CN103429619A - 双特异性和单特异性、不对称抗体和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体。该抗体包括Fc区和Fab区,其中:(i)Fc区包括两个不相同的重链,其中两个不相同的重链的至少一个包含氨基酸修饰使得在两个不相同的重链之间形成互补,从而提高形成不相同的重链的异源二聚体的可能性并且降低形成相同重链的同源二聚体的可能性;和(ii)Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在所述Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键,其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。还提供了产生上述抗体的方法和上述抗体的用途。
Description
技术领域
本发明,在其一些实施方式中,涉及双特异性抗体,单特异性、不对称抗体和它们的制备方法。
背景技术
双特异性抗体(BsAb)是具有两个结合位点的抗体,各自针对不同靶抗原,对其它们可以同时结合(Baeuerle and Reinhardt,2009)。这种性能使得能够开发使用常规的单克隆抗体所不可能的治疗策略。双特异性抗体的主要应用包括:a)同时抑制两种靶(例如,可溶性配体的受体,受体和配体,或两种不同的配体),b)再导向,其中一种结合特异性针对靶细胞(通常为肿瘤细胞),而另一个结合位点则用来募集对于靶细胞的毒性活性或部分(T或NK细胞;用于前药活性的酶;细胞因子、放射性核素、病毒、毒素),c)提高的特异性,由两个抗体臂的同时接合而介导的强结合仅可以发生在表达两种抗原的细胞上(Fischer and Leger,2007;Amann et al.,2009;Lutterbuese et al.,2010)。由于双特异性抗体被视为有前途的治疗剂,因此已开发了若干双特异性模式,但由于与稳定性和制造复杂性有关的问题,它们的效用受到限制。在过去的20年中,已提出用于产生双特异性抗体的若干种策略,但尽管多次尝试和提出了多种抗体形式,BsAb仍然苦于缺乏产物均一性和具有挑战性的生产问题(Fischer andLeger,2007;Chames and Baty,2009)。
起初,尝试通过融合两种各自产生不同的抗体的杂交瘤来产生双特异性抗体,从而得到所谓的“四体杂交瘤(四源杂交瘤,quadromas)”或混合杂交瘤。然而,四体杂交瘤遭受遗传学不稳定性并产生重链和轻链的异质混合物。研究发现,平均而言,发现L链与H链的随机缔合具有两种抗体,并且仅有很小的部分是所期望的双特异性抗体(De Lau et al.,1991;Massino et al.,1997)。如果考虑由两种单特异性抗体A和B来产生双特异性抗体,则以IgG形式有效装配双特异性抗体具有两个基本要求,第一个要求是每个重链与第二个抗体的重链缔合(重链A与重链B缔合)并且不出现同源缔合(A+A或B+B)。第二个要求是每个轻链与它的同源重链缔合(轻链A与重链A,而不是轻链B与重链A,或轻链A与重链B)。在四体杂交瘤中抗体链的随机缔合不能满足这些要求。
抗体工程的进步使得可以有效生成双特异性抗体。先进的抗体工程使得能够产生新的重组抗体形式如串联单链可变片段(scFv)(Robinson etal.,2008)、双抗体(Hudson and Kortt,1999)、串联双抗体(Kipriyanov,2009)、二合一抗体(Bostrom et al.,2009)、和双可变区抗体(Wu et al.,2007)。这些新的抗体形式解决了一些制造问题,并提供均匀的制备品。然而,由于它们的较小尺寸,大多数的这些骨架遭受较差的药物代谢动力学并需要频繁给予或结合至较大的载体分子以提高半衰期(Constantinouet al.,2009)。
Ridgway等,1996年提供了对于用于制备双特异性抗体的两个标准之一的解决方案,使得能够重新考虑基于IgG的双特异性抗体在技术上是可行的。他们描述了一种称作“球形突出物进入孔中(knobs into holes)”的工程方式,其仅允许形成“抗体A和B”的重链之间的异源二聚体,而不允许形成同源二聚体。当研究重链缔合的规则时,作者推测,它主要依赖于在两个重链的CH3结构域之间的界面相互作用。当蛋白质结构域或亚结构域相互作用时,球形突出物是庞大的侧链,其突入相反结构域,此处它与小的侧链对齐其使得这样的侵袭成为可能。在他们的方法中,通过球形突出物插入到伴侣CH3结构域上的适当设计的孔中而预期了球形突出物和孔变异体的异源二聚体化。通过以最大的侧链,酪氨酸或色氨酸,替代小侧链来构建球形突出物。通过以较小侧链(在这种情况下为丙氨酸或苏氨酸)替代较大侧链来产生与球形突出物相同或相似尺寸的孔。以这种方式,由于侧链冲突,同为球形突出物变异体的两个重链不能同源缔合,并且由于缺乏稳定的侧链相互作用,两个孔变异体的同源缔合不太有利。随后,此基团工程化产生在CH3结构域的C端附近的二硫键以进一步稳定所装配的双特异性抗体(Merchant et al.,1998)。
美国专利号US 7,183,076教导了使用球形突出物和孔的方式产生双功能抗体的方法。
然而,球形突出物进入孔中的方式仅为重链的异质缔合提供解决方案,而并没有为每个重链与它的同源轻链的正确配对提供解决方案。因此,在这项研究中,通过共表达共同轻链和相应的改造重链接着进行蛋白A层析制备了能够同时结合至人类受体HER3和cMpI的双特异性IgG。工程化重链保留了它们的支持抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的能力,如用抗-HER2抗体所证明的(Merchant et al.,1998)。
国际专利申请2010/115589教导了三价双特异性抗体,其中对于携带球形突出物进入孔中突变的单特异性IgG,具有第二特异性的VH和VL在两个CH3结构域的C端处融合。
在美国专利申请US 2010/0256340中描述了类似的分子。
首先由Andreas Plückthun小组(Glockshuber et al.,1990)并随后由IraPastan小组(Brinkmann et al.,1993;Reiter et al.,1994a;Reiter et al.,1994b;Reiter et al.,1995)描述了二硫键稳定的Fv。Pastan小组进行了关于dsFv的大量工作,并使用分子建模来确定抗体Fv片段(Fv)在保守骨架区中的位置,其远离CDR,并潜在地可以用来制备重组Fv片段,其中通过插入到结构保守框架位置之间的工程链间二硫键稳定了不稳定的VH和VL异源二聚体。在这些位置之一处引入二硫键,结果表明VH44-VL105或VH111-VL48可以稳定各种Fv,其保留充分结合和特异性。
美国专利号US 5,747,654、US 6,147,203和US 6,558,672教导了二硫键稳定的Fv,其中Fv被改造以在轻链和重链之间引入另外的二硫键。
其它背景技术包括Jackman et al.,Journal of Biological Chemistry Vol285,No.27,pp.20850-20859,July2,2010和Schaefer et al.,Proc Natl AcadSci U S A.2011July5;108(27):11187–11192。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一个方面,提供了包含Fc区和Fab区的抗体,其中:
(i)Fc区包括两个不相同的重链,其中两个不相同的至少一个重链包含氨基酸修饰以形成在两个不相同的重链之间的互补,从而增加形成不同重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性;和
(ii)Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键,其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
根据本发明的一些实施方式的一个方面,提供了用于制备抗体的方法,包括:
(a)提供编码第一重链的第一核酸分子;
(b)提供编码第二重链的第二核酸分子;
(c)提供编码第一轻链的第三核酸分子;
(d)提供编码第二轻链的第四核酸分子;
(e)在允许表达核酸分子的条件下培养包含第一、第二、第三和第四核酸分子的宿主细胞;和
(f)回收抗体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面,提供了药物组合物,该药物组合物包含本文披露的抗体作为活性剂和药用载体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面,提供了用于治疗感染或炎性疾病或病症的抗体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面,提供了用于在需要其的受试者中治疗感染或炎性疾病或病症的方法,该方法包括给予受试者治疗有效量的本文披露的抗体,从而治疗感染或炎性疾病或病症。
根据本发明的一些实施方式,抗体是双特异性抗体。
根据本发明的一些实施方式,抗体是不对称的、单特异性抗体。
根据本发明的一些实施方式,互补包括空间互补。
根据本发明的一些实施方式,互补包括电荷互补。
根据本发明的一些实施方式,Fc区包括Fc区的一个重链的突出部分和在Fc区的第二重链上的空间补偿空腔,其中突出部分突入补偿空腔。
根据本发明的一些实施方式,通过以具有比原始氨基酸更大侧链容积的另一个氨基酸取代在一个重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生突出部分。
根据本发明的一些实施方式,通过以具有比原始氨基酸更小侧链容积的另一个氨基酸取代在第二重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生补偿空腔。
根据本发明的一些实施方式,第一共价键是在一个重链的CH1结构域和一个轻链的CL结构域之间;并且第二共价键是在第二重链的VH结构域和第二轻链的VL结构域之间。
根据本发明的一些实施方式,第一和第二共价键是二硫键。
根据本发明的一些实施方式,具有比原始氨基酸更大侧链体积的氨基酸选自由酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和色氨酸组成的组中。
根据本发明的一些实施方式,具有比原始氨基酸更小侧链体积的氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苏氨酸组成的组中。
根据本发明的一些实施方式,抗体选自由嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体组成的组。
根据本发明的一些实施方式,第一重链的CH3结构域共价连接至第二重链的CH3结构域。
根据本发明的一些实施方式,抗体的第一抗原结合位点结合抗原的第一表位并且抗体的第二抗原结合位点结合抗原的第二表位。
根据本发明的一些实施方式,抗体的第一抗原结合位点结合第一抗原的表位并且抗体的第二抗原结合位点结合第二抗原的表位。
根据本发明的一些实施方式,每个轻链使用单二硫键连接至它的同源重链。
根据本发明的一些实施方式,抗体是完整抗体。
根据本发明的一些实施方式,抗体选自由IgA、IgD、IgE和IgG组成的组。
根据本发明的一些实施方式,IgG包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根据本发明的一些实施方式,第一重链包含T366W突变;并且第二重链包含T366S、L368A、Y407V突变。
根据本发明的一些实施方式,第一重链包含S354C突变并且第二重链包含Y349C突变。
根据本发明的一个实施方式,第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合erbB2。
根据本发明的一些实施方式,第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE)。
根据本发明的一些实施方式,第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合链霉亲和素。
根据本发明的一些实施方式,将至少一个重链连接到治疗部分。
根据本发明的一些实施方式,将至少一个重链连接到可识别部分。
根据本发明的一些实施方式,抗体选自由灵长类动物抗体、猪抗体、鼠抗体、牛抗体、羊抗体和马抗体组成的组。
根据本发明的一些实施方式,宿主细胞包括细菌细胞。
根据本发明的一些实施方式,宿主细胞包括哺乳动物细胞。
根据本发明的一些实施方式,在细菌细胞的包涵体中发生表达。
根据本发明的一些实施方式,将每个核酸分子转染进入不同的宿主细胞。
根据本发明的一些实施方式,将每个核酸分子转染进入相同的宿主细胞。
根据本发明的一些实施方式,细菌细胞包括革兰氏阴性细菌细胞。
根据本发明的一些实施方式,上述方法进一步包括在步骤(f)之后用蛋白A/G/L纯化抗体。
根据本发明的一些实施方式,炎性疾病是癌症。
根据本发明的一些实施方式,炎性疾病或病症是癌症。
除另有限定外,在本文中所使用的所有技术和/或科学术语具有如与本发明所属技术领域的技术人员的通常理解相同的含义。虽然与本文描述的类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式,但下文描述了示例性的方法和/或材料。在发生冲突的情况下,以本专利说明书(包括定义)为准。另外,材料、方法、和实施例仅是说明性的而不意在是限制性的。
附图说明
仅通过实例的方式并参照附图来描述本发明的一些实施方式。现详细地具体参照附图,强调的是,示出的细节是通过实例的方式并用于说明性讨论本发明的实施方式。在这方面,说明书连同附图一起使得本领域技术人员可以明了如何实施本发明的实施方式。
在附图中:
图1A-B是用于产生双特异性抗体的新策略的示意性结构。(A)通过球形突出物进入孔中的方式产生的IgG抗体的示意图,其中存在两个不同的重链和共同轻链。(B)根据本发明的实施方式制备的双特异性抗体的示意图。存在两个不同的重链,各自配对于它的同源轻链。“球形突出物”突变对应于T366W,“孔”突变对应于T366S、L368A、Y407V替换。在“球形突出物”或“孔”重链的CH3区处分别的半胱氨酸替换突变S354C和Y349C提供95%的异源二聚体化(Merchant et al.,1998)。
图2A-H是在大肠杆菌中用于表达单特异性抗体和双特异性抗体的基于pHAK-IgH和pHAK-IgL的质粒图谱的示意图:pHAK-IgL用于表达具有人κ或轻链的抗体、pHAK-LC-Cys用于表达包含dsFv样链内二硫键的轻链、pHAK-IgH用于表达具有人γ1重链的抗体、pHAK-HC-球形突出物用于表达在恒定区中包含S354C和T366W“球形突出物”突变的重链、pHAK-HC-孔用于表达在恒定区中包含Y349C、T366S、L368A和Y407V“孔”突变的重链、pHAK-HC-孔-PE38用于表达包含融合至假单胞菌外毒素A的截短形式(PE38)的“孔”突变的重链、pHAK-HC-Cys用于表达包含dsFv样链内二硫键的重链、pHAK-HC-Cys-球形突出物用于表达在恒定区中包含“球形突出物”突变和dsFv样链内二硫键的重链。
图3是重链和轻链纯化的SDS-PAGE分析的照片。以包涵体收集表达的蛋白,通过连续离心步骤纯化并溶解在6M盐酸胍缓冲溶液。(1)T427IgL,(2)T427IgH,(3)T427-IgH-球形突出物,(4)T427-IgH-PE38,(5)T427-IgH-孔-PE38。″球形突出物″突变对应于S354C:T366W。″孔″突变对应于Y349C:T366S:L368A:Y407V。
图4A-B提供了双特异性IgG样蛋白的分析。(A)IgG重链和轻链以及理论上可以形成的可能的IgG分子的示意性结构。根据分子量的显著差异,可以容易地检测每种变异体。(B)蛋白A纯化产物的SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)分析:野生型T427抗体,其显示在重链上的PE38(1),T427抗体的“球形突出物进入孔中”变体(S354C:T366W/Y349C:T366S:L368A:Y407V突变)(2),野生型FRP5抗体(3)。
图5A-B提供了蛋白A纯化产物的SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)分析。(1)T427“球形突出物-球形突出物”变体(IgL+IgH-球形突出物S354C:T366W突变体)。(2)T427抗体的“球形突出物进入孔中”变体(S354C:T366W/Y349C:T366S:L368A:Y407V突变体)。(3)T427“孔-孔”变体(IgL+IgH-孔-PE38Y349C:T366S:L368A:Y407V突变)。(4)野生型T427抗体,其显示在重链上的PE38。(M)标记。
图6示出IgG和IgG样蛋白的凝胶过滤分析。用Sephadex200凝胶过滤柱在11.5分钟时洗脱T427IgG抗体(150kDa)。在10.3分钟时洗脱IgG样T427异二聚体(2IgL+IgH-球形突出物+IgH-孔-PE38)(190kDa)。在11.5分钟时洗脱小部分球形突出物-球形突出物同源二聚体(150kDa)。可以在空隙容积下洗脱孔-孔同源二聚体(230kDa)(6.5分钟(未示出))。
图7A-C示出蛋白A纯化产物的SDS-PAGE(7.5%丙烯酰胺)和密度分析。(A)T427IgG野生型(1)、T427-球形突出物-孔-PE38(2)和T427-PE38(3)蛋白质的SDS-PAGE分析。(B)通过ImageMaster1D激光扫描密度测定法进行的SDS-PAGE的蛋白带密度分析。(C)根据在带位置处的像素强度,测量异源二聚体形成产率的饼图。T427-球形突出物-孔-PE38(2)由2IgL+IgH-球形突出物+IgH-孔-PE38构成。T427-PE38(3)由2IgL+2IgH-PE38构成。″球形突出物″突变对应于S354C:T366W。″孔″突变对应于Y349C:T366S:L368A:Y407V。
图8A-B示出IgG和IgG样蛋白的ELISA分析。FRP5IgG和双特异性FRP5-T437-PE38(PE38融合于T427重链)的结合能力。(A)以erbB2(FRP5抗体的抗原)涂覆ELISA板并使用抗人二抗来检测抗体。(B)以erbB2(FRP5抗体的抗原)涂覆ELISA板并使用抗PE二抗来检测抗体(检测双特异性抗体)。
FRP5-T427-PE38抗体由IgL-FRP5+IgL-T427+IgH-FRP5-球形突出物+IgH-T427-孔-PE38蛋白构成。“球形突出物进入孔中”突变:S354C:T366W/Y349C:T366S:L368A:Y407V。
图9A-B示出蛋白A纯化IgG和IgG样蛋白的SDS-PAGE(12%和6%丙烯酰胺)分析。(1)FRP5IgG野生型。(2)T427IgG野生型。(3)T427IgG-Cys(IgH-Cys44:Cys222Ala+IgL-Cys104:Cys218del)。(4)双特异性T427-FRP5IgG(IgH-FRP5-孔+IgL-FRP5+IgH-T427-球形突出物-Cys44:Cys222Ala+IgL-T427-Cys104:Cys218del IgG。“球形突出物”突变对应于S354C:T366W。“孔”突变对应于Y349C:T366S:L368A:Y407V。
图10是蛋白A纯化IgG和IgG样蛋白的SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)分析。(1)T427IgG野生型。(2)抗Tac IgG野生型。(3)T427IgG-Cys对照A(IgH野生型+IgL-Cys104:Cys218del)。(4)T427IgG-Cys对照B(IgH-Cys44:Cys222Ala+IgL野生型)。
图11是以包涵体纯化并重新悬浮在6M盐酸胍中的αPE(B11)、T427和αSA抗体的重链和轻链的SDS-PAGE分析。在12%丙烯酰胺凝胶上在还原条件下分离样品。
图12A-B是αSA(抗链霉亲和素)抗体的ELISA分析。分析了T427、αSA(单克隆)和T427-αSA(双特异性)蛋白A纯化抗体结合CD30的能力(A)。使用羊抗人HRP标记抗体来检测上述结合。以牛血清白蛋白(BSA)涂覆用作对照(B)。
图13A-C是αPE(抗假单胞菌外毒素38kDa片段)抗体的ELISA分析。分析了T427、αPE B11克隆(单克隆)和T427-αPE(双特异性)蛋白A纯化抗体结合avitag-PE38(A)和dsFv-PE38(B)抗原的能力。使用羊抗人HRP标记抗体来检测结合。以牛血清白蛋白(BSA)涂覆用作对照(C)。
图14是pDual载体系统的示意介绍。pDual载体是基于双顺反子、CMV启动子的质粒,用于在哺乳动物细胞中表达IgG。通过结合来自pMAZ载体的重链和轻链表达盒来构建它们(Mazor Y,J Immunol Methods.2007Apr 10;321(1-2):41-59)。
图15A-B示出在CaCl2转染的293Trex细胞的培养基中分泌的IgG的分析。(A)用pDual野生型、pDual L(Cys)+H(野生型)野生型或pMAZ-IgL+pMAZ-IgH载体系统转染的细胞培养基的蛋白印迹分析。使用羊抗人HRP标记二抗来检测抗体。通过与受必妥(Erbitux)抗体的二次稀释相比来确定在培养基中的抗体浓度(B)。
图16示出以pDual单特异性和双特异性载体或载体的组合转染的293Trex细胞的蛋白印迹分析。使用羊抗人HRP标记抗体来检测抗体。
图17示出由抗体分泌克隆的点杂交分析的示例性结果。将细胞培养基吸收到硝酸纤维素膜上并使用羊抗人HRP标记抗体来检测抗体。相对于其它克隆确定分泌水平。将未处理细胞的细胞培养基用作对照。
图18A-B示出双特异性克隆的结合活性的确认。以erbB2(18A)或CD30(18B)抗原温育细胞培养基。使用羊抗人HRP标记抗体来检测结合。带标记的克隆证明了对两种抗原的结合能力。
图19A-B示出在HEK293 T-RExTM哺乳动物细胞中产生的IgG随后是蛋白A纯化的SDS-PAGE分析。在未还原条件下并在10%丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质以评价150kDa IgG(A)并且在还原条件下并在12%丙烯酰胺凝胶(B)上分离蛋白质以评价在T427和FRP5重链和轻链之间的最小差异并确定在双特异性T427-FRP5分子中的双带。
图20A-B示出蛋白A纯化的在哺乳动物细胞中生产的IgG的ELISA分析。A5是以四种质粒转染的对照细胞系,两种编码单特异性T427抗体并且两种编码单特异性FRP5抗体。双特异性T427-FRP5表示对每种抗原(erbB2和CD30)具有单价结合能力的双特异性抗体的稳定分泌克隆D3。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
图21A-B是示出蛋白A纯化在哺乳动物细胞中产生的IgG的ELISA分析的曲线图。T427和FRP5表示具有二价结合活性的单特异性抗体。双特异性T427-FRP5表示对每种抗原(erbB2和CD30)具有单价结合能力的双特异性抗体的稳定分泌克隆D3。将Erbitux用作阴性对照。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
图22是示出分泌T427-FRP5双特异性抗体B3克隆(从稳定克隆的条件培养基进行蛋白A-纯化的)与A431/CD30和SKBR3(erbB2+)细胞的结合能力的细胞-ELISA分析曲线图。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
图23是本发明的实施方式的单特异性抗体的示意图。
图24是T427KIH的ELISA分析。相比于T427抗体的球形突出物进入孔中(KIH)变体(2×IgL+IgH-球形突出物+IgH-孔-PE38),T427IgG和T427-PE38(融合于重链的PE38)的结合能力。
具体实施方式
在其一些实施方式中,本发明涉及双特异性抗体、单特异性抗体、不对称抗体和它们的制备方法。
在详细解释本发明的至少一种实施方式以前,应当理解的是,本发明的应用不一定限于以下描述中陈述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或以各种方式加以实施或进行。
在过去几年中,实验室和早期临床研究分均已证明在癌症治疗中双特异性抗体(BsAb)可能具有重要的潜在应用:亦或通过用细胞毒性剂(包括效应细胞、放射性核素、药物、和毒素)靶向肿瘤细胞,亦或通过同时阻断两种相关的肿瘤靶标,即,生长因子受体或它们的配体,从而中和多种受体活性和下游信号转导通路。在开发BsAb中的主要障碍是通过传统技术如混合杂交瘤和化学结合法难以生产足够质量和数量的材料。因此,相信开发IgG样BsAb作为治疗剂将在很大程度上取决于在设计重组BsAb构建体和生产效率方面所取得的进步。
为了确保形成抗体″A″和″B”的重链之间的异源二聚体,并且为了防止抗体″A″与抗体″A″以及抗体″B″与抗体″B″的同源二聚体化,如在美国专利号US 7,183,076中所披露的,已提出了球形突出物和孔的方式。然而,球形突出物进入孔中的方式仅为重链的异质缔合提供了解决方案而没有为每个重链与它的同源轻链的正确配对提供解决方案。
本发明涉及以IgG形式来有效装配双特异性抗体的方式。该方式涉及通过应用球形突出物进入孔中的方式异源二聚体化两个重链,加之促进每个重链仅与它的同源轻链的配对。
本发明的发明人提出使用一个天然CH1-CL结合二硫键和一个非天然VH-VL结合dsFv样二硫键来使相同抗体的重链和轻链配对(如图1B所示)。以这种方式,一个抗体分支将在分子上保持未接触而其它抗体分支将获得在可变区中的新二硫共价键来代替野生型S-S键。错配的轻和重链将不会形成S-S稳定按合点并且将不会产生稳定的IgG分子。因此,这种策略意味着一个抗体分支转化成dsFv样分子而没有任何亲和力或稳定性损失。
虽然减少了本发明的实施,但本发明的发明人通过使抗CD30(T427)和抗erbB2(FRP5)抗体结合生产了双特异性抗体。在erbB2抗体中,通过共价连接重链的CH1结构域和轻链的CL结构域的天然二硫键促进了重-轻链缔合。在抗CD30抗体中,将CH1中的半胱氨酸突变成丙氨酸并且删除CL的C-端半胱氨酸,从而防止形成天然H-L二硫键。代替消失的二硫键,根据二硫键稳定的Fv片段(dsFv)的规则,引入两个半胱氨酸,一个在重链的可变区中并且一个在轻链的可变区中。因此,经由通过这些两个半胱氨酸残基形成于VH和VL之间的二硫键,共价缔合了抗CD30抗体的重链和轻链。因此,本发明预期在双功能抗体的一个臂上在重链和它的同源轻链之间产生新的二硫桥并以此进一步增强正确装配,删除在相同重链和它的同源轻链之间的天然存在的二硫桥。
如在图9A-B中所示,利用这种方式,在细菌细胞中产生了全长双功能抗体。当没有如上所述突变抗CD30抗体的重链和轻链时,不会产生全长双功能抗体(图10)。
另外,使用双特异性载体,本发明的发明人表明,通过应用球形突出物进入孔中方式,并联合促进每个重链仅与它的同源轻链的配对,促进了在哺乳动物细胞中产生全长双功能抗体(如图17-22所示)。
因此,根据本发明的一个方面,提供了包括Fc区和Fab区的抗体,其中:
(i)Fc区包括两个不相同的重链,其中两个不相同重链的至少一个包含氨基酸修饰以在两个不相同的重链之间形成互补,从而提高形成不相同的重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性;和
(ii)Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键,其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
抗体的特征在于,位于中央的二硫桥,其将一系列的反向平行的β链稳定成免疫球蛋白样折叠。抗体重链或轻链具有N端(NH2)可变区(V),和C端(-COOH)恒定区(C)。重链可变区被称为VH,并且轻链可变区被称为VL。VH和VL片段一起被称为″Fv″。可变区是分子的一部分,其结合至抗体的同种抗原,而恒定区则确定抗体的效应物作用(例如,补体结合、调理作用)。由在N端的可变区基因(一般约110个氨基酸)和在COOH端的恒定区基因编码全长免疫球蛋白或抗体″轻链″(一般约25千道尔顿(Kd),约214个氨基酸)。类似地,由可变区基因(通常编码约116个氨基酸)和多个恒定区基因(编码约330个氨基酸)之一来编码全长免疫球蛋白或抗体″重链″(一般约50Kd,约446个氨基酸)。抗体轻链或重链可变区包含三个超变区,还被称为互补决定区或CDR,两侧是四个相对保守的骨架区或FR。
根据本发明的此方面的一个实施方式,抗体是双特异性抗体。
如在本文中所使用的,术语″双特异性抗体″是指一种抗体,其包含两个抗原结合位点,各自结合至抗原的不同表位。本发明的此方面的双特异性抗体既不共享共同轻链也不共享共同重链。
根据一个实施方式,两个抗原结合位点各自结合至相同抗原的不同表位。根据另一个实施方式,两个抗原结合位点各自结合至不同抗原上的不同表位。
根据本发明的此方面的另一个实施方式,抗体是单特异性、不对称抗体。
本发明的此方面的单特异性抗体在结合相同抗原的两个臂上具有相同互补位。然而,不同于其对称装配了两个相同重链和两个相同轻链的常规的单克隆抗体,本文描述的单特异性抗体是两个不相同重链和两个不相同轻链的不对称装配。两个重链之间和两个轻链之间的差异在于恒定区和可变区中的骨架区,其使得链能够异源二聚化。因此,可变区的CDR环和支持可变区残基(其可以包含互补位)在链配对中是相同的–参见图23。
根据一个特定的实施方式,单特异性抗体是IgG4。
优选地,对于相同的靶标,与其相应的单克隆抗体的一个臂相比,抗体的每个抗原结合位点对于它的靶标的亲和力并没有显著降低。根据一个具体实施方式,亲和力没有降低超过100倍,更优选没有降低超过50倍,更优选没有降低超过20倍,更优选没有降低超过10倍并且甚至更优选没有降低超过5倍。
双特异性抗体的实例包括那些具有针对第一生长因子配体的一个抗原结合位点和针对第二生长因子配体的第二抗原结合位点的;针对第一生长因子受体的一个抗原结合位点和针对第二生长因子受体的第二抗原结合位点的;针对第一细胞因子的一个抗原结合位点和针对第二细胞因子的第二抗原结合位点的;针对第一细胞因子受体的一个抗原结合位点和针对第二细胞因子受体的第二抗原结合位点的;针对生长因子受体的一个抗原结合位点和针对生长因子配体的第二抗原结合位点的;针对细胞因子受体的一个抗原结合位点和针对细胞因子配体的第二抗原结合位点。还预期了生长因子、生长因子受体、细胞因子和细胞因子受体的另外的组合。
根据另一个实施方式,双特异性抗体阻断血管生成的两种途径,一个抗原结合位点针对与第一途径相关的受体或配体而另一个抗原结合位点针对与第二途径相关的受体或配体。
根据具体的实施方式,双特异性抗体包含针对肿瘤细胞抗原的一个抗原结合位点和针对其它抗原的结合位点,其它抗原包括细胞毒性触发分子如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗促黑激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3。
具有特异性地结合至肿瘤抗原的一个抗原结合位点和结合至毒素的一个抗原结合位点的双特异性抗体包括例如抗皂素/抗Id-1、抗CD22/抗皂素、抗CD7/抗皂素、抗CD38/抗皂素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱。
其它设想的双特异性抗体包括用于转化酶激活的前体药物的那些,如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化将丝裂霉素磷酸前药转化为丝裂霉素醇)。
其它设想的双特异性抗体包括可以用作纤维蛋白溶解剂的那些如抗血纤蛋白/抗组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)。
另外设想的双特异性抗体包括那些双特异性抗体,其用于将免疫复合物靶向细胞表面受体如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)。
另外设想的双特异性抗体包括用于治疗传染病的那些,如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体:CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV。用于体外或体内肿瘤检测的另外的双特异性抗体包括抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原。
双特异性抗体可以用作疫苗佐剂(参见Fanger et al.,Critical Reviewsin Immunology12(3,4):101-124(1992))。
双特异性抗体可以用作诊断工具如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生长抑素/抗P物质、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。
另外设想的双特异性抗体包括以下的双特异性抗体:其中第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合erbB2的双特异性抗体;其中第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE)的双特异性抗体;其中第一抗原结合位点结合CD30和第二抗原结合位点结合链霉亲和素的双特异性抗体。
三特异性抗体的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
可以由任何抗体,如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得本发明的抗体的Fc区。
根据一个实施方式,Fc区是IgG Fc区。
如所提及的,本文描述的抗体的Fc区包括两个不相同的重链(例如,其不同于可变区的序列),其中两个不相同重链的至少一个包含氨基酸修饰以提高形成不相同的重链的稳定异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的稳定同源二聚体的可能性。
根据一个实施方式,至少一个重链被基因修饰以致产生了穿过界面的改变的电荷极性。因而,促进了在静电匹配的Fc链之间稳定的异源二聚体,并且由于不利的排斥电荷相互作用抑制了不需要的Fc同源二聚体形成。
Gunasekaran K,Pentony M,Shen M,Garrett L,Forte C,Woodward A,Ng SB,Born T,Retter M,Manchulenko K,Sweet H,Foltz IN,Wittekind M,Yan W.Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostaticsteering effects:applications to bispecific molecules and monovalent IgG.JBiol Chem.2010Jun 18;285(25):19637-46.Epub2010Apr 16中解释了确定修饰何种氨基酸和修饰到何种氨基酸,通过引用结合于此。
根据一个实施方式,在两个重链之间的界面的边缘处而不在界面的疏水核心处的结构上保守的隐蔽残基上进行氨基酸修饰(其影响电荷互补性)。
根据另一个实施方式,基因修饰至少一个重链以产生具有3D结构的重链,相对于相同重链(即同源二聚体),其更有效地结合至不相同的重链(即异源二聚体)。由于空间互补促进生成异源二聚体并且由于空间位阻阻碍生成同源二聚体。
根据这个实施方式,基因修饰一个重链以产生突出部分,并且基因修饰第二重链以产生空间补偿空腔,突出部分突入补偿空腔。
通过以较大侧链(例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸)替代来自第一重链的界面的小氨基酸侧链来构建″突起物″。可选地,在第二重链的界面上通过以较小氨基酸侧链(例如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、或苏氨酸)替代大氨基酸侧链,产生与突出部分具有相同或相似尺寸的补偿″空腔″。
可以通过合成方法将突出部分或空腔″引入″第一或第二重链的界面,例如通过重组技术、体外肽合成、先前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶学或化学连接或这些技术的一些组合。因此,″引入的″突出部分或空腔是″非天然存在的″或″非天然的″,其意味着它并不存在于自然界中或最初多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
优选地,用于形成突出部分的导入氨基酸残基具有相对较少数目的“旋转异构体”(例如约36)。″旋转异构体″是氨基酸侧链的能量最优的构象。在Ponders and Richards,J.Mol.Biol.193:775791(1987)中综述了各种氨基酸残基的旋转异构体的数目。
作为选择用于形成突出部分和/或空腔的初始残基的第一步骤,利用本领域中众所周知的技术如X射线晶体学或NMR来获得抗体的三维结构。基于三维结构,本领域技术人员将能够确定界面残基。
优选的界面是免疫球蛋白恒定区的CH3结构域。优先选择待取代″隐蔽″残基。已经确定了IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH3结构域的界面残基(参见,例如,PCT/US96/01598,其全部内容通过引用结合于此),包括最适用于以导入的残基替代的那些界面残基,如各种IgG亚型的界面残基和″隐蔽″残基。优选的CH3结构域源自IgG抗体,如人IgG1。
人IgG1的CH3/CH3界面涉及位于4个反向平行β链上的在每个结构域上的16个残基,其隐蔽了来自每个表面的1090ANG2。优选突变靶向位于两个中央反向平行β链上的残基。目的是使产生的突出部分通过突入周围溶剂而不是通过在伴侣CH3结构域中的补偿空腔来容纳产生的突出部分的风险最小化。
在美国专利号US 7,183,076中已经披露了在重链上选择特定位点的方法,通过引用结合于此。
根据一个具体实施方式,第一重链包含T366W突变(即,苏氨酸到色氨酸),并且第二重链包含T366S、L368A、Y407V突变(即,苏氨酸到丝氨酸;亮氨酸到丙氨酸;和酪氨酸到缬氨酸)。
根据一个实施方式,在界面的疏水核心处在结构上保守的隐蔽残基进行氨基酸修饰,而不是在两个重链之间的界面有边缘处(其影响结构互补性)。
可以使用分子图形建模程序如InsightTM程序(Biosym Technologies)来研究替代残基对重链的影响。
一旦通过分子建模确定了优选的初始/导入残基以后,可以使用在本领域中众所周知的技术将氨基酸替换引入重链。
寡核苷酸介导的诱变是用于制备编码第一或第二重链的DNA的替代变体的优选方法。如由Adelman et al.,DNA,2:183(1983)所描述的,在本领域中这种技术是众所周知的。简要地,通过将编码所期望的突变的寡核苷酸杂交到DNA模板来改变第一或第二多肽编码DNA,其中模板是单链形式的质粒或噬菌体(包含异多聚体的未改变或天然的DNA序列)。在杂交以后,使用DNA聚合酶合成模板的整个第二互补链,其将因此结合寡核苷酸引物,并将在异多聚体DNA中编码所选改变。
可以如Wells et al.Gene34:315(1985)所描述的通过以由使互补寡核苷酸退火所产生的合成突变片段替代感兴趣的DNA的区进行盒式诱变。PCR诱变也适用于制备第一或第二多肽DNA的变体。虽然以下讨论涉及DNA,但可以理解的是,上述技术也适用于RNA。PCR技术通常是指以下步骤(参见Erlich,Science,252:1643 1650(1991),R.Higuchi的章节,p.61 70)。
还设想另外的修饰以进一步增强在两个重链之间的相互作用的特异性。因此,本发明结合在两个重链之间的共价键(例如在CH3结构域上)。
本发明设想的共价键的实例包括酰胺键和二硫键。
因此,例如本发明设想引入自由巯基,其在抗体的两个重链之间形成分子间二硫键。在允许在重链之间形成二硫键的位置处,通过用例如半胱氨酸取代重链的天然存在残基,可以将自由巯基引入重链之一的界面。
如在本文中所使用的,短语″包含自由巯基的化合物″是指一种化合物,其可以被加入或与本发明的多肽界面的氨基酸反应,使得化合物的自由巯基部分被定位于在本发明的另外的多肽的界面处与该部分的自由巯基相互作用来形成二硫键。优选地,包含自由巯基的化合物是半胱氨酸。
根据一个具体实施方式,第一重链包含S354C突变(即,丝氨酸到半胱氨酸);并且第二重链包含Y349C突变(酪氨酸到半胱氨酸)。
除在它们的重链中具有修饰之外,也修饰了本文描述的抗体的至少一个轻链,使得在第一重链和第一轻链之间存在第一共价键并且在第二重链和第二轻链之间存在第二共价键,其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
选择第一和第二共价键的定位使得促进了重链与它的同源轻链之间的配对,同时相比于从其所产生的单个抗体,没有降低抗体的特异性和稳定性超过20%或者优选地超过10%或者甚至更优选地超过5%。
根据另一个实施方式,将第一重链和它的同源轻链之间的共价键定位在CH1和CL区之间,而将第二重链和它的同源轻链之间的共价键定位在VH和VL区之间。
本发明设想的共价键的实例包括例如酰胺键、二硫键和在位点特异性插入氨基酸残基(包括非天然氨基酸)之间发生的另外形式的共价键(参见Wu,X.,Schultz,P.G.″Synthesis at the Interface of Chemistry and Biology.″J.Am.Chem.Soc.,131(35):12497-515,2009;Hutchins BM,Kazane SA,Staflin K,Forsyth JS,Felding-Habermann B,Schultz PG,Smider VV.Site-specific coupling and sterically controlled formation of multimericantibody fab fragments with unnatural amino acids J Mol Biol.2011 Mar4;406(4):595-603.Epub 2011 Jan 13;Liu CC,Schultz PG.Adding newchemistries to the genetic code.Annu Rev Biochem.2010;79:413-44.Review,所有上述通过引用结合于此)。
因此,本发明设想突变重链和它的同源轻链的至少之一,使得不再能够产生连接两个分子的至少一个天然存在的(即天然的)二硫键。通常,这是通过删除(或取代)在上文所述位置处的半胱氨酸实现。
如在本文中所使用的,短语″天然二硫键″是指连接重链和它的同源轻链(通常在轻链的恒定区和重链的CH1区之间)的链间二硫键,其由天然存在的种系抗体基因所编码。
通常,通过以具有类似大小和电荷的氨基酸(即保守氨基酸,如半胱氨酸到丙氨酸)替代氨基酸来进行半胱氨酸的取代。
本发明设想,第一共价键是天然存在的二硫键而第二共价键是非天然存在的共价键(例如工程二硫键),其中,已经将至少一个半胱氨酸氨基酸残基插入链–即工程半胱氨酸。
如在本文中所使用的,术语″工程半胱氨酸″是指在天然种系抗体序列中不存在半胱氨酸的位置处已被引入抗体片段序列的半胱氨酸。
可替代地,第一和第二共价键均可以是非天然存在的,并且可以由不能作为氨基酸残基来产生共价键的其它氨基酸来替代半胱氨酸(其在非修饰抗体中作为氨基酸残基来产生二硫键)。
需要关于感兴趣的抗体的信息以产生二硫键的适当位置。通过与在Kabat和Wu的众所周知的出版物中的那些类似序列[Sequences of Proteinsof Immunological Interest,″E.Kabat,et al.,U.S.Government Printing Office,NIH Publication No.91-3242(1991)](通过引用结合于此)进行序列比对来比较感兴趣的可变区的氨基酸序列,以确定可以突变哪些序列以致在每个重链和轻链可变区的适当位置编码半胱氨酸,从而在所期望抗体的骨架区中提供二硫键。
比对序列以后,确定了在感兴趣的序列中的氨基酸位置,其与由Kabat和Wu使用的编号系统的以下位置对齐:重链可变区的位置43、44、45、46、和47(第1组)和位置103、104、105、和106(第2组);以及轻链可变区的位置42、43、44、45、和46(第3组)和位置98、99、100、和101(第4组)。在一些情况下,一些这些位置可以是缺失的,表示为在序列对比中的缺口。
随后,改变编码在这些确定位置中的两个位置处的氨基酸的核酸序列使得这两个氨基酸被突变成半胱氨酸残基。待选择的设想的氨基酸对是:VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44、VH103-VL45。
最优选地,在以下位置处进行半胱氨酸的取代:VH44-VL100、或VH105-VL43。(符号VH44-VL100,例如,是指一种多肽,其具有在VH中在位置44处的半胱氨酸和在VL中在位置100处的半胱氨酸;上述位置是根据由Kabat和Wu给出的编号)。
注意,使用根据Kabat和Wu的位置的指定,位置的编号是指定义的保守残基而不是指在给定抗体中实际顺序编号的氨基酸位置。例如,(Kabat和Wu的)CysL100其用来产生如在以下实施例中描述的ds(Fv)B3,实际上对应于B3(VL)的位置105。
根据一种实施方式,可以根据在美国专利号US 5,747,654(其通过引用结合于此)中记载的规则来选择突变哪个氨基酸。可以通过检查亦或实际抗体亦或如下文举例说明的感兴趣的模型抗体来确定突变为半胱氨酸残基的位点。用来产生蛋白质如抗体的模型有计算机程序是通常可获得的并且是本领域技术人员众所周知的(参见Kabat and Wu;Loew,et al.,Int.J.Quant.Chem.,Quant.Biol.Symp.,15:55-66(1988);Bruccoleri,et al.,Nature,335:564-568(1988);Chothia,et al.,Science,233:755-758(1986)),均通过引用结合于此。可以将市售计算机程序用来在计算机监视器上显示这些模型、计算在原子之间的距离和估计不同的氨基酸相互作用的可能性(参见,Ferrin,et al.,J.Mol.Graphics,6:13-27(1988),通过引用结合于此)。例如,计算机模型可以预测易接近的带电荷氨基酸残基和关于结合,然后可以合成构象受限的有机分子。参见,例如,Saragovi,et al.,Science,253:792(1991),其通过引用结合于此。在其它情况下,可以获得实验确定的抗体的实际结构。
根据一个实施方式,一对适宜的氨基酸残基应该:(1)具有在两个残基之间小于或等于8ANG的Cα-Cα距离、优选地小于或等于6.5ANG(由可获得的抗体的晶体结构如来自Brookhaven Protein Data Bank的那些晶体结构确定)和(2)尽可能远离CDR区。一旦确定它们之后,可以以半胱氨酸取代它们。
为了,通过众所周知的技术可以容易地完成在靶标点处编码半胱氨酸的基因的修饰,如寡核苷酸定向诱变(如上文所述的)、位点定向诱变(参见,Gillman and Smith,Gene,8:81-97(1979)和Roberts,S.,et al,Nature,328:731-734(1987),两者通过引用结合于此)、通过在Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)中描述的方法,其通过引用结合于此、通过全基因合成(Hughes,R.A.et al,,Methods in Enzymology,Volume498p.277-309(2011))或通过本领域中已知的任何其它方法。
本发明的一些实施方式的抗体可以是来自任何哺乳动物源,包括人、猪、鼠、牛、山羊、马、犬、猫、绵羊等。抗体可以是异源抗体。
如在本文中所使用的,″异源抗体″是相对于转基因宿主如表达抗体的植物加以定义。
根据本发明的一些实施方式,抗体是分离的完整抗体(即,基本上不含除抗体外具有不同的抗原特异性的细胞材料和/或其它化学品)。
如在本文中所使用的,″重组抗体″是指通过重组方法所制备、表达、产生或分离的完整抗体,如(a)分离自动物(例如,小鼠)的抗体,其相对于免疫球蛋白基因(例如,人免疫球蛋白基因)或从其制备的杂交瘤是转基因的;(b)分离自被转化以表达抗体的宿主细胞的抗体;(c)分离自重组抗体库的抗体;和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式所制备、表达、产生或分离的抗体。在某些实施方式中,本发明的免疫球蛋白可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在其它实施方式中,可以将上述重组人抗体进行体外诱变并由此使得重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列包含这样的序列:其虽然源自并且与人种系VH和VL序列相关,但不能自然地体内存在于人抗体种系谱内。
由本发明的范围覆盖抗体的以下示例性实施方式。
如在本文中所使用的,″人抗体″是指具有可变区的完整抗体,其中骨架区和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列,如,例如,由Kabat et al.(参见Kabat1991,Sequences of proteins of immunological Interest,5th Ed.NIH Publication No.91-3242)所描述的。人抗体的恒定区还源自人类种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基残基(例如,通过体外随机诱变或位点定向诱变或体内体细胞突变所引入的突变)。然而,如在本文中所使用的,术语″人抗体″并不意在包括这样的抗体:其中将源自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列移植到人骨架序列上。
如在本文中所使用的,″嵌合抗体″是指完整抗体,其中可变区源自第一物种而恒定区源自第二物种。可以通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片段来构建嵌合免疫球蛋白(例如,VH和VL区来自小鼠抗体并具有人起源的恒定区)。
如在本文中所使用的,″人源化免疫球蛋白″是指完整抗体,其中将来自非人(例如,鼠)抗体的最小小鼠部分移植到人抗体上;人源化抗体通常是5-10%小鼠抗体和90-95%人抗体。
通常,人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、并且通常两个可变区,其中所有或几乎所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区并且所有或几乎所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳地将还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988);and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
在本领域中用于人源化非人抗体的方法是众所周知的。通常,人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为导入残基,其通常获自导入可变区。基本上可以根据Winter和同事的方法[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann etal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]来进行人源化,其中通过以啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此,上述人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号US4,816,567),其中,由来自非人物种的相应序列取代比完整的人可变区显著更少的部分。在实际操作中,人源化抗体通常是其中一些CDR残基并且可能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所取代的人抗体。
还可以使用本领域中已知的各种技术产生人抗体,包括噬菌体展示文库[Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体[Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地,可以通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的转基因动物例如,小鼠,)中来制备人抗体。在攻击后,观测到人抗体生产,其在所有方面均非常类似于在人类中观测到的情况,包括基因重排、装配、和抗体谱。例如在于美国专利号US 5,545,807、US5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016,和以下科学出版物:Marks et al.,Bio/Technology10,:779-783(1992);Lonberget al.,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368812-13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology14,845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13,65-93(1995)中描述这种方式。
可以将本发明的抗体连接至功能部分如可检测或治疗部分。
可以将各种类型的可检测部分或报告部分连接至本发明的抗体。它们包括但不限于放射性同位素(如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品(荧光团)、酶、荧光多肽、亲和标签、和通过正电子发射层析成像(PET)或磁共振成像(MRI)可检测的分子(造影剂)。
适合的荧光团的实例包括但不限于:藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、德克萨斯红、PE-Cy5等。对于关于荧光团选择、将荧光团连接于各种类型的分子的方法的另外指导,参见Richard P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals1992–1994”,5th ed.,Molecular Probes,Inc.(1994);属于Oncoimmunin Inc.的美国专利号US6,037,137;Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Academic Press New York,N.Y.(1995);Kay M.et al.,1995.Biochemistry34:293;Stubbs et al.,1996.Biochemistry35:937;Gakamsky D.et al.,“Evaluating Receptor Stoichiometryby Fluorescence Resonance Energy Transfer,”in“Receptors:A PracticalApproach,”2nd ed.,Stanford C.and Horton R.(eds.),Oxford University Press,UK.(2001);属于Targesome,Inc.的美国专利号US 6,350,466]。当连接至荧光可检测部分时,可以用来检测抗体的荧光检测方法包括,例如,荧光活性流式细胞计数(FACS)、免疫荧光共焦显微镜术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET)。
可以将许多类型的酶连接至本发明的抗体[例如,辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶(AP)],并且可以使用ELISA(例如,在溶液中)、酶联免疫组化测定(例如,在固定组织中)、酶联化学发光测定(例如,在电泳分离的蛋白混合物中)或本领域中已知的其它方法来检测酶-标记的抗体[参见例如,Khatkhatay MI.and Desai M.,1999.JImmunoassay20:151-83;Wisdom GB.,1994.Methods Mol Biol.32:433-40;Ishikawa E.et al.,1983.J Immunoassay4:209-327;Oellerich M.,1980.J ClinChem Clin Biochem.18:197-208;Schuurs AH.and van Weemen BK.,1980.JImmunoassay1:229-49)。
亲和标签(或结合对的成员)可以是由相应抗体可识别的抗原[例如,异羟洋地黄毒甙元(DIG),其通过抗DIG抗体确定)或对于标签具有高亲和力的分子[例如,链霉亲和素和生物素]。如上文所述可以荧光标记结合亲和标签的抗体或分子或将其连接至酶。
可以采用在本领域中广泛实行的各种方法将链霉亲和素或生物素分子连接至本发明的抗体。例如,如在随后的实施例部分和在Denkberg,G.etal.,2000.Eur.J.Immunol.30:3522-3532中所描述的,可以经由生物素蛋白连接酶(例如,BirA)的识别序列将生物素分子连接至本发明的抗体。可替代地,可以将链霉亲和素分子连接于抗体片段如单链Fv,基本上如在Cloutier SM.et al.,2000.Molecular Immunology37:1067-1077;Dubel S.etal.,1995.J Immunol Methods178:201;Huston JS.et al.,1991.Methods inEnzymology 203:46;Kipriyanov SM.et al.,1995.Hum AntibodiesHybridomas 6:93;Kipriyanov SM.et al.,1996.Protein Engineering9:203;Pearce LA.et al.,1997.Biochem Molec Biol Intl 42:1179-1188中所描述的。
基本上从所有的免疫荧光流式细胞计数试剂的主要供应商(例如,Pharmingen或Becton-Dickinson)可商业上获得连接至链霉亲和素的功能部分,如荧光团。
根据本发明的一些实施方式,将生物素标记的抗体结合至链霉亲和素分子以形成多价成分(例如,抗体的二聚体或四聚体形式)。
表1提供了可以被连接至本发明的抗体的可识别部分的非限制性实例。
表1
如所提及的,可以将抗体连接至治疗部分。治疗部分可以是,例如,细胞毒性部分、毒性部分、细胞因子部分和包括相对于本发明的抗体不同的特异性的二抗部分。
在以下表2中提供了可以连接至本发明的抗体的治疗部分的非限制性实例。
表2
治疗部分 | 氨基酸序列(GenBank登记号) | 核酸序列(GenBank登记号) |
假单胞菌外毒素 | ABU63124–SEQ ID NO:42 | EU090068–SEQ ID NO:51 |
白喉毒素 | AAV70486–SEQ ID NO:43 | AY820132.1–SEQ ID NO:52 |
白细胞介素2 | CAA00227–SEQ ID NO:44 | A02159–SEQ ID NO:53 |
CD3 | P07766–SEQ ID NO:45 | X03884–SEQ ID NO:54 |
CD16 | NP_000560.5–SEQ ID NO:46 | NM_000569.6–SEQ ID NO:55 |
白细胞介素4 | NP_000580.1–SEQ ID NO:47 | NM_000589.2–SEQ ID NO:56 |
HLA-A2 | P01892–SEQ ID NO:48 | K02883–SEQ ID NO:57 |
白细胞介素10 | P22301–SEQ ID NO:49 | M57627–SEQ ID NO:58 |
蓖麻蛋白毒素 | EEF27734–SEQ ID NO:50 | EQ975183–SEQ ID NO:59 |
可以在N端或C端将功能部分连接至VH或VL序列或插入在适当位置的其它蛋白质序列。例如,对于源自假单胞菌外毒素(PE)的融合蛋白,应将VH或VL连接于毒素的N端或插入PE的结构域III。对于源自白喉毒素的抗体,优选将VH或VL连接于毒素的C端。
将可以理解的是,还可以利用化学连接(即,不通过重组DNA技术)来进行上述融合。
可以由通过本领域中已知的各种技术的任何一种产生的抗体获得用于本发明的VH和VL序列。
在本领域中产生多克隆和单克隆抗体的方法是众所周知的(参见例如,Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York,1988,其通过引用结合于此)。
通常,通过以包含所期望的抗原或免疫原的免疫原来免疫非人动物,优选小鼠,来提供抗体。可替代地,可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来提供抗体,如例如在Ward et al(Nature341(1989)544)中披露的。因此,根据本教导,可以设想抗体生产的任何方法,只要最终在细菌宿主中表达免疫球蛋白抗体被。
可以以在本领域中众所周知的用于在小鼠中刺激抗体生产的任何方式进行使用抗原免疫非人哺乳动物的步骤(参见,例如,E.Harlow and D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988))。在一个优选实施方式中,非人动物是哺乳动物,如啮齿动物(例如,小鼠、大鼠等)、牛、猪、马、兔、山羊、绵羊等。如所提及的,可以基因修饰非人哺乳动物或设计以产生″人″抗体,如XenomouseTM(Abgenix)或HuMAb-MouseTM(Medarex)。通常,将免疫原悬浮或溶解在缓冲液中,可选地使用佐剂,如完全弗氏佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法是本领域技术人员众所周知的,并且不以任何方式限制本发明。对于不同的免疫原,这些参数可以是不同的,但容易阐明。
类似地,在本领域中足以刺激生产抗体的免疫的位置和频率也是众所周知的。在典型的免疫方案中,在第1天并在约一周后再次使用抗原腹膜内注射非人动物。接着是在约第20天进行抗原的回忆注射,可选地使用佐剂如不完全弗氏佐剂。静脉内或腹膜内进行回忆注射并且可以重复持续数天。接着是在第40天,静脉内或腹腔内进行加强注射,通常地没有佐剂。此方案使得在约40天后产生生产抗原特异性抗体的B细胞。还可以采用其它方案,只要它们导致产生表达指向在免疫中使用的抗原的抗体的B细胞。
在可替代的实施方式中,分离来自非免疫非人哺乳动物的淋巴细胞,体外生长,然后暴露于在细胞培养物中的免疫原。然后收获淋巴细胞并进行下文描述的融合步骤。
对于单克隆抗体,下一步骤是自免疫的非人哺乳动物分离脾细胞并随后将那些脾细胞与永生化细胞融合以形成生产抗体的杂交瘤。在本领域中,自非人哺乳动物分离脾细胞是众所周知的并且通常涉及从麻醉的非人哺乳动物摘取脾脏、将其切割成小块并挤压来自脾脏被膜的脾细胞,接着通过细胞过滤器的尼龙网而进入合适的缓冲液以产生单细胞悬液。洗涤、离心细胞并将细胞重新悬浮在溶解任何红细胞的缓冲液中。再次离心溶液并最后将在沉淀物中的剩余淋巴细胞重新悬浮在新鲜缓冲液中。
一旦分离并存在于单细胞悬液中以后,将淋巴细胞融合于永生化细胞系。这通常是小鼠骨髓瘤细胞系,虽然可用于产生杂交瘤的许多其它永生化细胞系在本领域中是已知的。优选的小鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于:源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些,其可获自Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,Calif.U.S.A.;X63Ag8653和SP-2细胞,其可获自American Type Culture Collection,Rockville,Md.U.S.A.。利用聚乙二醇等来进行上述融合。然后在包含一种或多种抑制非融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或生存的物质的选择性培养基中生长产生的杂交瘤细胞。例如,如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤细胞的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶(HAT培养基),这些物质可以防止HGPRT缺陷细胞的生长。
通常在巨噬细胞的饲养层上生长杂交瘤细胞。巨噬细胞优选来自用来分离脾细胞的非人哺乳动物同窝出生的动物,并通常在平板接种杂交瘤细胞前若干天用不完全弗氏佐剂等加以引发。在Goding,″MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,″pp.59-103,Academic Press,1986中描述了融合方法。
在选择性培养基中允许细胞生长足够的时间以便于集落形成和抗体生产。这通常为7至14天。然后分析杂交瘤集落的结合免疫原/抗原的抗体的生产。上述分析通常是比色ELISA型分析,虽然可以采用可适合于在其中生长杂交瘤细胞的孔的任何分析。其它分析包括免测沉淀法和放射性免疫分析法。检查对所期望抗体生产为阳性的孔以确定是否存在一个或多个不同的集落。如果存在一个以上的集落,则可以重新克隆细胞并生长以确保单细胞产生生产所期望抗体的集落。通常重新克隆并重新测定具有单一明显集落的阳性孔以确保仅检测和生产一种单克隆抗体。
然后在适当的培养基(如DMEM或RPMI-1640)中以更大的量生长被证实是生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。可替代地,可以以在动物中的腹水瘤体内生长杂交瘤细胞。
在足够生长以产生所期望的单克隆抗体后,从细胞分离出包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)并纯化其中存在的单克隆抗体。通常通过凝胶电泳、透析、利用蛋白A或蛋白G-琼脂糖凝胶的层析法、或连接于固体载体如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠的抗小鼠Ig来进行纯化(例如,均描述于Antibody Purification Handbook,Amersham Biosciences,publication No.18-1037-46,Edition AC,其披露内容通过引用结合于此)。通常通过使用低pH缓冲液(pH3.0以下的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)自蛋白A、蛋白G或蛋白L柱洗脱结合的抗体,然后立即中和含有抗体的级分。根据需要,汇集、透析、并浓缩这些级分。
使用常规步骤(例如,通过使用能够特异性地结合于编码如鼠或人的抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来容易地分离和测序编码抗体的重链和轻链的DNA。一旦分离后,可以将DNA连接至表达载体,然后将其转染进入宿主细胞。
通常通过重组法来产生根据本发明的抗体。
可以将编码免疫球蛋白轻链和重链多肽的DNA序列独立地插入分开的重组载体或一个单一载体,其可以任何载体,可以使其方便地经受重组DNA步骤,并且将往往取决于其将被引入的宿主细胞来选择载体。
在本领域中用于重组生产的方法是众所周知的并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达以及抗体的随后分离,并通常将抗体纯化到药学上可接受的纯度。
对于如上所述的抗体在宿主细胞中的表达,通过标准方法将分别编码修饰后轻链和重链的核酸插入表达载体。
用来连接分别编码多肽、启动子(例如,组成型或诱导型)和可选地终止序列的DNA序列的步骤,以及用来将它们插入包含用于复制所必要的信息的适合载体的步骤,是本领域技术人员众所周知的(参见,例如,Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989)。
在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母、或细菌细胞中进行表达,并自细胞(在裂解以后的上清或细胞)回收抗体。
本发明设想,在各自单独的宿主细胞中表达抗体的每种成分,或在各自的宿主细胞中表达抗体成分的各种组合。因此,例如,可以在一种宿主细胞中表达轻链而在另一种宿主细胞中表达重链。可替代地,在一种宿主细胞中表达一个轻链和一个重链而在另一种宿主细胞中表达第二轻链和第二重链。仍然可替代地,可以在相同的宿主细胞中表达两种重链和两种轻链。
将可以理解的是,当在相同的宿主细胞中表达两种重链和两种轻链时,链的体外装配是没有必要的,并且仅需要自条件培养基纯化抗体,即,通过蛋白A层析法(参见例如:Jackman J,J Biol Chem.2010Jul2;285(27):20850-9.Epub2010May5)。
当在于其它三个链不同的宿主细胞中表达链的至少一个链时,则需要链的体外装配。
根据具体实施方式,宿主细胞包括细菌细胞。
根据另一个实施方式,作为Inclonals产生抗体,如在WO2009/107129中描述的,其通过引用结合于此。
可以选择能够以包涵体(即,可染色物质的核或细胞质聚集体)产生重组蛋白(即,重链和轻链)的细菌宿主。
使用的宿主细胞(例如,第一宿主细胞和第二宿主细胞)可以是相同物种或不同的物种的细胞。
根据本发明的具体实施方式,宿主细胞选自革兰阴性细菌。
如在本文中所使用的,″革兰氏阴性细菌″是指在显微镜下具有特征性的染色特性的细菌,其中在革兰氏染色法期间它们不染色或被醇脱色。革兰氏阴性细菌通常具有以下特性:(i)它们的细胞壁仅包括几层肽聚糖(在革兰氏阳性细菌中其以高得多的水平存在);(ii)细胞被外膜所包围,外膜包括肽聚糖层以外的脂多糖(其由脂质A、核心多糖、和O-多糖构成);(iii)在外膜中存在膜孔蛋白,其行为像用于特定分子的孔;(iv)在肽聚糖层和次生细胞膜之间存在间隙,称作周质间隙;(v)S层直接连接于外膜,而不是肽聚糖;(vi)脂蛋白连接于多糖骨架,而在革兰氏阳性细菌中不存在脂蛋白。
根据本发明教导可以使用的革兰氏阴性细菌的实例包括但不限于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(erwinia)和沙雷氏菌属(Serratia)。应当指出的是,由于假单胞菌属的代谢和生理两方面的性能,使用上述革兰氏阴性细菌如假单胞菌属而不是大肠杆菌作为宿主细胞将提供巨大的经济价值。在某些情况下,例如,假单胞菌属可以生长至比大肠杆菌更高的细胞培养密度,从而潜在地提供更大的产物产率。
根据本发明教导,适用的细菌表达载体的实例包括但不限于pETTM系统、T7系统和pBADTM系统,在本领域中这是众所周知的。
在本领域中用于将表达载体引入细菌宿主细胞的方法是众所周知的,并且主要取决于所使用的宿主系统。
可以亦或在相同培养基中共培养、亦或分开培养宿主细胞。
在有效条件下培养宿主细胞使得能够表达大量的重组重链和轻链。有效的培养条件包括但不限于允许重组蛋白生产的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效的培养基是指培养细菌以产生本发明的重组蛋白的任何培养基。这样的培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源,和适当的盐、矿物、金属和其它营养物质如维生素的水溶液。取决于所期望的量,可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿、和培养皿中培养本发明的细菌宿主。可以在适合于重组宿主的温度、pH和氧含量下进行培养。这样的培养条件是在本领域技术人员的专门知识内。
一旦达到免疫球蛋白重链和轻链的适当的表达水平后,从包涵体回收多肽。在本领域中,从细菌包涵体回收重组蛋白的方法是众所周知的并且通常涉及细胞裂解,接着是溶解在变性剂中[例如,De Bernardez-Clark andGeorgiou,″Inclusion and recovery of proteins from the aggregated state″Protein Refolding Chapter1:1-20(1991)。还参见以下实施例部分,标题为″在大肠杆菌中Inclonals″]。
简要地,可以通过给予有效的纯化策略的简单的离心,从大量的细胞质蛋白分离包涵体。然后可以通过强变性剂如尿素(例如,8M)或盐酸胍和有时使用极端的pH或温度来溶解它们。对于每种蛋白质,应该使变性剂浓度、暴露的时间和温度标准化。在完成溶解作用以前,可以使用变性剂和去垢剂的稀释溶液洗涤包涵体以除去一些污染蛋白质。
最后,可以在变性条件下通过层析技术对溶解的包涵体直接进行进一步的纯化,或可以在纯化以前将重链和轻链重新折叠成天然构象。
因此,可以在重折叠以前,并且可替代地或者另外地在重新折叠之后进行进一步纯化重建/重折叠重链和轻链多肽(即,溶解减少的多肽)。
在本领域中抗体纯化的方法是众所周知的并且在上文和以下实施例部分中描述。用于纯化IgG的其它方法描述于“Purification of IgG andinsulin on supports grafted by sialic acid developing“thiophilic-like”interactions Hamid Lakhiaria and Daniel Mullerb,Journal of ChromatographyB Volume818,Issue1,15April2005,Pages53-59。
可替代地或者另外地,纯化可以是基于亲和力并通过可识别或治疗部分的(例如,使用结合PE38以纯化与PE38融合的抗体的亲和柱)。
可以通过标准技术,包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳、和在本领域中众所周知的其它方法进行抗体的进一步纯化以消除细胞成分或其它污染物,例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel,F.,et al.,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing andWiley Interscience,New York(1987)。不同的方法被得到确认并广泛用于蛋白质纯化,如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如使用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳烃吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖凝胶、氮杂-亲芳烃树脂、或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻层析、和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
为了改善重折叠产率,以所选比率提供重建重链和重建轻链,以最大化完整抗体的形成。为此,重链与轻链摩尔比为约1:1至1:3、1:1.5至1:3、1:2至1:3。在一个示例性实施方式中,重链与轻链摩尔比为约1:1。
当需要时,可以对免疫球蛋白进行体外定向糖基化,其可以根据由Isabelle Meynial-salles and Didier Combes.In vitro glycosylation of proteins:An enzymatic approach.Journal of Biotechnology Volume46,Issue1,18April1996,Pages1-14所描述的方法来进行。
本发明的一个方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是根据本发明的抗体在制造药物组合物中的用途。本发明的又一个方面是用于制造包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中,本发明提供了组合物,例如药物组合物,其包含与药用载体一起配制的根据本发明的抗体。
抗体和包含抗体的组合物(例如,药物组合物)可以用于诊断和治疗应用,因此可以包括在治疗或诊断试剂盒中。
因此,如果需要的话,将本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中,如FDA批准的试剂盒,其可以包含含有活性组分即抗体的一个或多个单位剂型。例如,包装可以包括金属或塑料箔,如泡形罩包装(blisterpack)。包装或分配器装置可以连同用于给予的说明书。包装或分配器还可以连同以由监管药品的制造、应用或安全的政府机构规定形式的与容器相关的注意事项,上述注意事项反映了机构对组合物的形式或人或兽医给予的认可。上述注意事项,例如,可以是由美国食品和药物管理局批准的用于处方药或批准的产品插入物的标签。还可以制备配制在相容的药物载体中的本发明的包含组合物的制剂,放置在适当容器中,并标示用于治疗指定病症,如上文进一步详述的。
根据本发明的抗体的一个用途是用于治疗与炎症和感染相关的疾病。
如在本文中所使用的,术语“炎症”是指任何医学病症,其包括炎性反应,其中细胞的迁移(例如到淋巴结)促成炎症发生或进展。
可以使用上文描述的方法来治疗涉及炎性反应的若干疾病和病症,包括慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
这种疾病的实例包括与超敏反应相关的炎性疾病。
超敏反应的实例包括但不限于:I型超敏反应、II型超敏反应、III型超敏反应、IV型超敏反应、速发型超敏反应(immediate hypersensitivity)、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
可以使用本文披露的双功能抗体治疗的其它类型的炎性疾病是自身免疫性疾病、传染病、移植排斥疾病、变应性疾病(过敏性疾病)和癌性疾病。
如在本文中所使用的,术语″癌症″是指增生性疾病,其包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。癌性疾病的特定实例包括但不限于:髓性白血病如慢性粒细胞性白血病、伴随化脓的急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、伴随增加的嗜碱细胞的急性非淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、伴随嗜伊红细胞增多的急性髓细胞单核细胞白血病;恶性淋巴瘤,如Birkitt的非霍奇金淋巴瘤;淋巴细胞白血病,如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病;骨髓增生性疾病,如实体肿瘤、良性脑膜瘤、唾液腺混合瘤、结肠腺瘤;腺癌,如小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、肉瘤、脂肪肉瘤、粘液样脂肪肉瘤(myxoid)、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤(小泡的)、骨外黏液样软骨肉瘤、尤文肉瘤;其它癌性疾病包括睾丸和卵巢无性细胞瘤、视网膜母细胞瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、恶性黑素瘤、间皮瘤、乳房癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌。
可以通过单独、或连同载体一起作为药物组合物来给予抗体以治疗疾病。
如在本文中所使用的,″药用载体″包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地,载体适合于静脉内给予、肌内给予、皮下给予、胃肠道外给予、脊柱给予或表皮给予(例如通过注射或输液)。
可以通过本领域中已知的各种的方法来给予本发明的组合物。如技术人员将理解的,给予的途径和/或方式将取决于所期望的结果而变化。为了通过给予的某些途径来给予本发明的化合物,可能需要以防止其失活的材料涂覆上述化合物,或连同防止其失活的材料一起共同给予上述化合物。例如,可以在适当载体例如,脂质体或稀释剂中将化合物给予受试者。
药用稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在本领域中,用于药用活性物质的上述介质和制剂的用途是已知的。
如在本文中所使用的,短语″胃肠道外给予″和″不经胃肠道地给予″是指通常通过注射的不同于肠内和局部给予的给予方式,并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输液。
这些组合物还可以包含佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序(上文)和通过包含各种抗细菌和抗真菌剂,例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等,来确保防止存在微生物。还可以期望在组合物中包括等渗剂,如糖、氯化钠等。
另外,可以通过包括延缓吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
不管所选的给予途径,通过本领域技术人员已知的常规方法,将本发明的化合物(其可以以适当的水合形式加以使用)和/或本发明的药物组合物配制成药用剂型。
可以改变在本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平以获得活性组分的量,对于特定患者、组合物、和给予方式,该量可以有效地实现所期望的治疗反应而对患者没有毒性。所选择的剂量水平将取决于各种各样的药代动力学因素,其包括所采用的本发明的特定组合物的活性、给予的途径、给予的时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物一起组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康和以前的医疗史、以及在医疗领域中众所周知的类似因素。
组合物必须是无菌并且是达到可以通过注射器来递送组合物的程度的流体。除水以外,载体优选是等渗缓冲盐水溶液。
例如,可以通过使用涂层如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的颗粒尺寸、和通过使用表面活性剂来保持适当流动性。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如,糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化钠。
本发明的双特异性抗体的其它设想的用途包括纯化分析物;用于免疫组织化学和酶免疫分析法;用于放射成像和放射免疫疗法;以及用于药物递送。
其它设想的应用陈述于Cao Y,Suresh MR.Bispecific antibodies asnovel bioconjugates.Bioconjug Chem.1998Nov-Dec;9(6):635-44,其通过引用结合于此。
如在本文中所使用的,术语“约”是指±10%。
术语″包含″、″包括″、“具有”和它们的变化形式是指″包括但不限于″。
术语“由…组成”是指“包括并限于”。
术语″基本上由…组成″是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分,但前提是上述另外的成分、步骤和/或部分并不本质上改变主张的组合物、方法或结构的基本和新颖的特性。
如在本文中所使用的,术语″方法″是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序,其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的、或由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如在本文中所使用的,术语“治疗”包括消除、显著抑制、减缓或逆转病症的进展;显著改善病症的临床或美学症状;或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
应理解的是,为清楚起见,在分开的实施方式中描述本发明的某些特点,还可以在单一实施方式的组合中提供本发明的某些特点。相反地,为简便起见,在单一实施方式中描述本发明的各种特点,还可以分开地或以任何适当子组合或(如果合适的话)以所描述的本发明的任何其它实施方式来提供本发明的各种特点。描述于各种实施方式中的某些特点并不被认为是那些实施方式的基本特点,除非在没有那些要素的情况下实施方式是无法进行的。
在以下实施例中发现如上文描述的和如在以下权利要求部分中声称的本发明的各种实施方式和方面的实验支持。
实施例
现在参照以下实施例,其连同以上描述一起,以非限制性方式来说明本发明的一些实施方式。
通常,本文中使用的术语和在本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中详细解释了上述技术。参见,例如,″Molecular Cloning:A laboratory Manual″Sambrook et al.,(1989);″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel et al.,″Current Protocols in Molecular Biology″,JohnWiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,″A Practical Guide toMolecular Cloning″,John Wiley&Sons,New York(1988);Watson et al.,″Recombinant DNA″,Scientific American Books,New York;Birren et al.(eds)″Genome Analysis:A Laboratory Manual Series″,Vols.1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998);如陈述于美国专利号US4,666,828、US4,683,202、US4,801,531、US5,192,659和US5,272,057中的方法;″Cell Biology:A Laboratory Handbook″,Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);″Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique″byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition;″Current Protocols inImmunology″Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994);Stites et al.(eds),″Basicand Clinical Immunology″(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),″Selected Methods in Cellular Immunology″,W.H.Freeman and Co.,New York(1980);可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献,参见,例如,美国专利号US3,791,932、US3,839,153、US3,850,752、US3,850,578、US3,853,987、US3,867,517、US3,879,262、US3,901,654、US3,935,074、US3,984,533、US3,996,345、US4,034,074、US4,098,876、US4,879,219、US5,011,771和US5,281,521;″OligonucleotideSynthesis″Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization″Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985);″Transcription and Translation″Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984);″Animal Cell Culture″Freshney,R.I.,ed.(1986);″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press,(1986);″A PracticalGuide to Molecular Cloning″Perbal,B.,(1984)和″Methods in Enzymology″Vol.1-317,Academic Press;″PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications″,Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual″CSHL Press(1996);所有上述文献通过引用结合于此。在整个本文件中提供了其它一般参考资料。其中的程序被认为是在本领域中是众所周知的并且为方便读者而提供。其中包含的所有信息通过引用结合于此。
用于实施例1-4的材料和方法
构建用于重链和轻链的表达载体:在pHAK载体的骨架上构建用于在大肠杆菌中生产抗体重链和轻链的载体(Hakim and Benhar,2009)。根据″球形突出物进入孔中″方式(Merchant et al.,1998),利用定点诱变(Kunkel诱变)在CH2-CH3恒定区处修饰重链载体(Kunkel,1985),以包含重-重异源二聚体-优选的突变。为此,在大肠杆菌CJ236株中制备pHAK-IgH载体的DNA,用M13K07辅助噬菌体感染,并在第二天使用苯酚-氯仿纯化收集释放的包含单链尿嘧啶的质粒DNA。在TM缓冲液(0.01M MgCl2,0.05M Tris pH7.5)中,将DNA样品与引物1(用于引入″球形突出物″突变)或引物2、引物3和引物4的混合物(用于″孔″突变的引入)(表3,下文)一起温育。在下一步骤中,在T7聚合酶和T4连接酶(提供有0.4mM ATP、0.4mM dNTP、6mM DTT)的存在下,温育DNA样品,并转化进入DH5α大肠杆菌细菌。将产生构建体被命名为pHAK-HC-球形突出物(携带突变T366W、S354C)和pHAK-HC-孔(携带突变T366S、L368A、Y407V、Y349C)。使用NsiI-NdeI限制酶将包含突变的区域亚克隆到pHAK-IgH-PE38载体上(Hakim and Benhar,2009),其产生pHAK-HC-球形突出物-PE38和pHAK-HC-孔-PE38载体。上述构建体提供了融合于PE38毒素的抗体重链的表达。
表3
为了提供重-轻链的有效配对,在一对IgH/IgL中的替代位置,以工程化的键替换天然链间二硫键。插入pHAK-LC-Cys中的突变是在VL中的A104C,和在C-κ中的C218del。插入pHAK-HC-Cys中的突变是在VH中的A44C和在CH1中的C222A。pHAK-LC-Cys载体的构建包括两个顺序克隆步骤。首先,使用引物5和引物6扩增所选抗体的轻链可变区,用NdeI-BsiWI限制酶消化并克隆到先前用相同酶消化的pHAK-IgL。将产生的载体作为模板用于使用引物5和引物7扩增IgL,其以NdeI-EcoRI酶消化并克隆到(NdeI-EcoRI消化的)pHAK-IgL。为了构建pHAK-HC-Cys(A44C),在StuI-NheI消化和克隆到pHAK-IgH载体中以后,使用引物8和引物9扩增所选抗体的重链可变区。通过扩增由亦或引物10和引物12亦或引物11和引物13产生的两种PCR片段的两个,接着使用引物12和引物13装配PCR,将C222A突变插入CH1。使用NdeI和BsrGI限制酶消化装配的DNA片段并克隆到先前构建的pHAK-HC-Cys(A44C)载体中。
通过将pHAK-HC-Cys的NdeI-SacII消化区插入pHAK-HC-球形突出物载体来构建组合的pHAK-HC-Cys-球形突出物载体(A44C、C222A、T366W、和S354C)。将所期望抗体的轻链可变区或重链可变区克隆到基于pHAK-LC的载体(使用NdeI-BsiWI亚克隆)或基于pHAK-HC的载体(利用NdeI-NheI亚克隆)上。
在大肠杆菌中生产IgG:作为包涵体,在单独的大肠杆菌BL21(DE3)pUBS500细菌培养物中表达分别基于pHAK-IgH和pHAK-IgL的重链和轻链构建体。根据在克隆(Inclonals)IgG生产方法(Hakim and Benhar,2009)纯化、变性、混合和重新折叠包涵体。对于双特异性IgG生产,以1:1摩尔比添加互补重链。对于轻链应用相同规则。
蛋白A纯化:在重新折叠过程以后,在蛋白A亲和柱上加载IgG和基于IgG的融合蛋白,并分离细菌污染物和没有有效地重新折叠的蛋白。使用0.1mM柠檬酸洗脱蛋白,用1M Tris(HCl)pH8.5中和,接着是对20mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)pH7.4的透析。通过在280nm处的吸光率来确定蛋白质最终浓度。
凝胶过滤层析:在Amersham Pharmacia系统上进行凝胶过滤分析以确定纯化抗体的分子量。将蛋白A纯化蛋白施加于提前用PBS(pH7.4)平衡的Superdex200柱,并使用相同缓冲液在0.5ml/分钟的流速下进行分离。通过与标准IgG(150kDa)和基于IgG的免疫毒素IgG-PE38(225kDa)的洗脱体积比较洗脱体积来确定检查的IgG样蛋白的分子量。
SDS-PAGE分析:根据Laemmli(Laemmli,1970)进行蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳。将1/5体积的5×样品缓冲液加入蛋白质样品,接着在装载到凝胶上之前煮沸5分钟。在120V下运行7.5%、10%和12%小凝胶。为了评价全长IgG,加载非还原样品(没有β-巯基乙醇),同时将还原蛋白质样品分离成重链和轻链成分。用考马斯蓝溶液(0.05%考马斯蓝R-250、20%乙醇、10%冰乙酸)染色凝胶2小时,然后在脱色溶液(20%乙醇、10%冰乙酸)中洗涤,直到可以清楚地看到蛋白带。通过ImageMaster1D激光扫描密度仪(Pharmacia,瑞典)来分析蛋白带密度。其中对于非纯化级分,使用20μg蛋白质/泳道加载被染色的凝胶,或对于纯化蛋白为3-5μg。对于通过免疫印迹进一步处理的凝胶,加载1/10上述量。
蛋白印迹分析:根据(Towbin et al.,1992),将通过SDS-PAGE解析的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。在室温和缓慢摇动下,使用包含5%脱脂奶粉的PBS封闭膜至少1小时。使用PBS洗涤膜,接着用HRP结合的羊抗人二抗温育(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)。在使用包含0.05%吐温-20(PBST)的PBS洗涤三次并用PBS洗涤一次以后,如由供应商描述的使用SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate(Thermo Scientific,USA)来显影硝酸纤维素滤膜。
ELISA分析:如下确定单和双特异性IgG的抗原结合:在4℃下,用在PBS中的5μg/ml的纯抗原100μl/孔涂覆96孔ELISA板持续过夜,然后在37℃下使用3%脱脂牛奶(在PBS中)封闭1小时。在室温(25℃)下进行所有后续步骤。以在PBST中的三倍稀释系列将蛋白A纯化的蛋白施加于平板1小时、温育、并使用PBST洗涤三次。在使用HRP结合的二抗(1:5000稀释度,在PBST中,100μl/孔)温育1小时以后,在PBST中洗涤平板,并利用发色HRP基质TMB进行显色,然后用1M H2SO4来终止显色。在450nm处对平板进行读数。
实施例1
使用Inclonals方法在大肠杆菌中生产全长IgG
用于在大肠杆菌细菌中生产全长IgG的Inclonals方法(Hakim andBenhar,2009)包括在单独的细菌培养物中使用pHAK-IgH和pHAK-IgL载体来分别生产IgH和IgL。重链和轻链的可变区限定抗体特异性,而对于每种载体,恒定区是共同的。根据Inclonals方案进行蛋白质表达、纯化和重新折叠,然后使用SDS-PAGE、蛋白质印迹、尺寸排阻层析和抗原结合分析来评价纯化蛋白。相对于单特异性抗体,双特异性IgG由2个不同的重链和2个不同的轻链构成,因此表达和重折叠步骤包括同时操作4种蛋白。
实施例2
构建和评价重-重链异源二聚体
实施″球形突出物进入孔中″方式(Ridgway et al.,1996)作为在大肠杆菌中对于双特异性IgG的生产优选形成不同的重链的异源二聚体的解决方案。先前证明了引入4种突变(在″球形突出物″重链中T366W,和在″孔″重链中T366S、L368A、Y407V)和不对称的二硫键(在互补重链上的S354C和Y349C)在哺乳动物细胞产生的IgG中提供重链的高(>95%)异源二聚体化水平(Merchant et al.,1998),(图1A)。上述突变用来构建用于表达和检查重链的pHAK-HC-球形突出物和pHAK-HC-孔载体,而共同未修饰的轻链则用于所有IgG构建体(图2A-H)。将T427(抗CD30)和FRP5(抗erbB2)抗体用作模型IgG用于方法评价(Harwerth et al.,1992;Nagata et al.,2004)。以包涵体表达抗体重链和轻链、通过离心纯化、并通过SDS-PAGE分析(图3)。4种抗体链的重折叠接着是根据Inclonals方案的蛋白A纯化使得能够生产全长IgG。
关于异源二聚化产率的详细表征,″孔-重″链被表达为与PE38毒素的融合蛋白(Kreitman et al.,1992),PE38向蛋白质分子量提供另外的38kDa。如图4A-B所示,利用SDS-PAGE分析可以区分″球形突出物″重链的同源二聚体(150kDa)、″孔″毒素-融合重链的同源二聚体(230kDa)和两个不同重链的异源二聚体(190kDa)。图4B表明,Inclonals过程中产生的T427″球形突出物进入孔中″抗体在非还原聚丙烯酰胺凝胶上迁移为190kDa带并且在还原条件下可以分离为3种成分(IgL、IgH和IgH-PE38)。
通过供给仅具有一种重链类型(″球形突出物″或″孔″)的重新折叠溶液来产生IgG的″球形突出物-球形突出物″和″孔-孔″变体的尝试导致IgG的装配失败和部分尺寸的分子的性能(图5A-B)。
利用分子排阻层析评价双特异性Inclonals″球形突出物进入孔中″抗体证明大部分蛋白质迁移为190kDa分子而仅有小部分蛋白质是同源二聚体(图6)。Inclonals“球形突出物进入孔中”抗体的密度分析SDS-PAGE的结论是,>90%的大肠杆菌产生的IgG经历重链异源二聚化(图7A-C)。
为了评价双特异性分子的结合活性,构建了″球形突出物进入孔中″双特异性T427-FRP5抗体。这种IgG由4种不同链组成:FRP5-球形突出物和T427-孔-PE38重链、以及FRP5野生型和T427野生型轻链。将这种构建体中的PE38毒素用作用于T427重链存在的检测信号。将单特异性T427和FRP5IgG作为对照。利用间接ELISA,本发明的发明人证明抗体对于它的每种抗原的结合能力(erbB2对于FRP5(图8A)和CD30对于T427(未示出))。具体ELISA(图8B)分析检查了结合于FRP5抗原的抗体,同时检测了T427-PE38链。此分析证明了存在T427-FRP5异源二聚体其能够结合它的两种抗原。
实施例3
构建和评价重-轻链特异性配对
为了在两个可变区之间引入二硫键以替换天然重-轻链间S-S键,使用了T427抗体。已广泛地研究了这种抗体并且已明确定义了它用于dsFv的半胱氨酸位置(Nagata et al.,2004)。通过替换由dsFv限定的常规的半胱氨酸位置构建了载体pHAK-HC-Cys和pHAK-LC-Cys。dsFv样修饰单特异性IgG的生产证明了有效形成了由单dsFv样重-轻链间S-S键稳定化的全长IgG(图9,泳道3)。
pHAK-HC-Cys-球形突出物的构建体使得能够生产完全双特异性全长T427-FRP5IgG(图9,泳道4)。通过“球形突出物进入孔中”策略,提供了重链的异源二聚化,并且由不对称的链间二硫键确保了重-轻配对匹配。另外,提供有未配对的重链和轻链的IgG重新折叠溶液并不产生完整的IgG分子(图10)。
实施例4
如上文在材料和方法中所描述的,产生、纯化和评价了两种另外的双特异性抗体。
1.T427-αSA IgG:结合至CD30和链霉亲和素(SA)。由4种链组成双特异性抗体:IgL-T427-Cys(Cys104:Cys218del)、IgH-T427-球形突出物-Cys(Cys44:Cys222Ala+S354C:T366W)、IgL-αSA和IgH-αSA-孔(Y349C:T366S:L368A:Y407V)。
2.T427-αPE(B11克隆)IgG:结合至CD30和PE38(假单胞菌外毒素38kDa片段)。由4种链组成双特异性抗体:IgL-T427-Cys(Cys104:Cys218del)、IgH-T427-球形突出物-Cys(Cys44:Cys222Ala+S354C:T366W)、IgL-αPE和IgH-αPE-孔(Y349C:T366S:L368A:Y407V)。
通过亲和选择″Ronit1″抗体噬菌体展示文库(Azriel-Rosenfeld et al.,2004,J Mol Biol335,177-92)将抗链霉亲和素(αSA)和抗PE B11克隆(αPE)抗体分离为scFv。将重链可变区和轻链可变区分别克隆到pHAK-IgH-孔和pHAK-IgL中(如上文所述)。在大肠杆菌细菌中以包涵体产生链、通过离心纯化并通过SDS-PAGE电泳分析(图11)。根据Inclonals方案(Hakim and Benhar,2009),混合、重折叠和通过蛋白A亲和纯化法纯化适当的重链和轻链用于生产单特异性T427、αSA、αPE和双特异性T427-αSA和T427-αPE抗体。通过ELISA分析了抗体对于每种抗原的结合活性(图12和13)。如图所示,成功生产了这些双特异性抗体被并根据双臂的特异性结合了两种抗原。通过与牛血清白蛋白(BSA)的可忽略不计的结合证明了特异性。
用于实施例5-9的材料和方法
构建用于在哺乳动物细胞中表达IgG的pDual载体:在pMAZ载体的骨架上构建了用于在大肠杆菌中生产抗体重链和轻链的载体(Mazor Y.,et al.J Immunol Methods.2007Apr10;321(1-2):41-59.)。构建两个双顺反子pMAZ载体:pMAZ-IgH,其携带重链和新霉素选择标记;和pMAZ-IgL,其携带轻链和潮霉素选择标记。通过两种载体的共转染来介导IgG表达,接着进行双药物选择以获得稳定转染子。
pDual载体基于pMAZ-IgH载体,其首先利用IgH-Apadel-NheI-For和IgH-BsrGI-Rev引物突变以删除恒定区中的ApaI限制位点。下一步骤是构建pCMV-IgL-term盒并将它克隆在pMAZ-IgH-Apadel载体的KpnI-EcoRI限制位点之间。通过装配三种PCR产物来建造pCMV-IgL-term盒,其包括:1)使用提供以ApaI限制位点替换BssHI的pCMV-KpnI-For和pCMV-Rev引物扩增pCMV启动子(因为存在于Fc编码区中的ApaI位点被突变,在质粒中该ApaI位点将是唯一的);2)使用提供以NotI限制位点替换XbaI的T427L-For和T427L-Rev引物扩增T427轻链抗体(VL+LC),;3)使用BGH-polyA-For和BGH-polyA-EcoRI-Rev引物扩增BGH多聚腺苷酸化位点。通过重叠延伸聚合酶链式反应(装配PCR)将上述PCR产物装配成pCMV-IgL-term盒,接着使用KpnI和EcoRI限制酶消化并克隆到如上文所述的pMAZ-IgH-Apadel载体中。将得到的载体命名为pDual并进一步用于克隆不同抗体的可变区,其中使用用于VL的ApaI-BsiWI限制位点(κ轻链,用于λ轻链,需要携带λ轻链的单独的载体,应该将V-λ可变区以ApaI-AvrII限制片段克隆到其中)和用于VH的BssHI-NheI限制位点。
构建类似的携带潮霉素选择标记的pDual载体。
在以下表4中汇总用于产生上述pDual载体的引物的列表。
表4
转染HEK293T-RExTM细胞:应用磷酸钙转染方法用于将1μg的pDual或pMAZ质粒引入T-REx293细胞,在转染以前24小时以3×105细胞/孔接种在6孔板上。对于瞬时转染,在转染后24、48和72小时采集培养基样品。为了获得稳定转染子,在转染后24小时收获细胞并接种于补充有适当抗生素(1.2mg/ml G418和0.2mg/ml潮霉素)的DMEM上。采集稳定的克隆并评价它们的培养基的抗体的存在。
在HEK293T-RExTM细胞中的IgG生产:将先前获得的稳定克隆转移到组织培养瓶(250cm3)并在补充有0.9mg/ml G418和0.15mg/ml潮霉素(常规浓度的75%)的DMEM中。第二天(或当细胞达到80%汇合时),将培养基改变为50%DMEM(+L-Glu、PNS和牛血清)和50%DCCM1(+L-Glu、PNS、无血清)+75%的抗生素浓度(0.9mg/ml G418和0.15mg/ml的潮霉素)持续24小时。第二天,将培养基改变为100%无血清DCCM1(+L-Glu、PNS)。每2-4天采集来自细胞的DCCM1培养基,并轻轻地改变为新的无血清培养基。可以从上述瓶收集多达4次。
蛋白A纯化在哺乳动物细胞中产生的IgG:以5500rpm离心采集自抗体分泌细胞的DCCM1培养基15分钟,并使用0.45μm filtrap过滤。使用×20浓度磷酸盐缓冲液(400mM)1:20稀释培养基至20mM Na2HPO4和20mM NaH2PO4的最终浓度,然后以1ml/分钟的流速将混合物加载于蛋白A柱上。使用0.1mM柠檬酸(pH3)洗脱蛋白质,使用1M Tris(HCl)(pH8.5)中和,接着对20mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH7.4)进行透析。通过在280nm处的吸光率确定蛋白质最终浓度。
ELISA分析:如下确定单和双特异性IgG的抗原结合:在4℃下,用在PBS中5μg/ml的纯抗原100μl/孔涂覆96孔ELISA板持续过夜,然后在37℃下,用3%牛奶(在PBS中)封闭1小时。在室温(25℃)下进行所有后续步骤。以在PBST中的三倍稀释系列将蛋白A纯化的蛋白(或条件培养基)施加到平板上,温育1小时并使用PBST洗涤三次。在用HRP-标记二抗(在PBST中1:5000稀释,100μl/孔)温育1小时以后,在PBST中洗涤平板并使用产色HRP基质TMB加以显色,然后使用1MH2SO4来终止显色。在450nm处对平板进行读数。
细胞ELISA分析:在补充有10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM中维持A431/CD30(表达CD30,T427的靶抗原)和SKBR3(表达ErbB2,FRP5的靶抗原)细胞系并在37℃和5%CO2下生长。将细胞(2×104/孔)接种于96孔组织培养板上100μl培养基中,并在37℃下生长过夜。在过夜生长以后,轻轻地倒出培养基并在室温下用3%戊二醛水溶液固定细胞15分钟。在37℃下,使用PBS洗涤细胞并用在PBS中的5%BSA封闭2小时。在室温(25℃)下根据常规ELISA方案进行所有后续步骤。
点杂交分析:将转染后72小时细胞条件培养基的100μl样品稀释在等体积的PBS中并使用点杂交装置(Schleicher and Schuell,USA)经由真空歧管施加在硝酸纤维素滤膜上。在37℃下用在PBS中的3%(v/v)脱脂牛奶封闭膜1小时以后,用PBS简单地洗涤膜,接着在室温下使用羊抗人HRP结合的二抗温育1小时。在使用PBS洗涤三次以后使用ECL试剂(Pierce,USA)来显影膜。
SDS-PAGE分析:根据Laemmli(Laemmli,1970)进行蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳。将1/5体积的5×样品缓冲液加入蛋白质样品,接着在装载到凝胶上前煮沸5分钟。在120V下运行7.5%、10%和12%小凝胶。为了评价全长IgG,加载非还原样品(没有β-巯基乙醇),同时将还原蛋白质样品分离成重链和轻链成分。用考马斯蓝溶液(0.05%考马斯蓝R-250、20%乙醇、10%冰乙酸)染色凝胶2小时并在脱色溶液(20%乙醇、10%冰乙酸)中洗涤直到可以清楚地看到蛋白带。通过ImageMaster1D激光扫描密度仪(Pharmacia,瑞典)来分析蛋白带密度。加载染色的凝胶,其中,对于非纯化级分为20μg蛋白质/泳道,或对于纯化蛋白为3-5μg。通过免疫印迹进一步处理的凝胶加载1/10量。
蛋白印迹分析:根据(Towbin et al.,1992),将通过SDS-PAGE解析的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。在室温和缓慢摇动下,用包含5%脱脂奶粉的PBS封闭膜至少1小时。使用PBS洗涤膜,接着温育HRP结合的羊抗人二抗(Jackson Laboratories,West Grove,PA)。在使用包含0.05%吐温-20(PBST)的PBS洗涤三次并用PBS洗涤一次以后,如由供应商所描述的,使用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(ThermoScientific,USA)来显影硝酸纤维素滤膜。
实施例5
在哺乳动物细胞中生产IgG
在用于生产双特异性抗体的哺乳动物细胞中生产IgG的载体系统基于用于在哺乳动物细胞培养物中生产单克隆抗体的pMAZ载体(Mazor Yet al,2007)。设计载体pMAZ-IgH用于人γ1重链表达而设计载体pMAZ-IgL用于人κ轻链表达。将轻链和重链的可变区引入适当载体、共转染到HEK293细胞中并且确定和保持稳定的抗体分泌克隆。细胞克隆对于血清的饥饿导致以高达20mg/升培养物的总产率分泌所期望抗体。
实施例6
构建用于在哺乳动物细胞中生产IgG分子的双元载体
通过融合源自先前用于独立地生产抗体的轻链和重链(图14)的pMAZ-IgL和pMAZ-IgH载体(Mazor Y et al,2007)的DNA片段来构建pDual载体,以构建使用相同载体用于生产轻和重抗体链的嵌合构建体。在pDual载体中在分开的CMV启动子的控制下以单独的盒构建IgL和IgH。在轻链盒中,由ApaI限制位点替换BssHI,简化了随后将轻链和重链可变区克隆到双重载体:将ApaI-BsiWI用于克隆VL而将BssHI-NheI用于克隆VH。
实施例7
构建用于转染到哺乳动物细胞的双特异性载体
为了构建用于生产双特异性分子的基于pDual的载体,将从pHAK载体克隆的″球形突出物″、″孔″和″Cys″相关突变克隆到pDual系统中。克隆过程产生列于表5的构建体系列。通过使用AvrII和KpnI限制酶亚克隆来自pMAZ-IgL载体的盒,从而在pDual-T427载体中用Hygro抗性盒来替换NeoR。获得的pDual-NeoR和pDual-HygroR载体对可以用于转染哺乳动物细胞并选择稳定的克隆,其在一种细胞系内产生4种不同的抗体链:两种重链和两种轻链。
表5
实施例8
在瞬时转染的HEK293T-RExTM细胞中生产和评价双特异性IgG分子
以下实施例表明在IgG分泌系统中抗体的轻和重链之间的S-S桥的重要性,并且证明了在哺乳动物生产体系中,用于连接双特异性抗体的适当的轻链和重链的″替代半胱氨酸″理论是相关的,以及已经证明了在大肠杆菌中产生双特异性“Inclonals”。将HEK293T-RExTM细胞系用于本研究。亦或使用pDual-T427wt(编码野生型IgG)、pDual-T427-L(Cys)-H(wt)(编码野生型重链和轻链,其缺乏C-κ半胱氨酸并且不包含在VL中的工程化半胱氨酸,这应该是不应当形成IgG的一对链,)亦或使用pMAZ-IgL+pMAZ-IgH(用于野生型IgG生产的先前系统)对作为对照,来瞬时转染细胞。通过蛋白印迹分析评价转染后的培养基表明在pDual-T427-L(Cys)-H(wt)转染细胞的培养基没有检测到完整尺寸抗体,而转染pDual野生型构建体则产生了可检测水平的分泌抗体(和Erbitux稀释度相比高达1μg/ml)(图15A和B)。
还证明了双特异性IgG分子的分泌,并且还估计了使用″球形突出物进入孔中″和″替代半胱氨酸″(也称为“二硫键稳定化”)方式形成双特异性IgG的偏好。将pDual载体瞬时转染到HEK293TRex细胞并通过条件培养基的蛋白印迹分析检测分泌的抗体。将使用4种pMAZ载体(pMAZ-T427-IgL、pMAZ-T427-IgH、pMAZ-FRP5-IgL和pMAZ-FRP5-IgH)转染的细胞用作对照。实验分析证明了:1)″球形突出物进入孔中″方式是用于不同重链的有效异源二聚体化的解决方案,2)“替代Cys”方式提供了用于连接相同抗体臂的轻链和重链的解决方案,3)上述两种方式的组合提供了在哺乳动物细胞生产系统中分泌全长双特异性IgG抗体。如图16所示,当使用链的“错误的”组合时,在条件培养基的免疫印迹分析中不能看到完整尺寸IgG。在表达单特异性IgG的细胞中(泳道1和2)、在表达两种单特异性IgG的细胞中(泳道5,两种pDual载体,和泳道4,四种pMAZ载体)以及在表达双特异性IgG的细胞中(泳道7),可以观测到完整IgG。
实施例9
在稳定转染的HEK293T-RExTM细胞中生产和评价双特异性IgG分子并评价抗原结合
为了获得稳定的抗体分泌克隆,本发明的发明人使用pDual-FRP5-L(wt)-H(孔)NeoR和pDual-T427-L(Cys)-H(Cys-球形突出物)HygroR载体共转染HEK293T-RExTM细胞。证实了获得的Neo+Hygro抗性克隆具有以下能力:1)分泌抗体,2)结合两种抗原,3)分泌全长IgG用于一步纯化。使用点杂交分析来初步抗体分泌试验(试验实例示于图17)并确定了低、中和高分泌克隆。检查了标记为中和高分泌器的克隆的抗原结合活性。进行ELISA以评价每种克隆与erbB2(FRP5)和CD30(T427)重组抗体的结合水平(图18)。能够结合每种抗原的若干克隆继续到第三步骤并用蛋白A亲和柱加以纯化(图19)。分析纯化抗体以确定它们的大小、纯度和与重组抗原或抗原呈递细胞的结合活性(图20和21)。如图18所示,在ELISA中的结合信号与这些克隆的分泌水平相关。如图20和21所示,蛋白A纯化的双特异性IgG同时结合CD30和ErbB2抗原。在这样的ELISA中(图21),预计单特异性IgG(其是二价的)将显示各自对其同源抗原的更强烈的结合信号(由于亲和力效应)。初步的细胞ELISA(图22)表明,由克隆D3分泌的双特异性抗体染色抗原阳性细胞。
实施例10
构建单特异性抗体
首先,产生包含球形突出物进入孔中(KIH)突变的单特异性抗体(T427IgG)。为了评价KIH T427IgG分子的结合活性,进行了ELISA。用MBP-CD30涂覆ELISA板并用T427KIH IgG(融合于PE38)加以温育。证明了,T427KIH分子的结合能力类似于未修饰的T427IgG和T427-PE38IgG-PE38的结合(图24)。
随后,产生如上文所述的包含在轻链中的KIH突变和半胱氨酸突变的单特异性抗体(T427IgG)。
为了产生单特异性T427抗体,构建了4种链:IgL-PE38、IgH-球形突出物、IgH-Cys-孔和IgL-Cys。存在融合于VL-未修饰轻链的38kDa PE38提供了可能性来分析适当重链和轻链的配对(类似于KIH异源二聚体化分析)和形成完整尺寸的单和双特异性分子(图中未示出)。
虽然已连同其具体实施方式一起描述了本发明,对于本领域技术人员来说,许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此,它旨在包括落在所附权利要求的精神和广阔范围内所有的这种替代、修改和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书。另外,在本申请中任何参考文献的引用或鉴别不应被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的在先技术。在使用章节标题的程度上,它们不应当被解释为一定限制性的。
Claims (41)
1.一种抗体,包括Fc区和Fab区,其中:
(i)所述Fc区包括两个不相同的重链,其中,所述两个不相同的重链的至少一个包含氨基酸修饰使得所述两个不相同的重链之间形成互补,从而增加形成所述不相同的重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性;和
(ii)所述Fab区包含在所述Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在所述Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键,其中,所述第一共价键相对于所述第一重链的位置不同于所述第二共价键相对于所述第二重链的位置。
2.根据权利要求1所述的抗体,是双特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体,是不对称的、单特异性抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述互补包括空间互补。
5.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述互补包括电荷互补。
6.根据权利要求4所述的抗体,其中,所述Fc区包含所述Fc区的一个重链的突出部分和在所述Fc区的第二重链上的空间补偿空腔,所述突出部分突入所述补偿空腔。
7.根据权利要求4所述的抗体,其中,通过用比初始氨基酸具有更大侧链体积的另一氨基酸取代在所述一个重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生所述突出部分。
8.根据权利要求7所述的抗体,其中,通过以比所述初始氨基酸具有更小侧链体积的另一氨基酸取代在所述第二重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生所述补偿空腔。
9.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述第一共价键是在所述一个重链的CH1结构域和所述一个轻链的CL结构域之间;而所述第二共价键是在所述第二重链的VH结构域和所述第二轻链的VL结构域之间。
10.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述第一和所述第二共价键是二硫键。
11.根据权利要求7所述的抗体,其中,比所述初始氨基酸具有更大侧链体积的所述氨基酸选自由酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和色氨酸组成的组中。
12.根据权利要求8所述的抗体,其中,比所述初始氨基酸具有更小侧链体积的所述氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苏氨酸组成的组中。
13.根据权利要求1所述的抗体,选自由嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体组成的组中。
14.根据权利要求1所述的抗体,其中,将所述第一重链的所述CH3结构域共价地连接至所述第二重链的所述CH3结构域。
15.根据权利要求2所述的抗体,其中,所述抗体的第一抗原结合位点结合抗原的第一表位而所述抗体的第二抗原结合位点结合所述抗原的第二表位。
16.根据权利要求2所述的抗体,其中,所述抗体的第一抗原结合位点结合第一抗原的表位而所述抗体的第二抗原结合位点结合第二抗原的表位。
17.根据权利要求1所述的抗体,其中,每个轻链经由单二硫键连接至它的同源重链。
18.根据权利要求1所述的抗体,是完整抗体。
19.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述抗体选自由IgA、IgD、IgE和IgG组成的组中。
20.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述IgG包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
21.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述第一重链包含T366W突变;并且所述第二重链包含T366S、L368A、Y407V突变。
22.根据权利要求21所述的抗体,其中,所述第一重链包含S354C突变并且所述第二重链包含Y349C突变。
23.根据权利要求16所述的抗体,其中,所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合erbB2。
24.根据权利要求16所述的抗体,其中,所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE)。
25.根据权利要求16所述的抗体,其中,所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合链霉亲和素。
26.根据权利要求1所述的抗体,其中,至少一个所述重链连接至治疗性部分。
27.根据权利要求1所述的抗体,其中,至少一个所述重链连接至可识别部分。
28.根据权利要求1所述的抗体,选自由灵长类动物抗体、猪抗体、鼠抗体、牛抗体、羊抗体和马抗体组成的组中。
29.一种制备根据权利要求1所述的抗体的方法,包括:
(a)提供编码所述第一重链的第一核酸分子;
(b)提供编码所述第二重链的第二核酸分子;
(c)提供编码所述第一轻链的第三核酸分子;
(d)提供编码所述第二轻链的第四核酸分子;
(e)在允许表达所述核酸分子的条件下培养包含所述第一、第二、第三和第四核酸分子的宿主细胞;和
(f)回收根据权利要求1所述的抗体。
30.根据权利要求29所述的方法,其中,所述宿主细胞包括细菌细胞。
31.根据权利要求29所述的方法,其中,所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。
32.根据权利要求30所述的方法,其中,所述表达发生在所述细菌细胞的包涵体中。
33.根据权利要求29所述的方法,其中,将每种所述核酸分子转染进入不同的宿主细胞。
34.根据权利要求27所述的方法,其中,将每种所述核酸分子转染进入相同的宿主细胞。
35.根据权利要求30所述的方法,其中,所述细菌细胞包括革兰氏阴性细菌细胞。
36.根据权利要求29所述的方法,进一步包括,按照步骤(f)纯化在蛋白A/G/L上的抗体。
37.一种药物组合物,包含作为活性剂的根据权利要求1所述的抗体,和药用载体。
38.根据权利要求1所述的抗体,用于治疗感染或炎性疾病或病症。
39.根据权利要求38所述的抗体,其中,所述炎性疾病是癌症。
40.一种用于在需要其的受试者中治疗感染或炎性疾病或病症的方法,所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1所述的抗体,从而治疗所述感染或炎性疾病或病症。
41.根据权利要求40所述的方法,其中,所述炎性疾病或病症是癌症。
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