-10天待克隆增殖后，用ELISA方法重新检测各个克隆所分泌抗体(上清)的结合活性和blocking活性，并利用实施例2中的方法检测融合细胞与稳定表达人TIGIT的CHO-K1细胞的结合情况，进一步优选，最终得到6株单克隆细胞株分泌的上清(抗体)对人TIGIT有很好的结合活性，且能很好地阻断人TIGIT与人PVR的结合(结果如表2所示)。
将上述6株单克隆细胞扩增后计数，取1*10^7cells/200μL注射入小鼠腹腔，小鼠饲养6天后收腹水，用实施例1中的方法纯化后分别得到IF071、IF081、IF091、IF101、IF112和IF122 6个鼠源抗体。然后利用实施例2、3和4中的方法，评价6个鼠源抗体与人TIGIT、食蟹猴TIGIT和鼠TIGIT及稳定表达TIGIT的CHO-K1细胞(CHO-K1-T1001)的结合活性及阻断活性，结果如表3所示。结果显示，IF071、IF081、IF091、IF101、IF112和IF122均不与鼠TIGIT结合，IF081不与cynoTIGIT结合，且IF091与hTIGIT、cyno TIGIT和CHO-K1-T1001的结合活性及阻断hTIGIT与hPVR结合的活性，在6个鼠源抗体中均为最优，更佳地，IF091与CHO-K1-T1001的结合活性较Ref1好1.73倍，IF091阻断hTIGIT结合hPVR的活性较Ref1好1.83倍。提取IF091的序列，即为本发明优选鼠源mab22的抗体序列。
表2杂交瘤融合筛选单克隆细胞活性(OD450)
克隆号 与hTIGIT结合活性 阻断hTIGIT与hPVR结合的活性
3A10B3D6B3 2.06 0.0586
23H3G9B6D3 1.53 0.0604
17A10D2B3F9 1.28 0.0611
6H4E3C4D5 2.01 0.0578
7H4E11E8F3 1.76 0.0703
11A4B11D2G9 2.00 0.113
表3优选鼠源抗体活性
Figure BDA0003436690930000182
Figure BDA0003436690930000191
ND：未能检测到信号。
实施例8：本发明鼠源抗人TIGIT抗体mab22抗体序列提取、分析鉴定
从杂交瘤优选得到的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员常用的方法。具体地，收集上述单克隆细胞株，扩增培养后，取1×106个细胞，用Trizol(Invitrogen，Cat#15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA用反转录试剂盒(生工生物，Cat#B532435)反转录成cDNA，以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物测序，分别得到mab22抗体轻、重链可变区碱基/编码序列(如下)。所用引物参阅Novagen发表的手册TB326 Rev.C0308。
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab22轻链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：
tcatgaagtttgctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgttttg atgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagca ttgtacataatagtggaaacacctatttagaatggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatcta caaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaag atcagcagagtggaggctgaggatctgggtatttattactgctttcaattttcacatgttcctcggacgttcggtg gaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctaccccaaacgacaatcaag(SEQ ID NO:1)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab22重链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：
tcatggactccaggctcaatttagttttccttgtccttgttttaaaaggtgtcctgtgtgaagtgaag ctggtggagtctgggggaggtttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagcctctggattcactt tcagtagctataccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggagctggtcgcagaaattagtagtag tggtggtagtacctactatccagacactgtaaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctg ttcctgcaaatgaacagtctgaagtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagaccagggctgggagcctggt ttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctgtcaagggttatgcctagcctgattctc(SEQ ID NO:2)
本发明所得到的上述鼠源单克隆抗体mab22轻、重链可变区的碱基序列所编码的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab22轻链可变区氨基酸序列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQFSHVPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)
本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的鼠源单克隆抗体mab22重链可变区氨基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCVASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAMYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:4)
本发明上述抗体轻、重链可变区序列和IgG不同型的恒定区，例如人hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4，人轻链κ、λ型；鼠mIgG1、mIgG2、mIgG3，鼠轻链κ、λ型等重组表达纯化得到完整的人鼠嵌合抗体或鼠抗体。本发明以重链恒定区为hIgG1，轻链κ型为例子，按实施例1表达纯化方法得到嵌合抗体mab22c，用实施例2、实施例3和实施例4之方法检测了mab22c与hTIGIT、RhTIGIT、hTIGIT+细胞的结合活性及阻断hTIGIT与hPVR结合的活性，并和对照抗体进行了比较，结果见表4。
表4本发明抗体mab22c活性分析
Figure BDA0003436690930000201
表4结果表明，本发明抗体mab22c较Ref1和Ref2活性均较好。mab22c与hTIGIT的结合活性较Ref1和Ref2均好(0.270nM vs 0.462nM vs 0.396nM)，其结合EC50分别是Ref1和Ref2结合EC50的0.58倍和0.68倍，mab22c与hTIGIT+细胞结合EC50是Ref2 EC50的0.47倍，与Ref1的EC50接近(0.101nM vs 0.0.216nM vs 0.138nM)；mab22c阻断hTIGIT结合hPVR的IC50是Ref2 IC50的0.51倍，是Ref1 IC50的0.46倍(0.541nM vs 1.07nM vs 1.19nM)；mab22c与RhTIGIT的结合活性较强，在Ref1和Ref2结合EC50的2倍左右(0.658nM vs0.243nM vs 0.391nM)。
上述结果表明，本发明意外发现的抗体mab22c是优于Ref1和Ref2的一种新的抗体。mab22c结合hTIGIT活性及阻断hTIGIT结合hPVR的活性较Ref1和Ref2均较好，可用于肿瘤治疗产品的开发，包括单克隆抗体，双特异抗体，多特异抗体，CAR,ADC等。且mab22c能与恒河猴TIGIT结合(恒河猴TIGIT序列Ig-like区域同食蟹猴完全一致)，结合EC50与Ref1和Ref2相差在2倍左右，这一特点为该抗体临床前在非人灵长类动物中进行安全性评价提供便利。
实施例9：本发明鼠源抗体人源化
为了避免用于药物开发过程中的免疫原性等方面的风险，对本发明的鼠源抗体mab22进行了人源化设计和筛选，以及序列优化，具体过程描述如下。
抗体的CDR定义本领域还有多种不同的方法，这些标记CDR方法可总结如下表5。
表5本领域抗体CDR定义不同方法汇总*
Loop CCG定义 Kabat定义 AbM定义 Chothia定义 Contact定义
轻链CDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
轻链CDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L45-L55
轻链CDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
重链CDR1 H26-35 H31-35 H26-35 H26-32 H30-35
重链CDR2 H50-65 H50-65 H50-58 H52-56 H47-H58
重链CDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
*更多信息可以参阅网站：http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef
上述所述针对TIGIT靶点的鼠源抗体mab22可变区按照表5各种定义方法，其CDR序列标记/注释如下表6-表10所示。
表6本发明抗hTIGIT(anti-hTIGIT)抗体mab22按CCG定义的CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 GFTFSSYTMS(SEQ ID NO:8)
重链CDR2 EISSSGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:9)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表7本发明抗hTIGIT(anti-hTIGIT)抗体mab22按Kabat定义的CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 SYTMS(SEQ ID NO:11)
重链CDR2 EISSSGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:9)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表8本发明抗hTIGIT(anti-hTIGIT)抗体mab22按AbM定义的CDR序列
Figure BDA0003436690930000211
Figure BDA0003436690930000221
表9本发明抗hTIGIT(anti-hTIGIT)抗体mab22按Chothia定义的CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 RSSQSIVHNSGNTYLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO:6)
轻链CDR3 FQFSHVPRT(SEQ ID NO:7)
重链CDR1 GFTFSSY(SEQ ID NO:13)
重链CDR2 SSSGGS(SEQ ID NO:14)
重链CDR3 PGLGAWFAY(SEQ ID NO:10)
表10本发明抗hTIGIT(anti-hTIGIT)抗体mab22按Contact定义的CDR序列
抗体 mab22 CDRs
轻链CDR1 VHNSGNTYLEWY(SEQ ID NO:15)
轻链CDR2 LLIYKVSNRF(SEQ ID NO:16)
轻链CDR3 FQFSHVPR(SEQ ID NO:17)
重链CDR1 SSYTMS(SEQ ID NO:18)
重链CDR2 LVAEISSSGGSTY(SEQ ID NO:19)
重链CDR3 ARPGLGAWFA(SEQ ID NO:20)
对本发明鼠源抗体mab22的CDR序列做上述分析、标记、定义后，如本领域许多文献公示的方法进行人源化。将鼠源抗体序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，找出同源性高的人抗体轻、重链种系，在此基础上，计算机建模，模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点，回复突变关键位点和组合，筛选出活性优选的人源化抗体分子。
具体地，通过序列同源性比较分析，发现和mab22轻链同源性比较好的人抗体种系包含IGKV2-40*01、IGKV2D-40*01、IGKV2-28*01、IGKV2-29*02、IGKV2-29*03、IGKV2/OR22-4*01、IGKV2D-28*01、IGKV2D-29*01、IGKV2-29*01、IGKV2D-29*02等。进一步比较、分析，优选人抗体种系轻链IGKV2-28*01。序列比对发现mab22轻链的J基因区和人抗体种系hJk1、hJk2.1、hJk2.2、hJk2.3、hJk2.4、hJk3、hJk4.1、hJk4.2、hJk5同源性高，进一步比较、分析，优选hJk4.1用于mab22轻链人源化抗体J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
通过序列同源性比较分析，发现和mab22重链同源性比较好的人抗体种系包含有IGHV3-7*01、IGHV3-7*02、IGHV3-7*03、IGHV3-48*01、IGHV3-48*02、IGHV3-48*03、IGHV3-48*04、IGHV3-66*01、IGHV3-66*02、IGHV3-66*04等。进一步比较、分析，优选人种系重链IGHV3-66*01序列用于本发明抗体人源化。序列比对发现和mab22的重链J基因区和人抗体种系重链J基因hJh1、hJh2、hJh3.1、hJh3.2、hJh4.1、hJh4.2、hJh4.3、hJh5.1、hJh5.2、hJh6.1、hJh6.2、hJh6.3、hJh6.4等同源性高，进一步比较、分析，优选hJh4.1用于本发明鼠源抗体mab22重链人源化抗体J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。
将本发明抗体mab22的CDR区(见上述CDR之定义)移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与IgG轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对人源化抗体中包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，筛选这些突变以及突变组合，看对抗体活性的影响，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到结构、活性等优化的抗体分子序列，即完成本发明鼠源抗体的人源化。
以下结合mab22的具体序列，以hIgG1重链，κ型轻链(序列如下)为例子进行说明。
人抗体κ型轻链恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:21)
人IgG1的重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:22)本发明人源化轻链可变区优选序列：
>mab22-hL1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:23)
>mab22-hL2
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:24)
>mab22-hL3
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:25)
本发明人源化重链可变区优选序列：
>mab22-hH1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:26)
>mab22-hH2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)
本发明鼠源抗体轻链的人源化序列中回复突变的个数较少，回复突变位点数目只有0个、1个或2个，如上述所列序列，因此本发明抗体轻链可变区序列的人源化程度很高。这些序列与人抗体轻链恒定区κ链或λ链的恒定区序列组合得到本发明抗体的轻链序列,比如本发明轻链用κ型轻链恒定区，如SEQ ID NO:21。同样，人源化所用重链可变区回复突变的位点数也较少，回复突变位点数目只有2个或0个，如上述所列重链可变区序列。因此本发明人源化抗体重链可变区序列人源化程度也很高。这些含不同数量回复突变的重链可变区序列，同任选人IgG1,2,3,4链恒定区序列重组得到本发明的重链序列，比如本发明重链用hIgG1作为恒定区序列为例子加以说明。将抗体人源化后各轻链序列与各重链序列组合得到各人源化抗体。
本发明部分优选人源化抗体序列，以及所选抗体的表达量及活性评估(本发明实施例子3之ELISA检测方法)结果如下表11所示。
表11本发明人源化抗体表达量及结合活性
Figure BDA0003436690930000241
上述结果表明，本发明人鼠嵌合抗体mab22c与hTIGIT的结合活性较对照分子Ref1好，其结合EC50仅是Ref1 EC50的0.517倍(0.585nM vs 1.132nM)。由本发明抗体鼠源序列mab22不同人源化程度的轻、重链序列组合得到的上述人源化抗体分子均保留了与嵌合抗体几乎一致的结合活性。
更佳地，不同人源化程度的组合抗体基本保留了嵌合抗体的表达量水平，是Ref1表达量的4.4-5.4倍，除mab22-h4的表达量下降约2倍外，其他抗体表达量水平均在100mg/mL左右。
更加特别地，用实施例4所述的实验方法，检测了本发明人源化抗体阻断hTIGIT与hPVR结合的效果，部分结果如表12和图1，本发明人源化抗体基本保留了嵌合抗体mab22c能很好的阻断hTIGIT与hPVR结合的特性，且人源化抗体阻断hTIGIT与hPVR结合的活性均较Ref1好，以mab22-h6为例，其阻断IC50仅是Ref1 IC50的0.44倍(1.443nM vs 3.30nM)。且用实施例2中的方法检测各人源化抗体与hTIGIT+细胞的结合活性发现，本发明人源化抗体与hTIGIT+细胞的结合活性基本一致(mab22-h3稍弱)，均较Ref1结合活性较好，以mab22-h6为例，其结合EC50仅是Ref1结合EC50的0.50倍(0.0133nM vs 0.0268nM)。
这一结果表明，本发明抗体，人源化抗体，人源化优选抗体分子不仅同hTIGIT蛋白结合，与hTIGIT+细胞结合，而且能有效的阻断hTIGIT与hPVR的结合。
表12本发明人源化抗体结合hTIGIT+细胞活性及阻断活性
Figure BDA0003436690930000251
表12所述部分优选人源化抗体的轻、重链氨基酸(包括恒定区)序列如下。
人源化mab22-h1抗体氨基酸序列：
轻链：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:28)
重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:29)
人源化mab22-h2抗体氨基酸序列：
轻链：
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:30)
人源化抗体mab22-h2重链序列同SEQ ID NO:29。
人源化mab22-h5抗体氨基酸序列：
人源化抗体mab22-h5轻链序列同SEQ ID NO:30。
重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:31)
人源化mab22-h6抗体氨基酸序列：
轻链：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHNSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQFSHVPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:32)
人源化抗体mab22-h6重链序列同SEQ ID NO:31。
综合本发明数据表明，发明人通过创新性筛选，意外发现了一株抗人TIGIT抗体，它们结合活性好，能很好地结合人TIGIT蛋白和hTIGIT+细胞，能有效的阻断人TIGIT和人PVR的结合，比目前临床上的抗体(对照抗体Ref1)有更好的活性；能和非人灵长类TIGIT结合，为非临床安全性评价提供便利；人源化程度高，为后期药物开发降低了免疫原性的风险；人源化后抗体表达量高，为下游生产及工艺提供便利，节约成本。本发明抗体独特的特性，使其更适合用于针对人TIGIT靶点抗体药物开发，并且作为候选药物可单独或者联合，特别是为联合PD-1抗体治疗肿瘤提供了新的，甚至是更好的选择。
实施例10：针对TIGIT靶点的双特异抗体设计
基于上述发现的抗TIGIT抗体，本发明进行了多种双特异抗体的设计。所设计的双特异抗体的通式如下。
表13基于本发明抗Sirpα抗体进行的双特异设计(通式1)
方案 含轻链的序列 含重链的序列
1 T2(scFv)n1-T1VL-LC-T2(scFv)n2 T2(scFv)n3-T1VH-HC-T2(scFv)n4
2 T1(scFv)n1-T2VL-LC-T1(scFv)n2 T1(scFv)n3-T2VH-HC-T1(scFv)n4
3 T2(scFv)n1-T1VL-LC-T1(scFv)n2 T2(scFv)n3-T1VH-HC-T1(scFv)n4
4 T1(scFv)n1-T2VL-LC-T2(scFv)n2 T1(scFv)n3-T2VH-HC-T2(scFv)n4
表13中，含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外，还可以包括与轻链序列连接的scFv；含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外，还可以包括与重链序列连接的scFv。其中，T1代表针对靶点1(比如TIGIT)的第一蛋白功能区，T2代表针对靶点2(非TIGIT)的第二蛋白功能区。T1(scFv)代表针对靶点1抗体的scFv序列；T2(scFv)代表针对靶点2的scFv序列。
(scFv)n1，(scFv)n2，(scFv)n3，(scFv)n4中的n1，n2，n3，n4分别为自然数，可以是0、1、2、3等，在本发明的具体实施例中，n1，n2，n3，n4中其中至少1个数值为1，其余为0。VL，代表针对靶点1或者2的抗体轻链可变区序列；VH，代表针对靶点1或者2的抗体重链可变区序列。LC，代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列，优选人轻链恒定区序列；HC代表重链的恒定区序列，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区序列(缩写为HC-IgG1、HC-IgG2、HC-IgG3、HC-IgG4)，优选人的重链恒定区序列(HC-hIgG)。重链恒定区C末端连接scFv或其它蛋白序列的时候，其C末端末位氨基酸K可以突变，优选突变为A。由此，在方案1中，T1为免疫球蛋白，T2为scFv；在方案2中，T2为免疫球蛋白，T1为scFv；scFv针对的靶点相同；在方案3、4中，两端的scFv针对两个不同的靶点。
表13中，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
需说明的是，当上述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区时，其连接方式为轻链可变区的C末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的N末端连接，从而将scFv轻链可变区的N末端和重链可变区的C末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接。在本发明中，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与免疫球蛋白轻链的N末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
当所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区时，其连接方式为轻链可变区的N末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的C末端连接，从而将scFv轻链可变区的C末端和重链可变区的N末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在此情况下，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的C末端与免疫球蛋白轻链的N末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
所述连接子优选为(G4S)m，所述的m优选为0～10之间的整数。进一步优选地，所述连接子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3，和/或，所述scFv的数量为一对，对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端和或N末端。
上述双特异设计涉及的各个靶点抗体序列，除了本发明所述anti-TIGIT抗体序列外，其它的靶点抗体序列来自已经公开的抗体序列。包括，抗PD-1抗体Nivolumab/Opidivo(简称Nivo)和Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem)；抗PD-L1抗体Atezolizumab/Tecentriq(简称Atezo)、Durvalumab/Imfinzi(简称Durv)和Avelumab/Bavencio(简称Avel)等。Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab和Avelumab等序列都能从www.drugbank.ca等公开资源查到。
实施例11：针对TIGIT和PD-1/PD-L1双靶点的双特异抗体设计和活性评价
本发明针对TIGIT和PD-1/PD-L1两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体，见下表14。
表14针对TIGIT和PD-1或PD-L1双靶点设计的双特异抗体
Figure BDA0003436690930000281
Figure BDA0003436690930000291
*：κ链表示轻链为人IgG的κ型轻链恒定区。#：IgG的C末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸K突变为A。以下重链C末端引入scFv的设计均将最末端K突变为A。
按本发明实施例1中所述的克隆表达纯化方法，分别克隆表达、纯化上述双特异抗体，并用前述实施例3中的方法分别检测各双特异抗体分子和人TIGIT以及PD-1或PD-L1的结合活性。发现不同设计的双特异抗体表达量、质量和活性差异显著。部分优选双特异抗体分子的质量、表达量及活性数据如图2和表15所示。
表15针对TIGIT和PD-1/PD-L1双靶点设计的双特异抗体的结合活性评价
Figure BDA0003436690930000301
注：NA，不适用，表示该抗体无表达。ND，由于质量不好或与另一抗原结合活性差而未检测。括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC50。*：同样实验条件下，双特异抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内(实验误差范围)，说明结合活性没有受到影响。
表15中是本发明抗TIGIT抗体mab22-h6的scFv在PD-1抗体Pem和Nivo、抗PD-L1抗体Atezo、Durv或Avel的重链N末端、C末端；轻链N末端、C末端设计成的双特异分子，或者PD-1抗体Pem或Nivo的scFv、抗PD-L1抗体Atezo、Durv或Avel的scFv与本发明抗TIGIT抗体mab22-h6设计成的双特异分子的表达量、与PD-1或PD-L1和TIGIT的结合活性。
结果表明，相同的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体和抗TIGIT抗体scFv，不同的位置设计成的双特异抗体，表达量和质量不同，如LB601-LB603无表达vs LB604表达量为3.22mg/L、LB609无表达vs LB606表达量为7.68mg/L、LB612 10.54mg/L vs LB613 1.59mg/L，且LB612质量较好，LB613聚体较多；相同的TIGIT抗体和抗PD-L1抗体scFv，不同的位置设计的双特异抗体，表达量不同，质量也不同，如LB622 vs LB623，LB615(12.4mg/L)vs LB621(40mg/L)(图2所示，LB615 SEC纯度远低于LB621)；相同的抗TIGIT抗体和抗PD-L1抗体，IgG形式和scFv形式抗体不同，表达量不同，活性不同，如LB611-LB614 vs LB621，mab22-h6以scFv连接于抗PD-L1抗体上时，抗体表达量低，抗体活性丢失，抗PD-L1抗体以scFv连接在mab22-h6完整抗体分子上时，基本能保留对两个靶点的活性，如LB621，表达量为40mg/L，与两个靶点的结合活性与相应单抗接近；相同的TIGIT抗体，相同的连接位置，不同的PD-1或PD-L1抗体scFv，对活性影响不同，如LB605 vs LB610 vs LB621，说明Pem scFv连接在mab22-h6重链的N端影响了mab22-h6的活性，而scFv形式的Nivo和Atezo连接在mab22-h6重链的N端形成的双特异抗体分子(LB610和LB615)基本保留了两个靶点的活性。
上述数据表明，同样的TIGIT抗体(本发明)以scFv形式连接在非TIGIT抗体上，所设计的双特异抗体分子针对TIGIT抗原的活性丢失。同样的TIGIT抗体(本发明)，连接不同的PD-1抗体scFv或PD-L1抗体的scFv，或者scFv的位置不同，所设计的双特异抗体分子活性差别也很大。
这些数据表明，基于本发明TIGIT抗体序列所设计的双特异抗体，其序列不同，scFv和抗体位置等不同，活性不同。合适的位置、合适的序列设计得到能针对双靶点活性很好的双特异抗体，这些双特异抗体结构类似常规IgG，有完整的Fc，本发明称之为Sequence-based IgG like bispecific antibody format，即序列特异的IgG结构相似的双特异抗体(SBody)。这些双特异抗体分子具有正常抗体一样完整的Fc，让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行，因而工艺简单，具有生产成本低的优势。
将上述保留了双靶点活性的SBody利用实施例4和实施例5中的方法分别针对两个靶点进行功能(阻断抗原和相应配体结合实验)评估，结果见表16a。
表16a针对TIGIT和PD-1/PD-L1双靶点设计的双特异抗体功能活性评价
Figure BDA0003436690930000311
注：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性IC50。*：IC50改变倍数，即双特异抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围，即活性没有受到影响。
用Biacore T200(厂家：Cytiva)仪器对本发明优选双特异抗体的亲和力进行测定。运行缓冲液pH 7.4的HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％的P20)。待测样品1μg/mL。抗原购自北京义翘神州TIGIT/his，货号：10917-H08H，PD-L1/his货号：10084-H08H。捕获ProteinA芯片，Cat#29-1275-56，Cytiva。稀释的分析物(TIGIT/his或PD-L1/his)依次流经芯片表面Fc1，Fc2通道。流速30μL/分钟，结合时间为180秒，解离时间为800秒。实验后，用10mM Glycine-HCl，pH 1.5，30μL/min，30s清洗芯片。实验数据用BiacoreT200 evaluation version 3.1(GE)软件以1:1Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值KD。结果如表16b所示。
表16b针对TIGIT和PD-1/PD-L1双靶点设计的双特异抗体的亲和力检测
Figure BDA0003436690930000321
上述功能活性结果表明，本发明设计的双特异抗体(SBody)，保留了对双靶点的结合、亲和力活性。且其阻断抗原与相应配体结合的活性变化与结合活性变化一致，如LB605，其结合人TIGIT的活性稍有减弱，阻断人TIGIT和人PVR的结合活性也稍有减弱(与相对应的单抗相比，变化倍数分别为3.548和3.729)。
综合数据表明，本发明抗TIGIT抗体mab22-h6和PD1、PD-L1抗体设计的双特异抗体SBody不仅活性、功能，而且表达量、质量也是序列特异的。
本发明抗TIGIT抗体mab22-h6和PD1、PD-L1抗体设计的双特异抗体SBody部分优选序列如下：
LB610轻链序列：
LB610轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB610重链序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:33)
LB621轻链序列：
LB621轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB621重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK*(SEQ ID NO:34)
LB605轻链序列：
LB605轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB605重链序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:35)
LB615轻链序列：
LB615轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB615重链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:36)
LB623轻链序列：
LB623轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB623重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK*(SEQ ID NO:37)
LB624轻链序列：
LB624轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB624重链序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLVEGGSGGSGGSGGSGGVDEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:38)
LB625轻链序列：
LB625轻链序列同SEQ ID NO:32。
LB625重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLELVAEISSSGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGLGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGSGGSGGSGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL*(SEQ ID NO:39)
实施例12：本发明TIGIT和PD-1/PD-L1双特异性抗体在不同制剂处方中的稳定性评价
将本发明优选双特异性抗体LB621用实施例中的方法表达纯化的样品用脱盐离心柱(Thermo，Cat#89890)置换至各制剂处方中，制剂处方如表17所示。各制剂buffer置换过程如下，对脱盐离心柱先进行预处理，以1000g离心2min，去除储存液后，向脱盐离心柱中加入1mL各制剂缓冲液，以1000g离心2min，重复进行3次，弃掉收集管中的缓冲液；将脱盐离心柱置于一个新的收集管中，将适量的LB621缓慢地加到柱子中，并加入20μL制剂缓冲液压层，以1000g离心2min，收集离心后的样品，混匀后用0.2μm滤膜过滤；将过滤后的各LB621制剂样品按80μL/管分装，其中4管置于40℃水浴锅中，分别在第7，14，21，28天进行SEC-HPLC和SDS-PAGE检测，即为40℃处理7天、14天、21天和28天的样品；另取1管无菌分装后进行SEC-HPLC检测，即为40℃处理0天的样品。不同制剂处方的SEC-HPLC检测结果如表18所示。
表17本发明优选双特异性抗体LB621制剂处方方案
Figure BDA0003436690930000361
表18本发明双特异性抗体LB621各制剂处方样品SEC-HPLC检测结果
Figure BDA0003436690930000362
Figure BDA0003436690930000371
上述结果表明，本发明双特异抗体LB621在较高浓度下，40℃处理，随时间的延长，在4种制剂处方中，除LB621在处方2中有少量聚体增加，在其他处方中聚体均无进一步增加；在4种处方中，从第21天开始，LB621有部分降解片段产生。40℃处理28天时，片段和聚体均无进一步增加，SEC-HPLC检测LB621的纯度下降至85％左右。LB621在4种制剂处方中的稳定性差别较小，40℃处理28天后的样品SDS-PAGE检测发现(如图3所示)，制剂处方1和制剂处方2中处理28天，LB621产生的降解片段明显少于处方3和处方4，且在处方1中，LB621产生聚体量较少。综合纯度变化及SDS-PAGE发现，LB621在处方1中稳定性较好。
上述结果表明本发明双特异抗体LB621在较高浓度下(14.2mg/mL)，在制剂缓冲液(20mM柠檬酸-柠檬酸钠，50mM精氨酸，50mM谷氨酸，200mM海藻糖，0.02％吐温80,pH6.0)中经40℃处理28天后SEC-HPLC纯度仅下降至86.22％，说明LB621稳定性较好。
实施例13：本发明TIGIT和PD-L1双特异性抗体活化T细胞活性评估
通过SEB活化人PBMC同时与本发明优选双特异抗体LB621、对应的单克隆抗体Atezo(抗PD-L1抗体)和Ref1(抗TIGIT抗体)单独以及联合孵育，对比各抗体诱导IL-2释放的增加量来评价其体外活性。
人PBMC细胞(妙顺生物科技有限公司，货号：PB010C，批号：P121040901C)从液氮中取出，复苏计数并用添加10％热灭活胎牛血清(Gibco，货号：10270-106)的RPMI1640培养基(含1μg/mL SEB)(Hyclone，货号：SH30809.01B)调整密度至2×106/mL后按照每孔100μL添加到96孔培养板(Corning，货号：3599)中，活化3天后，同时继续用该培养基依次配制梯度浓度的Atezo，Ref1，Atezo和Ref1的联合组及LB621，阴性对照为human IgG1 isotype，以每孔100μL添加到96孔培养板中。在二氧化碳恒温培养箱中培养3天后，离心收集上清。上清中的IL-2水平通过human IL-2precoated ELISA kit(达优，货号：1110203)进行测量。
如图4所示，在1μg/mL SEB的作用下，除阴性对照组以及Ref1单抗引起的IL-2释放微弱升高外，其余组均引起了明显的IL-2释放，并存在浓度梯度依赖。同时，同一浓度水平下，本发明双抗LB621组各浓度诱导的IL-2释放水平均高于Atezo和Ref1抗体单独给药组及联合给药组。说明本发明优选双抗LB621同时靶向PD-L1和TIGIT后能很好地协同增强T细胞活性。
实施例14：本发明TIGIT和PD-L1双特异性抗体优化设计分子动物体内药效评估
用BALB/cJGpt-Tigitem1Cin(hTIGIT)/Gpt雌性小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：SCXK(浙)2019-0001)建立动物药效模型，对本发明双特异性抗体LB621进行了体内药效评估。
CT26细胞(购自上海中科院)培养于含10％胎牛血清(Gibco，货号：10270-106)的RPMI1640培养基中(Hyclone，货号：SH30809.01B)，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。BALB/cJGpt-Tigitem1Cin(hTIGIT)/Gpt雌性小鼠，5只/笼饲养于SPF级环境，温度20～25℃；湿度40％～60％，自由进食进水，定期更换垫料。待CT26细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，用RPMI1640培养基洗涤细胞两次，并用RPMI1640培养基进行重悬计数，调整细胞密度为10×106/mL用于接种。接种CT26细胞悬液(1×106个)100μL于小鼠左肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约120-130mm3大小后随机分组，每组7只。
待测样品与阳性对照用PBS无菌配制。Blank组为PBS，Atezo(PD-L1抗体)为单抗阳性对照组，Atezo+Ref1为联合用药阳性对照组，LB621为双特异抗体药物待测组。给药方式为腹腔注射。Atezo给药剂量为10mg/kg，注射体积为200μL/只；Atezo+Ref1给药剂量为(10+10)mg/kg，注射体积为(100+100)μL/只；LB621给药剂量为13.3mg/kg(和联合组药物等摩尔)，注射体积为200μL/只。各组给药频率均为2次/周，共3次给药。
各注射样品给药当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。在首次给药后第18天结束试验。药效数据分析统计到第18天。
肿瘤大小计算公式：肿瘤体积TV(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)；肿瘤相对体积(RTV)＝T/T0或者C/C0。相对肿瘤增长率(T/C％)＝100％×(T-T0)/(C-C0)；抑瘤率(TGI)＝(1-T/C)×100％；其中T0、T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0、C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
图5和表19结果表明，BALB/cJGpt-Tigitem1Cin(hTIGIT)/Gpt雌性小鼠CT26结肠癌动物模型中，本发明优选双特异性抗体分子LB621和人源化单克隆抗体Atezo+Ref1联合给药组对肿瘤生长表现出明显的抑制作用，对肿瘤生长的抑制效果(TGI)分别达到76％和62％，显著优于Atezo给药组(TGI为46％)，且LB621给药组对肿瘤生长的抑制作用优于联合给药组。
表19给药18天后肿瘤相对体积分析结果及TGI计算
Figure BDA0003436690930000391
*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.01。
实施例15：本发明TIGIT和PD-L1双特异性抗体PK评价
用同实施例11中一样的BALB/cJGpt-Tigitem1Cin(hTIGIT)/Gpt雌性小鼠，同样饲养条件进行本发明双特异性抗体的PK评价。随机挑选3只小鼠组成一组。小鼠尾静脉注射mab22-h6和LB621，注射剂量分别为10mg/kg和13.3mg/kg，注射体积为200μL/只。分别于注射前0小时、注射后0.25、0.5、2、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、360、384小时眼眶取血。所取血样离心，取上清，-20℃保存。待收集完所有时间点血液样本后，用实施例6中双夹心ELISA法检测血清中LB621(双特异性抗体可同时结合PD-L1和TIGIT)的浓度，同时用实施例3中的ELISA方法检测血清中mab22-h6的浓度，来评价LB621和mab22-h6的PK特点。用EXCEL软件分析PK数据，计算LB621和mab22-h6的T1/2，结果见表20。
表20本发明优选人源化抗体和双特异性抗体的PK评价
Figure BDA0003436690930000392
Figure BDA0003436690930000401
上述结果表明，本发明优选人源化抗体mab22-h6和双特异性抗体LB621单次尾静脉注射小鼠体内后，血药浓度于0.25h达到峰值，LB621给药组的Cmax和AUC分别为136.57μg/mL和5070μg/mL*h，T1/2为35.21小时；mab22-h6给药组的Cmax和AUC分别为224.82μg/mL和5794.5μg/mL*h，T1/2为64.83小时。该结果说明本发明优选人源化抗体和优选双特异性抗体在小鼠体内PK参数在正常范围，具可开发性。
综合以上本发明数据表明，发明人通过创新性筛选，意外发现了一种抗人TIGIT抗体，它们和TIGIT结合活性好；和非人灵长类食蟹猴TIGIT蛋白有很好的结合活性。能有效地阻断人TIGIT和人PVR的结合。比目前临床上的抗体(对照抗体Ref1)有更好的活性，体内实验显示，比Ref2具有更优的抗肿瘤活性；且人源化程度高，为后期药物开发降低了免疫原性的风险。人源化后抗体表达量高，为下游生产及工艺提供便利，节约成本。此外，基于本发明TIGIT抗体序列所设计的双特异抗体，能够保留双靶点抗体的功能活性，对两个靶点的结合活性、亲和力均与其相对应的单抗接近，且阻断抗原与相应的配体结合的活性也和对应的单抗结合活性一致，稳定性好，能协同增强T细胞活性，具有很好的抗肿瘤活性。这些双特异抗体(本发明称之为SBody)结构类似常规IgG，具有正常抗体一样完整的Fc，让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行，因而工艺简单，具有生产成本低的优势。本发明抗体独特的特性，使其更适合用于针对人TIGIT靶点抗体药物开发，并且作为候选药物可单独或者联合给药，特别是为联合PD-1、PD-L1抗体治疗肿瘤提供了新的，甚至是更好的选择，且本发明优选出的双特异性抗体为肿瘤的多靶点治疗提供了另一种选择。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 靶向TIGIT的抗体和双特异性抗体及其应用
<130> P21015687C
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 509
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
tcatgaagtt tgctgttagg ctgttggtgc tgatgttctg gattcctgct tccagcagtg 60
atgttttgat gacccaaact ccactctccc tgcctgtcag tcttggagat caagcctcca 120
tctcttgcag atctagtcag agcattgtac ataatagtgg aaacacctat ttagaatggt 180
acctgcagaa gccaggccag tctccaaagc tcctgatcta caaagtttcc aaccgatttt 240
ctggggtccc agacaggttc agtggcagtg gatcagggac agatttcaca ctcaagatca 300
gcagagtgga ggctgaggat ctgggtattt attactgctt tcaattttca catgttcctc 360
ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat 420
ccatcttccc accatccagt gagcagttaa catctggagg tgcctcagtc gtgtgcttct 480
gaacaactct accccaaacg acaatcaag 509
<210> 2
<211> 524
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
tcatggactc caggctcaat ttagttttcc ttgtccttgt tttaaaaggt gtcctgtgtg 60
aagtgaagct ggtggagtct gggggaggtt tagtgcagcc tggagggtcc ctgaaactct 120
cctgtgtagc ctctggattc actttcagta gctataccat gtcttgggtt cgccagactc 180
cagagaagag gctggagctg gtcgcagaaa ttagtagtag tggtggtagt acctactatc 240
cagacactgt aaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac accctgttcc 300
tgcaaatgaa cagtctgaag tctgaggaca cggccatgta ttactgtgca agaccagggc 360
tgggagcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcagccaaaa 420
caacagcccc atcggtctat ccactggccc ctgtgtgtgg agatacaact ggctcctcgg 480
tgactctagg atgcctgtca agggttatgc ctagcctgat tctc 524
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鼠源单克隆抗体mab22轻链可变区
<400> 3
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鼠源单克隆抗体mab22重链可变区
<400> 4
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG、Kabat、AbM和Chothia定义的轻链CDR1
<400> 5
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG、Kabat、AbM和Chothia定义的轻链CDR2
<400> 6
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG、Kabat、AbM和Chothia定义的轻链CDR3
<400> 7
Phe Gln Phe Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG和AbM定义的重链CDR1
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG和Kabat定义的重链CDR2
<400> 9
Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCG、Kabat、AbM和Chothia定义的重链CDR3
<400> 10
Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kabat定义的重链CDR1
<400> 11
Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AbM定义的重链CDR2
<400> 12
Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chothia定义的重链CDR1
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chothia定义的重链CDR2
<400> 14
Ser Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的轻链CDR1
<400> 15
Val His Asn Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的轻链CDR2
<400> 16
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的轻链CDR3
<400> 17
Phe Gln Phe Ser His Val Pro Arg
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的重链CDR1
<400> 18
Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的重链CDR2
<400> 19
Leu Val Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Contact定义的重链CDR3
<400> 20
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人抗体κ型轻链恒定区
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人IgG1的重链恒定区
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化轻链可变区优选序列mab22-hL1
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化轻链可变区优选序列mab22-hL2
<400> 24
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化轻链可变区优选序列mab22-hL3
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化重链可变区优选序列mab22-hH1
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化重链可变区优选序列mab22-hH2
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体mab22-h1轻链氨基酸序列
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体mab22-h1和mab22-h2重链氨基酸序列
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体mab22-h2和mab22-h5轻链氨基酸序列
<400> 30
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Phe
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体mab22-h5和mab22-h6重链氨基酸序列
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
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450 455 460
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
465 470 475 480
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp
485 490 495
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys
500 505 510
Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
515 520 525
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
530 535 540
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly
545 550 555 560
Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
565 570 575
Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
595 600 605
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
610 615 620
Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
625 630 635 640
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
645 650 655
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
660 665 670
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
675 680 685
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
690 695 700
Glu Ile Lys
705
<210> 38
<211> 708
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 双特异性抗体LB624重链序列
<400> 38
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Val Glu
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
260 265 270
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
275 280 285
Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
290 295 300
Leu Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
305 310 315 320
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
325 330 335
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
340 345 350
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly Lys
705
<210> 39
<211> 708
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 双特异性抗体LB625重链序列
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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385 390 395 400
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
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Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
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Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile Met Met Trp
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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr
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565 570 575
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Gly Ser Gly Gly Val Asp Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
595 600 605
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
610 615 620
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
625 630 635 640
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
645 650 655
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
660 665 670
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
675 680 685
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys
690 695 700
Val Thr Val Leu
705

Claims (18)

1.一种靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其包括轻链可变区和/或重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合人TIGIT，并具有阻断PVR和TIGIT结合的功能；所述轻链可变区包含：如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR3；所述重链可变区包含：如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的CDR2和如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的CDR3。
2.如权利要求1所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23-25或其突变所示的氨基酸序列；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:26-27或其突变所示的氨基酸序列；
优选地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其是抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，其包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区；更优选地，所述人源抗体轻链恒定区为κ或者λ型轻链恒定区，和/或，所述人源抗体重链恒定区为hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4的重链恒定区或其突变。
4.如权利要求3所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其轻链包含如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其突变，和/或，其重链包含如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其突变；
优选地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述重链的氨基酸序列如SEQID NO:29所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
5.一种靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中，所述第一蛋白功能区为如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段；所述第二蛋白功能区为非靶向TIGIT的抗体；优选地，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区分别选自免疫球蛋白、scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2，且所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区中至多只有一个蛋白功能区为免疫球蛋白；更优选地，当所述第二功能区的结构为免疫球蛋白时，所述免疫球蛋白的恒定区包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区；进一步更优选地，所述人抗体轻链恒定区为κ链或者λ链，所述人抗体重链恒定区为hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4或其突变。
6.如权利要求5所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scFv，所述scFv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接；
优选地，所述scFv通过连接子与所述免疫球蛋白连接，所述连接子优选为(G4S)w，所述w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4；
更优选地，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
7.如权利要求6所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其特征在于，所述连接子为(G4S)3，和/或，所述scFv的数量为两个，且两个scFv对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；所述scFv连接免疫球蛋白的重链；
优选地，所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，所述scFv的轻链可变区的C末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的N末端连接，所述scFv的重链可变区的C末端通过所述连接子与所述免疫球蛋白重链的N末端连接；或，所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，所述scFv的轻链可变区的N末端与所述连接子连接，所述连接子再与重链可变区的C末端连接，所述scFv的重链可变区的N末端与所述免疫球蛋白重链的C末端连接。
8.如权利要求5-7中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其特征在于，所述第二蛋白功能区靶向PD-1/PD-L1、Claudin18.2、TIM-3或LAG-3；
优选地，所述第二蛋白功能区为靶向PD-1/PD-L1的抗体；
更优选地，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab；
进一步更优选地，当所述scFv连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端时，所述重链的C末端由K突变为A；和/或，所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv或其突变，其中，所述scFv的轻链可变区为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab或Avelumab的重链可变区，所述突变优选与原氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，并且保持或改善了所述抗体的功能。
9.如权利要求5-8中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，其特征在于，其选自以下组：
(i)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv，所述连接子为(G4S)3；
其中，所述scFv的数量为两个；所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scFv的重链可变区的C末端通过(G4S)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端，且所述C末端由K突变为A；或，
(ii)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；所述第二蛋白功能区为两个相同的scFv，所述连接子为(G4S)3；
其中，所述scFv的数量为两个；所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scFv的重链可变区的N末端分别通过(G4S)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端；
优选地，所述靶向TIGIT的双特异性抗体包括以下轻链和含重链的氨基酸序列：
氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:33所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:34所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:35所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:36所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:37所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:38所示的含重链的氨基酸序列；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示的轻链，如SEQ ID NO:39所示的含重链的氨基酸序列。
10.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如权利要求5-9中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
11.一种包含根据权利要求10所述的分离的核酸的表达载体。
12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
13.一种靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体的制备方法，其包含培养如权利要求12所述的宿主细胞，从培养物中获得所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
14.一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如权利要求5-9任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、如权利要求5-9中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、和/或如权利要求14所述的抗体药物偶联物。
16.一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A包含如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、如权利要求5-9中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、和/或如权利要求14所述的抗体药物偶联物；所述药盒B包含靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab和/或Avelumab；
优选地，所述药盒A包含靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段，所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述药盒B包含靶向PD-1/PD-L1的抗体，所述靶向PD-1/PD-L1的抗体为Atezolizumab。
17.如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、权利要求5-9中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体、权利要求14所述的抗体药物偶联物、权利要求15所述的药物组合物和/或如权利要求16所述的药物组合在制备诊断、治疗和/或预防癌症的药物中的应用；
优选地，所述癌症为实体肿瘤或液体肿瘤，所述实体肿瘤例如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、肝癌、上皮鳞状细胞癌、食道癌、直肠癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤，所述液体肿瘤例如急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤。
18.一种如权利要求1-4中任一项所述的靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或如权利要求5-9中任一项所述的靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体的制剂，其特征在于，
所述制剂包括柠檬酸-柠檬酸钠、吐温80和所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体；优选地，所述制剂还包括精氨酸、谷氨酸和海藻糖中的一个或多个；更优选地，所述制剂包括20mM的柠檬酸-柠檬酸钠、50mM的精氨酸、50mM的谷氨酸、200mM的海藻糖、0.02％的吐温80和14.2mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0；
或，所述制剂包括20mM的His-HCI、50mM的精氨酸或谷氨酸、200mM的海藻糖、0.02％PS80和11.4mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0；
或，所述制剂包括20mM的His-HCI、125mM的甘氨酸、125mM的海藻糖、0.02％PS80和11mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0；
或，所述制剂包括20mM的His-HCI、50mM的精氨酸盐酸盐、150mM的海藻糖、0.02％吐温80和11.6mg/mL的所述靶向TIGIT的抗体或抗原结合片段、或所述靶向TIGIT的双特异性抗体或多特异性抗体，所述制剂的pH为6.0。
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