CN116789836A - 针对dll3的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了针对DLL3的抗体及其用途，特别是针对DLL3的单克隆抗体、针对DLL3和CD3的双特异性抗体、包含编码抗体的核苷酸序列的核酸、包含核酸的载体、以及包含核酸或载体的宿主细胞。还公开了包含抗体的药物组合物和缀合物，以及使用抗体的治疗方法。

Description

针对DLL3的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及针对DLL3的抗体，以及此类抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。

背景技术

Delta样配体3 (DLL3)是一种附着在细胞表面的单次跨膜蛋白，是Notch 配体家族的成员。人DLL3基因位于染色体19q13上，并且具有长度为约1800 bp的开放阅读框。人DLL3蛋白由 619 个氨基酸组成，其特征在于 Delta/Serrate/LAG-2 (DSL)结构域、六个表皮生长因子(EGF)样重复序列和跨膜结构域。胞外N端结构域的DSL基因序列在配体家族中高度保守，是与Notch受体结合的必需结构。与其他Notch配体不同，目前的研究表明DLL3是抑制性Notch配体。配体DLL3与Notch受体结合并对Notch信号通路具有抑制作用。除了Notch信号通路外，DLL3还在其他信号通路中发挥作用。 例如，DLL3通过抑制Notch信号通路来激活磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B (PI3K/Akt)。随着DLL3表达上调，Wnt-1和Wnt-4以及Wnt靶向基因(Axin-2和Lef-1)的表达水平上调，表明DLL3参与Wnt信号通路的激活。此外，还证明DLL3通过调节Nrarp的循环表达来调节Notch/Wnt信号通路。DLL3是一种高度肿瘤选择性的细胞表面靶点，其主要表达于神经性或神经内分泌肿瘤，尤其是小细胞肺癌(SCLC)，80%以上的SCLC具有DLL3阳性表达。

DLL3在神经内分泌肿瘤中的高表达显示了其用于肿瘤疗法的潜在能力。

发明内容

本公开提供了靶向DLL3或其抗原结合片段的新型抗体，其可以是单克隆抗体或双特异性抗体的形式，如双特异性T细胞接合剂(BiTE)。已经对抗体的体外 T 细胞依赖性功效以及体内抗肿瘤活性进行了评估。这些功能测定的结果证明了这些工程化抗体，特别是BiTE形式的抗体的有效抗肿瘤作用。

在一个方面，本公开提供了特异性结合DLL3的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中VL包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有如SEQ ID NO: 6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQID NO: 9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含如SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体属于选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。在一些实施方案中，抗体属于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv和ds-scFv。

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO: 10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在其他实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，其进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区。在一些实施方案中，第二抗原是肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。在一些实施方案中，第二抗原是T细胞抗原。在一些实施方案中，T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD38、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB (CD137)和NKG2D。

在一些实施方案中，第二抗原是CD3，并且第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含分别具有如SEQ ID NO: 14-16所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有如SEQID NO: 18-20所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在一些实施方案中，第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，并且VH包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体包含scFv，该scFv包含特异性结合DLL3的抗体的VL和VH，并且scFv任选地经由接头连接至第二抗原结合区的VL或VH的N端。在一些实施方案中，抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：scFv、任选的接头、第二抗原结合区的VL、轻链恒定区(CL)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，其从N端至C端包含：第二抗原结合区的VH、重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数，优选地接头包含如SEQ ID NO: 25或26所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

在另一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与DLL3结合的第一抗原结合区和与CD3结合的第二抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3；并且VH1包含分别具有如SEQ ID NO: 6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3；并且VL2包含分别具有如SEQ ID NO: 14-16所示氨基酸序列的LCDR 1-3；并且VH2包含分别具有如SEQ ID NO:18-20所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VL1包含与SEQID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，VL1包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ IDNO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，VL1包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ IDNO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQID NO: 9所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合区包含scFv，该scFv包含VL1和VH1，并且scFv任选地经由接头连接至VL2或VH2的N端。在一些实施方案中，双特异性抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：scFv、任选的接头、VL2、轻链恒定区(CL)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，其从N端至C端包含：VH2、重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数，优选地接头包含如SEQ ID NO: 25或26所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

在又一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

在另一方面，本公开提供了包含本文公开的核酸的载体。

在另一方面，本公开提供了包含本文公开的核酸或本文公开的载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(i)本文公开的抗体或其抗原结合片段，或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，和(ii)药学上可接受的载剂或赋形剂。

在本发明公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在又一方面，本公开提供了缀合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

在本文公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分可以选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

在另一方面，本公开提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方案中，癌症是DLL3阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是神经内分泌瘤，例如肺癌，优选小细胞肺癌。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在另一方面，本公开提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备治疗受试者的癌症的药物中的应用。

在另一方面，本公开提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物用于治疗受试者的癌症。

在本文公开的用途的一些实施方案中，癌症是DLL3阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是神经内分泌瘤，例如肺癌，优选小细胞肺癌。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂联合。在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

附图说明

可通过参考如利用了本发明的原理的示例性实施方案及其附图所示的以下详细描述来获得对本发明的特征和优点的理解：

图1显示了通过ELISA测量的抗DLL3 mAb针对重组人DLL3的结合。

图2显示了本发明的DLL3×CD3 BiTE的一个实例的示意图。

图3显示了通过ELISA测量的DLL3×CD3 BiTE针对重组人CD3的结合。

图4显示了通过ELISA测量的DLL3×CD3 BiTE针对重组人DLL3的结合。

图5显示了通过ELISA测量的DLL3×CD3 BiTE针对重组人DLL3和CD3的共结合。

图6A显示了通过流式细胞术测量的DLL3×CD3 BiTE针对DLL3阴性细胞系HT55的结合。

图6B显示了通过流式细胞术测量的DLL3×CD3 BiTE针对DLL3阳性细胞系LS174T-DLL3的结合。

图6C显示了通过流式细胞术测量的DLL3×CD3 BiTE针对DLL3阳性肿瘤细胞系H82的结合。

图7A显示了在DLL3阴性细胞系LS174T存在的情况下DLL3×CD3 BiTE诱导的T细胞活化。

图7B显示了在DLL3阳性细胞系H82存在的情况下DLL3×CD3 BiTE诱导的T细胞活化。

图7C显示了在DLL3阳性细胞系LS174T-DLL3存在的情况下DLL3×CD3 BiTE诱导的T细胞活化。

图8A显示了在人T细胞存在的情况下DLL3×CD3 BiTE针对DLL3阴性LS174T细胞的杀伤。

图8B显示了在人T细胞存在的情况下DLL3×CD3 BiTE针对DLL3阳性LS174T-DLL3细胞的杀伤。

图9A显示了用100或500 μg/kg DLL3×CD3 BiTE预防性处理的LS174T-DLL3细胞异种移植的B-NDG小鼠中的肿瘤体积。用生理盐水处理的小鼠作为阴性对照。数据代表平均肿瘤体积±SEM。

图9B显示了用100或500 μg/kg DLL3×CD3 BiTE预防性处理的LS174T-DLL3细胞异种移植的B-NDG小鼠的体重。用生理盐水处理的小鼠作为阴性对照。数据代表平均体重±SEM。

具体实施方式

通过结合附图和以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。

本文参照附图描述的实施方案是解释性的、示例性的，并用于一般性理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的元素和具有相同或相似功能的元素在整个说明书中使用相同的参考数字表示。

除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语都具有技术人员所清楚的本领域通常的含义。例如参考标准手册，如Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.和Klbl, H. eds., "Amultilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)",Helvetica Chimica Acta (1995), CH-4010 Basel, Switzerland; Sambrook等人, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel等人, eds., "Current protocols inmolecular biology", Green Publishing and Wiley InterScience, New York (1987);Roitt等人, "Immunology (6th Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001);以及Janeway等人, "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone, New York (2005)，以及以上引用的通用背景技术。

定义

如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个抗体”包括复数个抗体以及在一些实施方案中提及“一个抗体”包括多个抗体，诸如此类。

除非另有说明或定义，术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包括所述的元素或步骤或元素组或步骤组，但不排除任何其他元素或步骤或元素组或步骤组。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。此类分子通常包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(或结构域)(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(或结构域)(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如C1q (补体激活经典途径中的第一组分)。

免疫球蛋白的重链可分为三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。Fd区包含VH和CH1结构域，并与轻链结合形成Fab (抗原结合片段)。Fc片段负责免疫球蛋白效应功能，包括例如补体结合和与效应细胞的同源Fc受体结合。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区充当柔性间隔区，允许Fab部分相对于Fc区在空间中自由移动。铰链结构域在结构上多种多样，在免疫球蛋白类别和亚类之间的序列和长度都不同。

根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区在结构和功能上可进一步细分为三个区域：上铰链、核心铰链和下铰链。上铰链包括从CH1的羧基末端至铰链中限制运动的第一个残基的氨基酸，通常是在两条重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫键。下铰链区连接CH2结构域的氨基末端，并包括CH2结构域中的残基。免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性允许的构象变化可以影响抗体Fc部分的效应功能。

“轻链可变区”(VL)或“重链可变区”(VH)由通过三个“互补决定区”或“CDR”分隔的“框架”区组成。框架区用于对齐特异性结合抗原表位的CDR。CDR包括抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。VL结构域和VH结构域从氨基端至羧基端都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

每个VL结构域和VH结构域的氨基酸排列与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, 1987和1991))、Chothia定义(Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia等人, Nature 342:878-883, 1989)；Chothia Kabat CDR的复合，其中CDR-H1是Chothia CDR和Kabat CDR的复合；OxfordMolecular的抗体建模软件使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(world wideweb bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中任一项定义的CDR，但是优选实施方案使用Kabat定义的CDR。

基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可以进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda (λ)链和kappa (κ)链。

如本文所用，术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和含有至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体中获得的抗体。也就是说，除了可能天然存在的少量突变，构成群体的每个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。本文中的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，也不应被解释为要求通过任何特定的方法产生的抗体。

术语“双特异性抗体”在本发明的上下文中应理解为具有由不同的抗体序列限定的两个不同抗原结合区域的抗体。这可以理解为与不同的靶标结合，但也包括与一个靶标的不同表位相结合。本文所用术语“双特异性抗体”应以其最广泛的含义理解，包括全长双特异性抗体及其抗原结合片段。双特异性抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。双特异性抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。

术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的抗原结合片段的实例涵盖：(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)₂片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) Fab’片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab；(iv) Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v) Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi) Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(vii)dAb片段，其由VH结构域组成；(viii) 分离的互补决定区(CDR)；(ix) 纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头连接它们，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv))。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“直链抗体”，其与互补的轻链多肽共同形成抗原结合区域，以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰形式。

这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力代表抗原与抗体解离的平衡常数(KD)，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度就越强。替代性地，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。

亲合力是抗体和相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量。通常，抗体结合抗原将以以下解离常数(KD)结合抗原：10^-5 M至10^-12 M或更小，并且优选10^-7 M至10^-12 M或更小，并且更优选10^-8 M至10^-12 M，和/或具有以下结合亲和力：至少10⁷ M^-1，优选至少10⁸ M^-1，更优选至少10⁹ M^-1，如至少10¹² M^-1。通常认为任何大于10^-4 M的K_D值表示非特异性结合。抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何已知的合适方式来确定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域已知的其不同变型。

术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或由一个或多个蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在变性溶剂的暴露中保留，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包括独特的空间构象中的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，并因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两条序列(氨基酸)对齐后在相同位置具有相同残基的程度。例如，“一条氨基酸序列与SEQ ID NO: Y X%相同”是指氨基酸序列与SEQ IDNO: Y有X%的同一性，并被阐述为氨基酸序列中X%的残基与SEQ ID NO: Y中公开的序列的残基相同。通常，使用计算机程序进行此类计算。比较和对齐序列对的示例性程序包括ALIGN (Myers和Miller, 1988)、FASTA (Pearson和Lipman, 1988; Pearson, 1990)以及gapped BLAST (Altschul等人, 1997)、BLASTP、BLASTN或者GCG (Devereux等人, 1984)。

此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。此类保守氨基酸取代是本领域众所周知的。

此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指与正常细胞相比在癌细胞中差异表达的抗原，并因此可用于靶向癌细胞。

如本文所用，术语“CD3”是指人CD3蛋白复合物，其具有5条肽链，γ链、δ链、ε链、ζ链和η链，并与T细胞受体α和β链缔合以形成TCR-CD3复合体。该术语包括任何CD3变体、亚型和物种同源物，其可以由包括T细胞在内的细胞天然表达，或者由转染了编码上述链的基因或cDNA的细胞表达。

如本文所用，术语“双特异性T细胞接合剂”或“BiTE”是指具有两个抗原结合结构域的多肽链分子，其中一个结合T细胞抗原并且第二个结合靶细胞表面呈递的抗原(参见PCT公开WO 05/061547；Baeuerle等人，2008，Drugs of the Future 33：137-147；Bargou等人，2008，Science 321：974-977，其通过整体引用并入本发明)。因此，本公开的BiTE具有与DLL3结合的抗原结合区和靶向T细胞抗原的第二抗原结合区。

如本文所用，术语“载体”意在指能够运输其所连接的另一种核酸的核酸分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。

术语“药学上可接受”是指载剂或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有实质性毒害，和/或此类载剂或赋形剂被批准或可用于包括在对人肠胃外施用的药物组合物中。

如本文所用，术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指为了获得效果的目的而施用药剂或进行程序。这些效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈方面可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”可以包括治疗哺乳动物，特别是人的疾病或病症(例如癌症)，并且包括：(a)在可能易感该疾病(例如，包括可能与原代疾病相关或由其引起的疾病)而尚未被诊断患病的受试者中预防疾病或疾病症状的发生;(b)抑制疾病，即阻止其发展;和(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可以指在癌症的治疗或改善或预防中的任何成功指标，包括任何客观或主观参数，如症状的减少；缓解；消除疾病症状或使疾病病症对患者更容易忍受；减慢恶化或衰退速度；或使恶化的最后节点衰弱减少。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括本文公开的抗体或组合物或缀合物的施用，以预防或延迟、缓解、或阻止或抑制与疾病(例如癌症)相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减少、消除或预防。

如本文所用，术语“有效量”是指施用于受试者以治疗疾病的量足以实现该疾病的治疗。

如本文所用，术语“受试者”是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜、以及实验室、动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。

如本文所用的术语“神经内分泌瘤(neuroendocrine neoplasm，NEN)”是指起源于神经内分泌细胞的肿瘤。神经内分泌细胞是机体内具有神经内分泌表型、可以产生多种激素的一大类细胞，其遍布全身各处。因此，神经内分泌瘤可发生于全身任何部位，但最常见的是胃、肠、胰腺等消化系统的神经内分泌瘤，占全部神经内分泌瘤的约2/3。根据世界卫生组织2010年的最新命名规定，“神经内分泌瘤(NEN)”泛指所有来源于神经内分泌细胞的赘生物，其中将高分化的神经内分泌瘤命名为神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor，NET)，将低分化的神经内分泌瘤命名为神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)。

抗DLL3抗体

本公开提供了特异性结合DLL3的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中VL包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有如SEQ ID NO: 6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。

当CDR序列根据Kabat编号系统定义时，本文公开的抗体的VL包含分别具有如SEQID NO: 1 (RSSQSIVHSNGDTYLE)、SEQ ID NO: 2 (KVSNRFS)和SEQ ID NO: 3 (FQGSHVPWT)所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且本文公开的抗体的VH包含分别具有如SEQ IDNO: 6 (SYWMN)、SEQ ID NO: 7 (MIHPSDSETRLNQKFKD)和SEQ ID NO: 8 (WDYYDYAWFAY)所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中,VL包含与SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中,VL包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中,VL包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 4或11所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合DLL3的能力。在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO: 9、12和13中任一项所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合DLL3的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在功能变体的内容中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，并且更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如在FR1、FR2、FR3和/或FR4进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

在优选的实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且VH包含如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可以进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda (λ)链和kappa (κ)链。本文公开的抗体可以是上述任何类别或亚型。

在一些实施方案中，抗体属于选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。在一些实施方案中，抗体属于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。在优选的实施方案中，抗体是IgG1抗体。

本文公开的抗体可以是完整的抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段可以是保留与DLL3特异性结合能力的抗体的任何片段。抗原结合片段的实例包括但不限于：Fab片段；F(ab’)2片段；Fab’片段；Fd片段；Fd’片段；Fv片段；scFv片段；dAb片段；分离的互补决定区(CDR)；纳米抗体；由一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)组成的线性抗体，以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰形式。

在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv和ds-scFv。在优选的实施方案中，抗原结合片段是Fab。在另一个优选的实施方案中，抗原结合片段是Fv。在另一个优选的实施方案中，抗原结合片段是scFv。

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO: 10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，轻链包含如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与DLL3结合的能力。在一些实施方案中，重链包含如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与DLL3结合的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，并且更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至50，优选是1至20，更优选是1至10，还更优选是1至5。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如FR1、FR2、FR3和/或FR4；和/或恒定区，例如CL、CH1、CH2和/或CH3进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。保守取代的实例如上所述。

在优选的实施方案中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，并且所述重链包含如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区的双特异性抗体。在一些实施方案中，第二抗原是肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。

本领域已经鉴定了许多与特定癌症相关的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是可以激发明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为通常在正常细胞中沉默(即不表达)的抗原、仅在某些分化阶段表达的抗原、以及随时间表达的抗原如胚胎和胎儿抗原。其他癌细胞抗原由突变细胞基因如致癌基因(例如活化的ras癌基因)、抑制基因(例如P53突变体)以及由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其他癌症抗原可以通过病毒基因如RNA和DNA肿瘤病毒携带的基因编码。许多其他肿瘤相关抗原和针对它们的抗体是已知的和/或可商用的，并且也可以由本领域技术人员制备。

肿瘤相关抗原的实例包括但不限于5T4、甲胎蛋白、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、AXL、EGFR、EGFRvIII、上皮肿瘤抗原、ERBB2、FLT3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HIV-1包膜糖蛋白gp120、黑色素瘤相关抗原、MUC-1、突变的p53、突变的ras、ROR1、GPC3、VEGFR2及其组合。

在一些实施方案中，第二抗原是T细胞抗原。在一些实施方案中，T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD38、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB(CD137)、和NKG2D或其任何组合。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3，并且第二抗原结合区与CD3的γ链、δ链、ε链、ζ链和η链中的任一个结合。

在一些实施方案中，第二抗原是CD3，并且第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含分别具有如SEQ ID NO: 14-16所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有SEQ IDNO: 18-20所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。当使用Kabat定义的CDR序列时，本文公开的第二抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO: 14(RSSTGAVTTSNYAN)、SEQ ID NO: 15 (GANKRAP)和SEQ ID NO: 16 (ALWYSNLWV)所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的第二抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ IDNO: 18 (TYAMN)、SEQ ID NO: 19 (RIRSKYNNYATYYADSVKG)和SEQ ID NO: 20(HGNFGSSYVSYFAY)所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸所形成的，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸所形成的，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，并且更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如在FR1、FR2、FR3和/或FR4进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。保守取代的实例如上所述。

在优选的实施方案中，第二抗原结合区包含VL和VH，其中VL包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，并且VH包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体包含含有特异性结合DLL3的抗体的VL和VH的scFv，并且scFv任选地经由接头连接至第二抗原结合区的VL或VH的N端。在一些实施方案中，抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：scFv、任选的接头、第二抗原结合区的VL、轻链恒定区(CL)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，其从N端至C端包含：第二抗原结合区的VH、重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数，优选地接头包含如SEQ ID NO: 25或26所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。在其他优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。在一些实施方案中，双特异性抗体是HBiTE的形式，如PCT申请号PCT/US2018/016524 (其通过整体引用并入本文)中所述。在HBiTE中，轻链从N端至C端包含抗靶标VL结构域、抗CD3 VL-CL和单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)；并且重链从N端至C端包含抗靶标VH结构域、抗CD3 VH-CH1和单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)。单体Fc7.2含有能够抑制Fc同二聚化的两个氨基酸突变(T366L和Y407H)。

双特异性抗体

本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与DLL3结合的第一抗原结合区和与CD3结合的第二抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3；并且VH1包含分别具有如SEQ ID NO: 6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3；并且VL2包含分别具有如SEQ ID NO:14-16所示氨基酸序列的LCDR 1-3；并且VH2包含分别具有如SEQ ID NO: 18-20所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。

当根据Kabat编号系统定义CDR序列时，本文公开的双特异性抗体的VL1包含分别具有如SEQ ID NO: 1 (RSSQSIVHSNGDTYLE)、SEQ ID NO: 2 (KVSNRFS)和SEQ ID NO: 3(FQGSHVPWT)所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的双特异性抗体的VH1包含分别具有如SEQ ID NO: 6 (SYWMN)、SEQ ID NO: 7 (MIHPSDSETRLNQKFKD)和SEQ ID NO: 8(WDYYDYAWFAY)所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，本文公开的双特异性抗体的VL2包含分别具有如SEQ ID NO: 14 (RSSTGAVTTSNYAN)、SEQ ID NO: 15 (GANKRAP)和SEQ IDNO: 16 (ALWYSNLWV)所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且本文公开的双特异性抗体的VH2包含分别具有如SEQ ID NO: 18 (TYAMN)、SEQ ID NO: 19(RIRSKYNNYATYYADSVKG)和SEQ ID NO: 20 (HGNFGSSYVSYFAY)所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VL1包含与SEQID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，VL1包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ IDNO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，VL1包含与SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH1包含与SEQ IDNO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VL2包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列且VH2包含与SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4或11所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合DLL3的能力。在一些实施方案中，VH1包含如SEQ ID NO: 9、12和13中任一项所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合DLL3的能力。在一些实施方案中，VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。在一些实施方案中，VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在功能变体的内容中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如在FR1、FR2、FR3和/或FR4进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。保守取代的实例如上所述。

在优选的实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，VL1包含如SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列且VH1包含如SEQ IDNO: 13所示的氨基酸序列；并且VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列且VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合区包含含有VL1和VH1的scFv，并且scFv任选地经由接头连接至VL2或VH2的N端。在一些实施方案中，scFv任选地经由接头连接至VL2的N端。在一些实施方案中，scFv任选地经由接头连接至VH2的N端。在一些实施方案中，scFv是通过经由接头连接VL1和VH1而形成的。

在一些实施方案中，接头可以是任何柔性接头。在一些实施方案中，接头包含(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 27)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ IDNO: 28)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 25)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 30)。在优选的实施方案中，接头包含如SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，接头包含GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGS (SEQ ID NO: 31)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 32)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 33)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 34)。在优选的实施方案中，接头包含如SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列。

本文公开的双特异性抗体可以包含含有抗体的CH2和CH3的Fc区。

Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可以包含一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，Fc区是IgG1同种型或由其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一个实施方案中，Fc区是IgG4同种型或由其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc。

在一个实施方案中，Fc区具有降低的效应功能，例如降低的ADCC、ADCP、CDC和/或Clq、FcγRI、FcγRII或FcγRIIIA结合。例如，Fc区可以是IgGl同种型，或非IgGl型，例如IgG2、IgG3或IgG4，其已被突变使得介导效应功能的能力降低甚至消除。此类突变已经例如描述于Dall’Acqua WF等人, J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006)以及Hezareh M, JVirol. ; 75(24):12161-12168 (2001)中。例如，与野生型序列相比，Fc区可包含具有一个或多个以下氨基酸取代的氨基酸序列：E233P、L234A、L234F、L235A、L235E、G237A、N297A、N297D、P331S和P329G。

在一个实施方案中，Fc区包含去除Asn连接的糖基化的受体位点的突变或以其他方式被操作以改变糖基化特性的突变。例如，在IgG1 Fc区中，可以使用N297Q突变去除Asn连接的糖基化位点。因此，在具体的实施方案中，Fc区包含具有N297Q突变的IgG1序列。

在进一步的实施方案中，Fc区被糖工程化以减少岩藻糖并因此增强ADCC，例如通过在抗体产生期间向培养基中添加化合物，如US2009317869中所述或者如van Berkel等人(2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350中所述，或者通过使用FUT8敲除细胞，例如Yamane-Ohnuki等人(2004) Biotechnol. Bioeng 87:614中所述。替代性地，可以使用Umaña等人(1999) Nature Biotech 17:176描述的方法来优化ADCC。在另一个实施方案中，Fc区被工程改造以增强补体激活，例如在Natsume等人(2009) Cancer Sci. 100:2411中所述。

在一些实施方案中，Fc区包含可以抑制Fc同二聚化的修饰或突变。在一些实施方案中，Fc区包含人IgG1 Fc野生型序列的变体。该变体可以包含在人IgG1 T366和Y407位置处(Kabat编号)的氨基酸取代。优选地，T366被L (亮氨酸)取代。优选地，Y407被I (异亮氨酸)、F (苯丙氨酸)、L (亮氨酸)、M (甲硫氨酸)、H (组氨酸)、K (赖氨酸)、S (丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T (苏氨酸)、W (色氨酸)、A (丙氨酸)、G (甘氨酸)或N (天冬酰胺)取代。更优选地，Y407被H取代。在一个实施方案中，T366被L取代，并且Y407被H取代。

在一些实施方案中，Fc区可以是单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)，如PCT申请号PCT/US2018/016524中所述，其通过整体引用并入本文。

在一些实施方案中，双特异性抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：scFv、任选的接头、VL2、轻链恒定区(CL)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，其从N端至C端包含：VH2、重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3(CH3)。

本文公开的双特异性抗体还可包含抗体的铰链区。

IgG类抗体的铰链区是指重链CH1和CH2部分之间的短氨基酸序列区域，在抗体天然状态下相对柔性。铰链区可包含野生型铰链序列的部分或全部或其具有一个或多个取代的变体。

在一些实施方案中，双特异性抗体包含：第一多肽链，其从N端至C端包含：scFv、任选的接头、VL2、轻链恒定区(CL)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，其从N端至C端包含：VH2、重链恒定区1 (CH1)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和铰链区各自独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG (例如人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4的IgG亚型(例如人IgG1、IgG2和IgG4)。在一些实施方案中，CL衍生自λ轻链或κ轻链。

在一些实施方案中，CH2之一或两者包含能够降低双特异性抗体的效应功能的至少一个氨基酸突变。例如，CH2可包含选自E233P、L234A、L234F、L235A、L235E、G237A、N297A、N297D、P331S和P329G的至少一个氨基酸取代或其任何组合。在一些实施方案中，至少一个突变选自L234A、L235A、G237A、P329G或其任何组合。在优选的实施方案中，至少一个突变选自L234A、L235A、G237A和P329G。在一些实施方案中，至少一个突变选自L234F、L235E、P329G或其组合。在优选的实施方案中，至少一个突变选自L234F、L235E和P329G。

在一些实施方案中，CH3之一或两者包含能够降低第一和第二多肽链之间的同二聚化的至少一个氨基酸突变。在优选的实施方案中，CH3之一或两者的氨基酸T366被L (亮氨酸)取代，并且CH3之一或两者的氨基酸Y407被I (异亮氨酸)、F (苯丙氨酸)、L (亮氨酸)、M (蛋氨酸)、H (组氨酸)、K (赖氨酸)、S (丝氨酸)、Q (谷氨酰胺)、T (苏氨酸)、W (色氨酸)、A (丙氨酸)、G (甘氨酸)或N (天冬酰胺)取代。在一个实施方案中，CH3之一或两者的氨基酸T366被L取代，并且CH3之一或两者的氨基酸Y407被H取代。在优选的实施方案中，第一和第二多肽链两者的CH3中，T366被L取代并且Y407被H取代。

接头可以是如上所述的那些。例如，接头可以是任何柔性接头。在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数，优选地接头包含如SEQ ID NO: 25或26所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 22或23所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与DLL3和CD3结合的能力。在一些实施方案中，第二多肽链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前体是功能变体保留与CD3结合的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，并且更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至50，优选是1至20，更优选是1至10，还更优选是1至5。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如FR1、FR2、FR3和/或FR4；和/或恒定区，例如CL、CH1、CH2和/或CH3进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。保守取代的实例如上所述。

在优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列；并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。在其他优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列；并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

核酸

本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

术语“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。核酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如溴尿苷和肌苷衍生物、核糖修饰如2’,3’-二脱氧核糖、核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。

例如，本发明提供了编码本文公开的任一个重链可变区序列的核酸分子。本发明还提供与编码本文公开的任一个重链可变区序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本发明提供了编码本文公开的任一个轻链可变区序列的核酸分子。本发明还提供与编码本文公开的任一个轻链可变区序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本发明提供了编码重链可变区序列的核酸分子，该重链可变区序列包含本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列。本发明还提供了编码重链可变区序列的核酸分子，该重链可变区序列包含与本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

例如，本发明提供了编码轻链可变区序列的核酸分子，该轻链可变区序列包含本文公开的任一个轻链可变区序列的CDR序列。本发明还提供了编码轻链可变区序列的核酸分子，该轻链可变区序列包含与本文公开的任一个轻链可变区序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

在一些实施方案中，核酸是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文公开的抗体的核苷酸序列的核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文公开的抗体的脱氧核苷酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方案中，可将脱氧核糖核酸(DNA)体内引入人体细胞中。在一些实施方案中，本发明的脱氧核糖核酸(DNA)包含在载体或递送剂中。在一些实施方案中，本发明的脱氧核糖核酸(DNA)被整合到细胞的基因组中。

在一些实施方案中，可将核糖核酸(RNA)体内引入人体细胞中。在一些实施方案中，本发明的核糖核酸(RNA)包含在载体或递送剂中。

载体

本公开提供了包含本文公开的核酸的载体。

在一些实施方案中，载体是能够表达包含抗体的重链或轻链可变区的多肽的表达载体。例如，本发明提供了包含上述任何核酸分子的表达载体。

任何载体都可以适用于本公开。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任何组合。合适的示例性载体包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1 GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空质粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES萤光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc。

表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体，如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas LifeSciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)和pEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。可用于本公开内容的植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19 (Clontech)。可用于本公开内容的动物表达载体的实例包含pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo (Clontech)。

重组表达载体可以使用描述于例如Sambrook等人, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. 2001;以及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994中的标准重组DNA技术制备。可以制备环形或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中的复制系统功能。复制系统可以衍生自例如COLEL、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

例如，载体可以是包含编码本文公开的抗体的核苷酸序列的腺病毒载体。载体可以被施用到受试者体内，然后体内进入受试者的细胞，从而将本文公开的编码抗体的核苷酸序列整合到细胞的基因组中，随后细胞表达本文公开的抗体。

宿主细胞

本公开提供了包含本文公开的核酸或本文公开的载体的宿主细胞。

任何细胞都可以用作本公开的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E. coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌(Shigella)；杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如CHO细胞，如CHOS细胞和CHO-K1细胞，或HEK293细胞，如HEK293A、HEK293T和HEK293FS。

本发明的宿主细胞通过在体外或离体引入本文公开的载体或本文公开的核酸来制备。可以将本发明的宿主细胞施用于受试者体内，并且该宿主细胞在体内表达本文公开的抗体。

本发明提供其中已引入任何上述载体的宿主细胞。本发明还提供了制备本发明的抗体的方法，该方法包括a)在适合产生抗体的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞；和b)从培养物中获得抗体。

药物组合物

本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载剂或赋形剂。

本发明的抗体或其抗原结合片段或药剂(在本文中也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物可掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体或其抗原结合片段或药剂以及药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类载剂或赋形剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水媒介物如不挥发油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

在一些实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方案中，第二治疗剂是细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白介素(例如IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15)和干扰素(例如IFNα、IFNγ)。 在一些实施方案中，第二治疗剂是白介素。在优选的实施方案中，第二治疗剂是IL-2。

在一些实施方案中，第二治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽醌、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如三尖杉碱、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、氮丙环、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

可以配制本发明的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、透皮(即局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二酸四乙胺(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。pH值可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应该是以易于注射的程度存在的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适混合物。适当的流动性可以例如通过使用包被如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持需要的粒度和通过使用表面活性剂来保持。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液可以通过如下制备：将所需量的活性化合物与上文列举的一种成分或成分的组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性化合物引入无菌媒介物中来制备，该媒介物含有基本分散介质和来自上述列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他期望成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的流体载剂来制备，其中将流体载剂中的化合物口服施用并漱口并吐出或吞服。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：结合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

对于吸入施用，化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或含有合适的推进剂(例如气体如二氧化碳)的分配器或喷雾器中递送。

全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在配制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，活性化合物被配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。

活性化合物也可以制成栓剂形式(例如，使用常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。

在一个实施方案中，活性化合物与将保护化合物免于从体内快速消除的载剂(如控释配制剂，包括植入物和微囊化递送系统)一起制备。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明提供包含本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物将与合适的载剂、赋形剂和掺入配制剂中的其他药剂一起施用以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的配制剂可见于所有药物化学家已知的处方中：Remington’sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA。这些配制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、果冻、蜡、油、脂质、含囊泡脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTIN™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、聚乙二醇乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。另见Powell等人"Compendium ofexcipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311。

缀合物

本公开提供了缀合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

在本公开的上下文中，“缀合物”是共价连接至化学部分的抗体或抗体片段(如抗原结合片段)。化学部分可以是例如药物、毒素、治疗剂、可检测标记、蛋白质、核酸、脂质、纳米颗粒、碳水化合物或重组病毒。抗体缀合物通常称为“免疫缀合物”。当缀合物包含连接至药物(例如，细胞毒剂)的抗体时，缀合物通常被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。

术语“缀合”或“连接”可以指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体连接至化学部分。在另一个实施方案中，连接至化学部分的抗体进一步连接至脂质或其他分子至蛋白质或肽以增加其在体内的半衰期。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和化学部分之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包括在抗体和化学部分之间。

可以使用本领域技术人员已知的任何数量的方式将化学部分连接至本发明的抗体。可以使用共价和非共价附接方式。将化学部分附接至抗体的程序根据化学部分的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)部分，它们可用于与抗体上合适的官能团反应以导致化学部分的结合。替代性地，抗体被衍生化以暴露或附接额外的反应性官能团。衍生化可以涉及附接许多已知接头分子中的任何一种。接头可以是用于将抗体连接到化学部分的任何分子。接头能够与抗体和化学部分两者形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在抗体和化学部分是多肽的情况下，接头可以通过它们的侧基连接至组成氨基酸(如通过二硫键至半胱氨酸)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。

在某些情况下，当免疫缀合物到达其靶位点时，期望从抗体中释放化学部分。因此，在这些情况下，免疫缀合物将包含在靶位点附近可切割的连接。

酶促活性或免疫缀合物在靶细胞内或靶位点附近所经受的条件可能促使接头裂解以从抗体释放化学部分。

鉴于已报道的用于将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标记物(如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他药剂附接至抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定将给定药剂附接至抗体或其他多肽的合适方法。

本文公开的抗体可以衍生化或连接到另一个分子(如另一个肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分被衍生化，使得与靶抗原的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，如另一种抗体(例如，双特异性抗体或二价抗体)、检测剂、药剂、和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。

一种类型的衍生抗体是通过交联两种或多种抗体(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有被合适的间隔区隔开的两个明显反应性部分(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的异双官能交联剂或同双官能交联剂(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类接头是可商购的。

在本发明公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

在一些实施方案中，治疗剂包括但不限于免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)、化学治疗剂(例如顺铂)或毒素。在一些实施方案中，治疗剂可以是例如美登素、格尔德霉素、微管蛋白抑制剂如微管蛋白结合剂(例如奥瑞他汀类)或小沟结合剂如加利车霉素。

其他合适的治疗剂包括例如小分子细胞毒剂，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的分子量小于700道尔顿的化合物。此类化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒剂还包括药物前体，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。此类药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素、加利车霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer钠光敏素II、替莫唑胺、拓扑替康、三甲双胍、奥瑞他汀E长春新碱和多柔比星；肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段，例如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即随着一种或多种a或β粒子或γ射线的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素，例如碘-131、铼-186、铟-111、钇-90、铋-210、铋-213、锕-225和砹-213；螯合剂可用于促进这些放射性核素与分子或其多聚体的结合。

在一些实施方案中，可检测部分可以选自生物素、链霉亲和素、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子或荧光、磷光或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。

抗体可以与可检测标记缀合；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像NMRI)、磁共振断层扫描(MTR)、超声、纤维光学检查和腹腔镜检查)检测的可检测标记。可检测标记的具体、非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。也可以使用生物发光标记，如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。

抗体或抗原结合片段还可以与可用于检测的酶缀合，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶缀合时，可以通过添加酶用来产生可识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当存在辣根过氧化物酶试剂时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入会导致有色反应产物，这可以通过视觉检测到。抗体或抗原结合片段也可以与生物素缀合，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测量来检测。应该注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标记缀合。

抗体可以与自标记蛋白标签(例如HaloTag)融合。例如，蛋白质标签可以克隆到恒定区的末端。HaloTag是衍生自细菌酶(卤代烷脱卤素酶)的自标记蛋白标签，旨在与合成配体共价结合。在一些情况下，合成配体包含附接至荧光团如近红外荧光团的氯代烷烃接头(Los等人(2008) ACS Chem Biol. 3(6):373-82)。

抗体可以用诸如钆的磁性剂标记。抗体也可以用镧系元素(如铕和镝)和锰标记。

顺磁性颗粒如超顺磁性氧化铁也可以用作标记。抗体也可以用第二报告基因识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。在一些实施方案中，标签由各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

抗体也可以用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记可以用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X射线、发射光谱或其他诊断技术检测靶抗原的表达。多肽标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。

在一些实施方案中，免疫刺激分子是刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，免疫刺激分子可以是细胞因子如IL-2和IFN-γ、趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白、补体激活剂；病毒/细菌蛋白结构域，或病毒/细菌肽。

治疗方法

本公开提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方案中，癌症是DLL3阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是神经内分泌瘤。神经内分泌瘤包括神经内分泌肿瘤和神经内分泌癌。 神经内分泌瘤的实例包括但不限于胰腺来源的神经内分泌肿瘤、胃肠道来源的神经内分泌肿瘤、肺神经内分泌肿瘤、垂体神经内分泌肿瘤、头颈神经内分泌肿瘤、乳腺神经内分泌肿瘤、泌尿生殖系统神经内分泌肿瘤、肾上腺神经内分泌肿瘤和皮肤神经内分泌肿瘤。在优选的实施方案中，癌症是肺癌，优选小细胞肺癌。

在一些实施方案中，施用于受试者的剂量可随实施方案、所用药物、施用方法以及待治疗的部位和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。临床医生可以确定施用于人或其他受试者以治疗医学病症的有效量。治疗有效所需的精确量可能取决于许多因素，例如抗体的活性和施用途径。

本文所述的抗体、组合物或缀合物的剂量可以在合适的时间段内一次性或以一系列亚剂量施用于哺乳动物，例如根据需要，每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两月、每半年或每年一次。包含有效量的抗体、组合物或缀合物的剂量单位可以单日剂量施用，或者总日剂量可以根据需要以每日施用的两个、三个、四个或更多个分剂量施用。

合适的施用方式可以由医生选择。施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部施用。在一些实施方案中，选择抗体、组合物或缀合物用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。施用剂量和方法可以根据受试者的重量、年龄、条件等而变化，并且可以适当地选择。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方案中，本文公开的抗体、组合物或缀合物在第二治疗剂施用之前、基本上同时或之后施用。

在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方案中，第二治疗剂是细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白介素(例如IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15)和干扰素(例如IFNα、IFNγ)。 在一些实施方案中，第二治疗剂是白介素。在优选的实施方案中，第二治疗剂是IL-2。

在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽醌、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如三尖杉碱、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、氮丙环、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

医疗用途

本公开提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备治疗受试者的癌症的药物中的用途。

本公开还提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物，其用于治疗受试者的癌症。

在本文公开的用途的一些实施方案中，癌症是DLL3阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是神经内分泌瘤，例如肺癌，优选小细胞肺癌。

在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂联合。在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自白介素(例如IL-2)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。在一些实施方案中，第二治疗剂是细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白介素(例如IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15)和干扰素(例如IFNα、IFNγ)。 在一些实施方案中，第二治疗剂是白介素。在优选的实施方案中，第二治疗剂是IL-2。

诊断和检测方法

本公开提供了体外或体内检测DLL3蛋白的方法。在一些情况下，在生物样品中检测DLL3表达。样品可以是任何样品，包括但不限于血液样品、来自活组织检查的组织、尸体解剖和病理学标本。生物样品还包括体液，如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿液。生物样品通常获自哺乳动物，如人或非人灵长类动物。

本公开还提供了通过使来自受试者的样品与本文公开的抗DLL3抗体接触；并检测抗体与样品的结合来确定受试者是否患有DLL3阳性癌症的方法。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品的结合增加鉴定受试者患有癌症。

在另一个实施方案中，本公开提供了通过使来自受试者的样品与本文公开的抗DLL3抗体接触；并检测抗体与样品的结合来诊断受试者中的DLL3阳性癌症的方法。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品的结合增加证实了受试者中癌症的诊断。

在一些实施方案中，对照样品是来自没有癌症的受试者的样品。在特定实施方案中，样品是血液或组织样品。

在诊断和检测方法的一些实施方案中，抗DLL3抗体直接用可检测标记标记。在另一个实施方案中，抗DLL3抗体(第一抗体)是未标记的，而第二抗体或可以结合第一抗体的其他分子是标记的。正如本领域技术人员所熟知的，选择能够特异性结合特定物种和类别的第一抗体的第二抗体。例如，如果第一抗体是人IgG，则第二抗体可以是抗人IgG。可与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者均可商购。

抗体或二抗的合适标记包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制性示例性发光材料是鲁米诺(luminol)；非限制性示例性磁性剂是钆，并且非限制性示例性放射性标记包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在替代性实施方案中，可以通过竞争免疫测定法在生物样品中测定DLL3，该测定法利用用可检测物质标记的DLL3蛋白标准品和未标记的抗DLL3抗体。在该测定中，将生物样品、标记的DLL3蛋白标准品和抗DLL3抗体组合，并确定与未标记抗体结合的标记的DLL3蛋白标准品的量。生物样品中DLL3的量与结合抗DLL3抗体的标记DLL3蛋白标准品的量成反比。

本文公开的免疫测定和方法可用于多种目的。在一个实施方案中，抗DLL3抗体可用于检测细胞培养物中细胞中DLL3的产生。在另一个实施方案中，该抗体可用于检测生物样品(如组织样品或血液或血清样品)中DLL3的量。在一些实例中，DLL3是细胞表面DLL3。

试剂盒

本公开提供了药物包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，其中装有本文所述药物组合物的一种或多种成分，如本文公开的抗体或抗原结合片段。

在具体实施方案中，该试剂盒包括含有本文公开的抗体的第一容器。在具体实施方案中，该试剂盒包括第一容器，其是在真空下含有作为冻干无菌粉末的抗体的小瓶，并且该试剂盒还包括含有药学上可接受的流体的第二容器。

在具体实施方案中，本文提供含有抗体的注射装置。在具体实施方案中，注射装置包含在无菌溶液中的抗体。在具体实施方案中，注射装置是注射器。

在一个实施方案中，提供该试剂盒用于检测生物样品(如血液样品或组织样品)中的DLL3。例如，为了确认受试者的癌症诊断，可以进行活组织检查以获得用于组织学检查的组织样品。用于检测多肽的试剂盒通常包含抗DLL3抗体，如本文公开的任何单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体被标记(例如，用荧光、放射性或酶促标记)。

在一个实施方案中，试剂盒包括公开使用抗DLL3抗体的方式的说明材料。说明材料可以是书面的、电子形式的(如计算机软盘或光盘)，也可以是可视的(如视频文件)。试剂盒还可以包括额外的组分以促进试剂盒被设计用于的应用。因此，例如，试剂盒可以另外含有检测标记的工具(例如用于酶促标记的酶底物、用于检测荧光标记的过滤器组、合适的二级标记如二抗等)。试剂盒还可以包括缓冲液和其他常规用于实施特定方法的试剂。此类试剂盒和合适的内容物是本领域技术人员众所周知的。

在一个实施方案中，诊断试剂盒包括免疫测定。检测生物样品中DLL3的方法通常包括使生物样品与抗DLL3抗体接触的步骤。使抗体在免疫反应条件下特异性结合形成免疫复合物，直接或间接检测免疫复合物(结合抗体)的存在。

实施例

出于说明本发明的各项实施方案的目的，给出以下实施例，但并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例以及本文描述的方法当前代表优选实施方案，是示例性的，并非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内的变化和其他用途。

293 free style (293FS)细胞、CHO-S细胞和蛋白A琼脂糖购自ThermoFisherScientific。DLL3阳性细胞系NCI-H82 (人小细胞肺癌细胞)和DLL3阴性细胞系LS174T购自中科院上海细胞库（National Collection of Authenticated Cell Cultures）。DLL3阴性细胞系HT55购自南京科佰生物科技有限公司。

人DLL3蛋白(His标签)、恒河猴DLL3蛋白和人CD3蛋白购自ACRO。小鼠DLL3蛋白购自Kaika Biology。在山羊中产生的抗人IgG (γ-链特异性)-R-藻红蛋白抗体和在山羊中产生的抗人IgG (Fc特异性)-过氧化物酶抗体购自Sigma。小鼠单克隆抗His标签抗体(HRP)购自Sino Biological。

构建了稳定细胞系LS174T-DLL3以促进体外和体内功效研究。简而言之，将商购的DLL3重组质粒pCMV-DLL3 (Sino Biological)用Hieff Trans Liposomal TransfectionReagent (YEASEN)和转染特异性培养基Opti-MEM™ I(Gibco)瞬时转染到LS174T细胞中。细胞培养物随后补充潮霉素B以选择阳性克隆。2-3周后，逐渐分离出单个阳性克隆，并用流式细胞术进行验证。获得DLL3阳性稳定细胞系LS174T-DLL3。

实施例1.抗DLL3抗体的免疫和筛选

通过使用人DLL3蛋白作为免疫缀合物来免疫Balb/c小鼠(6-8周龄)从而获得针对DLL3的抗体。第四次免疫后一周，通过ELISA测定从每只小鼠尾静脉收集的抗血清的效价。处死具有最高抗血清效价的小鼠，取出脾脏以8:1的比例与骨髓瘤细胞SP2/0融合。

培养10天后，显微镜下可见明显的杂交瘤细胞。ELISA检测杂交瘤细胞上清液与人DLL3蛋白的结合活性。ELISA使用标准方案进行。简而言之，人DLL3蛋白以1000 ng每孔包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上，在4℃下过夜，并用含3%脱脂牛奶的PBS(pH7.4)封闭。加入30微升杂交瘤细胞上清液，然后37℃孵育1 h。用含有0.05% Tween20的PBS洗涤各孔。结合的抗体通过HRP缀合的山羊抗小鼠IgG-Fc片段交叉吸附抗体(Bethyl)检测。该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)显色，并使用酶标仪在450 nm处测量。通过使用类似的方案，分别检测杂交瘤细胞上清液与恒河猴DLL3蛋白和小鼠DLL3蛋白的结合活性。选择与人和恒河猴DLL3蛋白结合但不与小鼠DLL3蛋白结合的杂交瘤细胞上清液用于后续测定。

为了测量杂交瘤细胞上清液与细胞表面DLL3的结合能力，使用DLL3阳性肿瘤细胞系NCI-H82进行流式细胞术。约2.5×10⁵个细胞与杂交瘤细胞上清液在冰上孵育1 h。用含有0.5%牛血清白蛋白的PBS (PBSA)洗涤细胞一次，并重悬于100 μl PBSA中。然后加入1 µl山羊抗小鼠IgG (H+L)高吸附二抗Alexa Fluor 633 (Thermo Fisher)并孵育30分钟。细胞用PBSA洗涤一次并用于流式细胞术分析。最后，鉴定出特异性抗DLL3克隆1G2用于构建单克隆抗体和双特异性抗体。

实施例2.抗DLL3单克隆抗体的构建和表征

抗DLL3克隆1G2用于构建针对人DLL3的完整形式的单克隆抗体IgG1 (称为DLL3-1G2 mAb)。1G2克隆的Fab片段融合至人IgG1 Fc片段的N端。将轻链和重链分别构建到载体pcDNA3.4中。DLL3-1G2 mAb的构建和初始表征如下进行。

抗DLL3单克隆抗体的克隆

为生成抗DLL3单克隆抗体的构建体，使用了以下引物：

1G2Mo-mAB-LC-F:

5’ CCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCgatgttttgatgacccaaactcc 3’(正义) (SEQ ID NO:35);

1G2Mo-mAB-LC-R：

5’ CAGATGGTGCAGCCACCGTACGtttgatttccagcttggtgcctc 3’(反义) (SEQ ID NO:36);

1G2Mo-mAB-HC-F:

5’ TCCTGACTGGGGTGAGGGCCcaggtccaactgcagcagcctgggg 3’(正义) (SEQ ID NO:37);

1G2Mo-mAB-HC-R：

5’ GATGGGCCCTTGGTGCTAGCtgcagagacagtgaccagagtccctt 3’(反义) (SEQ IDNO: 38);

pBY-vectormAB-LC-FP：

5’ CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG 3’(正义) (SEQ ID NO: 39);

pBY-vectormAB-HC-FP:

5’ GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC 3’(正义) (SEQ ID NO: 40);

pBY-SP-RP：

5’ GGCCCTCACCCCAGTCAGGAGGACCAGGCAACAG 3’(反义) (SEQ ID NO: 41)。

使用引物对1G2Mo-mAB-LC-F/1G2Mo-mAB-LC-R从抗DLL3克隆1G2扩增抗DLL3抗体的VL结构域的基因片段。使用引物对1G2Mo-mAB-HC-F/1G2Mo-mAB-HC-R从抗DLL3克隆1G2扩增抗DLL3抗体VH结构域的基因片段。使用引物对pBY-vectormAB-LC-FP/pBY-SP-RP和pBY-vectormAB-HC-FP/pBY-SP-RP克隆轻链和重链载体的片段。然后经由吉布森(Gibson)组装将VH和VL结构域的基因片段克隆到两个轻链和重链载体中。

蛋白质表达、纯化和初步表征

DLL3-1G2 mAb在CHO-S细胞中表达。将质粒和转染剂PEI按1:3的比例混合，然后滴加到CHO-S细胞培养液中。转染后细胞继续生长5-7天。在8000 rpm下离心20分钟，收获细胞培养物。将含有靶标蛋白的培养上清液加载到Protein A Sepharose 4 Fast Flow柱(GEHealthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。

对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE上，DLL3-1G2 mAb显示出约150 kDa的表观分子量(aMW)。在还原性SDS-PAGE上，重链和轻链分别具有约50 kDa和25kDa的表观分子量(数据未显示)。

DLL3-1G2 mAb的根据Kabat编号系统的CDR序列、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列、以及完整轻链（LC）和重链（HC）序列如下所示。

DLL3-1G2 mAb LCDR1:

RSSQSIVHSNGDTYLE (SEQ ID NO: 1)

DLL3-1G2 mAb LCDR2:

KVSNRFS (SEQ ID NO: 2)

DLL3-1G2 mAb LCDR3:

FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 3)

DLL3-1G2 mAb HCDR1:

SYWMN (SEQ ID NO: 6)

DLL3-1G2 mAb HCDR2:

MIHPSDSETRLNQKFKD (SEQ ID NO: 7)

DLL3-1G2 mAb HCDR3:

WDYYDYAWFAY (SEQ ID NO: 8)

DLL3-1G2 mAb VL:

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 4)

DLL3-1G2 mAb VH:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 9)

DLL3-1G2 mAb LC:

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQ ID NO: 5)

DLL3-1G2 mAb HC:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 10)

实施例3.抗DLL3单克隆抗体与DLL3的结合

根据标准方案进行ELISA，以确定DLL3-1G2 mAb与人DLL3蛋白的结合亲和力。简而言之，将人DLL3蛋白以100 ng每孔包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上，在4℃下过夜，并用含3%脱脂牛奶的PBS (pH7.4)封闭。加入从100 μg/mL五倍连续稀释的抗体，并在室温下孵育2 h。用含有1%脱脂牛奶的PBS清洗板。通过抗Fc标签抗体(HRP)(Sigma)检测结合的抗体。该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)显色，并用酶标仪在450nm处检测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。结果显示于图1中。

结果表明，DLL3-1G2 mAb以29.53 ng/mL的EC₅₀结合人DLL3，表明DLL3-1G2 mAb对人DLL3具有高亲和力和潜在的优异性能。

实施例4.抗DLL3双特异性抗体的构建与表征

双特异性T细胞接合剂(BiTE)是一类新型的双特异性抗体，其通过同时结合肿瘤抗原和如T细胞表面CD3分子的T细胞抗原，引导细胞毒性T细胞杀伤癌细胞。在本实施例中，设计了一种特定形式的BiTE，其由形成异二聚体的轻链和重链组成。轻链从N端至C端包含抗靶标scFv、抗CD3 VL-CL和单体人IgG1 Fc (mFc7.2)。重链从N端至C端包含抗CD3 VH-CH1和mFc7.2（图2）。mFc7.2含有能够抑制Fc同二聚化的两个氨基酸突变(T366L和Y407H)，如PCT申请号PCT/US2018/016524中所述，该申请通过引用整体并入本文。

为了生成DLL3×CD3 BiTE，将上述DLL3-1G2 mAb的VL和VH结构域人源化，以得到人源化抗DLL3 VL和VH结构域。最终得到一个人源化抗DLL3 VL结构域(SEQ ID NO: 11)和两个人源化抗DLL3 VH结构域(SEQ ID NO: 12和13)。人源化VL和VH结构域经由接头GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 25)连接以形成抗DLL3-scFv。该scFv经由接头GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)融合至抗CD3 Fab的VL结构域的N端。为了获得全长轻链，通过融合克隆将抗DLL3 scFv片段克隆到含有抗CD3 VL-CL和完整工程化Fc的pBY质粒中。将重链构建到单个载体pBY中用于在哺乳动物细胞中表达。获得的DLL3×CD3 BiTE分别命名为DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1。

将含有重链和轻链基因的两种质粒共转染至293FS或CHO-S细胞。将质粒和转染剂PEI以1:3的比例混合，然后滴加到293FS或CHO-S细胞培养物中。转染后细胞继续生长5-7天。在8000 rpm下离心20分钟，收获细胞培养物。将含有靶标蛋白的培养上清液加载到Protein A Sepharose 4 Fast Flow柱(GE Healthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。

对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE上，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1显示出约124 kDa的表观分子量(aMW)(数据未显示)。

DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1的根据Kabat编号系统的CDR序列、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列、以及完整轻链（LC）和重链（HC）序列如下所示。

针对DLL3的LCDR1:

RSSQSIVHSNGDTYLE (SEQ ID NO: 1)

针对DLL3的LCDR2:

KVSNRFS (SEQ ID NO: 2)

针对DLL3的LCDR3:

FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 3)

针对DLL3的HCDR1:

SYWMN (SEQ ID NO: 6)

针对DLL3的HCDR2:

MIHPSDSETRLNQKFKD (SEQ ID NO: 7)

针对DLL3的HCDR3:

WDYYDYAWFAY (SEQ ID NO: 8)

针对CD3的LCDR1:

RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 14)

针对CD3的LCDR2:

GANKRAP (SEQ ID NO: 15)

针对CD3的LCDR3:

ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 16)

针对CD3的HCDR1:

TYAMN (SEQ ID NO: 18)

针对CD3的HCDR2:

RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 19)

针对CD3的HCDR3:

HGNFGSSYVSYFAY (SEQ ID NO: 20)

针对CD3的VL:

EIVVTQSPATLSVSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGANKRAPGVPARFSGSLSGDEATLTISSLQSEDFAVYYCALWYSNLWVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 17)

针对CD3的VH:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGSSYVSYFAYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 21)

针对DLL3的VL:

DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 11)

DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1的针对DLL3的VH:

QVQLVQSGAELKRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)

DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1的针对DLL3的VH：

QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETRLNQKFKDRVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13)

DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1的LC:

QVQLVQSGAELKRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKVEIKGSGGGGSGGGGSEIVVTQSPATLSVSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGANKRAPGVPARFSGSLSGDEATLTISSLQSEDFAVYYCALWYSNLWVFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGSCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLHSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 22)

DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1的LC:

QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETRLNQKFKDRVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARWDYYDYAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKVEIKGSGGGGSGGGGSEIVVTQSPATLSVSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGANKRAPGVPARFSGSLSGDEATLTISSLQSEDFAVYYCALWYSNLWVFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGSCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLHSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 23)

HC:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGSSYVSYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLHSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 24)

实施例5.DLL3×CD3 BiTE与DLL3和CD3的结合

为确定双特异性抗体DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1对人DLL3和人CD3的结合亲和力，如实施例3所述进行ELISA实验，其中包被蛋白为人DLL3或人CD3。

此外，还进行了共结合测定以进一步确定DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1的结合亲和力。将人CD3蛋白以（Fc标签）100 ng每孔包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上，在4℃下过夜，并用含3%脱脂牛奶的PBS (pH7.4)封闭。然后同时加入每孔100 ng的人DLL3蛋白和从100 µg/mL五倍连续稀释的抗体，并在室温下孵育2 h。用含有1%脱脂牛奶的PBS洗涤板。结合的抗体通过抗-His标签抗体(HRP)(SinoBiological)检测。该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)显色，并用酶标仪在450 nm处检测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。结果显示于图3-5中。

结果表明，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1分别以1453 ng/mL和891.8 ng/mL的EC₅₀结合人CD3 (图3)，分别以377.9 ng/mL和267.0 ng/mL的EC₅₀结合人DLL3 (图4)。此外，共结合分析的结果表明，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1以高亲和力同时结合DLL3和CD3蛋白(图5)。这些结果表明DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1能够以高亲和力结合DLL3和CD3，提示了DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1潜在高效的体外和体内抗肿瘤活性。

实施例6.DLL3×CD3 BiTE与癌细胞系的结合

为了测量DLL3×CD3 BiTE与细胞表面表达的DLL3的结合能力，使用DLL3阳性细胞系H82和LS174T-DLL3以及DLL3阴性细胞系HT55进行流式细胞术。将约5×10⁵个细胞与10 μg/mL DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1或DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1在冰上孵育60分钟。细胞用含有0.5%牛血清白蛋白的PBS (PBSA)洗涤一次，并重悬于100 µl PBSA中。然后加入1 µL/测试预吸附的山羊F(ab')2抗人IgG-(Fab')2 (PE) (Abcam)作为二抗并孵育30分钟。阴性对照组仅添加二抗。细胞用0.5%PBSA洗涤一次，然后用于流式细胞术分析。结果显示于图6A-6C中。

结果表明，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和 DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1与DLL3阳性的H82和LS174T-DLL3细胞结合良好，但基本上不与DLL3阴性的HT55细胞结合。

实施例7.DLL3×CD3 BiTE介导的T细胞活化

DLL3×CD3 BiTE在靶细胞(LS174T、H82和LS174T-DLL3细胞)存在的情况下激活人T细胞的能力和特异性通过使用Bio-Glo^TM萤光素酶测定系统和TCR/CD3效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)进行评估。在这些靶细胞中，LS174T 细胞不表达人DLL3，而H82和LS174T-DLL3细胞具有高水平的DLL3表达。TCR/CD3效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)表达内源性TCR和CD3受体。当效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)与适当的TCR/CD3配体或抗TCR/CD3抗体接合时，TCR转导细胞内信号，导致TCR介导的T细胞活化并产生增强的荧光信号。

将靶细胞(LS174T和LS174T-DLL3细胞)以每孔100 μL DMEM完全培养基中1×10⁴个细胞的密度接种在96孔板上过夜。去除60 μL的上清液后，每孔加入5倍梯度稀释的40 μl抗体(DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1或DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1)，最大浓度为50 μg/mL。以此同时，将上述测试抗体以40 μL/孔添加至新的96孔板，并将靶细胞（H82细胞）以40 μL DMEM完全培养基中1×10⁵个细胞的密度接种在该新的96孔板上。然后以每孔40 μl DMEM完全培养基中2×10⁵个细胞的密度加入效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)。将板在加湿培养箱中于37°C孵育6小时。然后，将Stable-Lite萤光素酶测定系统溶液(Vazyme)以120μL/孔加入每个孔中，并在室温下避光孵育10分钟。使用SpectraMax®i3x ELISA阅读器(Molecular Devices)检测发光。结果显示于图7A-7C中。

在DLL3阴性LS174T细胞存在的情况下，效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)未被DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1有效激活，EC₅₀分别为约10569 ng/mL和20093ng/mL（图7A）。在DLL3阳性H82或LS174T-DLL3细胞存在的情况下，效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)被DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1有效激活，EC₅₀分别为约4024 ng/mL、1971 ng/mL、5468 ng/mL和2703 ng/mL（图7B-7C）。这些结果表明DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1可以同时结合效应细胞的CD3抗原和肿瘤细胞的DLL3抗原，从而导致T细胞特异性活化。

实施例8.DLL3×CD3 BiTE介导的人癌细胞系杀伤

双特异性T细胞接合剂可以同时与肿瘤抗原和T细胞抗原(例如，T细胞表面的CD3分子)结合，导致T细胞聚集和活化，最终导致肿瘤细胞的杀伤。为了评估DLL3×CD3 BiTE的杀伤效率，使用DLL3阴性LS174T 细胞和DLL3阳性LS174T-DLL3细胞作为靶细胞。

将靶细胞以每孔100 μL DMEM完全培养基中4×10⁴个细胞的密度接种在96孔板上并孵育过夜。第二天，将50 µl从4 μg/ml五倍连续稀释的抗体添加到每孔。然后以每孔50μLDMEM完全培养基中4×10⁴个细胞的密度加入效应细胞人T效应细胞并孵育6小时。孵育后，去除培养基，并加入20 µL CCK8并在CO₂培养箱中孵育30分钟。根据制造商的说明，使用酶标仪测量细胞杀伤活性。结果显示于图8A-8B中。

结果表明，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1对DLL3阴性LS174T细胞不具有有效的T细胞依赖性细胞毒性(CTL)(图8A)，但对DLL3阳性细胞系LS174T-DLL3具有有效的T细胞依赖性细胞毒性，其中CTL EC50分别为304.8 ng/mL和103.6 ng/mL(图8B),表明CTL杀伤功效依赖于双特异性抗体与肿瘤抗原DLL3以及T细胞抗原CD3的结合。总而言之，这些结果证明，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1明显具有体外致死作用，值得进一步开发。

实施例9.DLL3×CD3 BiTE介导的小鼠中的肿瘤生长抑制

将200μL 3×10⁶个LS174T-DLL3细胞皮下接种到B-NDG小鼠的右侧腹部，并将这些小鼠随机分为五组（每组三只小鼠）。阴性对照组中的小鼠腹膜内给予生理盐水。实验组中的小鼠每周三次腹膜内施用100或500 μg/kg的DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1或者100或500 μg/kg的DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1，每周三次腹膜内施用100 μL 1000 IU人白介素-2 (IL-2)和每周一次腹膜内施用300 μL 2×10⁷ 人T细胞，总共处理16天。小鼠总共接受六次抗体处理、六次IL-2处理和两次T细胞处理。同时，每周三次测量肿瘤体积和小鼠体重，持续16天。使用以下公式计算肿瘤生长抑制率(TGI)：TGI(%)=(C-T)/C×100(T：实验组平均肿瘤体积；C：对照组平均肿瘤体积)。结果如图9A-9B所示。

结果表明，通过DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1或DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1在100和500 μg/kg的两个剂量下的处理观察到显著的抗肿瘤作用，并且在16天的处理后DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1的肿瘤生长抑制率（TGI）分别达到79.79%（对于100 μg/kg组而言）和100%（对于500μg/kg组而言），DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1的肿瘤生长抑制率（TGI）分别达到79.69%（对于100μg/kg组而言）和100%（对于500 μg/kg组而言）（图 9A）。所有小鼠组的体重仅有微小变化（图9B），表明DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1在体内具有低毒性优势。

综上所述，DLL3-1G2H1L1-M6MV1-1和DLL3-1G2H2L1-M6MV1-1具有优异的体外和体内药效功能。因此，这些靶向DLL3和CD3的双特异性抗体有望进行临床研究。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言，这些实施方案仅作为示例提供是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变体、变化和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (39)

1. 特异性结合DLL3的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中所述VL包含分别具有如SEQ ID NO：1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH包含分别具有如SEQ ID NO：6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述VL包含与SEQ ID NO：4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO：9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)所述VL包含与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO：12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；或者

(iii)所述VL包含与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

3. 根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述VL包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列并且所述VH包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列；或者

(ii)所述VL包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且所述VH包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；或者

(iii)所述VL包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且所述VH包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体属于选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体属于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv和ds-scFv。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体。

9. 根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO：5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。

11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体，其进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区。

12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。

13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为T细胞抗原。

14. 根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD38、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB (CD137)和NKG2D。

15. 双特异性抗体或其抗原结合片段，包含结合DLL3的第一抗原结合区和结合CD3的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，所述第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中

所述VL1包含分别具有如SEQ ID NO：1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH1包含分别具有如SEQ ID NO：6-8所示氨基酸序列的HCDR 1-3；和

所述VL2包含分别具有如SEQ ID NO：14-16所示氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH2包含分别具有如SEQ ID NO：18-20所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

16. 根据权利要求15所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述VL1包含与SEQ ID NO：4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列并且所述VH1包含与SEQ ID NO：9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)所述VL1包含与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列并且所述VH1包含与SEQ ID NO：12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；或者

(iii)所述VL1包含与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列并且所述VH1包含与SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且其中

所述VL2包含与SEQ ID NO：17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列并且所述VH2包含与SEQ ID NO：21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

17. 根据权利要求16所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列并且所述VH1包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列；或

(ii)所述VL1包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且所述VH1包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；或

(iii)所述VL1包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列并且所述VH1包含如SEQ IDNO: 13所示的氨基酸序列；并且其中

所述VL2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列并且所述VH2包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合区包含scFv，所述scFv包含所述VL1和所述VH1，并且所述scFv任选地经由接头连接至所述VL2或所述VH2的N端。

19. 根据权利要求18所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含：

第一多肽链，其从N端至C端包含：所述scFv、任选的接头、所述VL2、轻链恒定区(CL)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3); 和

第二多肽链，其从N端至C端包含：所述VH2、重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

20.根据权利要求18所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数。

21. 根据权利要求20所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含如SEQ ID NO：25或26所示的氨基酸序列。

22. 根据权利要求19所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述第一多肽链包含与SEQ ID NO：22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含与SEQ IDNO：24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；或

(ii)所述第一多肽链包含与SEQ ID NO：23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含与SEQ IDNO：24具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

23.根据权利要求15-17中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

24.核酸，其包含编码根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求15-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

25.载体，其包含根据权利要求24所述的核酸。

26.宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的核酸或根据权利要求25所述的载体。

27.药物组合物，其包含(i)根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载剂或赋形剂。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。

29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。

30.根据权利要求28或29所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自白介素、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

31.缀合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

32.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

33.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求15-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求27-30中任一项所述的药物组合物、或根据权利要求31或32所述的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途，其中所述癌症是DLL3阳性癌症。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述癌症是神经内分泌瘤。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述癌症是肺癌。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述癌症是小细胞肺癌。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的用途，其中所述药物与第二治疗剂组合。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述第二治疗剂选自白介素、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。