CN108138200A - 增强的免疫球蛋白产生 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含工程化免疫球蛋白等位基因的细胞、转基因动物，包括转基因哺乳动物并且特别地啮齿动物。等位基因中的突变被设计为使等位基因排斥受损并且具有被用于分离双特异性抗体的潜力。
Description
相关申请
本申请要求2015年8月24日提交的USSN 62/209,267的优先权。
发明领域
本发明涉及免疫球蛋白分子的产生，包括在转基因动物中产生双特异性抗体以用于开发人类治疗剂。
发明背景
在以下讨论中，出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不得被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下根据可适用的法定条文证明本文引用的文章和方法不构成现有技术的权利。
单克隆抗体已经作为用于治疗多种病因学的人类疾病的重要类别的治疗性分子出现。在人类以及大多数脊椎动物中，抗体以各自与相同的轻(L)链配对的两个相同的重(H)链的二聚体存在。每一个H链和L链的N-末端包括可变结构域(分别是VH和VL)，它们一起为H-L对提供其独特的抗原结合特异性。因此，每一个抗体包括两个相同的抗原结合位点并且是单特异性的。
编码抗体VH和VL结构域的外显子不存在于种系DNA(germlineDNA)中。而是，每一个VH外显子通过存在于H链基因座中的随机选择的V、D和J基因的重组产生；同样，单独VL外显子由轻链基因座中随机选择的V和J基因的染色体重排产生。人类基因组包含可以表达H链的两个等位基因(来自各自亲本的一个等位基因)、可以表达kappa(κ)L链的两个等位基因和可以表达lambda(λ)L链的两个等位基因。在H链基因座处存在多个V、D和J基因以及在两个L链基因座处存在多个V和J基因。在每一个免疫球蛋白基因座处的J基因的下游存在编码抗体恒定区的一个或更多个外显子。在重链基因座中，也存在用于表达不同抗体类别(同种型)的外显子。尽管基因组中存在多个免疫球蛋白等位基因，通过被称为等位基因排斥的过程，每一个B细胞被阻止一次表达多于一个功能性重链和一个功能性轻链。
在B细胞发育期间，V(D)J基因重组首先发生在包含H链基因的两个同源染色体之一上。随后所得的VH外显子在RNA水平被剪接至编码H链恒定区(CH)的外显子。现在仅当VDJ基因重排后形成的VH外显子与CH外显子符合读框(in-frame)时才能表达全长H链。当H链多肽在内质网(ER)中被翻译后，它们形成膜结合的同二聚体并且与VpreB和λ5蛋白配对以形成前B细胞受体(前-BCR)复合物。VpreB和λ5一起作为替代L链，并且只有正确折叠的前BCR可以从ER运输至细胞表面。在足够数目的前BCR到达细胞表面后，通过尚未完全理解的机制，信号级联(signalingcascade)被触发以防止重组酶活化基因(RAG)的酶进行同源染色体上的第二重链等位基因的V、D和J基因的重组。相比之下，如果由第一重链等位基因生成非功能性重链基因，则前BCR不被形成，并且第二H链等位基因现在允许VDJ重组。因此，H链等位基因排斥通过来自细胞表面前BCR的信号传导来介导。这通过其中Cμ重链跨膜外显子的损失导致重链等位基因排斥严重受损的B细胞最好地例示(Kitamura和Rajewsky,Nature356:154-156(1992))。
在成功完成VDJ基因重排用于产生功能性H链后，VJ重组以相似的有序方式在L链基因座之一处发生。在人类和小鼠两者中，κL链基因座趋于在λL链基因座之前重排。VJ重排一次发生在一个L链等位基因上，直至产生功能性L链，在其之后L链多肽现在可以与H链同二聚体缔合。如同在前BCR装配的情况下，只有由各自与L链配对的同二聚体H链组成的功能性B细胞受体(BCR)可以运输至质膜以介导B细胞进一步发育所必需的信号。细胞表面BCR信号也有效地关闭RAG表达以防止任何另外的L链重排。因此，需要质膜上的重链表达来介导H链和L链基因座两者处的等位基因排斥。
由于在H链和L链基因座处的等位基因排斥，每一个B淋巴细胞仅能够产生单特异性抗体。然而，治疗上，每个抗体分子携带两个不同抗原结合位点的人工工程化抗体已经被证明作为用于许多疾病的治疗是有效的。此类双特异性抗体的生成通常涉及费时的单独努力来筛选、鉴定和分离针对两个不同的感兴趣抗原的每一个的单特异性抗体。随后，编码待被工程化作为双特异性抗体的一半的每一个候选单克隆抗体的H链和L链的基因被克隆并且被修饰用于允许H链之间或H链与L链之间的异型缔合。为了获得用于进一步评价的双特异性抗体，细胞系必须用来自两个原始单克隆抗体的修饰的H链和/或L链基因转染。因此，特别地在药物开发的初始阶段期间，用于更高效产生双特异性抗体的方法是重要的未满足的需求。由本说明书提供的方法和组合物满足这一重要需求。
发明概述
提供该概述是为了以简化的形式介绍一系列概念，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势从以下撰写的详述包括附图中阐释的和所附的权利要求中限定的那些方面将是明显的。
本说明书描述了用于分离双特异性抗体的方法。它还描述了在其基因组中携带修饰的免疫球蛋白等位基因或其他转基因的转基因动物，包括转基因哺乳动物。对等位基因的修饰干扰VDJ和/或VJ重排后的等位基因排斥的正常机制。这些遗传修饰的动物中的B细胞获得了产生具有两种或更多种抗原结合特异性的抗体的能力。抑制等位基因排斥以便于由免疫的宿主产生双特异性抗体是本发明的一个新颖方面。
在一些示例性实施方案中，本发明引入对免疫球蛋白等位基因的修饰以影响(impinge on)正常等位基因排斥过程，使得符合读框的V(D)J重排不阻止相继的其他免疫球蛋白等位基因的V(D)J重排。通过干扰在B细胞发育期间介导等位基因排斥的信号，本文描述的发明提供了用于修饰动物的基因组内含物使得它们的B细胞能够表达每个细胞多于一个功能性VH结构域和/或多于一个功能性VL结构域的方法和组合物。
在该实施方案的一个示例性方面，前BCR信号传导因引入到两个H链等位基因中的每一个以抑制重链等位基因排斥的突变而受损。突变也被选择为使得它们不利于同二聚体重链形成但与两个突变体重链之间的异二聚体化相容。结果，预期由两个突变体重链等位基因的任一个单独表达的重链多肽在ER中错误折叠(misfold)，并且因此被阻止运输至质膜以介导用于等位基因排斥和进一步B细胞发育的信号。因此，仅当两个突变体重链等位基因被共表达并且形成互补异二聚体时，成功的前BCR组装才能发生。重链基因座的恒定区也可以被修饰以限制同种型转换的程度。尽管预期单独B细胞表达仅与一种轻链配对的两个不同的重链，但预期重链和轻链所有组成成分(repertoires)两者在宿主中的B细胞池中非常广泛。
在该实施方案的另一个形式中，重链和/或轻链等位基因的恒定区被修饰，使得一个等位基因上的符合读框的VDJ或VJ重排对于等位基因排斥失能，但被保存用于在稍后B细胞发育阶段的表达。在一个具体实例中，DNA盒被插入重链基因座中一个等位基因的J基因的下游，以防止从高效地组装的VDJ外显子表达全长重链。此类DNA盒可以包括以下元件中的一种或更多种：剪接受体、核糖体跳跃序列(ribosomal skip sequence)或内部核糖体进入位点(IRES)、开放阅读框、聚腺苷酸化信号序列或终止密码子。因此，来自该等位基因的符合读框的VDJ外显子不能介导等位基因排斥或支持进一步的B细胞发育。然而，如果符合读框的VDJ基因重排发生在第二等位基因上，B细胞仍然可以正常发育。为了随后的沉默重链等位基因的再活化，位点特异性DNA重组酶诸如Cre的识别序列可以被引入到插入的DNA盒两翼。当位点特异性DNA重组酶被表达时，现在DNA盒被切离或倒位，允许先前沉默的VDJ外显子被剪接到其他CH外显子的下游以用于全长重链表达。可选地，DNA盒可以被插入在可以经由正常同种型转换机制从重链基因座切离的位置处。两个重链等位基因的下游恒定区可以被进一步修饰以限制同种型转换的程度，以在两个重链被共表达时有利于异二聚体化，或者一次仅允许一个重链被表达。
在可选的实施方案中，可以实施与刚刚描述的策略类似的策略以使在κ或λ轻链基因座处的等位基因排斥失能，其中由单独B细胞产生的双特异性抗体由与两个不同的轻链配对的重链同二聚体或重链异二聚体组成。
在另一个可选的实施方案中，采用类似于用于重链等位基因相容(allelicinclusion)的那些的策略以产生由仅重链组成的双特异性抗体。在实施方案的该形式中，编码第一重链恒定结构域(CH1)的外显子被从每一个等位基因中去除。进一步的遗传修饰可以被引入至两个重链等位基因，使得它们表达的蛋白有利于彼此异二聚体化并且与自身二聚体化较不相容。可选地，修饰可以被引入至重链等位基因，使得无CH1重链等位基因以前述实施方案中描述的诱导型方式顺序表达，以产生双特异性的仅含重链的抗体。
在又另一个可选的实施方案中，免疫球蛋白等位基因被修饰以用于允许在等位基因排斥所必需的一个或更多个信号传导分子有缺陷的动物中由B细胞产生双特异性抗体。
引入到免疫球蛋白等位基因中的有利于双特异性抗体形成的某些修饰对等位基因排斥具有最小影响。例如，包含类似于熟知的“柞适配臼(knob-into-hole)”突变的修饰的重链容易形成异二聚体；然而，如果每一个修饰的重链单独表达，则引入的修饰不完全抑制同二聚体形成。由于一次仅一个免疫球蛋白等位基因重排，由第一重排等位基因表达的重链同二聚体可以保留等位基因排斥的能力。本发明的方法在其中等位基因排斥因前BCR或BCR的一个或更多个信号传导组分的缺陷而受损的动物或细胞的情况下实施本身对等位基因排斥具有最小的影响的此类免疫球蛋白等位基因修饰。
因此，在一些实施方案中，提供了一种具有受损的免疫球蛋白重链基因等位基因排斥的遗传修饰的动物，允许选择各自能够共表达每个细胞两种或更多种不同抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。
在一些方面，遗传修饰的动物的免疫球蛋白重链基因的一个或更多个恒定区编码部分内的外显子被改变，使得在发育中的B淋巴细胞中在V(D)J重排后不发生等位基因排斥。在一些方面，对遗传修饰的动物中的免疫球蛋白重链基因的改变允许免疫球蛋白重链基因的一个或更多个恒定区编码部分中的一个或更多个外显子的表达的诱导型失活和/或活化；遗传修饰的动物的一个或更多个恒定区外显子的部分或所有相对于同一免疫球蛋白重链基因中重排的V(D)J基因区段以倒位阅读框方向放置；并且在一些方面，DNA盒被插入到遗传修饰的动物中以防止来自同一染色体上的重排的V(D)J基因区段的恒定区外显子的表达。
一些方面提供了一种遗传修饰的动物，当用两种不同的抗原同时注射、或者用一种抗原随后第二种不同的抗原注射时，所述遗传修饰的动物生成各自能够共表达或顺序表达两种或更多种不同的抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。在一些方面，B淋巴细胞中的两种抗原受体的异二聚体化由发育或分化事件实现，或者可以被诱导。
其他方面提供了一种遗传修饰的动物，其中动物中单独B细胞中的两个重排免疫球蛋白重链基因表达彼此不高效同二聚体化的基因产物；并且在一些方面，两个不同重链基因产物的同二聚体化不发生，或相对于异二聚体化是不利的。
又其他实施方案提供了一种具有受损的免疫球蛋白轻链基因等位基因排斥的遗传修饰的动物，允许选择各自能够共表达每个细胞两种或更多种不同抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。在一些方面，动物的免疫球蛋白轻链基因中的一个或更多个内的恒定区编码外显子被改变，使得在发育中的B淋巴细胞中在VJ重排后不发生等位基因排斥；并且在其他方面，对遗传修饰的动物的免疫球蛋白轻链基因中的一个或更多个的改变允许免疫球蛋白轻链基因的恒定区编码部分的表达的诱导型失活和/或活化。
其他实施方案提供了遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中一个或更多个恒定区外显子的部分或所有相对于同一免疫球蛋白轻链基因中的重排的VJ基因区段以倒位阅读框方向放置；遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中DNA盒被插入以防止来自同一染色体上的重排的VJ基因区段的恒定区外显子的表达；以及遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中恒定区外显子被修饰以对与在同一B细胞中的一个但非两个重链等位基因缔合相容。
其他实施方案提供了来源于遗传修饰的动物的原代B细胞、永生化B细胞或杂交瘤。
又其他实施方案提供了一种遗传修饰的动物，其中对免疫球蛋白重链基因的改变允许产生仅由重链组成的双特异性抗体。
其他实施方案包括由来自遗传修饰的动物的工程化部分的免疫球蛋白重链基因转录的部分或完整免疫球蛋白；以及来源于遗传修饰的动物的细胞的部分或完整工程化免疫球蛋白。
下文更详细地描述本发明的这些以及其他方面、特征和优势。
附图简述
图1阐释了在VDJ重组之前具有可变基因区段特征的重链基因座处的两个典型等位基因。
图2阐释了允许从两个重链等位基因的同时表达产生双特异性抗体的重链等位基因的修饰。
图3阐释了具有用于表达不同抗体类别的外显子特征的重链基因座的恒定区区域(locales)。
图4阐释了用于通过顺序重链表达产生双特异性抗体的重链等位基因的修饰。
图5阐释了用于通过顺序重链表达产生双特异性抗体的重链等位基因的可选的修饰。
图6阐释了用于诱导型双特异性抗体产生的重链等位基因的修饰。
定义
本文使用的术语意图具有如本领域的技术人员理解的简单和普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制此类术语的含义，除非特别地指示。
本文中使用术语“转基因”来描述已经或将要被人工插入到细胞，特别地脊椎动物宿主动物的细胞的基因组中的遗传物质(genetic material)。
“转基因动物”意指具有在其细胞的一部分中作为染色体元件或染色体外元件存在或者被稳定整合到其种系DNA中(即，在其大部分或所有细胞的基因组序列中)的外源核酸序列的非人类动物，通常哺乳动物，诸如啮齿类动物，特别地小鼠或大鼠，虽然设想了其他哺乳动物。
“载体”包括无论是否自我复制，均可以用于转化、转导或转染细胞的质粒和病毒以及任何DNA或RNA分子。
“细胞表面”指细胞的质膜，即细胞被最直接暴露于细胞外空间并且可用于与细胞外(包括细胞间)空间中的细胞和蛋白两者接触的那部分。
“双特异性抗体”是包含在其抗原特异性方面彼此不同的两个物理上可分开的抗原结合表面的抗体。普通抗体具有结构上相同并且因此具有相同的抗原特异性的两个物理上可分开的抗原结合表面。双特异性抗体的优选形式是类似于具有两个物理上可分开的抗原结合表面的普通IgG抗体分子的双特异性抗体，但与这些表面结构上相同不同的是，它们彼此不同。在本发明的情况下，这两个表面可以包含相同的重链蛋白，但它们在其所包含的轻链蛋白中彼此不同。可选地，该两个表面可以包含相同的轻链蛋白，但它们在其所包含的重链蛋白中彼此不同。
如本文使用的，“有效重排(productive rearrangement)”是符合读框并且允许可变区结构域翻译的VDJ或VJ重排。如果重链或轻链的可变结构域可以与下游恒定区外显子符合读框地表达，其被认为是“功能性”的。如果分别由有效VDJ或VJ重排翻译的重链或轻链蛋白可以在细胞表面上被表达，则它们被称为“功能性”的。
本文描述的免疫球蛋白“等位基因”指可以包含可变基因区段、内含子增强子、恒定区基因和内源或外源来源的其他序列的在重链或轻链基因座处的染色体区段。
“等位基因排斥”指这样的事实，即脊椎动物物种诸如啮齿动物或人类中的绝大多数B细胞仅在两个同源常染色体之一上携带有效重排重链基因。相似地，在轻链基因座上的等位基因排斥将涉及类似的情况。在更一般的意义上，只要在任何重链或轻链基因座处的有效V(D)J重排分别抑制其他重链或轻链V(D)J基因区段的进一步重排，无论其染色体位置在何处，等位基因排斥均适用。例如，如果两组或更多组重链VDJ连锁群被插入于同一染色体中，在重链连锁群之一处的有效重排防止在任何其他重链连锁群处的进一步V(D)J重排。相同的原理适用于轻链连锁群。原则上，这种“等位基因”排斥将通过与常规等位基因排斥相同的机制发生。
“等位基因相容(allelic inclusion)”指等位基因排斥的失去，并且因此指B细胞产生两种或更多种功能性重链可变结构域和/或两种或更多种功能性轻链可变结构域的能力。
基因组“区域(locale)”是与一个特定功能方面相关的任何基因组区(region)，优选地基因。本文中使用术语区域来指免疫球蛋白基因座的部分。例如，它可以指主要包含一种基因区段的免疫球蛋白基因座的那部分，诸如V基因区段区域、或D基因区段区域、或J基因区段区域，或更广泛地，可变区域，其包括所有的V、D和J基因区段。恒定区区域是免疫球蛋白基因座中包含恒定区外显子的那部分。
发明详述
除非另外指出，本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些均在本领域的技术人员的技术内。此类常规的技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、和利用标记物的杂交检测。合适技术的具体说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然，也可以使用其他等同的常规程序。此类常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如：Green,等,编著.(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)；Weiner,Gabriel,Stephens,编著.(2007),Genetic Variation:A Laboratory Manual；Dieffenbach,Dveksler,编著.(2003),PCR Primer:A Laboratory Manual；Bowtell和Sambrook(2003),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A LaboratoryManual；以及Sambrook和Russell(2002),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,New York N.Y.；Lehninger,Principles of Biochemistry第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；以及Berg等(2002)Biochemistry,第5版,W.H.FreemanPub.,New York,N.Y.；Nagy,等,编著(2003)Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratory Manual(第3版)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.，其全部通过引用以其整体出于所有目的并入本文。
应该注意，除非上下文另外明确指出，如本文和所附的权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“免疫球蛋白”指一个或更多个此类免疫球蛋白，并且提及“该方法”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有的出版物通过引用并入，用于描述和公开可以结合目前描述的发明使用的装置、制剂和方法的目的。
在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间每一个居间值以及在该指定的范围中的任何其他指定值或居间值包括在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，受制于指定的范围中的任何特异性排除的限制。在指定的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本发明内。
在以下的描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，对本领域的技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
发明总述
本发明提供了用于从动物中快速分离双特异性抗体的方法和组合物。免疫系统中存在的B淋巴细胞通过被称为等位基因排斥的过程被阻止表达多于一种功能性重链和一种功能性轻链。本发明的某些实施方案提供了对动物的基因组内含物的修饰，使得等位基因排斥在发育中的B细胞中的一个或更多个免疫球蛋白基因座处失能。本文描述的方法为B细胞提供了表达每个细胞多于一种功能性VH结构域和/或多于一种功能性VL结构域的能力。
在某些实施方案中，本发明实施对免疫球蛋白等位基因的修饰以影响正常等位基因排斥过程，使得一个等位基因的符合读框的V(D)J重排不抑制另一个等位基因的V(D)J重排。某些实施方案还实施两种一般策略以从转基因动物中分离双特异性抗体。第一种策略涉及用两种或更多种感兴趣抗原的同时免疫接种方案。第二种策略涉及用不同的感兴趣抗原的顺序免疫接种。
重链和轻链重排两者后的等位基因排斥需要将重链运输至细胞表面。在优选的实施方案中，本发明利用了这样的可能性：如果不适当折叠，新合成的重链多肽被保留于ER中并且缺乏介导等位基因排斥的能力。在重链的VDJ重组后——除了必需的VH结构域与替代轻链复合物配对以外——需要重链多肽的二聚体化以实现适当的蛋白折叠。除了IgM和IgE以外，所有同种型的重链同二聚体化由两个CH3结构域之间的对称蛋白相互作用启动。IgM和IgE重链经由其CH4结构域之间的蛋白相互作用启动同二聚体化。
在该实施方案的一个方面，重链等位基因被修饰以限制同种型转换的程度，其中编码两个等位基因上的CH3或CH4二聚体化结构域的外显子被修饰以与同二聚体化较不相容但彼此互补以用于异二聚体化。由在任一个等位基因上的符合读框的VDJ重排表达的重链多肽单独不能有效地实现适当的蛋白质折叠，并且因此不能运输至细胞表面以介导等位基因排斥。
除了VH-VL配对以外，轻链等位基因排斥需要易于错误折叠的重链CH1结构域的适当蛋白折叠(参见例如Feige等,Mol Cell 34:569–579(2009))。为了实现适当的蛋白折叠，每一个重链CH1结构域必须与轻链的恒定区(Cκ或Cλ)缔合。在本发明的方法的扩展方面，对编码两个重链等位基因的CH1结构域的外显子以及轻链恒定区结构域的外显子实施遗传修饰，使得每一个轻链可以与仅由一个等位基因而非两个等位基因表达的重链缔合。
在具有或不具有以上提及的CH1修饰的情况下，携带以上提及的CH3修饰的转基因小鼠用两种感兴趣的抗原同时进行免疫。可以采用重复免疫接种以使识别两种抗原的B细胞的克隆扩增最大化。在免疫接种方案已经完成之后，采用标准杂交瘤或其他技术以分离产生针对两种感兴趣的抗原的双特异性抗体的B细胞。
在该实施方案的另一个形式中，转基因动物诸如转基因小鼠在两个染色体上携带重链等位基因的工程化形式，其中修饰被引入到表达重链分子的恒定结构域的重链区域中。两个工程化等位基因均能够在B细胞发育期间经历VDJ重排以产生重链多样性。工程化等位基因之一也能够表达可以生成前BCR信号的全长跨膜重链蛋白。另一工程化等位基因在这方面被禁用。
在该实施方案的一个方面，两个工程化等位基因携带一个或更多个位点特异性重组酶诸如Cre或Flp的识别序列(野生型或突变的)。识别位点以使得位点特异性重组改变基因座的恒定结构域编码部分的功能性的方式放置。即，如果等位基因能够表达完全功能性重链蛋白，则位点特异性重组剥夺该基因座的这一特性。相似地，如果等位基因不能表达完全功能性重链蛋白，则位点特异性重组赋予在该基因座上表达功能性重链的能力。
刚刚总结的位点特异性重组酶介导的改变通过缺失或倒位两个同源染色体上重链基因座的恒定结构域编码部分中的DNA片段来完成。在本发明的某些实施方案中，一个染色体上恒定结构域完全功能性的位点特异性重组酶依赖性损失伴随着另一个染色体上完全功能性的同步或接近同步的获得。在有利的方面，该位点特异性重组酶的表达处于来自在B细胞活化期间被诱导的基因诸如Cγ1或Aicda(活化诱导的脱氨酶)的启动子的控制下。
刚刚描述的转基因小鼠用允许表达对抗原特异性的抗体分子的B细胞的克隆扩增的抗原进行免疫。由于它们携带的重链基因修饰，对该抗原特异性的抗体包含由两个重链等位基因中的仅一个的重排形式编码的重链；即，由其恒定域编码部分的完全功能性定义的等位基因编码的重链。另一个等位基因缺乏此类功能性，并且因为这将不编码能够参与抗原特异性克隆扩增所必需的信号过程的重链。可以采用重复免疫接种以使克隆扩增和抗原特异性抗体多样性最大化。
在免疫接种方案已经完成之后，位点特异性重组被诱导，导致重链恒定结构域功能性从一个染色体转换至另一个染色体。作为该转换的结果，编码对免疫接种中使用的抗原特异性的抗体中的重链的等位基因被剥夺了恒定结构域完全功能性。同时或接近同时地，先前已经被剥夺恒定结构域完全功能性的等位基因现在获得了该功能性。通过功能性的该转换，参与应答免疫接种方案中使用的抗原的克隆扩增的细胞获得新的重链蛋白的表达。
在刚刚描述的诱导的位点特异性重组酶依赖性转换后，将小鼠用第二抗原进行免疫。应答第二抗原的克隆扩增取决于包含由第二等位基因编码的重链的抗体；即由于诱导的位点特异性重组酶事件获得恒定结构域功能性的等位基因编码的重链的抗体。如在第一种情况中一样，可以重复第二免疫接种以使克隆扩增和抗原特异性抗体多样性最大化。
表达对第二抗原特异性的抗体的克隆扩增的细胞包括先前已经参与应答第一抗原的克隆扩增的那些细胞。在第二克隆扩增期间，这些细胞不表达对第一抗原具有特异性的重链蛋白但反而表达来自第二等位基因的不同重链蛋白。它们表达的有助于对第二抗原的特异性的重链蛋白由由于诱导的位点特异性重组事件获得恒定结构域完全功能性的重链等位基因编码。
在第二免疫接种方案已经完成之后，采用杂交瘤或其他技术以分离对第一抗原和第二抗原两者特异性的B细胞。第二位点特异性重组酶事件可以被诱导以恢复携带对第一抗原的抗原特异性的等位基因上的完全功能性。例如，第二位点特异性重组酶的表达可以处于诱导型系统，诸如由他莫昔芬(Tamoxifen)或多西环素(doxycyline)可诱导的那些系统的控制下。通过该修饰，可以评价细胞表达两种不同抗体分子的能力：一个对第一免疫接种方案中使用的抗原具有特异性，并且另一个对第二免疫接种方案中使用的抗原具有特异性。
在第二位点特异性重组后，每一个重链等位基因上的组装的VDJ外显子现在以蛋白或蛋白结构域表达，所述蛋白或蛋白结构域是异二聚体(被称为异二聚体化物(heterodimerizer))的互补半部分。在有利的方面，异二聚体化物是突变体IgG1等位基因，其中编码两个等位基因的CH3结构域的第四外显子被突变，使得它们促进彼此的异二聚体化并且抑制同二聚体化。可选地，异二聚体化物对可以是非免疫球蛋白蛋白，诸如c-Fos和c-Jun(其在生理上异二聚体化以形成AP-1转录因子)、亮氨酸拉链或形成异二聚体的相似蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，等位基因排斥并非是在重链基因座处受损，而是在轻链基因座处受损。在本发明的该形式中，重链等位基因排斥是正常的。本发明的轻链等位基因相容形式在概念上相似于重链等位基因相容形式，具有相关同源轻链基因的恒定结构域编码部分中的类似修饰的特征。它使用相似的双重免疫接种方案与适当阶段的诱导型位点特异性重组步骤结合来开发。双特异性B细胞以与针对本发明的重链等位基因相容形式描述的类似的方式鉴定和/或分离。本发明的该轻链等位基因相容形式产生各自包含两个轻链蛋白和一个重链蛋白的双特异性抗体，而重链等位基因相容形式产生各自包含一个轻链蛋白和两个重链的双特异性抗体。
在可选的实施方案中，类似于关于重链等位基因相容刚刚描述的那些的策略被实施以生成产生由仅重链组成的双特异性抗体的B细胞。在该实施方案中，编码CH1结构域的外显子从两个重链等位基因中去除。由各自重链等位基因表达的无CH1多肽应该表现出很少(如果有的话)对轻链或替代轻链的存在以用于适当的蛋白折叠以及运输至细胞表面的依赖性(参见例如Feige等,Mol Cell 34:569–579(2009))。两个重链等位基因的可变基因区段可以来源于天然表达单链抗体的动物，诸如骆驼科动物(camelids)，或来源于具有或不具有改进VH结构域当在无轻链表达时的热稳定性的修饰的其他动物。
在该实施方案的一个形式中，重链等位基因被进一步修饰以限制同种型转换的程度，其中编码两个等位基因上的CH3或CH4二聚体化结构域的外显子被突变为与同二聚体化较不相容但彼此互补以用于异二聚体化。由任一个突变体等位基因表达的无CH1重链多肽单独不应该运输至细胞表面以介导等位基因排斥，因为突变抑制有效的重链同二聚体化。因此，成功的B细胞发育取决于来自两个突变体重链等位基因的无CH1重链的同时表达。
缺乏以上提及的CH1结构域编码外显子并且携带以上提及的CH3修饰的转基因小鼠用两种感兴趣的抗原同时进行免疫。可以采用重复免疫接种以使识别两种抗原的B细胞的克隆扩增最大化。在免疫接种方案已经完成之后，采用标准杂交瘤或其他技术以分离产生针对两种感兴趣的抗原的双特异性抗体的B细胞。
在该实施方案的可选的形式中，以类似于前述实施方案中描述的重链等位基因相容方案的诱导型方式，缺乏CH1结构域的重链的等位基因相容经由每一个突变体重链等位基因的顺序表达来实现。重链等位基因也被修饰为使得一个等位基因上符合读框的VDJ重排对于等位基因排斥失能，并且被保存用于在稍后B细胞发育阶段的表达。这相似地经由用DNA盒或通过倒位编码重链恒定区的一个或更多个外显子破坏一个重链等位基因的开放阅读框来实现。位点特异性DNA重组的诱导型事件同样被引入以使每一个突变体重链等位基因的表达交替。采用相似双重免疫接种方案随后是第二诱导型位点特异性重组步骤以获得双特异性B细胞。本发明的该重链等位基因相容形式产生各自包含两个重链而无轻链的双特异性抗体。
在其他可选的实施方案中，被修饰以用于允许由B细胞产生双特异性抗体的免疫球蛋白等位基因在等位基因排斥所必需的一个或更多个信号传导分子有缺陷的动物中实施。
在某些情况下，该方法对免疫球蛋白等位基因引入被设计为有利于双特异性抗体形成但对等位基因排斥具有最小影响的修饰。在一个具体方面，包含类似于熟知的“柞适配臼”突变的修饰的重链被引入至编码重链CH3结构域的外显子(参见例如Ridgway,等,Protein Eng 9:617-621(1996))。如果每一个修饰的重链单独表达，引入的修饰不完全抑制同二聚体的形成。由于一次仅一个免疫球蛋白等位基因重排，由第一重排等位基因表达的重链同二聚体可以保留等位基因排斥的能力。本发明在具有由前BCR或BCR的一个或更多个信号传导组分的缺陷引起的受损的等位基因排斥的动物或细胞中实施其本身对等位基因排斥具有最小的影响的此类免疫球蛋白等位基因修饰。此类突变体的一个实例是E2A缺陷的小鼠品系(参见例如Hauser等,Journal of Immunology 192:2460-2470(2014))。
携带以上提及的CH3修饰和有缺陷的前BCR或BCR信号传导组分的转基因小鼠用两种感兴趣的抗原同时进行免疫接种。可以采用重复免疫接种以使识别两种抗原的B细胞的克隆扩增最大化。在免疫接种方案已经完成之后，采用标准杂交瘤或其他技术以分离产生针对两种感兴趣的抗原的双特异性抗体的B细胞。
图1描绘了通常在人类和大多数脊椎动物中发现的两个重链等位基因(101和102)。每一个重链等位基因包含编码IgM的恒定区的Cμ外显子(108)上游的多个V(103)、D(104)、和J(105)基因。在每一个染色体上，调节元件诸如5’“内含子性”增强子(106)和转换区(107)也存在于J基因与第一个CH外显子之间。在优选的实施方案中，转基因小鼠的V、D和J基因区段是嵌合的，由人类编码区和小鼠非编码区组成。图中的标记的组分如下：重链基因座的染色体区段(101、102)；可变区基因区段(103)；D区基因区段(104)；J区基因区段(105)；重链“内含子性”增强子(106)；转换区(107)；编码IgM的恒定区的Cμ外显子(108)。
图2描绘了本发明对两个重链等位基因(201、202)实施以使B细胞允许等位基因相容的修饰的实例。在种系结构下，每一个重链等位基因包含未重排的V(203)、D(204)、和J(205)基因随后是编码IgG同种型的修饰的Cγ外显子(208和209)。在优选的实施方案中，转基因小鼠的V、D和J基因区段是嵌合的，由人类编码区和小鼠非编码区组成。在B细胞发育期间，随机选择的V、D和J基因组装(210)以形成VH外显子(211、212)。每一个重链等位基因的CH3外显子内的某些密码子被突变，使得编码的重链对于与彼此的异二聚体化相容(诸如突变体Cγ1，其两个重链等位基因的cDNA序列以[SEQ ID No.1和2]指定)。另外地，如果任一个等位基因单独表达，修饰引起翻译的重链多肽错误折叠。因此，除非突变体重链多肽由两个等位基因的同时表达形成异二聚体，否则前BCR不能形成和运输至质膜以介导等位基因排斥。在该实施方案的扩展形式中，结合以上提及的CH3突变，两个重链等位基因的CH1外显子内的某些密码子被相似地修饰，使得每一个重链可以与不同的轻链配对。尽管该图例示了使用突变体IgG重链抑制等位基因排斥以及便于重链异二聚体化，可以相似地采用其他同种型(即IgM、IgD、或IgA)。图中的标记的组分如下：修饰的重链等位基因的染色体区段(201、202)；可变区基因区段(203)；D区基因区段(204)；J区基因区段(205)；重链“内含子性”增强子(206)；转换区(207)；编码IgG突变体恒定区的Cγ外显子(208、209)；VDJ重组事件(210)；组装的VDJ外显子(211、212)。
图3描绘了啮齿动物中发现的两个同源染色体上的重链基因。(典型的人类重链基因座非常相似，但具有更多恒定区基因。)在该图中，与图1相比，两个重链等位基因(301、302)的V(303)和D(304)基因被压缩(以“n”表示)，以强调染色体的恒定区区域的结构。在优选的实施方案中，转基因小鼠的V(303)、D(304)和J(305)基因区段是嵌合的，由人类编码区和小鼠非编码区组成。IgM和IgD(308，单独CH外显子未示出)是由B细胞表达的第一同种型。编码其他抗体类别的CH外显子(309-314，单独外显子未示出)存在于更下游。在C57BL/6小鼠品系中，这些是Cγ3(309)、Cγ1(310)、Cγ2b(311)、Cγ2c(312)、Cε(313)、和Cα(314)。某些小鼠品系诸如BALB/c具有Cγ2a而不是Cγ2c。除了Cδ以外，同种型转换区(307)存在于每一个抗体类别的第一个CH外显子之前。图中的标记的组分如下：重链等位基因(301、302)；以方括号表示的V基因，“n”指多个数目的基因区段(303)；以方括号表示的D基因，“n”指多个数目的基因区段(304)；J基因(305)；重链“内含子性”增强子(306)；转换区(307)；Cμ和Cδ(308，单独外显子未示出)；IgG及其他抗体类别的CH外显子(309-314，单独外显子未示出)。
在图4中描绘了在VDJ重排已经发生以产生不同的VH外显子(403、404)之后的两个重链等位基因(401、402)，如同它们将在幼稚B细胞中被发现的。在等位基因401上，编码Cμ和/或Cδ的外显子(406)与重排的VDJ外显子(403)处于相同有义方向(下方箭头)。相比之下，在等位基因402上，Cμ和/或Cδ外显子(412)以相对于VDJ外显子(404)的相反方向(下方箭头)存在。因此，等位基因402不能表达全长重链多肽，因为其Cμ和/或Cδ外显子处于反义构型，并且正常B细胞发育依赖于来自等位基因401的功能性重链的表达。等位基因402中的反向Cμ和/或Cδ外显子(412)与两个相反定向的识别序列(409、410)直接侧接以用于位点特异性DNA重组。在等位基因401中，位点特异性DNA重组的两个识别序列(409、410)被置于离得更远，也处于相反方向：一个(409)在Cμ和/或Cδ外显子(406)的上游，另一个(410)在Cγ外显子(408)的下游。在对免疫原(414)的B细胞应答期间，等位基因401经历同种型转换，其使下游位点特异性DNA重组序列(410)更靠近其上游对应物(counterpart)(409)。当位点特异性DNA重组酶的表达被诱导(415)时，在两个等位基因上侧接其识别序列(409、410)的DNA区段经历不可逆的倒位，因为所得重组位点(416、417)不再胜任重组。等位基因402现在能够表达全长重链，而等位基因401通过其CH外显子的倒位而变得失活。在用第二抗原免疫接种(418)后，等位基因402经历同种型转换。两个等位基因的可逆DNA区段另外地侧接第二位点特异性DNA重组酶的识别序列(411)，其可以在杂交瘤生成之前或之后引入。在切离间插DNA片段后，两个等位基因(403、404)上的VDJ外显子现在与被修饰以与重链异二聚体化相容的下游CH外显子(413)一起表达。图中的标记的组分如下：重链等位基因(401、402)；组装的VDJ外显子(403、404)；重链“内含子性”增强子(405)；最初的相对于组装的VDJ外显子(403)处于有义方向(下方箭头)的Cμ和/或Cδ外显子(406)；转换区(407)；转换的同种型的CH外显子(408)；第一位点特异性重组酶的识别序列(409，该位点的序列处于与标记为410的位点的相反方向)；第二位点特异性重组酶的识别序列(411)；最初的相对于组装的VDJ外显子(404)处于相反方向(下方箭头)的Cμ和/或Cδ外显子(412)；与重链异二聚体化相容的修饰的外显子(413)；同种型转换后的抗原应答(414)；第一位点特异性DNA重组酶表达(415)；位点特异性DNA重组后的剩余DNA序列(416、417)；对第二免疫原的抗原应答和同种型转换(418)。
图5阐释了用于通过顺序重链表达的双特异性抗体产生的重链等位基因的可选修饰。示出了在VDJ重排已经发生以产生不同的VH外显子(503、504)之后的两个重链等位基因(501、502)，如同它们将在幼稚B细胞中被发现的。在等位基因501上，侧接位点特异性DNA重组酶的两个相反定向的识别序列(509、510)的DNA盒(512)被插入于J基因的下游、编码Cμ和/或Cδ恒定结构域的外显子(506)之前。DNA盒(512)相对于组装的VDJ外显子(503)处于相反方向(下方箭头)并且包含以下中的一个或更多个：剪接受体、核糖体跳跃序列或IRES、开放阅读框、终止密码子或聚腺苷酸化信号序列。相似的DNA盒(514)也被插入于等位基因502上的类似区域处，但处于与重排的VDJ外显子(504)相同的有义方向(下方箭头)。等位基因502不能表达全长重链，因为DNA盒(514)在VDJ外显子(504)后破坏其开放阅读框。相比之下，等位基因501可以表达全长重链，因为倒位的DNA盒不破坏其开放阅读框。两个等位基因的IgG外显子的下游是第二DNA重组酶的识别位点(511)。同样在两个等位基因上，第二DNA重组酶的另一个位点(511)被插入于第一DNA重组酶的识别位点(509)的上游。在对免疫原(515)的B细胞应答期间，等位基因501经历同种型转换。当第一位点特异性DNA重组酶的表达被诱导时(516)，两个等位基因上的DNA盒(512、514)经历不可逆的倒位，因为所得重组位点(517、518)不再胜任重组。等位基因502现在能够表达全长重链，因为DNA盒(514)现在处于相反方向并且不再破坏重链开放阅读框。相比之下，等位基因501的开放阅读框被与其VDJ外显子(503)处于相同方向的DNA盒(512)破坏。在用第二抗原免疫接种(519)后，等位基因502经历同种型转换。当在杂交瘤生成之前或之后引入第二位点特异性DNA重组酶的表达时，间插DNA片段(512、514)现在在其同源(cognate)识别序列(511)处被切离。随后，两个等位基因(503、504)上的VDJ外显子现在与被修饰以用于重链异二聚体化的CH外显子(513)一起表达。图中的标记的组分如下：重链等位基因(501、502)；组装的VDJ外显子(503、504)；重链“内含子性”增强子(505)；Cμ和/或Cδ外显子(506)；转换区(507)；转换的同种型的CH外显子(508)；第一位点特异性重组酶的识别序列(509，该位点的序列处于与标记为510的位点的相反方向)；第二位点特异性重组酶的识别序列(511)；最初的相对于VDJ外显子(503)处于相反方向(下方箭头)的DNA盒(512)；与重链异二聚体化相容的修饰的外显子(513)；最初的相对于VDJ外显子(504)处于有义方向(下方箭头)的DNA盒(514)；同种型转换后的抗原应答(515)；第一位点特异性DNA重组酶表达(516)；位点特异性DNA重组后的剩余DNA序列(517、518)；对第二免疫原的抗原应答和同种型转换(519)。
图6阐释了用于诱导型双特异性抗体产生的重链等位基因的修饰。在种系结构中，一个重链等位基因(601)包含未重排的V(603)、D(604)和J(605)基因，随后是侧接位点特异性DNA重组酶的两个识别序列(609)的Cμ和/或Cδ外显子(608)。在另一个重链等位基因(602)上，侧接相同位点特异性DNA重组酶的两个识别序列(609)的处于有义方向(下方箭头)的DNA盒(610)被插入于V、D和J基因的下游。在优选的实施方案中，转基因小鼠的V、D和J基因区段是嵌合的，由人类编码区和小鼠非编码区组成。DNA盒包含以下中的一个或更多个：剪接受体、核糖体跳跃序列或IRES、开放阅读框、终止密码子或聚腺苷酸化信号序列。另外地，重链等位基因包含用于异二聚体化的对CH外显子的相同修饰(611和612)，如图2中描述的那些(图2中的208和209)。在VDJ重组事件(614)后，等位基因601上的符合读框的VH外显子(615)的成功组装导致全长重链的正常表达。相比之下，等位基因602上的DNA盒(610)防止任何成功的VDJ重排(616)能够表达全长重链多肽。在位点特异性DNA重组酶基因(617)表达后，第一等位基因(601)上的CH外显子(608)以及第二等位基因(602)上的DNA盒(610)被从染色体上切离。两个等位基因上的VDJ外显子(615、616)现在可以与包含有助于重链异二聚体化的修饰的下游CH外显子一起表达。图中的标记的组分如下：修饰的重链等位基因(601、602)；以方括号表示的V基因，其中“n”指多个基因区段的存在(603)；以方括号表示的D基因，其中“n”指多个基因区段的存在(604)；J基因(605)；重链“内含子性”增强子(606)；转换区(607)；Cμ和/或Cδ外显子(608)；位点特异性DNA重组酶的识别序列(609)；以由下方箭头指示的有义方向的DNA盒(610)；突变体Cγ1外显子(611；612)；重链3’增强子(613)；VDJ重组事件(614)；组装的VDJ外显子(615、616)；位点特异性DNA重组酶的活化(617)。
转基因细胞文库
本发明的转基因细胞可以用于产生表达文库，优选地低复杂性文库，用于鉴定浆细胞表面上感兴趣的抗体。本发明因此还包括使用本发明的细胞技术产生的抗体文库，用于鉴定浆细胞上表达的抗原特异性抗体。
转基因动物
在本发明的具体方面，本发明提供了携带工程化的重链或轻链基因的转基因动物。
在某些实施方案中，本发明的转基因动物还包含人类免疫球蛋白区。例如，已经开发了用于用人免疫球蛋白序列代替内源小鼠免疫球蛋白区以产生用于药物发现目的的部分或完全人类抗体的许多方法。此类小鼠的实例包括以下中描述的那些：例如，美国专利第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；和第5,591,669号。
在特别优选的方面，本发明的转基因动物包含嵌合免疫球蛋白区段，如在Wabl和Killeen的共同待决申请美国公布第2013/0219535号中描述的。此类转基因动物具有包含引入的部分地人类免疫球蛋白区(partially human immunoglobulin region)的基因组，其中所引入的区包含人可变区编码序列和基于非人类脊椎动物的内源基因组的非编码可变序列。优选地，本发明的转基因细胞和动物具有其中部分或所有内源免疫球蛋白区被去除的基因组。
在抗体产生中的用途
体外培养细胞一直是许多治疗性生物技术产品生产的基础，并且涉及在细胞中产生蛋白产物并且释放到支持培养基中。由培养中生长的细胞随时间推移的蛋白产生的数量和质量取决于许多因素，诸如例如细胞密度、细胞周期阶段、蛋白的细胞生物合成速率、用于支持细胞存活力和生长的培养基的条件、以及培养中的细胞的寿命。(参见，例如，Fresney,Culture of Animal Cells,Wiley,Blackwell(2010)；以及Cell CultureTechnology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,Ozturk和Ha,编著,CRCPress,(2006))。
本发明提供了来源于免疫接种方案的B细胞的来源，其中动物用两种或更多种抗原同时攻击，或首先用一种抗原攻击并且然后稍后用另一种抗原攻击。在两种情况下，可以采用多次免疫接种以增加单独动物中的抗原特异性抗体滴度。两个免疫接种系列之间包括诱导型位点特异性重组步骤。在最后的免疫接种方案后，B细胞被分离并且培养或用于产生杂交瘤，或用作用于克隆免疫球蛋白链基因的RNA来源。测试B细胞或它们包含的抗体链的双特异性抗原结合特性。在杂交瘤的情况下，这通过以下来完成：对杂交瘤直接筛选双特异性抗体、或筛选针对一种抗原的特异性，并且然后进一步分析它们是否携带赋予针对第二种抗原的特异性的另外的重排免疫球蛋白链基因，即，它们是否具有潜在的或表达的双特异性。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意图限制发明人认为是他们的发明的范围，它们也不意图代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域技术人员将理解，可以对如具体实施方案中示出的发明作出许多变化和/或改变而不脱离如所广泛描述的本发明的精神或范围。因此，所列出的实施方案在所有方面被认为是说明性的而非限制性的。
已经作出了努力以确保关于使用的术语和数字(例如，载体、量、温度，等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是按重量计份数，分子量是加权平均分子量，温度以摄氏度计，并且压力处于大气压下或临近大气压。
实施例1.允许在用两种或更多种抗原同时免疫接种后分离双特异性抗体的工程化重链等位基因。生成携带缺乏同种型转换能力的两个修饰的重链等位基因的转基因小鼠(如图2中描绘的)。两个等位基因可以经历VDJ重组。在优选的实施方案中，IgG1重链而非IgM重链在B细胞发育期间表达，但可以采用包括IgM的任何其他同种型。仅表达IgG1的B细胞发育非常正常并且在免疫接种期间应答于抗原(参见，例如，Waisman,等,Journal ofExperimental Medicine 204:747-758(2007))。
两个IgG1等位基因的第四个外显子(其编码CH3结构域)被突变，使得它们促进重链异二聚体的形成并抑制同二聚体化。在优选的方法中，突变是在一个重链等位基因上的D276K、E233K、和Q234K；以及在另一个重链等位基因上的K286D、K269D、和T247D(氨基酸编号开始于CH1的第一个密码子)。在人类IgG1重链中相似位置处的突变已经被证明促进异二聚体化和细胞系中双特异性抗体的分泌(参见例如Gunasekaran等,Journal ofBiological Chemistry 285:19637-19646(2010))。
在B细胞发育期间，已经重排仅一个重链等位基因的前B细胞在发育中被阻断，因为突变体IgG1重链不能有效地同二聚体化以形成前BCR。因此，被转导的信号不足以介导等位基因排斥，并且表达突变体Cγ1的第二重链等位基因变得允许VDJ重组。仅当两个突变体重链共表达并且异二聚体化形成前BCR时，发育中的B细胞可以进展超出前B细胞阶段。
最终，优选的方法的转基因小鼠中的成熟B细胞携带每个细胞两个功能性重链与一个轻链。转基因小鼠可以用于用两种或更多种感兴趣的抗原同时免疫接种，随后使用标准方法生成杂交瘤。来源于转基因小鼠的杂交瘤允许直接分离双特异性抗体。
在该实施例1的重链等位基因的示例性实施方案中，两个重链等位基因(201、202)的V(203)、D(204)、和J(205)基因包含具有小鼠调节序列的人类编码序列，并且在Wabl和Killeen的共同待决申请美国公布第2013/0219535号中描述。重链“内含子性”增强子(206)以及所有下游元件的序列，包括在野生型小鼠中发现的重链恒定区基因在LOCUS:NG_005838(1..180,971)中描述。在该实施例1中，包含所有同种型的CH外显子的跨越8,608..175,134的序列从两个重链等位基因中缺失，并且被修饰的Cγ1外显子(图2中的元件208和209)代替。元件208和209两者的外显子4被突变以相对于与自身二聚体化有利于彼此异二聚体化。两个重链等位基因的突变体Cγ1cDNA序列以[SEQ ID No.1和2]指定以及重链等位基因的野生型cDNA序列以[SEQ ID No.3]指定。
实施例2.允许在顺序免疫接种后分离双特异性抗体的工程化重链等位基因。
生成携带可以通过位点特异性DNA重组打开或关闭的重链等位基因的转基因小鼠。其中一个等位基因能够在有效VDJ重排之后表达全长重链，而另一个等位基因缺乏该功能性。
两个等位基因包含位于恒定结构域编码区域内的一个或更多个位点特异性重组酶的识别序列。这些位点处的位点特异性重组引起两个等位基因中的一段DNA倒位，并且由于该倒位，等位基因中的恒定结构域功能性被改变。
位点特异性重组将表达全长重链蛋白的能力赋予最初缺乏该能力的等位基因。相比之下，位点特异性重组将该能力从最初具有它的等位基因中去除。
图4中描绘了该实施方案的一种形式，其中相关的位点特异性重组序列被标记为409和410，并且其中恒定结构域编码外显子被标记为406和412。恒定结构域编码外显子的转录方向由被标记的组分下方紧邻的箭头描绘。
图4示出了处于在VDJ重排已经发生以生成VH外显子(403和404)之后的构型的两个等位基因。然而，图4中描绘的等位基因的VDJ重排可以导致任一个等位基因上的非有效基因区段连接(join)。相似地，该过程也可以导致任一个等位基因上的有效重排。如果B细胞表达来自等位基因401的全长重链分子，则它们仅在骨髓中完成它们的发育，因为即使等位基因402可以经历有效VDJ重组，它也不能表达全长重链，因为所有或部分Cμ和/或Cδ外显子处于相反方向。
在携带图4中示出的等位基因的小鼠中发育的外周B细胞表达包含来源于等位基因401的重链的B细胞抗原受体(跨膜的或分泌的)。这些B细胞抗原受体中的轻链来源于其轻链基因座之一处的正常独立VJ重排。
携带图4中示出的等位基因的小鼠的免疫接种导致表达对免疫原特异性的抗体的B细胞的克隆扩增。至关重要地，再一次，这些抗体仅包含来源于等位基因401的重链。重复免疫接种导致相似于正常小鼠中发生的增强的克隆扩增、体细胞高频突变和同种型转换(图4中显示为414)。
存在或可以被容易工程化允许在包括B淋巴细胞的多种细胞类型中特定的位点特异性DNA重组酶的诱导型表达的转基因小鼠系统。在本发明方法的又另一个实施方案中，携带图4中描绘的突变体等位基因401和402的转基因小鼠另外地携带诱导型位点特异性重组酶系统，诸如他莫昔芬诱导型系统。引起已经对免疫接种中使用的抗原产生可证明的抗体应答的免疫小鼠表达相关的位点特异性重组酶。
在表达位点特异性DNA重组酶(图4中的415)后，侧接用于诱导的DNA重组酶的位点的染色体区段在两个等位基因上经历倒位。所得特征是失去了在等位基因401上表达全长重链的能力。同时，等位基因402获得表达全长重链的能力。
等位基因402在应答于免疫接种已经经历克隆扩增的B细胞中的一些中被有效地重排。此类第二等位基因有效重排的频率通常比正常情况的高得多，因为该等位基因在B细胞发育期间不表达全长重链，但它仍然能够经历VDJ重排。
携带图4中描绘的新活化的等位基因402的小鼠的免疫接种导致表达对免疫接种中使用的抗原特异性的B细胞抗原受体的B细胞的克隆扩增。这些B细胞抗原受体(跨膜的或分泌的)仅包含来源于等位基因402的重链。重复免疫接种导致相似于正常小鼠中发生的增强的克隆扩增、体细胞高频突变和同种型转换。
对第二免疫接种中使用的抗原特异性的B细胞包括尚未经历应答于第一抗原的克隆扩增的一些细胞。此类B细胞不是能够识别两次免疫接种中使用的抗原的双特异性抗体的期望来源。
然而，对第二抗原特异性的B细胞的一些级分已经参与应答于第一抗原的克隆扩增。这些B细胞是双特异性抗体的明显来源，因为它们的重排重链基因中的一个携带对第一免疫原的特异性，同时其另一个重排重链基因携带对第二免疫原的特异性。在这两种情况下，单独B细胞将一个轻链蛋白与两个重链蛋白配对。
可以利用杂交瘤或其他克隆技术来回收对第二免疫抗原具有特异性的B细胞。然后分析这些B细胞以确定它们是否还携带赋予针对第一免疫抗原的特异性的重排重链基因。
实施例3.允许在顺序免疫接种后分离双特异性抗体的可选的工程化重链等位基因。这里描述的方法非常相似于实施例2中描述的那些方法。转基因小鼠被工程化为携带可以通过位点特异性DNA重组酶系统打开或关闭的两个重链免疫球蛋白等位基因。两个等位基因被设计为用于相似于实施例2中描述的顺序免疫接种方案，并且因此具有在其恒定结构域区域中的基本上相同类型的功能性的特征。等位基因的不同之处在于包含被设计为改进分离期望种类的双特异性B细胞的效率的元件。
在图5中描绘了该实施方案。在两个工程化重链等位基因中的一个(等位基因501)上，侧接位点特异性DNA重组酶的两个识别序列(509和510)的DNA盒(512)被插入在重链增强子(505)之后，但在Cμ外显子(506)前的转换区(507)之前，使得重链增强子(505)在同种型转换之后保留在基因组中。在第二个重链等位基因(等位基因502)上，相似的元件被插入于类似的位置处，但处于相反方向(下方箭头)。DNA盒被设计为当与组装的VDJ外显子以相同的转录方向排列时破坏重链外显子的开放阅读框。
在一个实施方案中，等位基因501包含以与VH外显子相反方向排列的来自鼠(murine)整联蛋白β-7(Itgb7)基因的外显子15和16。两个Itgb7外显子均包含剪接受体。另外地，Itgb7外显子15携带终止密码子，而Itgb7外显子16包含终止密码子以及聚腺苷酸化信号序列。由于倒转的转录方向，该DNA盒不干扰由等位基因501上符合读框的VDJ重组的重链表达。
在优选的结构中，等位基因502中插入的DNA盒包含来自基因的开放阅读框，所述基因为已经由VDJ重组成功组装符合读框的VH外显子的B细胞提供存活、功能性或选择优势。此类基因的一个实例是抗凋亡B细胞淋巴瘤-2(Bcl2)。有利基因的开放阅读框以与重链mRNA相同的转录方向排列。为了防止该基因被表达为与VH外显子融合的蛋白，将核糖体跳跃序列(诸如来自细小核糖核酸病毒(picornavirus)的2A肽)置于剪接受体与有利基因的开放阅读框之间。2A肽还确保有利基因仅在已经成功组装符合读框的VH外显子的B淋巴细胞中表达，且不在缺乏有效VDJ重排的B细胞中表达。
在一个示例性实施方案中，两个重链等位基因(501、502)上的组装的VDJ基因(503、504)来源于包含具有小鼠调节序列的人类编码序列的单独基因区段，并且在Wabl和Killeen的共同待决申请美国公布第2013/0219535号中描述。下游的所有内源序列(包括重链恒定区基因)在LOCUS:NG_005838(1..180,971)中描述。Itgb7和Bcl2DNA盒(分别是元件512和514)的序列以[SEQ ID No.4和5]指定，并且被插入于基因座的位置178,000附近，在重链“内含子性”增强子与第一外显子Cμ外显子的转换区之间。在该实施方案中，第一位点特异性DNA重组酶的识别序列(元件509和510)是lox66和lox71(参见，例如，Oberdoerffer等,Nucleic Acids Res 31:e140(2003))。还在该实施方案中，第二位点特异性DNA重组酶的识别序列(元件511)是由Flp酶使用的那些(参见例如McLeod等,Mol Cell Biol6:3357-3367(1986))。在该实施方案中，异二聚体(在每一个重链等位基因上的元件513)是被设计为相对于自身二聚体化有利于彼此异二聚体化的突变体Cγ1。两个重链等位基因的突变体Cγ1cDNA序列以[SEQ ID No.1和2]指定。
如在实施例2中，在第一次免疫接种后，等位基因501可以正常应答于抗原，因为倒位的Itgb7盒对重链基因座的转录活性不具有影响。因为第二DNA盒中断了等位基因502的重链开放阅读框，在第一次免疫接种后未从等位基因502中选择到对免疫原的特异性。
在位点特异性DNA重组酶的表达(516)后，两个重链等位基因上的DNA盒被倒位。等位基因501中的Itgb7基因盒的开放阅读框现在与重链mRNA处于相同的转录方向。有效地，Itgb7基因的终止密码子和聚腺苷酸化信号序列阻止了来自等位基因501的全长重链的表达。
相比之下，等位基因502现在可以表达全长重链，因为插入的有利基因的开放阅读框不再与重链mRNA处于相同的方向。随后等位基因502可以在第二次免疫接种中应答免疫原。
可以利用杂交瘤或其他克隆技术来回收对第二免疫抗原具有特异性的B细胞。然后可以分析这些B细胞以确定它们是否还携带赋予针对第一免疫抗原的特异性的重排重链基因。
实施例4.允许在用两种或更多种抗原同时免疫接种后分离双特异性抗体的可选的工程化重链等位基因。该实施例4的方案在图6中描绘，并且包含实施例1以及实施例3两者的一些元件。转基因小鼠被工程化为携带缺乏通过正常手段进行同种型转换能力的两个修饰的重链等位基因。在一个重链等位基因(图6中的601)上，Cμ和/或Cδ重链外显子侧接位点特异性重组酶的直接定向识别序列。更下游的是包含用于重链间异二聚体化(如关于图2和实施例3中的等位基因201描述的)的CH3突变的Cγ1外显子，诸如关于如以[SEQ ID No.1和2]指定的两个重链等位基因的突变体Cγ1cDNA序列。等位基因601可以支持正常的B细胞发育，因为其由组装的VH外显子转录的开放阅读框不被位点特异性DNA重组酶的识别序列中断。在第二重链等位基因(图6中的602)上，侧接相同位点特异性DNA重组酶的直接定向识别序列(609)的DNA盒(610)被插入于J基因(605)的下游。因此，等位基因602上的符合读框的VDJ装配被剥夺了表达全长重链的能力，因为DNA盒(610)被设计为破坏其开放阅读框。这些元件的更下游是包含互补CH3突变的Cγ1外显子，用于与由等位基因601编码的突变体IgG1重链的异型缔合。
在优选的结构中，如在实施例3中，等位基因602中的插入的DNA盒包含来自基因的开放阅读框，所述基因为已经由VDJ重组成功组装符合读框的VH外显子的B细胞提供存活、功能性或选择优势。DNA盒还在有利基因开放阅读框前包含剪接受体和2A肽序列。至关重要地，2A肽还确保有利基因仅在已经成功组装符合读框的VH外显子的B淋巴细胞中表达，且不在缺乏有效VDJ重排的B细胞中表达。
当位点特异性DNA重组酶的表达被引入时，侧接位点特异性DNA重组酶的识别序列的间插DNA区段从两个重链等位基因切离。随后，两个重链现在均能胜任全长重链表达。如实施例1中描述的，两个突变体IgG1重链的细胞表面表达和分泌彼此相互依赖。任一个突变体重链等位基因单独的表达可能导致B细胞死亡，因为BCR的细胞表面表达对于成熟B细胞的存活也是必需的(参见例如Lam等,Cell 90:1073-1083(1997))。
如在实施例1中，此实施例的转基因小鼠中的成熟B细胞携带每个细胞两个功能性重链与一个轻链。随后转基因小鼠可以用于用两种或更多种感兴趣的抗原同时免疫接种。携带双特异性抗体的杂交瘤使用标准方法产生。
例如，在示例性实施方案中，两个重链等位基因(601、602)的V(603)、D(604)、和J(605)基因包含具有小鼠调节序列的人类编码序列，如在Wabl和Killeen的共同待决申请美国公布第2013/0219535号中描述的。重链“内含子性”增强子(606)以及所有下游元件的序列，包括在野生型小鼠中发现的重链恒定区基因在LOCUS:NG_005838(1..180,971)中描述。在等位基因601上，包含所有下游同种型的Cδ和CH外显子的跨越8,608..168,728的序列被缺失。另外地，等位基因601的Cμ外显子(该基因座的171230..175134)侧接两个直接定向的标准loxP位点。在等位基因602上，包含所有同种型的CH外显子的跨越基因座的8,608..175,134的序列被缺失。侧接两个直接定向的loxP位点的Itgb7DNA盒被插入于基因座的位置178,000附近。两个等位基因上的3'loxP位点的下游是修饰的Cγ1外显子的序列(元件611、612)。元件611和612两者的外显子4被突变以相对于自身二聚体化有利于彼此异二聚体化。两个重链等位基因的突变体Cγ1cDNA序列以[SEQ ID No.1和2]指定。
前述仅仅阐释了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出多种排布形式，尽管本文未明确描述或显示，这些排布形式体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于此类具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述预期包括其结构和功能等同物两者。另外，预期此类等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,的手段加功能的限定。
序列表
<110> 特里安尼公司
<120> 增强的免疫球蛋白产生
<130> TRIA009PCT2
<140> 同此提交
<141> 2016-08-24
<150> 62/209267
<151> 2015-08-24
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
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<210> 4
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体、具有终止密码子的小家鼠Itbg外显子15、
小家鼠Itgb7内含子、具有终止密码子非翻译区的小家鼠
Itgb7外显子以及聚腺苷酸化序列的融合
<400> 4
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cacgaagggc tggtccttcc ataataa 627
<210> 5
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体、接头、PTV-1-2A肽、
小家鼠Bcl2开放阅读框、小家鼠3'
非翻译区域和聚腺苷酸化信号的融合构建体
<400> 5
cagggatccg gagccacgaa cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac 60
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Claims (20)
1.一种遗传修饰的动物，具有受损的免疫球蛋白重链基因等位基因排斥，允许选择各自能够共表达每个细胞两种或更多种不同抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的动物，其中所述免疫球蛋白重链基因的一个或更多个恒定区编码部分内的外显子被改变，使得在发育中的B淋巴细胞中在V(D)J重排后不发生等位基因排斥。
3.根据权利要求1所述的遗传修饰的动物，其中对所述免疫球蛋白重链基因的改变允许所述免疫球蛋白重链基因的一个或更多个恒定区编码部分中的一个或更多个外显子的表达的诱导型失活和/或活化。
4.来自根据权利要求1所述的遗传修饰的动物的免疫球蛋白重链基因，其中一个或更多个恒定区外显子的部分或全部相对于同一免疫球蛋白重链基因中重排的V(D)J基因区段以倒位阅读框方向放置。
5.来自根据权利要求1所述的遗传修饰的动物的免疫球蛋白重链基因，其中DNA盒被插入以防止来自在同一染色体上的重排的V(D)J基因区段的恒定区外显子的表达。
6.根据权利要求1所述的遗传修饰的动物，当用两种不同的抗原同时、或者用一种抗原随后第二种不同抗原注射时，所述遗传修饰的动物生成各自能够共表达或顺序表达两种或更多种不同的抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。
7.来自根据权利要求6所述的遗传修饰的动物的B细胞，其中所述两种抗原受体的异二聚体化由发育或分化事件实现，或者可以被诱导。
8.根据权利要求1所述的遗传修饰的动物，其中所述动物中单独B细胞中的两种重排免疫球蛋白重链基因表达彼此不能有效地同二聚体化的基因产物。
9.来自根据权利要求8所述的遗传修饰的动物的B细胞，其中所述两种不同重链基因产物的同二聚体化不发生，或相对于异二聚体化是不利的。
10.一种遗传修饰的动物，具有受损的免疫球蛋白轻链基因等位基因排斥，允许选择各自能够共表达每个细胞两种或更多种不同抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。
11.根据权利要求10所述的遗传修饰的动物，其中所述动物的免疫球蛋白轻链基因中的一个或更多个内的恒定区编码外显子被改变，使得在发育中的B淋巴细胞中在VJ重排后不发生等位基因排斥。
12.根据权利要求10所述的遗传修饰的动物，其中对所述遗传修饰的动物的免疫球蛋白轻链基因中的一个或更多个的改变允许免疫球蛋白重链基因的恒定区编码部分的表达的诱导型失活和/或活化。
13.一种根据权利要求10所述的遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中一个或更多个恒定区外显子的部分或所有相对于同一免疫球蛋白轻链基因中重排的VJ基因区段以倒位阅读框方向放置。
14.一种根据权利要求10所述的遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中DNA盒被插入以防止来自在同一染色体上的重排的VJ基因区段的恒定区外显子的表达。
15.一种根据权利要求10所述的遗传修饰的动物中的免疫球蛋白轻链基因，其中恒定区外显子被修饰以对与在同一细胞中的一个但非两个重链等位基因缔合相容。
16.根据权利要求10所述的遗传修饰的动物，当用两种不同的抗原同时、或者用一种抗原随后第二种不同的抗体注射时，所述遗传修饰的动物将生成各自能够共表达或顺序表达每个细胞两种或更多种不同的抗原受体和/或双特异性抗原受体的B淋巴细胞。
17.来源于根据权利要求10所述的遗传修饰的动物的原代B细胞、永生化B细胞或杂交瘤。
18.根据权利要求1所述的遗传修饰的动物，其中对所述免疫球蛋白重链基因的改变允许产生由仅重链组成的双特异性抗体。
19.由根据权利要求4和5中任一项所述的免疫球蛋白重链基因或根据权利要求13-15中任一项所述的免疫球蛋白轻链基因转录的部分或完整免疫球蛋白。
20.来源于根据权利要求7、9和17中任一项所述的细胞的部分或完整免疫球蛋白。
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