KR20180038055A - 면역글로불린의 강화된 생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 공학처리된 면역글로불린 대립유전자를 포함하는, 세포, 트랜스제닉 포유동물을 포함하는 트랜스제닉 동물 및 특히 설치류를 제공한다. 대립유전자의 돌연변이는 대립유전자 배제를 손상시키고 이중특이적 항체의 분리에 이용될 잠재력을 갖도록 설계된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2015년 8월 24일 출원된 USSN 62/209,267호에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 인간 치료제의 개발을 위한 트랜스제닉 동물에서 이중특이적 항체의 생산을 포함하는, 면역글로불린 분자의 생산에 관한 것이다.
발명의 배경
하기 논의에서, 배경 및 서론의 목적으로 특정 문헌 및 방법이 기재된다. 본원에 포함된 어떤 것도 종래 기술의 "용인(admission)"으로 간주되어선 안된다. 출원인은 적절한 경우 본원에 참조된 문헌 및 방법이 적용가능한 법정 규정하에서 종래 기술을 구성하지 않는 것을 입증할 권리를 명백히 보유한다.
모노클로날 항체는 다양한 병인의 인간 질병의 치료를 위한 중요한 부류의 치료 분자로서 주목받아 왔다. 인간뿐 아니라 대부분의 척추 동물에서, 항체는 동일한 경쇄(L)와 각각 쌍을 이루는 2개의 동일한 중쇄(H)의 이합체로서 존재한다. 각 H 및 L 사슬의 N-말단은 함께 H-L 쌍에 고유한 항원-결합 특이성을 제공하는 가변 도메인(각각 VH 및 VL)으로 구성된다. 따라서, 각 항체는 2개의 동일한 항원-결합 부위로 구성되며 단일특이적이다.
항체 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 엑손은 종자세포(germline) DNA에는 존재하지 않는다. 대신, 각 VH 엑손은 H 사슬 유전자좌에 존재하는 무작위 선택된 V, D, 및 J 유전자의 재조합에 의해 생성된다; 마찬가지로, 개개 VL 엑손은 경쇄 유전자좌에 존재하는 무작위 선택된 V 및 J 유전자의 염색체 재배열에 의해 생산된다. 인간 유전체는 H 사슬을 발현시킬 수 있는 2개의 대립유전자(부모 각각으로부터의 1개의 대립유전자), 카파(κ) L 사슬을 발현시킬 수 있는 2개의 대립유전자 및 람다(λ) L 사슬을 발현시킬 수 있는 2개의 대립유전자를 함유한다. H 사슬 유전자좌에는 여러 V, D, 및 J 유전자가 있으며 둘 모두의 L 사슬 유전자좌에도 여러 V 및 J 유전자가 있다. 각각의 면역글로불린 유전자좌에 있는 J 유전자의 다운스트림에는 항체의 불변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 엑손이 존재한다. 중쇄 유전자좌에는 상이한 항체 부류(아이소형)의 발현을 위한 엑손도 존재한다. 유전체에서 여러 면역글로불린 대립유전자의 존재에도 불구하고, 각 B 세포는 대립유전자 배제(allelic exclusion)라고 불리는 과정에 의해 한 번에 하나 초과의 기능적 중쇄 및 하나의 기능적 경쇄를 발현하지 못한다.
B 세포 발달 동안, V(D)J 유전자 재조합은 H 사슬 유전자를 함유하는 2개의 동종 염색체 중 하나에서 먼저 일어난다. 생성된 VH 엑손은 이후 RNA 수준에서 H 사슬의 불변 영역(CH)을 인코딩하는 엑손으로 스플라이싱된다. 전장 H 사슬은 이제 VDJ 유전자 재배열 이후 형성된 VH 엑손이 CH 엑손과 인-프레임(in-frame)인 경우에만 발현될 수 있다. H 사슬 폴리펩티드가 세포질세망(ER)에서 번역되면, 이들은 막-결합된 동종이합체를 형성하고 VpreB 및 λ5 단백질과 쌍을 이루어 pre-B 세포 수용체(pre-BCR) 복합체를 형성한다. VpreB 및 λ5는 함께 대리 L 사슬 역할을 하며, 적절하게 폴딩된 pre-BCR만이 ER로부터 세포 표면으로 수송될 수 있다. 아직 충분히 이해되어 있지 않은 메커니즘에 의해, 충분한 수의 pre-BCR이 세포 표면에 도달하면, 신호전달 캐스케이드가 촉발되어, 재조합효소 활성화 유전자(RAG)의 효소가 동종 염색체 상의 제2 중쇄 대립유전자의 V, D, 및 J 유전자의 재조합을 진행하는 것을 막는다. 대조적으로, 비기능적 중쇄 유전자가 제1 중쇄 대립유전자로부터 생성되면, pre-BCR은 형성되지 않고 제2 H 사슬 대립유전자는 이제 VDJ 재조합을 허용한다. 따라서, H 사슬 대립유전자 배제는 세포 표면 pre-BCR로부터의 신호전달에 의해 매개된다. 이것은 Cμ 중쇄 막통과(trasmembrane) 엑손의 손실이 심각하게 손상된 중쇄 대립유전자 배제를 발생시키는 B 세포에 의해 가장 잘 예시된다(Kitamura and Rajewsky, Nature 356:154-156 (1992)).
기능적 H 사슬의 생산을 위한 VDJ 유전자 재배열의 성공적인 완료시, VJ 재조합은 유사하게 정연한 방식으로 L 사슬 유전자좌 중 하나에서 일어난다. 인간 및 마우스 둘 모두에서, κ L 사슬 유전자좌는 λ L 사슬 유전자좌 앞에 재배열되는 경향이 있다. VJ 재배열은 기능적 L 사슬이 생산될 때까지 한 번에 하나의 L 사슬 대립유전자에서 일어나고, 그 후 L 사슬 폴리펩티드는 이제 H 사슬 동종이합체와 회합될 수 있다. pre-BCR 어셈블리의 경우와 마찬가지로, L 사슬과 각각 쌍을 이루는 동종이합체 H 사슬로 구성된 기능적 B 세포 수용체(BCR)만이 형질막으로 이동하여 추가 B 세포 발달에 필요한 신호를 매개할 수 있다. 세포 표면 BCR 신호는 또한 임의의 추가 L 사슬 재배열을 막기 위해 효과적으로 RAG 발현을 끊는다. 따라서, 형질막에 대한 중쇄 발현은 H 및 L 사슬 유전자좌 둘 모두에서 대립유전자 배제를 매개하는데 필요하다.
H 및 L 사슬 유전자좌에서의 대립유전자 배제 때문에, 각 B 림프구는 단일특이적 항체만을 생산할 수 있다. 그러나, 치료학적으로, 항체 분자 당 2개의 상이한 항원-결합 부위를 갖는 인위적으로 공학처리된 항체는 많은 질병의 치료법으로서 효과적인 것으로 입증되었다. 그러한 이중특이적 항체의 생성은 통상적으로 두 별개의 관심 항원 각각에 대한 단일특이적 항체를 스크리닝하고, 동정하고, 분리하는데 시간-소모적인 별도의 노력을 수반한다. 이어서, 이중특이적 항체의 한 절반으로서 공학처리되기 위해 각 후보 모노클로날 항체의 H 및 L 사슬을 인코딩하는 유전자가 클로닝되고, H 사슬들 간 또는 H와 L 사슬 간의 이종 회합을 허용하기 위해 변형된다. 추가 평가를 위한 이중특이적 항체를 수득하기 위해, 세포주는 원래의 2개 모노클로날 항체로부터의 변형된 H 및/또는 L 사슬 유전자로 트랜스펙션되어야 한다. 따라서, 특히 약물 개발의 초기 단계에서, 이중특이적 항체의 보다 효율적인 생산을 위한 방법은 충족되지 않은 중요한 필요성을 갖는다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 이러한 중요한 필요성을 충족시킨다.
발명의 개요
이러한 개요는 하기 상세한 설명에서 추가로 기재되는 간소화된 형태의 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이러한 개요는 청구된 주제의 중요하거나 본질적인 특징을 확인하고자 하는 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 제한하기 위해 이용되는 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부사항, 유용성, 및 장점은 수반되는 도면에 예시되고, 첨부된 청구 범위에서 정의된 양태를 포함하는 하기 기재되는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 명세서는 이중특이적 항체의 분리를 위한 방법을 기재한다. 이것은 또한 변헝된 면역글로불린 대립유전자 또는 다른 트랜스진을 이들의 유전체에 지니는, 트랜스제닉 포유동물을 포함하는, 트랜스제닉 동물을 기재한다. 대립유전자의 변형은 VDJ 및/또는 VJ 재배열에 따른 대립유전자 배제의 정상적인 메커니즘을 방해한다. 이렇게 유적적으로 변형된 동물에서 B 세포는 2개 이상의 항원-결합 특이성을 갖는 항체를 생산하는 능력을 획득한다. 면역화된 숙주로부터 이중특이적 항체의 생산을 용이하게 하기 위해 대립유전자 배제를 억제하는 것이 본 발명의 신규한 양태이다.
일부 예시적인 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 대립유전자에 변형을 도입하여 정상적인 대립유전자 배제 과정에 영향을 줌으로써 인-프레임 V(D)J 재배열이 다른 면역글로불린 대립유전자(들)의 연속적인 V(D)J 재배열을 막지 않도록 한다. B 세포 발달 동안 대립유전자 배제를 매개하는 신호를 방해함으로써, 본원에 기재된 발명은 B 세포가 세포 당 하나 초과의 기능적 VH 도메인 및/또는 하나 초과의 기능적 VL 도메인을 발현할 수 있도록 동물의 유전체 내용을 변형시키는 방법 및 조성물을 제공한다.
이 구체예의 한 예시적인 양태에서, pre-BCR 신호전달은 중쇄 대립유전자 배제를 억제하기 위해 2개의 H 사슬 대립유전자 각각에 도입된 돌연변이에 의해 손상된다. 돌연변이는 또한 동종이합체 중쇄 형성에 불리하지만 두 돌연변이체 중쇄 사이의 이종이합체화와 양립할 수 있도록 선택된다. 결과적으로, 2개의 돌연변이체 중쇄 대립유전자 중 어느 하나에서만 발현되는 중쇄 폴리펩티드는 ER에서 미스폴딩되어 대립유전자 배제 및 추가의 B 세포 발달을 위한 신호를 매개하는 형질막으로의 이동이 방지될 것으로 예상된다. 따라서, 성공적인 pre-BCR 어셈블리는 둘 모두의 돌연변이체 중쇄 대립유전자가 공동-발현되어 상보적인 이종이합체를 형성할 때에만 발생한다. 중쇄 유전자좌의 불변 영역은 또한 아이소형 스위칭의 범위를 제한하도록 변형될 수 있다. 비록 개개 B 세포가 단 한 종류의 경쇄와 쌍을 이루는 2개의 상이한 중쇄를 발현시킬 것으로 예상되나, 둘 모두의 중쇄 및 경쇄 레퍼토리는 숙주 내 B 세포의 풀에서 매우 광범위할 것으로 예상된다.
이 구체예의 또 다른 형태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 대립유전자의 불변 영역은 하나의 대립유전자에 대한 인-프레임 VDJ 또는 VJ 재배열이 대립유전자 배제를 위해서는 무능력해지지만 나중의 B 세포 발달 단계에서의 발현을 위해 보존되도록 변형된다. 한 특수한 예에서, DNA 카세트는 생산적으로 어셈블링된 VDJ 엑손으로부터 전장 중쇄의 발현을 방지하기 위해 중쇄 유전자좌의 한 대립유전자의 J 유전자의 다운스트림에 삽입된다. 그러한 DNA 카세트는 다음 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 스플라이스 억셉터, 리보솜 스킵 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 개방형 해독틀, 폴리-아데닐화 신호 서열, 또는 종결 코돈. 따라서, 이 대립유전자로부터의 인-프레임 VDJ 엑손은 대립유전자 배제를 매개할 수 없거나 추가로 B 세포 발달을 지지할 수 없다. 그러나, B 세포는 인-프레임 VDJ 유전자 재배열이 제2 대립유전자에서 일어나는 경우 여전히 정상적으로 발달할 수 있다. 침묵(silenced) 중쇄 대립유전자의 후속 재활성화를 위해, Cre와 같은, 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열이 삽입된 DNA 카세트의 측면에 도입될 수 있다. 부위-특이적 DNA 재조합효소가 발현될 때, DNA 카세트는 이제 절단되거나 반전되어, 이전의 침묵 VDJ 엑손이 전장 중쇄 발현을 위해 다른 CH 엑손 다운스트림으로 스플라이싱되게 한다. 대안적으로, DNA 카세트는 이것이 정상적인 아이소형 스위칭 메커니즘을 통해 중쇄 유전자좌로부터 절단될 수 있는 위치에 삽입될 수 있다. 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 다운스트림 불변 영역은 아이소형 스위칭의 범위를 제한하거나, 둘 모두의 중쇄가 공동-발현될 때 이종이합체화를 선호하거나, 한 번에 단 하나의 중쇄만이 발현되도록 하기 위해 추가로 변형될 수 있다.
대안적인 구체예에서, 방금 설명한 것과 유사한 전략은 κ 또는 λ 경쇄 유전자좌에서 대립유전자 배제를 무능력화시키기 위해 구현될 수 있으며, 개개 B 세포로부터 생산된 이중특이적 항체는 중쇄 동종이합체 또는 2개의 상이한 경쇄와 쌍을 이룬 이종이합체로 구성된다.
또 다른 대안적인 구체예에서, 중쇄 대립유전자 포함에 대한 것과 유사한 전략은 중쇄만으로 구성된 이중특이적 항체를 생산하는데 이용된다. 이러한 형태의 구체예에서, 제1 중쇄 불변 도메인(CH1)을 인코딩하는 엑손은 각 대립유전자로부터 제거된다. 추가의 유전적 변형이 둘 모두의 중쇄 대립유전자에 도입되어 이들이 발현시키는 단백질이 서로 이종이합체화되는 것을 지지하고 자가-이합체화와 덜 양립되도록 할 수 있다. 대안적으로, 변형은 전술한 구체예에서 설명한 대로 CH1-없는(less) 중쇄 대립유전자가 유도 가능한 방식으로 순차적으로 발현되어 이중특이적 중쇄-단독 항체를 생산하도록 하기 위해 중쇄 대립유전자에 도입될 수 있다.
또한 또 다른 대안적인 구체예에서, 면역글로불린 대립유전자는 대립유전자 배제에 필요한 하나 이상의 신호전달 분자가 결핍된 동물에서 B 세포에 의한 이중특이적 항체 생산을 허용하도록 변형된다.
이중특이적 항체 형성에 도움이 되는 면역글로불린 대립유전자에 도입된 특정 변형은 대립유전자 배제에 최소한의 효과를 갖는다. 예를 들어, 널리 공지된 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 돌연변이와 유사한 변형을 함유하는 중쇄는 용이하게 이종이합체를 형성한다; 그러나, 도입된 변형은 각 변형된 중쇄가 단독으로 발현되는 경우 동종이합체 형성을 완전히 억제하지 않는다. 한 번에 단 하나의 면역글로불린 대립유전자가 재배열되므로, 재배열된 제1 대립유전자로부터 발현된 중쇄 동종이합체는 대립유전자 배제에 대한 능력을 보유할 수 있다. 본 방법은 대립유전자 배제가 pre-BCR 또는 BCR의 하나 이상의 신호전달 구성요소의 결핍에 의해 손상된 동물 또는 세포의 환경에서, 그 자체로 대립유전자 배제에 최소한의 영향을 미치는 그러한 면역글로불린 대립유전자 변형을 수행한다.
따라서, 일부 구체예에서, B 림프구 각각이 세포 당 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시킬 수 있는 B 림프구의 선택을 가능하게 하는, 손상된 면역글로불린 중쇄 유전자 대립유전자 배제를 갖는 유전자 변형 동물이 제공된다.
일부 양태에서, 유전자 변형 동물의 면역글로불린 중쇄 유전자의 하나 이상의 불변 영역-인코딩 부분 내의 엑손은 대립유전자 배제가 발달 중인 B 림프구에서 V(D)J 재배열 후에 발생하지 않도록 변경된다. 일부 양태에서, 유전자 변형 동물에서 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 변경은 면역글로불린 중쇄 유전자의 하나 이상의 불변 영역-인코딩 부분의 엑손들 중 하나 이상의 발현의 유도성 불활성화 및/또는 활성화를 가능하게 하고; 유전자 변형 동물의 하나 이상의 불변 영역 엑손들 중 일부 또는 전부는 동일한 면역글로불린 중쇄 유전자에서 재배열된 V(D)J 유전자 세그먼트와 비교하여 반대의 해독틀 배향으로 위치하며; 일부 양태에서, DNA 카세트는 유전자 변형 동물에 삽입되어 동일한 염색체 상에서 재배열된 V(D)J 유전자 세그먼트로부터 불변 영역 엑손의 발현을 막는다.
일부 양태는 2개의 상이한 항원이 동시에 주입되거나, 하나의 항원 이후에 제2의 상이한 항원이 주입될 때, B 림프구 각각이 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시키거나, 순차적으로 발현시킬 수 있는 B 림프구를 생성하는 유전자 변형 동물을 제공한다. 일부 양태에서, B 림프구에서 2개의 항원 수용체의 이종이합체화는 발달 또는 분화 사건에 의해 가능해지거나, 유도될 수 있다.
다른 양태는 동물의 개개 B 세포에서 2개의 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자가 서로 효율적으로 동종이합체화되지 않는 유전자 생성물을 발현시키는 유전자 변형 동물을 제공하고; 일부 양태에서, 2개의 상이한 중쇄 유전자 생성물의 동종이합체화는 일어나지 않거나, 이종이합체화에 비해 선호되지 않는다.
또한 다른 구체예는 B 림프구 각각이 세포 당 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시킬 수 있는 B 림프구의 선택을 가능하게 하는 손상된 면역글로불린 경쇄 유전자 대립유전자 배제를 갖는 유전자 변형 동물을 제공한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자 내의 불변 영역-인코딩 엑손은 대립유전자 배제가 발달 중인 B 림프구에서 VJ 재배열 후에 발생하지 않도록 변경되고; 다른 양태에서, 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자 중 하나 이상에 대한 변경은 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역-인코딩 부분의 발현의 유도성 불활성화 및/또는 활성화를 가능하게 한다.
다른 구체예는 하나 이상의 불변 영역 엑손들 중 일부 또는 전부가 동일한 면역글로불린 경쇄 유전자에서 재배열된 VJ 유전자 세그먼트와 비교하여 반대의 해독틀 배향으로 위치한 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자; DNA 카세트가 삽입되어 동일한 염색체 상에서 재배열된 VJ 유전자 세그먼트로부터 불변 영역 엑손의 발현을 막는 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자; 및 불변 영역 엑손이 동일한 B 세포 내의 둘 모두의 중쇄 대립유전자가 아닌 하나의 중쇄 대립유전자와의 회합을 위해 양립하도록 변형된 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자를 제공한다.
다른 구체예는 일차 B 세포, 무한증식 B 세포, 또는 유전자 변형 동물로부터 유래된 하이브리도마를 제공한다.
또한 다른 구체예는 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 변경이 중쇄만으로 구성된 이중특이적 항체의 생산을 허용하는 유전자 변형 동물을 제공한다.
다른 구체예는 유전자 변형 동물의 공학처리된 부분으로부터의 면역글로불린 중쇄 유전자로부터 전사된 일부 또는 전체 면역글로불린 단백질; 및 유전자 변형 동물의 세포로부터 유래된 일부 또는 전체의 공학처리된 면역글로불린 단백질을 포함한다.
본 발명의 상기 및 기타 양태, 목적 및 특징은 하기에서 보다 상세히 기재된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 VDJ 재조합 이전에 가변성 유전자 세그먼트를 특징으로 하는 중쇄 유전자좌에서 2개의 전형적인 대립유전자를 예시한다.
도 2는 2개의 중쇄 대립유전자의 동시 발현으로부터 이중특이적 항체 생산을 허용하는 중쇄 대립유전자에 대한 변형을 예시한다.
도 3은 상이한 항체 부류의 발현을 위한 엑손을 특징으로 하는 중쇄 유전자좌의 불변 영역 로케일(locale)을 예시한다.
도 4는 순차적 중쇄 발현에 의한 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 대립유전자에 대한 변형을 예시한다.
도 5는 순차적 중쇄 발현에 의한 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 대립유전자에 대한 대안적인 변형을 예시한다.
도 6은 유도성 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 대립유전자에 대한 변형을 예시한다.
정의
본원에서 사용되는 용어는 당업자에 의해 이해되는 것과 같은 분명하고 통상적인 의미를 갖는다. 하기 정의는 독자가 본 발명을 이해하는 것을 돕기 위한 것으로, 특별히 지정하지 않는 한 상기 용어의 의미를 변화시키거나 달리 제한하고자 하는 것이 아니다.
용어 "트랜스진(transgene)"은 세포, 특히 척추동물 숙주 동물의 세포의 유전체로 인공적으로 삽입되었거나 삽입되는 유전 물질을 기재하기 위해 본원에서 사용된다.
"트랜스제닉 동물"은 세포의 일부 내에 염색체 또는 염색체외 요소로 존재하거나, 종자세포 DNA로 안정적으로 통합(즉, 세포 대부분 또는 전부의 유전체 서열 내)된 외인성 핵산 서열을 갖는 비인간 동물, 보통 포유동물, 예를 들어, 설치류, 특히 마우스 또는 래트를 의미하지만, 다른 포유동물도 고려된다.
"벡터"는 자가 복제되거나 그렇지 않든 간에 세포를 형질전환시키거나, 형질도입하거나, 트랜스펙션시키는데 사용될 수 있는 플라스미드 및 바이러스 및 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다.
"세포 표면"은 세포의 형질막, 즉, 세포외 공간에 가장 직접 노출되고 세포외(세포간 포함) 공간에서 세포 및 단백질 둘 무도와 접촉하는데 이용될 수 있는 세포의 부분을 의미한다.
"이중특이적 항체"는 항원 특이성에 있어서 서로 상이한 2개의 물리적으로 분리 가능한 항원-결합 표면을 포함하는 항체이다. 보통의 항체는 구조적으로 동일한 2개의 물리적으로 분리 가능한 항원-결합 표면을 가지므로 동일한 항원 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체의 바람직한 형태는 2개의 물리적으로 분리 가능한 항원-결합 표면을 지닌 보통의 IgG 항체 분자와 유사한 항체이지만, 이러한 표면이 구조적으로 동일한 대신, 이들은 서로 상이하다. 본 발명과 관련하여, 이러한 표면 둘 모두는 동일한 중쇄 단백질로 구성될 수 있지만, 이들은 이들이 포함하는 경쇄 단백질에 있어서 서로 상이할 것이다. 대안적으로, 2개의 표면은 동일한 경쇄 단백질로 구성될 수 있지만, 이들은 이들이 포함하는 중쇄 단백질에 있어서 서로 상이할 것이다.
본원에서 사용되는 "생산적 재배열"은 인-프레임으로 존재하고 가변 영역 도메인 번역을 가능하게 하는 VDJ 또는 VJ 재배열이다. 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인은 다운스트림 불변 영역 엑손(들)과 인-프레임으로 발현될 수 있는 경우 "기능적"인 것으로 간주된다. 생산적 VDJ 또는 VJ 재배열로부터 각각 번역된 중쇄 또는 경쇄 단백질은 세포 표면에서 발현될 수 있는 경우 "기능적"인 것으로 지칭된다.
본원에 기재된 면역글로불린 "대립유전자"는 가변성 유전자 세그먼트, 인트론 인핸서, 불변 영역 유전자, 및 내인성 또는 외인성 공급원의 다른 서열을 포함할 수 있는 중쇄 또는 경쇄 유전자좌의 염색체 세그먼트를 의미한다.
"대립유전자 배제"는 설치류 또는 인간과 같은 척추동물 종에서 대다수의 B 세포가 2개의 동종 보통염색체 중 하나에만 생산적으로 재배열된 중쇄 유전자를 보유한다는 사실을 의미한다. 유사하게, 경쇄 유전자좌에서의 대립유전자 배제도 유사한 시나리오를 의미할 것이다. 보다 일반적인 의미에서, 대립유전자 배제는, 염색체의 위치와 무관하게, 임의의 중쇄 또는 경쇄 유전자좌에서의 생산적 V(D)J 재배열이 각각 다른 중쇄 또는 경쇄 V(D)J 유전자 세그먼트의 추가 재배열을 억제할 때마다 적용된다. 예를 들어, 중쇄 VDJ 결합기의 2개 이상의 세트가 동일한 염색체에 삽입되는 경우, 중쇄 결합기 중 하나에서의 생산적 재배열은 임의의 다른 중쇄 결합기에서의 추가 V(D)J 재배열을 막는다. 경쇄 결합기에도 동일한 원칙이 적용된다. 원칙적으로, 이러한 유형의 "대립유전자" 배제는 통상적인 대립유전자 배제와 동일한 메커니즘에 의해 발생할 것이다.
"대립유전자 포함"은 대립유전자 배제의 손실, 따라서, 2개 이상의 기능적 중쇄 가변 도메인 및/또는 2개 이상의 경쇄 가변 도메인을 생산하는 B 세포의 능력을 의미한다.
유전체 "로케일"은 한 특정 기능적 양태와 관련된 유전체의 임의의 영역, 바람직하게는 유전자이다. 용어 로케일은 면역글로불린 유전자좌의 일부를 나타내기 위해 여기에서 사용된다. 예를 들어, 이것은 한 종류의 유전자 세그먼트를 주로 함유하는 면역글로불린 유전자좌의 일부, 예를 들어, V 유전자 세그먼트 로케일, 또는 D 유전자 세그먼트 로케일, 또는 J 유전자 세그먼트 로케일, 또는 보다 광범위하게, V, D 및 J 유전자 세그먼트의 전부를 포함하는 가변성 로케일을 의미할 수 있다. 불변 영역 로케일은 불변 영역 엑손을 함유하는 면역글로불린 유전자좌의 일부이다.
발명의 상세한 설명
본원에 기재된 기술의 실시는 달리 지정되지 않는 한 당업자의 기술 범위 내의 유기 화학, 중합체 기술, 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 세포생물학, 생화학 및 시퀀싱 기술의 통상적인 기술 및 기재를 이용할 수 있다. 이러한 통상적인 기술은 중합체 어레이 합성, 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화 및 라이게이션, 및 표지를 이용한 하이브리드화의 검출을 포함한다. 적합한 기술의 특정 예시는 본원의 실시예에서 참조될 수 있다. 그러나, 물론 다른 동등한 통상적인 절차가 또한 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기술 및 기재는 표준 실험 매뉴얼, 예를 들어, 문헌[Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual; Bowtell and Sambrook (2003), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 및 Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (모두 Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.; Nagy, et al., Eds. (2003) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에서 발견될 수 있고, 이들 모두는 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 기재하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함함을 주의하라. 따라서, 예를 들어, "면역글로불린"에 대한 언급은 하나 이상의 면역글로불린을 의미하고, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계들 및 방법들에 대한 언급 등을 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 현재 기재된 발명과 함께 사용될 수 있는 장치, 포뮬레이션 및 방법을 기재하고 개시하기 위한 목적으로 참조로서 포함된다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 중간에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계에 속하는 경우, 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계들 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
하기 기재에서, 본 발명의 보다 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 기재된다. 그러나, 본 발명은 상기 특정 세부사항 중 하나 이상이 없이도 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 널리 공지된 특징 및 당업자에게 널리 공지된 절차는 본 발명을 불명료하게 하는 것을 피하기 위해 기재되지 않았다.
전반적인 본 발명
본 발명은 동물로부터 이중특이적 항체의 신속한 분리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 면역 시스템에 존재하는 B 림프구는 일반적으로 대립유전자 배제라고 불리는 과정에 의해 하나 초과의 기능적 중쇄 및 하나의 기능적 경쇄를 발현하는 것이 방지된다. 본 발명의 특정 구체예는 대립유전자 배제가 발달 중인 B 세포의 면역글로불린 유전자좌 중 하나 이상에서 무능력화되도록 하는 동물의 유전체 내용에 대한 변형을 제공한다. 본원에 기재된 방법은 B 세포에 세포 당 하나 초과의 기능적 VH 도메인 및/또는 하나 초과의 기능적 VL 도메인을 발현시키는 능력을 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 대립유전자에 변형을 실행하여 정상적인 대립유전자 배제 과정에 영향을 줌으로써 한 대림유전자의 인-프레임 V(D)J 재배열이 다른 대립유전자의 V(D)J 재배열을 억제하지 않도록 한다. 특정 구체예는 또한 트랜스제닉 동물로부터 이중특이적 항체를 분리하기 위한 두 가지 일반적인 전략을 수행한다. 첫 번째 전략은 2개 이상의 관심 항원에 의한 동시 면역화 요법을 수반한다. 두 번째 전략은 상이한 관심 항원에 의한 순차적인 면역화를 수반한다.
중쇄 및 경쇄 재배열 둘 모두에 뒤따르는 대립유전자 배제는 세포 표면으로의 중쇄의 이동을 필요로 한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 부적절하게 폴딩된 경우, 새롭게 합성된 중쇄 폴리펩티드가 ER에서 유지되고 대립유전자 배제를 매개하는 능력이 결여될 가능성을 활용한다. 중쇄의 VDJ 재조합 후-대용 경쇄 복합체와 필요한 VH 도메인 페어링 외에-중쇄 폴리펩티드의 이합체화는 적절한 단백질 폴딩을 달성하는데 요구된다. IgM 및 IgE를 제외한 모든 아이소형에 대한 중쇄 동종이합체화는 2개의 CH3 도메인 사이의 대칭적 단백질 상호작용제 의해 개시된다. IgM 및 IgE 중쇄는 이들의 CH4 도메인 사이의 단백질 상호작용을 통해 동종이합체화를 개시한다.
이러한 구체예의 한 양태에서, 중쇄 대립유전자는 아이소형 스위칭의 범위를 제한하도록 변형되며, 둘 모두의 대립유전자에서 CH3 또는 CH4 이합체화 도메인을 인코딩하는 엑손은 동종이합체화와는 덜 양립하지만 이종이합체화를 위해서는 서로 상보적이도록 변형된다. 어느 한 대립유전자 단독에 대한 인-프레임 VDJ 재배열로부터 발현된 중쇄 폴리펩티드는 적절한 단백질 폴딩을 비효율적으로 달성하므로, 대립유전자 배제를 매개하기 위해 세포 표면으로 이동할 수 없다.
VH-VL 페어링 외에, 경쇄 대립유전자 배제는 중쇄 CH1 도메인의 적절한 단백질 폴딩을 요구하며, 이는 미스폴딩되기 쉽다(예를 들어, 문헌[Feige, et al., Mol Cell 34: 569?579 (2009)] 참조). 적절한 단백질 폴딩을 달성하기 위해, 각 중쇄 CH1 도메인은 경쇄의 불변 영역(Cκ 또는 Cλ)과 회합하여야 한다. 본 발명의 방법의 확장된 양태에서, 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 엑손뿐만 아니라 경쇄 불변 영역 도메인의 엑손에 대한 유전적 변형이 수행되며, 이에 의해 각 경쇄는 둘 모두가 아닌 단 하나의 대립유전자로부터 발현된 중쇄와 회합될 수 있다.
상기 언급된 CH1 변형의 유무와 관계없이, 상기 언급된 CH3 변형을 갖는 트랜스제닉 마우스는 2개의 관심 항원으로 동시에 면역화된다. 반복적인 면역화를 이용하여 둘 모두의 항원을 인지하는 B 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 최대화할 수 있다. 면역화 요법이 완료된 후, 표준 하이브리도마 또는 다른 기술을 이용하여 둘 모두의 관심 항원에 대한 이중특이적 항체를 생산하는 B 세포를 분리한다.
구체예의 또 다른 형태에서, 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 동물은 둘 모두의 염색체에서 중쇄 대립유전자의 공학처리된 형태를 갖고, 변형은 중쇄 분자의 불변 도메인을 발현시키는 중쇄 로케일에 도입된다. 둘 모두의 공학처리된 대립유전자는 B 세포 발달 동안 중쇄 다양성을 생성하기 위해 VDJ 재배열을 겪을 수 있다. 공학처리된 대립유전자 중 하나는 또한 pre-BCR 신호를 발생시킬 수 있는 전장 막통과 중쇄 단백질을 발현시킬 수 있다. 다른 공학처리된 대립유전자는 이에 관해 사용될 수 없다.
이러한 구체예의 한 양태에서, 2개의 공학처리된 대립유전자는 Cre 또는 Flp와 같은 하나 이상의 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열(야생형 또는 돌연변이됨)을 지닌다. 인지 부위는 부위-특이적 재조합이 유전자좌의 불변 도메인-인코딩 부분의 기능을 변경하는 방식으로 배치된다. 다시 말해, 대립유전자가 완전한 기능을 가진 중쇄 단백질을 발현시킬 수 있다면, 부위-특이적 재조합은 이러한 특성의 유전자좌를 박탈한다. 유사하게, 대립유전자가 완전한 기능을 가진 중쇄 단백질을 발현시킬 수 없다면, 부위-특이적 재조합은 유전자좌에 기능적 중쇄를 발현시키는 능력을 부여한다.
방금 요약된 부위-특이적 재조합효소-매개된 변경은 2개의 동종 염색체 상에서 중쇄 유전자좌의 불변 도메인-인코딩 부분의 DNA 조각을 결실시키거나 반전시킴에 의해 확립된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 한 염색체에 대한 불변 도메인 완전 기능(full functionality)의 부위-특이적 재조합효소-의존성 손실은 다른 염색체에 대한 완전 기능의 동기식, 또는 거의 동기식 획득을 동반한다. 유리한 양태에서, 이러한 부위-특이적 재조합효소의 발현은 Cγ1 또는 Aicda(활성화-유도된 데아미나제)와 같이 B 세포 활성화 동안 유도된 유전자로부터의 프로모터의 제어 하에 있다.
방금 설명된 트랜스제닉 마우스는 항원으로 면역화되어 그 항원에 특이적인 항체 분자를 발현시키는 B 세포의 클론 확장을 허용한다. 이들이 보유하는 중쇄 유전자 변형으로 인해, 이 항원에 특이적인 항체는 2개의 중쇄 대립유전자 중 단 하나의 재배열된 형태; 즉, 불변 도메인-인코딩 부분의 완전 기능에 의해 정의된 대립유전자에 의해 인코딩된 중쇄로 구성된다. 다른 대립유전자는 그러한 기능이 결여되어 있고 이로 인해 항원-특이적 클론 확장에 필요한 신호전달 과정에 참여할 수 있는 중쇄를 인코딩하지 않을 것이다. 반복적인 면역화를 이용하여 클론 확장 및 항원-특이적 항체 다양성을 최대화할 수 있다.
면역화 요법이 완료된 후, 부위-특이적 재조합이 유도되어 한 염색체에서 다른 염색체로의 중쇄 불변 도메인 기능의 스위치를 발생시킨다. 이 스위치의 결과로서, 면역화에 이용된 항원에 특이적인 항체의 중쇄를 인코딩하는 대립유전자는 불변 도메인 완전 기능을 박탈 당한다. 동시에, 또는 그 근방에서, 이전에 불변 도메인 완전 기능을 박탈 당한 대립유전자는 이제 이 기능을 획득한다. 기능에서의 이러한 스위치를 통해, 클론 확장에 참여하는 세포는 면역화 요법에 사용된 항원에 반응하여 새로운 중쇄 단백질의 발현을 획득한다.
방금 설명된 유도된 부위-특이적 재조합효소-의존성 스위치 이후, 마우스는 제2 항원으로 면역화된다. 제2 항원에 반응하는 클론 확장은 제2 대립유전자에 의해 인코딩된 중쇄로 구성된 항체, 즉, 유도된 부위-특이적 재조합효소 사건으로 인해 불변 도메인 기능을 획득한 항체에 의존적이다. 첫 번째 경우와 마찬가지로, 두 번째 면역화를 반복하여 클론 확장 및 항원-특이적 항체 다양성을 최대화할 수 있다.
제2 항원에 특이적인 항체를 발현시키는 클론적으로 확장된 세포는 제1 항원에 반응하여 이전에 클론 확장에 관여한 세포를 포함한다. 제2 클론 확장 동안, 이러한 세포는 제1 항원에 특이성을 갖는 중쇄 단백질을 발현시키지 않고 대신 제2 대립유전자로부터 상이한 중쇄 단백질을 발현시킨다. 이들이 발현하는 제2 항원에 대한 특이성에 기여하는 중쇄 단백질은 유도된 부위-특이적 재조합 사건의 결과로서 불변 도메인 완전 기능을 획득한 중쇄 대립유전자에 의해 인코딩된다.
두 번째 면역화 요법이 완료된 후, 하이브리도마 또는 다른 기술을 이용하여 제1 및 제2 항원 둘 모두에 특이적인 B 세포를 분리시킨다. 제2 부위-특이적 재조합효소 사건이 유도되어 제1 항원에 항원 특이성을 갖는 대립유전자에 대한 완전 기능을 회복할 수 있다. 예를 들어, 제2 부위-특이적 재조합효소의 발현은 타목시펜 또는 독시사이클린에 의해 유도될 수 있는 것과 같이, 유도성 시스템의 제어 하에 있을 수 있다. 이러한 변형을 통해, 두 상이한 항체 분자를 발현시키는 세포의 능력을 평가할 수 있다: 첫 번째 면역화 요법에 사용된 항원에 특이적인 항체, 및 두 번째 면역화 요법에 사용된 항원에 특이적인 다른 항체.
제2 부위-특이적 재조합 후, 각 중쇄 대립유전자에서 어셈블링된 VDJ 엑손은 이제 이종이합체의 상보적인 절반인 단백질, 또는 단백질 도메인으로 발현된다(이종이합체 유도제(heterodimerizer)라고 불림). 유리한 양태에서, 이종이합체 유도제는 돌연변이 IgG1 대립유전자이고, 여기서 둘 모두의 대립유전자의 CH3 도메인을 인코딩하는 네 번째 엑손은 이들이 서로 이종이합체화되도록 촉진하고 동종이합체화를 억제하도록 돌연변이된다. 대안적으로, 이종이합체 유도제 쌍은 c-Fos 및 c-Jun(생리학적으로 이종이합체화되어 AP-1 전사 인자를 형성함), 류신 지퍼, 또는 이종이합체를 형성하는 유사한 단백질과 같은 비-면역글로불린 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 대립유전자 배제는 중쇄 유전자좌에서 손상되는 대신, 오히려 경쇄 유전자좌에서 손상된다. 본 발명의 이러한 형태에서, 중쇄 대립유전자 배제는 정상이다. 본 발명의 경쇄 대립유전자 포함 형태는 중쇄 대립유전자 포함 형태와 개념적으로 유사하며, 관련 동종 경쇄 유전자의 불변 도메인-인코딩 부분에서의 유사한 변형을 특징으로 한다. 이것은 적절하게 단계적으로 유도 가능한 부위-특이적 재조합 단계와 조합된 유사한 이중 면역화 도식을 이용하여 활용된다. 이중특이적 B 세포는 본 발명의 중쇄 대립유전자 포함 형태에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 확인되고/되거나 분리된다. 본 발명의 이러한 경쇄 대립유전자 포함 형태는 각각이 2개의 경쇄 단백질 및 하나의 중쇄 단백질로 구성된 이중특이적 항체를 생성하는 반면, 중쇄 대립유전자 포함 형태는 각각이 하나의 경쇄 단백질 및 2개의 중쇄로 구성된 이중특이적 항체를 생성한다.
대안적인 구체예에서, 중쇄 대립유전자 포함에 대해 방금 기술된 것과 유사한 전략은 중쇄만으로 구성된 이중특이적 항체를 생산하는 B 세포를 생성하기 위해 실행된다. 이러한 구체예에서, CH1 도메인을 인코딩하는 엑손은 둘 모두의 중쇄 대립유전자로부터 제거된다. 각각의 중쇄 대립유전자로부터 발현된 CH1-없는 폴리펩티드는 적절한 단백질 폴딩뿐만 아니라 세포 표면으로의 이동을 위해 경쇄 또는 대용 경쇄의 존재에 대한 의존성을, 만약 있다고 하더라고, 거의 나타내지 않아야 한다(예를 들어, 문헌[Feige, et al., Mol Cell 34: 569?579 (2009)] 참조). 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 가변성 유전자 세그먼트는 자연적으로 단일-쇄 항체를 발현시키는 동물, 예를 들어, 낙타, 또는 경쇄 없이 발현될 때 VH 도메인의 열-안정성을 개선하기 위해 변형 유무에 관계 없는 다른 동물로부터 유래될 수 있다.
이러한 구체예의 한 형태에서, 중쇄 대립유전자는 아이소형 스위칭의 범위를 제한하기 위해 추가로 변형되고, 둘 모두의 대립유전자에서 CH3 또는 CH4 이합체화 도메인을 인코딩하는 엑손은 동종이합체화와는 덜 양립하지만 서로 이종이합체화를 위해서는 상보적이도록 돌연변이된다. 어느 한 돌연변이 대립유전자 단독으로부터 발현된 CH1-없는 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이가 효율적인 중쇄 동종이합체화를 억제하므로 대립유전자 배제를 매개하기 위해 세포 표면으로 이동할 수 없어야 한다. 따라서, 성공적인 B 세포 발달은 둘 모두의 돌연변이 중쇄 대립유전자로부터의 CH1-없는 중쇄의 동시 발현에 의존적이다.
상기 언급된 CH1 도메인-인코딩 엑손이 결여되고 상기 언급된 CH3 변형을 갖는 트랜스제닉 마우스는 2개의 관심 항원으로 동시에 면역화된다. 반복적인 면역화를 이용하여 둘 모두의 항원을 인지하는 B 세포의 클론 확장을 최대화할 수 있다. 면역화 요법이 완료된 후, 표준 하이브리도마 또는 다른 기술을 이용하여 둘 모두의 관심 항원에 대한 이중특이적 항체를 생산하는 B 세포를 분리한다.
이러한 구체예의 대안적인 형태에서, CH1 도메인이 결여된 중쇄의 대립유전자 포함은 전술한 구체예에 설명된 중쇄 대립유전자 포함 도식과 유사한 유도 가능한 방식으로 각 돌연변이 중쇄 대립유전자의 순차적인 발현을 통해 달성된다. 중쇄 대립유전자는 또한 한 대립유전자에서 인-프레임 VDJ 재배열이 대립유전자 배제에 대해 무능력화되고 이후 B 세포 발달 단계에서의 발현을 위해 보존되도록 변형된다. 이것은 DNA 카세트에 의해 한 중쇄 대립유전자의 개방형 해독틀을 파괴하거나 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 엑손의 반전에 의해 유사하게 달성된다. 각 돌연변이 중쇄 대립유전자의 발현을 교대하기 위해 부위-특이적 DNA 재조합의 유도 가능한 사건이 또한 유사하게 도입된다. 유사한 이중 면역화 요법 이후 두 번째 유도 가능한 부위-특이적 재조합 단계를 사용하여 이중특이적 B 세포를 수득한다. 본 발명의 이러한 중쇄 대립유전자 포함 형태는 각각이 경쇄 없이 2개의 중쇄로 구성된 이중특이적 항체를 생성한다.
다른 대안적인 구체예에서, B 세포에 의한 이중특이적 항체 생산을 허용하도록 변형된 면역글로불린 대립유전자는 대립유전자 배제에 필요한 하나 이상의 신호전달 분자가 결핍된 동물에서 실행된다.
특정 경우에, 상기 방법은 이중특이적 항체 형성에는 도움이 되지만, 대립유전자 배제에는 최소한의 효과를 갖도록 설계된 변형을 면역글로불린 유전자에 도입시킨다. 한 특정 양태에서, 널리 공지된 "노브-인투-홀" 돌연변이와 유사한 변형을 함유하는 중쇄는 중쇄의 CH3 도메인을 인코딩하는 엑손에 도입된다(예를 들어, 문헌[Ridgway, et al., Protein Eng 9: 617-621 (1996)] 참조). 도입된 변형은 각 변형된 중쇄가 단독으로 발현되는 경우 동종이합체 형성을 완전히 억제하지 않는다. 한 번에 단 하나의 면역글로불린 대립유전자가 재배열되므로, 재배열된 제1 대립유전자로부터 발현된 중쇄 동종이합체는 대립유전자 배제에 대한 능력을 보유할 수 있다. 본 발명은 pre-BCR 또는 BCR의 하나 이상의 신호전달 구성요소의 결핍에 의해 초래된 손상된 대립유전자 배제를 갖는 동물 또는 세포에서, 그 자체로 대립유전자 배제에 최소한의 영향을 미치는 그러한 면역글로불린 대립유전자 변형을 수행한다. 그러한 돌연변이의 일례는 E2A가 결핍된 마우스 균주이다(예를 들어, 문헌[Hauser, et al., Journal of Immunology 192:2460-2470 (2014)]참조).
상기 언급된 CH3 변형 및 결함성 pre-BCR 또는 BCR 신호전달 구성요소를 포함하는 트랜스제닉 마우스는 2개의 관심 항원으로 동시에 면역화된다. 반복적인 면역화를 이용하여 둘 모두의 항원을 인지하는 B 세포의 클론 확장을 최대화할 수 있다. 면역화 요법이 완료된 후, 표준 하이브리도마 또는 다른 기술을 이용하여 둘 모두의 관심 항원에 대한 이중특이적 항체를 생산하는 B 세포를 분리한다.
도 1은 인간 및 대부분의 척추 동물에서 전형적으로 발견되는 2개의 중쇄 대립유전자(101 및 102)를 묘사한다. 각 중쇄 대립유전자는 IgM의 불변 영역(108)을 인코딩하는 Cμ 엑손의 여러 V(103), D(104), 및 J(105) 유전자 업스트림으로 구성된다. 각 염색체 상에, 5' "인트론" 인핸서(106) 및 스위치 영역(107)과 같은 조절 요소가 또한 J 유전자 및 제1 CH 엑손 사이에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 마우스의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 인간 코딩 영역 및 마우스 비코딩 영역으로 구성된 키메라이다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 중쇄 유전자좌의 염색체 세그먼트(101, 102); 가변 영역 유전자 세그먼트(103); D 영역 유전자 세그먼트(104); J 영역 유전자 세그먼트(105); 중쇄 "인트론" 인핸서(106); 스위치 영역(107); IgM의 불변 영역을 인코딩하는 Cμ 엑손(108).
도 2는 B 세포가 대립유전자 포함에 허용될 수 있도록 본 발명이 둘 모두의 중쇄 대립유전자(201, 202)에 대해 구현한 변형의 예를 묘사한다. 종자세포 구성 하에서, 각 중쇄 대립유전자는 재배열되지 않은 V(203), D(204), 및 J(205) 유전자 이후에 IgG 아이소형을 인코딩하는 변형된 Cγ 엑손(208 및 209)으로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 마우스의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 인간 코딩 영역 및 마우스 비코딩 영역으로 구성된 키메라이다. B 세포 발달 동안, 무작위 선택된 V, D, 및 J 유전자는 어셈블링되어(210) VH 엑손(211, 212)을 형성한다. 각 중쇄 대립유전자의 CH3 엑손 내의 특정 코돈은 인코딩된 중쇄가 서로 이종이합체화와 양립하도록 돌연변이된다(예를 들어, 돌연변이 Cγ1, 2개의 중쇄 대립유전자에 대한 이의 cDNA 서열은 [SEQ ID No. 1 및 2]에 명시된다). 추가로, 어느 한 대립유전자가 단독으로 발현되는 경우, 변형은 번역된 중쇄 폴리펩티드가 미스폴딩되도록 한다. 결과적으로, pre-BCR은 돌연변이 중쇄 폴리펩티드가 둘 모두의 대립유전자의 동시 발현으로부터 이종이합체를 형성하지 않는 한, 형성될 수 없고 대립유전자 배제를 매개하기 위해 형질막으로 이동할 수 없다. 구체예의 확장된 형태에서, 상기 언급된 CH3 돌연변이와 함께, 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 CH1 엑손 내의 특정 코돈은 각 중쇄가 상이한 경쇄와 쌍을 이룰 수 있도록 유사하게 변형된다. 비록 이 도면이 대립유전자 배제를 억제할 뿐아니라 중쇄 이종이합체화를 촉진하기 위해 돌연변이 IgG 중쇄의 사용을 예시하고 있으나, 다른 아이소형(즉, IgM, IgD, 또는 IgA)도 유사하게 이용될 수 있었다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 변형된 중쇄 대립유전자의 염색체 세그먼트(201, 202); 가변 영역 유전자 세그먼트(203); D 영역 유전자 세그먼트(204); J 영역 유전자 세그먼트(205); 중쇄 "인트론" 인핸서 (206); 스위치 영역(207); IgG의 돌연변이 불변 영역을 인코딩하는 Cγ 엑손(208, 209); VDJ 재조합 사건(210); 어셈블링된 VDJ 엑손(211, 212).
도 3은 설치류에서 발견된 2개의 동종 염색체에 대한 중쇄 유전자를 묘사한다. (전형적인 인간 중쇄 유전자좌는 매우 유사하지만 더 많은 불변 영역 유전자를 갖는다.) 이러한 도면에서, 둘 모두의 중쇄 대립유전자(301, 302)의 V(303) 및 D(304) 유전자는 염색체의 불변 영역 로케일의 구조를 강조하기 위해 도 1에 비해 압축된다("n"으로 표시됨). 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 마우스의 V(303), D(304), 및 J(305) 유전자 세그먼트는 인간 코딩 영역 및 마우스 비코딩 영역으로 구성된 키메라이다. IgM 및 IgD(308, 개개 CH 엑손은 도시되지 않음)는 B 세포에 의해 발현되는 제1 아이소형이다. 다른 항체 부류(309-314, 개개 엑손은 도시되지 않음)를 인코딩하는 CH 엑손은 추가로 다운스트림에 존재한다. C57BL/6 마우스 균주에서, 이들은 Cγ3(309), Cγ1(310), Cγ2b(311), Cγ2c(312), Cε(313), 및 Cα(314)이다. BALB/c와 같은 특정 마우스 균주는 Cγ2c 대신 Cγ2a를 갖는다. Cδ를 제외하고, 아이소형 스위치 영역(307)은 각 항체 부류의 제1 CH 엑손 앞에 존재한다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 중쇄 대립유전자(301, 302); 괄호 안에 표시된 V 유전자, 유전자 세그먼트의 여러 번호를 나타내는 "n"(303); 괄호 안에 표시된 D 유전자, 유전자 세그먼트의 여러 번호를 나타내는 "n"(304); J 유전자(305); 중쇄 "인트론" 인핸서(306); 스위치 영역(307); Cμ 및 Cδ(308, 개개 엑손은 도시되지 않음); IgG 및 다른 항체 부류의 CH 엑손(309-314, 개개 엑손은 도시되지 않음).
VDJ 재배열이 발생하여 상이한 CH 엑손(403, 404)이 생산된 후 2개의 중쇄 대립유전자(401, 402)가 도 4에 묘사되며, 이들은 나이브 B 세포에서 발견될 것이다. 대립유전자 401에서, Cμ 및/또는 Cδ를 인코딩하는 엑손(406)은 재배열된 VDJ 엑손(403)과 동일한 센스 배향(아래 화살표)으로 존재한다. 반대로, Cμ 및/또는 Cδ 엑손(412)은 대립유전자 402에서 VDJ 엑손(404)에 대해 역배향(아래 화살표)으로 존재한다. 따라서, 대립유전자 402는 이의 Cμ 및/또는 Cδ 엑손이 안티센스 구성이므로 전장 중쇄 폴리펩티드를 발현시킬 수 없고, 정상적인 B 세포 발달은 대립유전자 401로부터의 기능적 중쇄의 발현에 의존적이다. 대립유전자 402에서 반전된 Cμ 및/또는 Cδ 엑손(412)은 부위-특이적 DNA 재조합을 위해 2개의 반대로 배향된 인지 서열(409, 410)의 바로 옆에 있다. 대립유전자 401에서, 부위-특이적 DNA 재조합을 위한 2개의 인지 서열(409, 410)은 또한 반대 배향으로, 멀리 떨어져 배치된다: Cμ 및/또는 Cδ 엑손(406)의 한(409) 업스트림, Cγ 엑손(408)의 다른(410) 다운스트림. 면역원(414)에 대한 B 세포 반응 동안, 대립유전자 401은 아이소형 스위칭을 겪어, 다운스트림 부위-특이적 DNA 재조합 서열(410)을 이의 업스트림 대응부(409)에 더 가깝게 가져 온다. 부위-특이적 DNA 재조합효소의 발현이 유도되면(415), 둘 모두의 대립유전자에서 이의 인지 서열(409, 410)의 측면에 있는 DNA 세그먼트는 그로 인해 생성된 재조합 부위(419, 417)가 더 이상 재조합을 수행할 능력이 없으므로 비가역적인 반전을 거친다. 대립유전자 402는 이제 전장 중쇄를 발현시킬 수 있는 반면, 대립유전자 401은 이의 CH 엑손의 반전에 의해 불활성화된다. 제2 항원(418)에 의한 면역화 후, 대립유전자 402는 아이소형 스위칭을 겪는다. 둘 모두의 대립유전자의 반전 가능한 DNA 세그먼트가 추가로 제2 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열(411)의 측면에 있으며, 이는 하이브리도마 생성 전 또는 후에 도입될 수 있다. 개재 DNA 단편의 절제 후, 둘 모두의 대립유전자(403, 404)에 대한 VDJ 엑손은 이제 중쇄 이종이합체화(413)와 양립 가능하도록 변형된 다운스트림 CH 엑손으로 발현된다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 중쇄 대립유전자(401, 402); 어셈블링된 VDJ 엑손(403, 404); 중쇄 "인트론" 인핸서(405); 어셈블링된 VDJ 엑손(403)에 대해 초기에 센스 배향(아래 화살표)의 Cμ 및/또는 Cδ 엑손(들)(406); 스위치 영역(407); 스위치 아이소형의 CH 엑손(408); 제1 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열(409, 이 부위의 서열은 표지된 부위 410과 반대 배향이다); 제2 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열(411); 어셈블링된 VDJ 엑손(404)에 대해 초기에 역배향(아래 화살표)의 Cμ 및/또는 Cδ 엑손(들)(412); 중쇄 이종이합체화(413)와 양립 가능한 변형된 엑손; 항원 반응 이후 아이소형 스위칭(414); 제1 부위-특이적 DNA 재조합효소 발현(415); 부위-특이적 DNA 재조합 후 잔존 DNA 서열(416, 417); 제2 면역원에 대한 항원 반응 및 아이소형 스위칭(418).
도 5는 순차적 중쇄 발현에 의한 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 대립유전자에 대한 대안적인 변형을 예시한다. VDJ 재배열이 발생하여 상이한 VH 엑손(503, 504)이 생산된 후 2개의 중쇄 대립유전자(501, 502)가 묘사되며, 이들은 나이브 B 세포에서 발견될 것이다. 대립유전자 501에서, 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대해 2개의 반대로 배향된 인지 서열(509, 510)의 측면에 있는 DNA 카세트(512)는 Cμ 및/또는 Cδ 불변 도메인를 인코딩하는 엑손(506) 앞에서 J 유전자의 다운스트림에 삽입된다. DNA 카세트(512)는 어셈블링된 VDJ 엑손(503)에 대해 역배향(아래 화살표)으로 존재하고 다음 중 하나 이상을 함유한다: 스플라이스 억셉터, 리보솜 스킵 서열 또는 IRES, 개방형 해독틀, 종결 코돈, 또는 폴리-아데닐화 신호 서열. 유사한 DNA 카세트(514)가 또한 대립유전자 502에서 유사한 로케일에 삽입되지만, 재배열된 VDJ 엑손(504)과 동일한 센스 배향(아래 화살표)으로 존재한다. 대립유전자 502는 DNA 카세트(514)가 VDJ 엑손(504) 뒤에서 이의 개방형 해독틀을 파괴하기 때문에 전장 중쇄를 발현시킬 수 없다. 반대로, 대립유전자 501은 반전된 DNA 카세트가 이의 개방형 해독틀을 파괴하지 않으므로 전장 중쇄를 발현시킬 수 있다. 둘 모두의 대립유전자의 IgG 엑손의 다운스트림은 제2 DNA 재조합효소에 대한 인지 부위(511)이다. 또한 둘 모두의 대립유전자에서, 제2 DNA 재조합효소(511)에 대한 또 다른 부위는 제1 DNA 재조합효소(509)에 대한 인지 부위의 업스트림에 삽입된다. 면역원(515)에 대한 B 세포 반응 동안, 대립유전자 501은 아이소형 스위칭을 겪는다. 제1 부위-특이적 DNA 재조합효소의 발현이 유도되면(516), 둘 모두의 대립유전자(512, 514)에 대한 DNA 카세트는 그로 인해 생성된 재조합 부위(517, 518)가 더 이상 재조합을 수행할 능력이 없으므로 비가역적인 반전을 거친다. DNA 카세트(514)가 이제 역배향이고 더 이상 중쇄 개방형 해독틀을 파괴하지 않으므로 대립유전자 502는 이제 전장 중쇄를 발현시킬 수 있다. 반대로, 대립유전자 501의 개방형 해독틀은 이의 VDJ 엑손(503)과 동일한 배향의 DNA 카세트(512)에 의해 파괴된다. 제2 항원(519)에 의한 면역화 후, 대립유전자 502는 아이소형 스위칭을 겪는다. 제2 부위-특이적 DNA 재조합효소의 발현이 하이브리도마 생성 전 또는 후에 도입될 때, 개재 DNA 단편(512, 514)은 이제 이의 인지체 인지 서열(511)에서 절제된다. 후속하여, 둘 모두의 대립유전자(503, 504)에 대한 VDJ 엑손은 이제 중쇄 이종이합체화를 위해 변형된 CH 엑손(513)으로 발현된다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 중쇄 대립유전자(501, 502); 어셈블링된 VDJ 엑손(503, 504); 중쇄 "인트론" 인핸서(505); Cμ 및/또는 Cδ 엑손(506); 스위치 영역(507); 스위치 아이소형의 CH 엑손(508); 제1 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열(509, 이 부위의 서열은 표지된 부위 510과 반대 배향이다); 제2 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열(511); VDJ 엑손(503)에 대해 초기에 역배향(아래 화살표)의 DNA 카세트(512); 중쇄 이종이합체화와 양립 가능한 변형된 엑손(513); VDJ 엑손(504)에 대해 초기에 센스 배향(아래 화살표)의 DNA 카세트(514); 항원 반응 이후 아이소형 스위칭(515); 제1 부위-특이적 DNA 재조합효소 발현(516); 부위-특이적 DNA 재조합 후 잔존 DNA 서열(517, 518); 제2 면역원에 대한 항원 반응 및 아이소형 스위칭(519).
도 6은 유도 가능한 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 대립유전자에 대한 변형을 예시한다. 종자세포 구성에서, 하나의 중쇄 대립유전자(601)는 재배열되지 않은 V (603), D (604) 및 J (605) 유전자 다음에, 부위-특이적 DNA 재조합효소(609)에 대한 2개의 인지 서열의 측면에 있는 Cμ 및/또는 Cδ 엑손(608)으로 구성된다. 다른 중쇄 대립유전자(602)에서, 동일한 부위-특이적 DNA 재조합효소(609)에 대한 2개의 인지 서열의 측면에 있는 센스 배향(아래 화살표)의 DNA 카세트(610)는 V, D, 및 J 유전자의 다운스트림에 삽입된다. 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 마우스의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 인간 코딩 영역 및 마우스 비코딩 영역으로 구성된 키메라이다. DNA 카세트는 다음 중 하나 이상을 함유한다: 스플라이스 억셉터, 리보솜 스킵 서열 또는 IRES, 개방형 해독틀, 종결 코돈, 또는 폴리-아데닐화 신호 서열. 추가로, 중쇄 대립유전자는 도 2에 설명된 것들과 같은(도 2의 208 및 209) 이종이합체화를 위한 CH 엑손(611 및 612)에 대한 동일한 변형을 함유한다. VDJ 재조합 사건(614) 후, 대립유전자 601에서 인-프레임 VH 엑손(615)의 성공적인 어셈블리는 전장 중쇄의 정상 발현을 발생시킨다. 반대로, 대립유전자 602에서 DNA 카세트(610)는 임의의 성공적인 VDJ 재배열(616)이 전장 중쇄 폴리펩티드를 발현할 수 없게 한다. 부위-특이적 DNA 재조합효소 유전자(617)의 발현시, 제1 대립유전자(601)의 CH 엑손(608)뿐 아니라 제2 대립유전자(602)의 DNA 카세트(610)는 염색체로부터 절제된다. 둘 모두의 대립유전자의 VDJ 엑손(615, 616)은 이제 중쇄 이종이합체화에 도움이 되는 변형을 함유하는 다운스트림 CH 엑손으로 발현될 수 있다. 도면에 표시된 구성요소는 다음과 같다: 변형된 중쇄 대립유전자(601, 602); 괄호 안에 표시된 V 유전자, 여러 유전자 세그먼트의 존재를 나타내는 "n"(603); 괄호 안에 표시된 D 유전자, 여러 유전자 세그먼트의 존재를 나타내는 "n"(604); J 유전자(605); 중쇄 "인트론" 인핸서(606); 스위치 영역(607); Cμ 및/또는 Cδ 엑손(608); 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열(609); 아래 화살표에 의해 표시되는 센스 배향의 DNA 카세트(610); 돌연변이 Cγ1 엑손(611; 612); 중쇄 3' 인핸서(613); VDJ 재조합 사건(614); 어셈블링된 VDJ 엑손(615, 616); 부위-특이적 DNA 재조합효소의 활성화(617).
트랜스제닉 세포 라이브러리
본 발명의 트랜스제닉 세포는 형질 세포의 표면상의 관심 항체의 동정을 위해, 발현 라이브러리, 바람직하게는 낮은 복잡성 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 형질 세포에서 발현된 항원-특이적 항체의 동정을 위해 본 발명의 세포 기술을 이용하여 생산되는 항체 라이브러리를 또한 포함한다.
트랜스제닉 동물
본 발명의 특수한 양태에서, 본 발명은 중쇄 또는 경쇄 유전자에서 공학처리가 수행되는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 인간 면역글로불린 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 약물 발견의 목적으로 부분적- 또는 완전-인간 항체를 생성하기 위해 내인성 마우스 면역글로불린 영역을 인간 면역글로불린 서열로 대체하려는 수많은 방법이 개발되어 왔다. 그러한 마우스의 예는, 예를 들어, 미국특허 7,145,056호; 7,064,244호; 7,041,871호; 6,673,986호; 6,596,541호; 6,570,061호; 6,162,963호; 6,130,364호; 6,091,001호; 6,023,010호; 5,593,598호; 5,877,397호; 5,874,299호; 5,814,318호; 5,789,650호; 5,661,016호; 5,612,205호; 및 5,591,669호에 기재된 것들을 포함한다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 Wabl 및 Killeen에 의해 공동-계류 중인 출원인 미국 공개 2013/0219535호에 기재된 키메라 면역글로불린 세그먼트를 포함한다. 그러한 트랜스제닉 동물은 부분적으로 도입된 인간 면역글로불린 영역을 포함하는 유전체를 갖고, 이 때 도입된 영역은 인간 가변 영역 코딩 서열 및 비인간 척추동물의 내인성 유전체에 기반한 비코딩 가변 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 트랜스제닉 세포 및 동물은 내인성 면역글로불린 영역의 일부 또는 전부가 제거된 유전체를 갖는다.
항체 생산에서의 이용
세포를 시험관내 배양하는 것은 수많은 치료용 생명공학 제품을 생산하는 기초가 되었고, 이는 세포에서의 단백질 생성물의 생산 및 지지 배지로의 방출을 포함한다. 배양시 성장하는 세포로부터의 시간에 따른 단백질 생산의 양 및 질은, 예를 들어, 세포 밀도, 세포 주기 단계, 단백질의 세포 생합성 속도, 세포 생존 및 성장을 지지하는데 이용된 배지의 조건, 및 배양 중 세포의 수명과 같은 다수의 요인에 의존적이다(예를 들어, 문헌[Fresney, Culture of Animal Cells, Wiley, Blackwell (2010); and Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Ozturk and Ha, Eds., CRC Press, (2006)] 참조).
본 발명은 동물이 2개 이상의 항원으로 동시에 챌린징되거나, 먼저 하나의 항원 이후 나중에는 다른 항원으로 챌린징되는 면역화 도식으로부터 유래되는 B 세포의 공급원을 제공한다. 두 경우 모두, 개개 동물에서 항원-특이적 항체 역가를 증가시키기 위해 다중 면역화가 이용될 수 있다. 유도 가능한 부위-특이적 재조합 단계는 2개의 면역화 시리즈 사이에 포함된다. 최종 면역화 도식 이후에, B 세포를 분리하고 배양하거나 하이브리도마를 생성하는데 이용하거나, 면역글로불린 사슬 유전자를 클로닝하기 위한 RNA의 공급원으로 이용한다. B 세포 또는 이들이 함유하는 항체 사슬은 이중특이적 항원-결합 성질에 대해 시험된다. 하이브리도마의 경우, 이것은 하이브리도마를 이중특이적 항체 또는 한 종류의 항원에 대한 특이성에 대해 직접 스크리닝한 다음 이들이 두 번째 종류의 항원에 대해 특이성을 부여하는 추가의 재배열된 면역글로불린 사슬 유전자를 지니는지 여부, 즉, 이들이 잠재성이거나 이중특이성을 나타내는지 여부에 대해 이들을 분석함에 의해 수행된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 이용하는 방법의 완전한 개시 및 기재를 당업자에게 제공하기 위해 나열되며, 이러한 실시예는 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니고, 또한 하기 실험이 수행된 유일한 실험이거나 수행된 실험의 모두인 것을 나타내거나 의미하는 것도 아니다. 광범위하게 기재된 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 특정 구체예에 제시된 바와 같은 본 발명에 대해 다수의 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 인지될 것이다. 따라서, 본 구체예는 모든 측면에서 예시적인 것이고, 제한적인 것이 아닌 것으로 간주된다.
사용된 용어 및 수(예를 들어, 벡터, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 약간의 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 설명하지 않는 경우, 부(parts)는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.
실시예 1. 2개 이상의 항원으로 동시 면역화 후 이중특이적 항체의 분리를 허용하는 공학처리된 중쇄 대립유전자. 아이소형 스위치 능력이 결여된 2개의 변형된 중쇄 대립유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스를 생성하였다(도 2에 묘사된 바와 같음). 둘 모두의 대립유전자는 VDJ 재조합을 겪을 수 있다. 바람직한 구체예에서, IgM 중쇄 대신 IgG1이 B 세포 발달 동안 발현되지만, IgM을 포함하는 임의의 다른 아이소형도 이용될 수 있다. IgG1만을 발현하는 B 세포는 매우 정상적으로 발달하고 면역화 동안 항원에 반응한다(예를 들어, 문헌[Waisman, et al., Journal of Experimental Medicine 204:747-758 (2007)] 참조).
CH3 도메인을 인코딩하는 둘 모두의 IgG1 대립유전자의 네 번째 엑손은 이들이 중쇄 이종이합체의 형성을 촉진하고 동종이합체화를 억제하도록 돌연변이된다. 바람직한 방법에서, 돌연변이는 한 중쇄 대립유전자에 대해 D276K, E233K, 및 Q234K이고; 다른 중쇄 대립유전자에 대해 K286D, K269D, 및 T247D이다(아미노산 넘버링은 CH1의 첫 번째 코돈에서 시작한다). 인간 IgG1 중쇄의 유사한 위치에서의 돌연변이는 이종이합체화 및 세포주에서 이중특이적 항체의 분비를 촉진하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Gunasekaran, et al., Journal of Biological Chemistry 285:19637-19646 (2010)] 참조).
B 세포 발달 동안, 재배열된 단 하나의 중쇄 대립유전자를 갖는 pro-B 세포는 돌연변이 IgG1 중쇄가 pre-BCR을 형성하기에 비효율적으로 동종이합체화되기 때문에 발달이 차단된다. 따라서, 불충분한 신호가 대립유전자 배제를 매개하기 위해 형질도입되고, 돌연변이 Cγ1을 발현시키는 제2 중쇄 대립유전자가 VDJ 재조합을 허용하게 된다. B 세포를 발달시키는 것은 둘 모두의 돌연변이 중쇄가 공동-발현되고 이종이합체화되어 pre-BCR을 형성할 때에만 pro-B 세포 단계를 넘어서 진행될 수 있다.
궁극적으로, 바람직한 방법의 트랜스제닉 마우스에서 성숙 B 세포는 하나의 경쇄와 함께 세포 당 2개의 기능적 중쇄를 보유한다. 트랜스제닉 마우스는 표준 방법을 사용한 하이브리도마의 후속 생성과 함께 2개 이상의 관심 항원으로의 동시 면역화에 이용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 하이브리도마는 이중특이적 항체의 직접 분리를 허용한다.
이러한 실시예 1의 중쇄 대립유전자의 예시적인 구체예에서, 둘 모두의 중쇄 대립유전자(201, 202)의 V(203), D(204), 및 J(205) 유전자는 마우스 조절 서열과 함께 인간 코딩 서열을 포함하며, 이는 Wabl 및 Killeen에 의해 공동-계류 중인 출원인 미국 공개 2013/0219535호에 기재되어 있다. 야생형 마우스에서 발견되는 중쇄 "인트론" 인핸서의 서열(206)뿐 아니라 모든 다운스트림 요소, 예를 들어, 중쇄 불변 영역 유전자는 LOCUS: NG_005838 (1..180,971)에 기재되어 있다. 이러한 실시예 1에서, 모든 아이소형의 CH 엑손을 함유하는 8,608..175,134에 걸친 서열은 둘 모두의 중쇄 대립유전자로부터 결실되고 변형된 Cγ1 엑손(도 2의 요소 208 및 209)에 의해 대체된다. 둘 모두의 요소 208 및 209의 엑손 4는 자신과의 이합체화에 비해 서로 이종이합체화되는 것을 선호하도록 돌연변이된다. 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 돌연변이 Cγ1 cDNA 서열은 [SEQ ID No. 1 및 2]에 명시되며, 중쇄 대립유전자의 야생형 cDNA 서열도 명시된다[SEQ ID No.3].
실시예 2. 순차적 면역화 후 이중특이적 항체의 분리를 허용하는 공학처리된 중쇄 대립유전자
부위-특이적 DNA 재조합에 의해 스위치를 켜거나 끌 수 있는 중쇄 대립유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 대립유전자 중 하나는 생산적 VDJ 재배열 후 전장 중쇄를 발현시킬 수 있는 반면, 다른 대립유전자는 이 기능이 결여되어 있다.
둘 모두의 대립유전자는 불변 도메인-인코딩 로케일 내에 배치된, 하나 이상의 부위-특이적 재조합효소에 대한 인지 서열을 함유한다. 이러한 부위에서의 부위-특이적 재조합은 둘 모두의 대립유전자에서 DNA 조각의 반전을 초래하고, 이 반전의 결과로서, 대립유전자의 불변 도메인 기능은 변경된다.
부위-특이적 재조합은 처음에 이 능력이 결여된 대립유전자에 전장 중쇄 단백질을 발현시키는 능력을 부여한다. 대조적으로, 부위-특이적 재조합은 처음에 능력을 가진 대립유전자로부터 그 능력을 제거한다.
이러한 구체예의 한 형태가 도 4에 묘사되어 있고, 관련 부위-특이적 재조합 서열은 409 및 410으로서 표시되고, 불변 도메인-인코딩 엑손은 406 및 412로서 표시된다. 불변 도메인-인코딩 엑손의 전사 배향은 표시된 구성요소 바로 아래에 화살표로 묘사된다.
도 4는 VDJ 재배열이 발생하여 VH 엑손(403 및 404)이 생성된 후 그 구성의 2개의 대립유전자를 도시한다. 그러나, 도 4에 묘사된 대립유전자의 VDJ 재배열은 어느 한 대립유전자에서 비생산적 유전자 세그먼트 결합을 발생시킬 수 있었다. 유사하게, 이 과정은 또한 어느 한 대립유전자에서 생산적 재배열을 발생시킬 수 있었다. B 세포는 이들이 대립유전자 401로부터 전장 중쇄 분자를 발현하는 경우에만 골수에서의 발달을 완료하는데, 그 이유는 대립유전자 402가 생산적 VDJ 재조합을 겪을 수 있다 해도, Cμ 및/또는 Cδ 엑손의 전부 또는 일부가 역배향이므로 전장 중쇄를 발현할 수 없기 때문이다.
도 4에 도시된 대립유전자를 갖는 마우스에서 발달하는 말초 B 세포는 대립유전자 401로부터 유래된 중쇄로 구성된 B 세포 항원 수용체(막통과 또는 분비됨)를 발현시킨다. 이들 B 세포 항원 수용체의 경쇄는 이들의 경쇄 유전자좌 중 하나에서의 정상적인 독립적 VJ 재배열로부터 유래된다.
도 4에 도시된 대립유전자를 갖는 마우스의 면역화는 면역원에 특이적인 항체를 발현시키는 B 세포의 클론 확장을 발생시킨다. 결정적으로, 다시 말해, 이들 항체는 대립유전자 401로부터 유래된 중쇄만으로 구성된다. 반복적인 면역화는 정상적인 마우스에서 발생한 것과 유사한 향상된 클론 확장, 체세포 과돌연변이, 및 아이소형 스위칭을 발생시킨다(도 4에서 414로서 도시됨).
B 림프구를 포함하는 여러 세포 유형에서 특정 부위-특이적 DNA 재조합효소의 유도성 발현을 가능하게 하기 위해 트랜스제닉 마우스 시스템이 존재하거나, 용이하게 공학처리될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 도 4에 묘사된 돌연변이 대립유전자 401 및 402를 갖는 트랜스제닉 마우스는 타목시펜-유도성 시스템과 같은 유도 가능한 부위-특이적 재조합효소 시스템을 추가로 갖는다. 면역화에 사용된 항원에 대한 입증 가능한 항체 반응을 일으킨 면역화된 마우스를 발생시켜 관련 부위-특이적 재조합효소를 발현시킨다.
부위-특이적 DNA 재조합효소(도 4의 415)의 발현 후, 유도된 DNA 재조합효소에 대한 부위의 측면에 있는 염색체 세그먼트는 둘 모두의 대립유전자에서 반전을 겪는다. 이로 인한 특징은 대립유전자 401에서 전장 중쇄를 발현시키는 능력의 손실이다. 동시에, 대립유전자 402는 전장 중쇄를 발현시키는 능력을 획득한다.
대립유전자 402는 면역화에 반응하여 클론 확장을 겪은 B 세포의 일부에서 생산적으로 재배열된다. 그러한 제2 대립유전자 생산적 재배열의 빈도는, 이러한 대립유전자가 B 세포 발달 동안 전장 중쇄를 발현하지 않지만, 그럼에도 불구하고 이것이 VDJ 재배열을 겪을 수 있으므로, 일반적인 경우보다 통상적으로 훨씬 높다.
도 4에 묘사된 새롭게 활성화된 대립유전자 402를 갖는 마우스의 면역화는 면역화에 사용된 항원에 특이적인 B 세포 항원 수용체를 발현시키는 B 세포의 클론 확장을 발생시킨다. 이들 B 세포 항원 수용체(막통과 또는 분비됨)는 대립유전자 402로부터 유래된 중쇄만으로 구성된다. 반복적인 면역화는 정상 마우스에서 발생한 것과 유사한 향상된 클론 확장, 체세포 과돌연변이, 및 아이소형 스위칭을 발생시킨다.
두 번째 면역화에 사용된 항원에 특이적인 B 세포는 제1 항원에 반응하여 클론 확장을 겪지 않은 일부를 포함한다. 그러한 B 세포는 둘 모두의 면역화에 사용된 항원을 인지할 수 있는 이중특이적 항체에 대한 바람직한 공급원이 아니다.
그러나, 제2 항원에 특이적인 B 세포의 일부 분획은 제1 항원에 반응하는 클론 확장에 관여할 수 있다. 이들 B 세포는 이들의 재배열된 중쇄 유전자 중 하나가 제1 면역원에 대한 특이성을 갖는 한편, 이들의 다른 재배열된 중쇄 유전자가 제2 면역원에 대한 특이성을 가지므로, 이중특이적 항체에 대한 분명한 공급원이다. 두 경우 모두, 개개 B 세포는 하나의 경쇄 단백질이 둘 모두의 중쇄 단백질과 쌍을 이룬다.
제2 면역성 항원에 대해 특이성을 갖는 B 세포를 회수하기 위해 하이브리도마 또는 다른 클로닝 기술이 활용될 수 있다. 이후 이러한 B 세포는 이들이 또한 제1 면역성 항원에 대해 특이성을 부여하는 재배열된 중쇄 유전자를 갖는지 여부를 결정하기 위해 분석된다.
실시예 3. 순차적 면역화 후 이중특이적 항체의 분리를 허용하는 대안적인 공학처리된 중쇄 대립유전자. 여기에 설명된 방법은 실시예 2에 설명된 것과 매우 유사하다. 트랜스제닉 마우스는 부위-특이적 DNA 재조합 시스템에 의해 스위치를 켜거나 끌 수 있는 2개의 중쇄 면역글로불린 대립유전자를 지니도록 공학처리되었다. 2개의 대립유전자는 실시예 2에 설명된 것과 유사한 순차적 면역화 요법을 위해 설계되며, 결과적으로 이들의 불변 도메인 로케일에서 거의 동일한 종류의 기능을 특징으로 한다. 대립유전자가 상이한 경우는 요망되는 종류의 이중특이적 B 세포를 분리하는 효율을 개선시키기 위해 설계된 요소가 포함된 경우이다.
이 구체예는 도 5에 묘사된다. 2개의 공학처리된 중쇄 대립유전자 중 하나(대립유전자 501)에서, 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 2개의 인지 서열(509 및 510)의 측면에 있는 DNA 카세트(512)는 중쇄 인핸서(505) 뒤에, 그러나 Cμ 엑손(506)에 선행하는 스위치 영역(507) 앞에 삽입되어, 중쇄 인핸서(505)가 아이소형 스위칭 후에 유전체에 남도록 한다. 두 번째 중쇄 대립유전자(대립유전자 502)에서, 유사한 요소가 유사한 위치에 삽입되나, 반대 배향(아래 화살표)이다. DNA 카세트는 어셈블링된 VDJ 엑손과 동일한 전사 배향으로 정렬될 때 중쇄 엑손의 개방형 해독틀을 파괴하도록 설계된다.
한 구체예에서, 대립유전자 501은 VH 엑손과 반대 배향으로 정렬된, 뮤린 인테그린 베타-7(Itgb7) 유전자로부터의 엑손 15 및 16으로 구성된다. 둘 모두의 Itgb7 엑손은 스플라이스 억셉터를 함유한다. 추가로, Itgb7 엑손 15는 종결 코돈을 갖는 반면, Itgb7 엑손 16은 종결 코돈뿐만 아니라 폴리-아데닐화 서열 신호도 함유한다. 반전된 전사 배향으로 인해, 이러한 DNA 카세트는 대립유전자 501에서 인-프레임 VDJ 재조합으로부터 중쇄 발현을 방해하지 않는다.
바람직한 구성에서, 대립유전자 502의 반전된 DNA 카세트는 VDJ 재조합으로부터 인-프레임 VH 엑손을 성공적으로 어셈블링한 B 세포에 생존, 기능, 또는 선택 이점을 제공하는 유전자로부터의 개방형 해독틀로 구성된다. 그러한 유전자의 예는 항-아폽토틱 B-세포 림프종-2(Bcl2)이다. 유리한 유전자의 개방형 해독틀은 중쇄 mRNA와 동일한 전사 배향으로 정렬된다. 이러한 유전자가 VH 엑손에 융합된 단백질로서 발현되는 것을 막기 위해, 리보솜 스킵 서열, 예를 들어, 피코르나바이러스로부터의 2A 펩티드가 스플라이스 억셉터 및 유리한 유전자의 개방형 해독틀 사이에 위치한다. 2A 펩티드는 또한 유리한 유전자가 인-프레임 VH 엑손을 성공적으로 어셈블링한 B 림프구에서만 발현되고, 생산적 VDJ 재배열이 결여된 B 세포에서는 발현되지 않을 것을 보장한다.
한 예시적인 구체예에서, 둘 모두의 중쇄 대립유전자(501, 502)에서 어셈블링된 VDJ 유전자(503, 504)는 마우스 조절 서열과 함께 인간 코딩 서열을 포함하는 개개 유전자 세그먼트로부터 유래되고 이는 Wabl 및 Killeens에 의해 공동-계류 중인 출원인 미국 공개 2013/0219535호에 설명되어 있다. 중쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 모든 내인성 서열 다운스트림은 LOCUS: NG_005838 (1..180,971)에 기재되어 있다. Itgb7 및 Bcl2 DNA 카세트의 서열(각각 요소 512 및 514)은 [SEQ ID Nos. 4 및 5]에 명시되며, 중쇄 "인트론" 인핸서 및 제1 엑손 Cμ 엑손의 스위치 영역 사이에 있는 유전자좌의 대략 위치 178,000에서 삽입된다. 이러한 구체예에서, 제1 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열(요소 509 및 510)은 lox66 및 lox71이다(예를 들어, 문헌[Oberdoerffer, et al., Nucleic Acids Res 31:e140 (2003)] 참조). 또한 이러한 구체예에서, 제2 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열(요소 511)은 Flp 효소에 의해 사용되는 것들이다(예를 들어, 문헌[McLeod, et al., Mol Cell Biol 6:3357-3367 (1986)] 참조). 이러한 구체예에서, 이종이합체(각 중쇄 대립유전자에서 요소 513)는 자가-이합체화에 비해 서로 이종이합체화되는 것을 선호하도록 설계된 돌연변이 Cγ1이다. 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 돌연변이 Cγ1 cDNA 서열은 [SEQ ID Nos. 1 및 2]에 명시된다.
실시예 2에서와 같이, 첫 번째 면역화 후, 반전된 Itgb7 카세트가 중쇄 유전자좌의 전사 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 대립유전자 501은 항원에 정상적으로 반응할 수 있다. 제2 DNA 카세트가 대립유전자 502의 중쇄 개방형 해독틀을 중단시키기 때문에, 첫 번째 면역화 후 대립유전자 502로부터 면역원에 대한 특이성은 선택되지 않는다.
부위-특이적 DNA 재조합효소(516) 발현시, 둘 모두의 중쇄 대립유전자에서 DNA 카세트가 반전된다. 대립유전자 501에서 Itgb7 유전자 카세트의 개방형 해독틀은 이제 중쇄 mRNA와 동일한 전사 배향으로 존재한다. 유효하게, Itgb7 유전자의 종결 코돈 및 폴리-아데닐화 신호 서열은 대립유전자 501로부터 전장 중쇄의 발현을 막는다.
대조적으로, 대립유전자 502는 이제 삽입된 유리한 유전자의 개방형 해독틀이 더 이상 중쇄 mRNA와 동일한 배향이 아니기 때문에 전장 중쇄를 발현시킬 수 있다. 이어서 대립유전자 502는 두 번째 면역화에서 면역원에 반응할 수 있다.
제2 면역성 항원에 대한 특이성을 갖는 B 세포를 회수하기 위해 하이브리도마 또는 다른 클로닝 기술이 활용될 수 있다. 이후 이러한 B 세포는 이들이 또한 제1 면역성 항원에 대해 특이성을 부여하는 재배열된 중쇄 유전자를 갖는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
실시예 4. 2개 이상의 항원에 의한 동시 면역화 후 이중특이적 항체의 분리를 허용하는 대안적인 공학처리된 중쇄 대립유전자. 본 실시예 4에 대한 도식은 도 6에 묘사되며 실시예 1뿐만 아니라 실시예 3 둘 모두의 일부 요소를 함유한다. 트랜스제닉 마우스는 정상적인 수단에 의해 아이소형 스위치하는 능력이 결여된 2개의 변형된 중쇄 대립유전자를 지니도록 공학처리되었다. 한 중쇄 대립유전자(도 6의 601)에서, Cμ 및/또는 Cδ 중쇄 엑손은 부위-특이적 재조합효소에 대해 바로-배향된 인지 서열의 측면에 위치한다. 추가 다운스트림은 [SEQ ID No. 1 및 2]에 명시된 2개의 중쇄 대립유전자에 대한 돌연변이 Cγ1 cDNA 서열과 같은, 도 2 및 실시예 3에서 대립유전자 201에 대해 기술된 바와 같은 중쇄-간 이종이합체화를 위한 CH3 돌연변이를 함유하는 Cγ1 엑손이다. 대립유전자 601은 정상적인 B 세포 발달을 지지할 수 있는데, 그 이유는 어셈블링된 VH 엑손으로부터 전사된 이의 개방형 해독틀이 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열에 의해 중단되지 않기 때문이다. 두 번째 중쇄 대립유전자(도 6의 602)에서, 동일한 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 바로-배향된 인지 서열(609)의 측면에 있는 DNA 카세트(610)가 J 유전자(605)의 다운스트림에 삽입된다. 따라서, 대립유전자 602에서 인-프레임 VDJ 어셈블리는 DNA 카세트(610)가 이의 개방형 해독틀을 파괴하도록 설계되었으므로 전장 중쇄를 발현시키는 능력을 박탈 당한다. 이들 요소의 추가 다운스트림은 대립유전자 601에 의해 인코딩되는 돌연변이 IgG1 중쇄와의 이종 회합을 위한 상보적인 CH3 돌연변이를 함유하는 Cγ1 엑손이다.
바람직한 구성에서, 실시예 3에서와 같이, 대립유전자 602의 삽입된 DNA 카세트는 VDJ 재조합으로부터 인-프레임 VH 엑손을 성공적으로 어셈블링한 B 세포에 생존, 기능, 또는 선택 이점을 제공하는 유전자로부터의 개방형 해독틀을 포함한다. DNA 카세트는 또한 스플라이스 억셉터 및 유리한 유전자의 개방형 해독틀에 선행하는 2A 펩티드 서열을 함유한다. 중요하게는, 2A 펩티드는 또한 유리한 유전자가 인-프레임 VH 엑손을 성공적으로 어셈블링한 B 림프구에서만 발현되고, 생산적 VDJ 재배열이 결여된 B 세포에서는 발현되지 않을 것을 보장한다.
부위-특이적 DNA 재조합효소의 발현이 도입될 때, 부위-특이적 DNA 재조합효소에 대한 인지 서열의 측면에 있는 개제 DNA 세그먼트는 둘 모두의 중쇄 대립유전자에 의해 절제된다. 후속하여, 둘 모두의 중쇄는 이제 전장 중쇄 발현에 능력을 갖는다. 실시예 1에 기술된 대로, 2개의 돌연변이 IgG1 중쇄는 세포 표면 발현 및 분비에 대해 서로 상호 의존적이다. BCR의 세포 표면 발현이 또한 성숙 B 세포의 생존에 요구되기 때문에, 어느 한 돌연변이 중쇄 대립유전자만의 발현은 B 세포 사멸을 초래할 가능성이 있다(예를 들어, 문헌[Lam, et al., Cell 90:1073-1083 (1997)] 참조).
실시예 1에서와 같이, 본 실시예의 트랜스제닉 마우스의 성숙 B 세포는 하나의 경쇄와 함께 세포 당 2개의 기능적 중쇄를 보유한다. 트랜스제닉 마우스는 후속하여 2개 이상의 관심 항원으로의 동시 면역화에 이용될 수 있다. 이중특이적 항체를 갖는 하이브리도마는 표준 방법을 이용하여 생성된다.
예를 들어, 예시적인 구체예에서, 둘 모두의 중쇄 대립유전자(601, 602)의 V(603), D(604), 및 J(605) 유전자는 Wabl 및 Killeen에 의해 공동-계류 중인 출원인 미국 공개 2013/0219535호에 기재된 대로 마우스 조절 서열과 함께 인간 코딩 서열을 포함한다. 야생형 마우스에서 발견되는 중쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 중쇄 "인트론" 인핸서의 서열(606)뿐 아니라 모든 다운스트림 요소는 LOCUS: NG_005838 (1..180,971)에 기재되어 있다. 대립유전자 601에서, 모든 다운스트림 아이소형의 Cδ 및 CH 엑손을 함유하는 8,608..168,728에 걸친 서열은 결실된다. 추가로, 대립유전자 601의 Cμ 엑손(유전자좌의 171230..175134)은 2개의 바로 배향된 표준 loxP 부위의 측면에 위치한다. 대립유전자 602에서, 모든 아이소형의 CH 엑손을 함유하는 유전자좌의 8,608..175,134에 걸친 서열은 결실된다. 2개의 바로 배향된 loxP 부위의 측면에 있는 Itgb7 DNA 카세트는 유전자좌의 대략 위치 178,000에 삽입된다. 둘 모두의 대립유전자에서 3' loxP 부위의 다운스트림은 변형된 Cγ1 엑손(요소 611, 612)의 서열이다. 둘 모두의 요소 611 및 612의 엑손 4는 자가-이합체화에 비해 서로 이종이합체화되는 것을 선호하도록 돌연변이된다. 둘 모두의 중쇄 대립유전자의 돌연변이 Cγ1 cDNA 서열은 [SEQ ID No. 1 및 2]에 명시된다.
전술한 설명은 단지 본 발명의 원리를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 본원에 명시적으로 기재되거나 도시되지 않았어도 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 정신 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자가 기술을 발전시키는데 기여한 개념을 이해하도록 돕기 위해 의도된 것이며, 그러한 구체적으로 열거된 예 및 조건으로 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 양태, 및 구체예뿐만 아니라 이의 구체적인 실시예를 기재한 본원의 모든 설명은 이의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 이러한 등가물은 현재 알려진 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조와 무관하게 동일한 기능을 수행하도록 개발된 임의의 요소 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 도시되고 설명된 예시적인 구체예에 한정되지 않도록 의도된다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구 범위에 의해 구현된다. 이어지는 청구 범위에서, "수단"이라는 용어가 사용되지 않는 한, 그 안에 열거된 특징들 또는 요소들 중 어떤 것도 35 U.S.C. §112, ¶6에 따른 수단 및 기능의 제한으로 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Trianni, Inc.
<120> Enhanced Production of Immunglobulin
<130> TRIA009PCT2
<140> Submitted Herewith
<141> 2016-08-24
<150> 62/209267
<151> 2015-08-24
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgaa accccgggag gagcagatca acagcacttt ccgttcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaagaaaa agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac aaacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatgaagac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctgggc tgcaactgga cgagacctgt gctgaggccc aggacgggga gctggacggg 1020
ctctggacga ccatcaccat cttcatcagc ctcttcctgc tcagtgtgtg ctacagcgct 1080
gctgtcacac tcttcaaggt aaagtggatc ttctcctcgg tggtggagct gaagcagaca 1140
ctggttcctg aatacaagaa catgattggg caagcaccct ag 1182
<210> 2
<211> 1182
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgaa accccgggag gagcagatca acagcacttt ccgttcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataga taacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacgataac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcgatct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctgggc tgcaactgga cgagacctgt gctgaggccc aggacgggga gctggacggg 1020
ctctggacga ccatcaccat cttcatcagc ctcttcctgc tcagtgtgtg ctacagcgct 1080
gctgtcacac tcttcaaggt aaagtggatc ttctcctcgg tggtggagct gaagcagaca 1140
ctggttcctg aatacaagaa catgattggg caagcaccct ag 1182
<210> 3
<211> 1182
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgaa accccgggag gagcagatca acagcacttt ccgttcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac aaacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctgggc tgcaactgga cgagacctgt gctgaggccc aggacgggga gctggacggg 1020
ctctggacga ccatcaccat cttcatcagc ctcttcctgc tcagtgtgtg ctacagcgct 1080
gctgtcacac tcttcaaggt aaagtggatc ttctcctcgg tggtggagct gaagcagaca 1140
ctggttcctg aatacaagaa catgattggg caagcaccct ag 1182
<210> 4
<211> 627
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion of splice acceptor, mus musculus Itbg exon 15 with stop
codon, mus musculus Itgb7 intron, mus musculus Itgb7 exon with
stop codon untranslated region, and polyadenylation sequence
<400> 4
cagagggagt ggatcacacc cgtgccatca tactgggctg cacagggggc atcgtggcag 60
tgggactagg gctggttctg gcttactgac tctctgtgga aatctacgac cgacgggagt 120
acaggcgctt tgagaaggag cagcagcaac tcaactggaa gcaggtgagg ccagcgactg 180
ctgccacagg ctgggctttc ctggtgacgt ctcttaactt tctgtatccc taacacataa 240
ccagctctaa agcttccccg tgcaagtccc tccctcggca taaccaggcc tcggagatct 300
ggcctcgtgg ggcaggtagt ggggagagcc tgatagtttt ccttactgtg tgcaatgttt 360
tcccacagga caacaatcct ctctacaaaa gtgcgatcac aaccactgtc aacccccgct 420
tccaagggac aaacggtcgg tcgccatccc tctctctgac cagggaagca gactgactta 480
ggattcttgt cttggaggac agtggagata gaagggcagg gcagcgtctg tcaggcaaag 540
atgctgccac cgctgagatt tttcagagtg accttcagag ggcagcagcc attcccacca 600
cacgaagggc tggtccttcc ataataa 627
<210> 5
<211> 757
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion construct of splice acceptor, linker, PTV-1-2A peptide,
mus musculus Bcl2 open reading frame, mus musculus 3'
untranslated region, and polyadenylation signal
<400> 5
cagggatccg gagccacgaa cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac 60
cccggtccta tggcgcaagc cgggagaaca gggtatgata accgggagat cgtgatgaag 120
tacatacatt ataagctgtc acagaggggc tacgagtggg atgctggaga tgcggacgcg 180
gcgcccctgg gggctgcccc cacccctggc atcttctcct tccagcctga gagcaaccca 240
atgcccgctg tgcaccggga catggctgcc aggacgtctc ctctcaggcc cctcgttgcc 300
accgctgggc ctgcgctcag ccctgtgcca cctgtggtcc atctgaccct ccgccgggct 360
ggggatgact tctctcgtcg ctaccgtcgt gacttcgcag agatgtccag tcagctgcac 420
ctgacgccct tcaccgcgag gggacgcttt gccacggtgg tggaggaact cttcagggat 480
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 540
agcgtcaaca gggagatgtc acccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 600
ctgaaccggc atctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggtagg tgcatgtctg 660
gttgaatgag tctgggcttt gatctcaagg ccaagatgcg caggttgggg tgtgagtgga 720
ttctgggtca aaatgggcca ttgagcagat gaaataa 757
Claims (20)
- B 림프구 각각이 세포 당 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시킬 수 있는 B 림프구의 선택을 가능하게 하는, 손상된 면역글로불린 중쇄 유전자 대립유전자 배제를 갖는 유전자 변형 동물.
- 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 유전자의 하나 이상의 불변 영역-인코딩 부분 내의 엑손이 변경되어, 대립유전자 배제가 발달 중인 B 림프구에서 V(D)J 재배열 후에 발생하지 않는 유전자 변형 동물.
- 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 변경이 면역글로불린 중쇄 유전자의 하나 이상의 불변 영역-인코딩 부분 내의 엑손들 중 하나 이상의 발현의 유도성 불활성화 및/또는 활성화를 가능하게 하는 유전자 변형 동물.
- 제1항의 유전자 변형 동물로부터의 면역글로불린 중쇄 유전자로서, 하나 이상의 불변 영역 엑손의 일부 또는 전부가 동일한 면역글로불린 중쇄 유전자에서 재배열된 V(D)J 유전자 세그먼트에 비해 반대의 해독틀 배향으로 배치된 면역글로불린 중쇄 유전자.
- 제1항의 유전자 변형 동물로부터의 면역글로불린 중쇄 유전자로서, DNA 카세트가 동일한 염색체에서 재배열된 V(D)J 유전자 세그먼트로부터의 불변 영역 엑손의 발현을 방지하기 위해 삽입되는 면역글로불린 중쇄 유전자.
- 제1항에 있어서, 2개의 상이한 항원이 동시에 주입되거나, 하나의 항원 이후에 제2의 상이한 항원이 주입될 때, B 림프구 각각이 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시키거나, 순차적으로 발현시킬 수 있는 B 림프구를 생성하는 유전자 변형 동물.
- 제6항의 유전자 변형 동물로부터의 B 세포로서, 2개의 항원 수용체의 이종이합체화가 발달 또는 분화 사건에 의해 가능해지거나, 유도될 수 있는 B 세포.
- 제1항에 있어서, 동물의 개개 B 세포에서 2개의 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자가 서로 효율적으로 동종이합체화되지 않는 유전자 생성물을 발현시키는 유전자 변형 동물.
- 제8항의 유전자 변형 동물로부터의 B 세포로서, 2개의 상이한 중쇄 유전자 생성물의 동종이합체화가 일어나지 않거나, 이종이합체화에 비해 선호되지 않는 B 세포.
- B 림프구 각각이 세포 당 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시킬 수 있는 B 림프구의 선택을 가능하게 하는, 손상된 면역글로불린 경쇄 유전자 대립유전자 배제를 갖는 유전자 변형 동물.
- 제10항에 있어서, 동물의 하나 이상의 면역글로불린 경쇄 유전자 내에서 불변 영역-인코딩 엑손이 변경되어, 대립유전자 배제가 발달 중인 B 림프구에서 VJ 재배열 후에 발생하지 않는 유전자 변형 동물.
- 제10항에 있어서, 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자 중 하나 이상에 대한 변경이 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역-인코딩 부분의 발현의 유도성 불활성화 및/또는 활성화를 가능하게 하는 유전자 변형 동물.
- 제10항의 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자로서, 하나 이상의 불변 영역 엑손의 일부 또는 전부가 동일한 면역글로불린 경쇄 유전자에서 재배열된 VJ 유전자 세그먼트에 비해 반대의 해독틀 배향으로 배치된 면역글로불린 경쇄 유전자.
- 제10항의 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자로서, DNA 카세트가 동일한 염색체에서 재배열된 VJ 유전자 세그먼트로부터의 불변 영역 엑손의 발현을 방지하기 위해 삽입되는 면역글로불린 경쇄 유전자.
- 제10항의 유전자 변형 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자로서, 불변 영역 엑손이 동일한 세포 내의 둘 모두의 중쇄 대립유전자가 아닌 하나의 중쇄 대립유전자와의 회합을 위해 양립할 수 있도록 변형된 유전적으로 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자.
- 제10항에 있어서, 2개의 상이한 항원이 동시에 주입되거나, 하나의 항원 이후에 제2의 상이한 항체가 주입될 때, B 림프구 각각이 세포 당 2개 이상의 상이한 항원 수용체 및/또는 이중특이적 항원 수용체를 공동-발현시키거나, 순차적으로 발현시킬 수 있는 B 림프구를 생성할 유전자 변형 동물.
- 제10항의 유전자 변형 동물로부터 유래된 일차 B 세포, 무한증식 B 세포, 또는 하이브리도마.
- 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 변경이 중쇄만으로 구성된 이중특이적 항체의 생산을 허용하는 유전자 변형 동물.
- 제4항 또는 제5항의 면역글로불린 중쇄 유전자 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역글로불린 경쇄 유전자로부터 전사된 일부 또는 전체 면역글로불린 단백질.
- 제7항, 제9항 및 제17항 중 어느 한 항의 세포로부터 유래된 일부 또는 전체 면역글로불린 단백질.
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