JPH06506105A - 哺乳動物細胞における相同性組換え - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２７、前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、肝細胞、白血球、造血幹細 胞、繊維芽細胞、ＢＳ細胞及び接合体より成る群から選ばれる、請求項２６に記 載の方法。

２８、前記細胞が接合体である、請求項２６に記載の方法。

２９、前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質を特徴とする請求項２６に記載 の方法。

３０、前記タンパク質がｈＳＡである、請求項２９に記載の方法。

３１、約５０ｋｂより長いトランス遺伝子を含んで成る遺伝子導入哺乳動物細胞 。

３２、前記トランス遺伝子がタンパク質を特徴とする請求項３１に記載の細胞。

３３、トランス遺伝子を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物であって：第１と第２　 ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された組換えＤＮＡセグメント（ 各前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有しており；前記！ｌＤＮ Ａフラグメントの３′配列部分は、前記第２　ＤＮＡフラグメントの５′配列部 分と実質的に相同である）を含んで成る哺乳動物。

３４、前記組換えＤＮＡセグメントが少なくとも長さ５０ｋｂである、請求項３ ３に記載の哺乳動物。

３５、前記組換ＤＮＡセグメントがタンパク質を特徴とする請求項３３に記載の 哺乳動物。

３６、前記タンパク質がヒトイムノグロブリンである、請求項３５に記載の哺乳 動物。

３７、前記タンパク質がヒトラクトフェリンである、請求項３５に記載の哺乳動 物。

３８、前記哺乳動物がネズミの種の群から選ばれる、請求項３３に記載の哺乳動 物。

３９、前記哺乳動物がウシの種の群から選ばれる、請求項３３に記載の哺乳動物 。

４０、トランス遺伝子を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物であって：少なくとも第 １１第２及び第３　ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された組換え ＤＮＡセグメント（各前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有して おり；前記第１　ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２　ＤＮＡフラグ メントの５′配列部分と実質的に相同であり、そしてこの第２フラグメントの３ ′配列部分は前記第３　ＤＮＡフラグメントの５′配列部分と実質的に相同であ る）を含んで成る哺乳動物。

４１、前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質を特徴とする請求項４０に記載 の哺乳動物。

４２、前記タンパク質がｈＳＡである、請求項４１に記載の哺乳動物。

４３、前記哺乳動物がネズミの種の群より選ばれる、請求項４０に記載の哺乳動 物。

４４、前記哺乳動物がウシの種の群より選ばれる、請求項４０に記載の哺乳動物 。

４５、５０ｋｂより長いトランス遺伝子を含んで成る遺伝子導入非ヒト哺乳動物 。

４６、前記哺乳動物がネズミの種の群より選ばれる、請求項４５に記載の哺乳動 物。

４７、前記哺乳動物がウシの種の群より選ばれる、請求項４５に記載の哺乳動物 。

４８、前記トランス遺伝子がタンパク質を特徴とする請求項４５に記載の哺乳動 物。

明細書 哺乳動物細胞における相同性組換え 本出願は１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７１５７４．７４ ７号の一部係属出願である。

発明の技術分野 本発明は小さめのＤＮＡフラグメントの相同性組換えによりＤＮＡセグメントを 細胞内で生産することによって遺伝子導入哺乳類細胞及び遺伝子導入非ヒト哺乳 動物を作製する方法、並びにかかる方法により生産される遺伝子導入細胞及び遺 伝子導入非ヒト哺乳動物に関する。

発明の背景 遺伝子導入細胞又は動物はそのゲノムの中に１又は複数のトランス遺伝子（導入 遺伝子）を含んでいる。トランス遺伝子はゲノムの遺伝子座に組込まれたＤＮＡ 配列であり、このトランス遺伝子のＤＮＡ配列はそのゲノムにおけるその遺伝子 座にて通常見い出されないものである。トランス遺伝子は外来ＤＮＡ配列（他の 種のゲノムの中に通常見い出せる配列）より成るか、又は同族ＤＮＡ配列（同じ 種のゲノムに由来する配列）より成りつる。遺伝子導入動物が報告されている。

例えば、米国特許第４．７３６．８６６号はｃ−ｍｙｃ癌遺伝子を含む遺伝子導 入マウスを開示している。遺伝子導入動物の他の報告には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ３２１０４４４３号（マウス接合体の前核に導入したウサギβ−グロブリン遺伝 子ＤＮＡフラグメント）；ＥＰＯ公開番号０．２６４．１６６号（哺乳動物組織 の特異的発現のための、乳漿酸性タンパク質プロモーターのコントロール下にあ るＢ型肝炎表層抗原及び組織プラスミノゲン活性剤遺伝子）；　ＥＰＯ公開番号 第０．２４７．４９４号（種々の型のインスリンをコードする外来遺伝子を含む 遺伝子導入マウス）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ３８１００２３９号（乳漿タンパク質 プロモーターのコントロール下にある、■因子をコードするＤＮＡの組織特異的 発現）；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ３８１０１６４８号（Ｉ１１乳動物ラクトーゲン ー誘発性調節領域及び外来タンパク質をコードする構造領域を含んで成る組換え 発現系を含む哺乳動物分泌細胞を有する遺伝子導入哺乳動物）；並びにＥＰＯ公 開番号第０．２７９．５８２号（遺伝子導入マウスにおける、ラットβ−カゼイ ンプロモーターのコントロール下にあるクロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼの組織特異的発現）が含まれる。

遺伝子導入植物も提供されている。例えばＨｉａｔｔらの米国特許第４、８０１ ．５４０号は、発現にとって反対の方向に配向しているトマトのポリガラクツロ ナーゼ（ＰＧ）をコードするＤＮＡを含む植物発現ベクターによる植物細胞の形 質転換を開示している。この遺伝子から発現されるアンチセンスＲＮＡは、翻訳 を抑制するように内因性ＰＧｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能であると 報告されている。

今迄に動物及び植物に導入されているトランス遺伝子は比較的短い長さである（ 一般に約５０ｋｂ以下）。しかしながら数多くの真核生物遺伝子は大きなゲノム ＤＮＡ＠域を有し、これは通常ｍＲＮＡをコードするその配列領域（エキソン） の間に非常に多くの介在配列（イントロン）を有する。更に、数多くの真核細胞 遺伝子は調節配列、例えばエンハンサ−１組織特異的レギュレーター、シス作用 因子、及びこの構造遺伝子から時折り数千ヌクレオチド離れて位置していること のあるその他物理的に連結した調節因子と結合している。かかる真核生物遺伝子 の操作はそれらのサイズ及び複雑さにより妨げられている。障害には、大きなり ＮＡ分子の作製、安定性、パッケージング及び物理学的操作における困難性を含 む。

ＤＮＡをクローンするための媒体は、それらが収容できるＤＮＡのサイズに基づ く固有の限界を育する。伝統的なウィルスベクター、例えばラムダファージ及び ＳＶ４０はそれぞれが約５０及び５ｋｂの外来ＤＮＡをパッケージングする限界 を有している。より最近になって、Ｆ及びＰｌを基礎とするクローニング系、並 びに酵母人工染色体のクローニングの利用は、大きなりＮＡの連続断片の増殖を 可能にしている。

酵母人工染色体又はＹＡＣベクターは、酵母染色体に由来する配列をＤＮＡ断片 の末端にリゲートすることによって作られる。このような配列は動源体、２つの 末端小粒（各末端にて）、複製起点及び選択マーカーを含んでいる。末端小粒は クローンすべき特定のＤＮＡ断片の各末端にあり、動源体は一方の末端小粒とク ローンすべきＤＮＡとの間に介在している。いくつかのグループが、このような ＹＡＣベクターの中に５０−２００ｋｂのヒトＤＮＡを含んでいる酵母ライブラ リー５９０２）　、近年、酵母形質転換段階の最中にサイズの偏りを少なくする ポリアミン縮合を利用した酵母ライブラリーが報告されている（ＭｃＣｏｒｍｉ ｃｋら著（１９８９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ６．９９９１−９９９５）。

この方法により生産したライブラリーは４１０ｋｂの平均インサートサイズを有 する。残念ながら、プラスミド又はウィルスベクターと比べてバルクで酵母染色 体を作ることはかなり難しく、且つより長い時間がかかる。更に、酵母細胞当り ｌコピーのＹＡＣベクターしがなく、形質転換又はトランスフェクションのため にはより大量の酵母クローンの増殖が必要となる。最後に、細菌コロニーと比べ て酵母コロニーはスクリーンするのにより大変であり、且つこのような大きなＹ ＡＣ由来線状ＤＮＡセグメントを細菌の中に形質転換させるためにそれらを環状 ＤＮＡの中にリゲートすることは現状可能ではない。

比較的大きなりＮＡ分子を増殖させるその他の方法には、ＰＩクローニング系の 利用を包含している。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、　Ｎ、　（１９９０）Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　８７．１０３−１０７゜この系のための ベクタープラスミドはＰ１パッケージング部位（匹ψを含み、これはベクタープ ラスミドをＰ１バクテリオファージ頭部の中にバックさせることを開始させるの に必要である。このベクタープラスミドはクローンされたインサートに並んでい る２つのＰ　１１ｏｘＰ組換え部位も含み、これはＰＩ膿リすンビナーゼを含む 細胞のＰ１ファージ感染の後に、パッケージ化線状ＤＮＡを環化するのに必要で ある。この系の最大のインサートサイズは約１００ｋｂであると報告され、その 理由はＰＩファージ頭部は１１０−１１５ｋｂのＤＮＡ　Ｌか収容できないから である。

大きなりＮＡ断片を作り、且つ増殖させるその他の近年開発された方法は、Ｆ因 子を基礎とするプラスミドの利用を包含している。報告されているこの方法は、 大きなプラスミドを連続的に組立てるための、Ｅ、　三ｌＪ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）における２つの閉環プラスミドの間での連続相同性組換え段階を利用している 。各組換えのラウンドはプラスミド中のＤＮＡインサートのサイズを大きくする 。この技術を利用して、　ｌ　５０ｋｂのインサートを含むいくつかのプラスミ ドが報告されている（０’　Ｃａｎｎｅｒら著（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　 ２４４．１３０７−１３１２）　、この手法の欠点は多段手順がめんどうであり 、且つ転位人工産物が導入されていないかを確認するために慎重なる分析を必要 とすることにある。

更に、この技術は対象の作製体を含んでいるスーパーコイルプラスミドの生産を 提供するが、にもかかわらずその中に含まれている大きいＤＮＡインサートは切 り出しの際に機械的剪断を受ける。報告によるとこのようなインサートの切り出 しは必要であり、なぜならプラスミドの配列はトランス遺伝子の発現にとってネ ガティブな効果を有するからである（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら著（１９８５）Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

大きなりＮＡ断切を増殖させるためのこのような技術があるにもかかわらず、培 養哺乳動物細胞を形質転換させるのに、及び遺伝子導入動物を作るために比較的 小さいＤＮＡインサート（例えば４０−５０ｋｂ）が使用され続けられている。

本発明は非常に簡単な方法で、相同性組換えを利用することによる上記及びその 他の規制（大きなりＮＡ分子を作製することにおける困難性を含む）を解決する 。多大なる研究が相同性組換えにおいて行われているが、哺乳動物細胞形質転換 における上記の問題の解決はこのような研究からは明らかとなっていない。

遺伝子ターゲツティングとは、細胞の内因性染色体の特定の染色体遺伝子座の、 この特定の内因性配列と相同性を有する外因性ＤＮＡ配列との相同性組換えによ る直接的な改質に関する。遺伝子ターゲツティングは内因性遺伝子の発現を高め る改質する及び崩壊するために利用される（Ｂｏｌｌａｇら著、（１９８９）Ａ ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　２３．１９９−２２５を参照のこと）。

哺乳動物細胞における効率的な遺伝子ターゲツティングの顕著なる障害は、これ らの細胞が、トランスフェクトされたＤＮＡを非相同的に組込む能力を有するこ とにある（ＲＯｔｈとＷｉ　１ｓｏｎ著（１９８９）のｒＧｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ Ｃ０ＩＤｂｉｎａｔｉＯｎＪ　、　ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉとＳｍ１ｔｈ編、 頁６２１−６５３．　ワシントンＤ、　Ｃ，：　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　；Ｂｒ１ｎｓｔｅｒら著（１９８５）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．４４３８〜４４４２、を参照のこと）。

近年、相同性組換えによってゲノムの中にベクターが組込まれた細胞を選別する ための陽性−陰性選択ベクターが詳細されている（例染色体外相同性組換えとは 、２種類の外因性の、トランスフェクトされた、且つ少なくとも部分的に相同な りＮＡ配列の間での、細胞内において起こる相同性組換えに関する。この現象は 報告によれば染色体外遺伝子又はウィルスの「レスキュー（救済）」実験を行う ことにより確認されている（ｖａｎ　Ｚｉｊｌら著（１９８８）、Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、、　６２゜２１９１−２１９５　；　ＭｉｌｌｅｒとＴｅｍ１ｎ（１９８３ ）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２０．６０６−６０９　；　ＷｏｎｇとＣａｐｅｃ ｃｈｉ（１９８７）、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、ヱ、　２２９４−２２ ９５　、そして最近の論文に関しては、Ｂｏｌｌａｇら著（１９８９）、　Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、、２３．１９９−２２５を参照のこと）。これらの研 究において、重複したＤＮＡ断片（典型的には複合して機能的なウィルスを構成 するもの）を培養細胞に導入している。細胞内において、ウィルスのサブフラグ メントは活性ウィルス粒子を再構成するように相同組換えすると報告されている 。例えばｖａｎ　Ｚｉｊｌらは、リン酸カルシウム沈殿を利用して、仮性狂犬病 ウィルスの５つの重複クローン化サブゲノムフラグメントを培養細胞の中にトラ ンスフェクトしている。報告によればいくつかのフラグメントは活性ウィルスを 形成するように組換えする。このような研究は主にライスルゲノムの操作、相同 性組換えのメカニズム並びに種々のめざましい効率性及び精度の解釈を目的とす る。

染色体外相同性組換えのその他の例には、細菌細胞培養物における、２種類の近 親であるが異なるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入が含 まれる。このような親に由来するポリペプチドをコードする遺伝子間の組換えは ハイブリドポリペプチドをコードするバイブリド遺伝子をもたらす。例えば５ｃ ｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｗ、　Ｐ、ら著（１９８１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．２１６９−２１７３　（ｔｒｙｌ）　Ａ） 　；　Ｗｅｂ■■ とＷｅｉｓｓｍａｎｎ著（１９８３）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　 １１．５６６１−５６６９　（アルファーインターフェロン）　；Ｇｒａｙ、　 Ｇ、　Ｌ、ら著（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６６、６３５− ６４３（アルファーアミラーゼ）；及び１９８７年１月１４日に公開されたＥＰ Ｏ公開番号第０．２０８．４９１号を参照のこと。

ある研究室は、マウス接合体における染色体外遺伝子レスキューを報告している （Ｐａｌｍｉｔｅｒら著（１９８５）　：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　Ｅａｒｌｙ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｍｂｒｙｏ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

頁１２３−１３２）。既に、これらの研究者はヒト成長ホルモン（ｈＧ）Ｉ）に 関する遺伝子にマウスメタロチオネイン−Ｉ　（ＭＴ）プロモーターを融合して 、ＭＴ−ｈＧｆ（）ランス遺伝子を発現し、且つコントロールマウスよりも大き く成長する遺伝子導入マウスを作ったことを報告している。その後、これらの研 究者はＭＴ−ｈＧＨＤＮＡ　）ランス遺伝子の２種類の欠失突然変異体の作製を 報告している（Ｐａｌｍｉｔｅｒら著（１９８５）前述）。第１の突然変異体に おいては、ＭＴ−ｈＧＨＤＮＡセグメントの５′部分が欠失している。第２の突 然変異体においては、ＭＴ　−ｈＧＨＤＮＡセグメントの３′側の部分が欠失し ている。報告によれば、これらの研究者はこの欠失突然変異を正常マウス受精卵 の中に、同時導入することにより、遺伝子レスキュー実験に対するコントロール 実験を行っている。得られるマウスの子供のいくつかは報告によれば完全ＭＴ　 −ＨＧＨ遺伝子に対応するｍＲＮＡを発現し、そしてこれらはその同腹の子より も大きく成長した。このレスキューのメカニズムは未だ不明である。

以上に説明してきた文献は本出願の出願日前に関するその開示内容を単に提供し たにすぎない。本発明者は先行発明又は１もしくは複数の先願に基づく優先権に よってかかる開示内容に先行する質格を有していない。

発明の概要 本発明の目的は遺伝子導入哺乳動物細胞及び遺伝子導入哺乳動物を作る方法の提 供にある。本発明の更なる目的は、上記の方法が５０ｋｂより長いトランス遺伝 子を作製することができることを提供することにある。更に、本発明の目的は上 記の方法により作った遺伝子導入哺乳動物細胞及び遺伝子導入哺乳動物を提供す ることにある。

上記の目的に関連して、本発明は哺乳動物細胞に少なくとも２種類のＤＮＡフラ グメントを導入することによって遺伝子導入細胞を作る方法を含む。これらのＤ ＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を育し、ここで第１フラグメントの３ ′配列部分は第２７ラグメントの５′配列部分と実質的に相同である。細胞の中 でこれらのＤＮＡフラグメントは相同組換えして少なくとも５０ｋｂの長さの組 換えＤＮＡセグメントを形成し、これは細胞のゲノムの中に組込まれる。

更に本発明は、哺乳動物細胞に少なくとも第１、第２及び第３フラグメントを導 入することによって遺伝子導入細胞を作る方法も含む。各ＤＮＡフラグメントは ５′及び３′配列部分を有しており、ここでこの第１フラグメントの３′配列部 分はこの第２フラグメントの５′配列部分と実質的に相同である。更に、この＄ ２フラグメントの３′配列部分はこの第３フラグメントの５′配列部と実質的に 相同である。細胞の中でこれらのＤＮＡフラグメントは相同組換えして組換えＤ ＮＡセグメントを形成し、これは細胞のゲノムの中に組込まれる。

本発明は、哺乳動物細胞のゲノムの中に組込まれる、長さにおいて一般的に５０ ｋｂより大きいＤＮＡ分子の複数のコピーを前記細胞の中に導入することによっ て遺伝子導入マウスを作る方法をも含む。

本発明は遺伝子導入哺乳動物を作る方法も含む。これらの実施態様は遺伝子導入 哺乳動物に関して詳細の通りに行われるが、ただしＤＮＡフラグメント又は分子 を哺乳動物接合体又は多分化能性幹細胞、例えばＥＳ細胞に導入している。次に 遺伝子導入哺乳動物を作製するために、この接合体又は多分化能性幹細胞を常用 の方法によって利用する。

更に本発明は、本発明の上記の方法に従って作ったトランス遺伝子を含む遺伝子 導入哺乳動物細胞及び遺伝子導入哺乳動物を含む。

図面の簡単な説明 図１は２種類のＤＮＡフラグメントの相同性組換えによるＤＮＡセグメントの作 製を示す。

図２は３種類のＤＮＡフラグメントの相同性組換えによるＤＮＡセグメントの作 製を示す。

図３は２種類のＤＮＡフラグメントの相同性組換えによるＤＮＡセグメントの作 製を示し、その一方は相同の５′領域の末端に更なるフランキング領域を含んで いる。

図４は３種類のＤＮＡフラグメントの相同性組換えの方法による陽性−陰性選択 ベクターの作製を示す。

図５は遺伝子導入マウスの中でヒト血清アルブミン遺伝子を作製するのに用いた ＤＮＡフラグメントを示す。

図６及び７は実施例１の遺伝子導入マウスに由来する染色体ＤＮＡのサザンプロ ットである。

図８は（消化した及び未消化の）増幅ＤＮＡを含む臭化エチジウム染色アガロー スゲルである。

図９は実施例１のｈＳＡ遺伝子導入マウスに由来する肝ＩＩ　ＲＮＡのノーザン プロットである。

図ＩＯは実施例工のｈＳＡ遺伝子導入マウスにより生産されたｈＳＡを特徴付け するＲＩＡプロットである。

図１１は実施例１のｈＳＡ遺伝子導入マウスにより生産されたｈＳＡを特徴付け るウェスタンプロットである。

好ましい態様の詳細な説明 本発明者の発見によると、２種以上の重複ＤＮＡフラグメントを哺乳動物の接合 体のような組換えコンピテント細胞の中に導入すると、かかるＤＮＡフラグメン トは相同的に組換えしてこの感受性細胞のゲノムの中に組込まれる。この発見は 遺伝子導入分野に限らず、一般的に哺乳動物細胞内での外因性ＤＮＡの操作にお いても広範囲の概念を有している。

本明細書に用いるｒ　ＤＮＡフラグメント」なる語は、トランス遺伝子として哺 乳動物細胞のゲノムの中に組込まれるべきＤＮＡセグメントの断片を称する。各 ＤＮＡフラグメントは、別のＤＮＡフラグメントの配列部分と実質的に相同であ る少なくとも１つの配列部分を有し、従ってもし２種以上のこのＤＮＡフラグメ ントを組換えコンピテント哩乳動物の中に同時導入すると、これらはそれらの相 同領域で相同的に組換えする。好ましくは、この配列相同はこのＤＮＡフラグメ ントの末端又はその近くにある。更に各フラグメントは、それが組換えする他の ＤＮＡフラグメントの配列と相同でないＤＮＡ配列部分を含む。

本明細書で用いる、組換えしたｒ　ＤＮＡセグメント」とは、２以上のＤＮＡフ ラグメントの細胞内相同性組換えにより形成せしめたＤＮＡに関する。このよう なフラグメントの組換えはインビボ相同性組換えによって、ＤＮＡセグメントを 形成するのに用いられるどのＤＮＡフラグメントよりも大きな長さを有するＤＮ Ａセグメントをもたらす。

組換えＤＮＡセグメントを形成せしめるために用いられる複数のＤＮＡフラグメ ントは配列相同領域及び非相同領域を育する異なるＤＮＡフラグメントであるた め、このようにして形成せしめた組換えＤＮＡセグメントは、哺乳動物細胞の中 にＤＮＡの多数のコピーを導入した場合のこの細胞の中で形成されるマルチコピ ーヘッド−ツーテール複合体とは異なる。Ｆｏｌｇｅｒ、に、Ｒ，ら著（１９８ ２）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　２．１３７２−１３８７゜ ２本のＤＮＡフラグメントの組換えにより形成されたＤＮＡセグメントを図１に 示す。この図は第１及び第２　ＤＮＡフラグメントを、この第１と第２７ラグメ ントの組換えにより形成されたＤＮＡセグメントと一緒に示す。ここで見い出せ る通り、第１及び第２フラグメントそれぞれは５′と３′配列部分を有している 。これらのＤＮＡフラグメントの相同性組換えの後、第１　ＤＮＡフラグメント の５′配列部分は組換ＤＮＡセグメントの最も５′側の配列部分となる。同様に 、第２　ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は最も３′側の配列部分となる。

この第１　ＤＮＡフラグメント３′配列部分と第２フラグメント５′配列部分は 実質的に相同であり、且つ図１に示すＤＮＡセグメントの組換え領域に相当する 。これらのフラグメントそれぞれにおける残りのＤＮＡ配列は、このＤＮＡフラ グメント間で相同でない。ＤＮＡフラグメントの選択は本明細書の開示内容及び 実施例に基づいてより明らかとなるであろう。

３本のＤＮＡフラグメントの組換えより形成されたＤＮＡセグメントを図２に示 す。ここでわかる通り、第１配列部分と第１組換え領域は図１の組換えセグメン トに対応する。第２　ＤＮＡフラグメントの３′配列部分及び第３フラグメント の５′配列部分は実質的に相同であり、且つ図２に示すＤＮＡセグメントの第２ 組換え領域に相当する。

ここで、第３　ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は、組換ＤＮＡセグメントの 最も３′側の配列部分となる。図２において３種のＤＮＡフラグメントしか示し ていないが、本発明の実施のうえで３種以上のＤＮＡフラグメントを利用してよ い。

好ましい態様において、二本鎖ＤＮＡを利用する。このような場合、５′及び／ 又は３′の用語は、ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成される組換え ＤＮＡセグメントの一方の鎖に関する上記の配列の方向に関する。鎖の選択は自 由であるが、発現性遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを説明するのに用いる 場合、ＤＮＡセグメントの詳細はセンス鎖上で５′から３′へと読み取られるで あろう。

上記の詳細は、種々のＤＮＡフラグメントの末端に位置している種々の相同配列 部分を記載しているが、これらの配列部分はそのように位置している必要がない ことが理解されるべきである。例えば、図３は図１と、２種のＤＮＡフラグメン トが相同組換えして組換ＤＮＡセグメントを形成することにおいて類似する。し かしながら図３においては、第２　ＤＮＡフラグメントの５′配列部分（これは 第１　ＤＮＡフラグメントの３′配列部分と実質的に相同である）は第２　ＤＮ Ａフラグメントの５′末端に位置していない。この５′配列部分はＤＮＡフラグ メントでその３′配列部分に対して５′に並んでいるが、この５′配列部分に対 して更に５′側にある非相同配列がある。相同組換えの間、相同でないかかる５ ′　（又は３′）末端領域は切り出され、その結果、得られるＤＮＡセグメント から除外される（図３参照）。

本発明は任意の「組換えコンピテント哺乳動物細胞」において実施できる。この ような細胞は、実質的に相同な領域を含むＤＮＡフラグメントを相同的に組換え ることができるものとして機能的に規定されつる。このような細胞は内因性リコ ンビナーゼを含むものか、又はこのようなリコンビナーゼ及びＤＮＡ組換えを仲 介するのに必要なその他の必須成分を含むように遺伝子操作されたものである。

組換えコンピテント哺乳動物細胞の側には、内皮細胞、上皮細胞、胚芽細胞、肝 細胞、白血球、造血幹細胞、繊維芽細胞、通常の培養細胞、例えばＨｅＬａ細胞 及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、並びに胚種的細胞が含まれる 。

本明細書で用いる「胚種的細胞」とは、この胚種的細胞のゲノムにより哺乳動物 生殖系列を増殖させることができ、且つこの胚種的細胞を起源とするゲノム材料 をかかる哺乳動物の子孫へと伝搬することのできる任意の細胞として定義する。

胚種的細胞の例には、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ及び非人類霊長類、並びにラ ット、ウサギ及びギニアビッグに由来するような接合体が含まれる。特に好まし いのは、ネズミ、ウシ及びブタの種、好ましくはネズミ及びウシの種、そして最 も好ましくはネズミの種の接合体である。

本発明の実施において育用なその他の胚種的細胞には胚幹細胞（ＥＳ細胞）が含 まれる。ＢＳ細胞はインビトロで培養した着床前の胚Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１． 　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　８３．９０６５−９０６９　；及びＲｏ ｂｅｒｔｓｏｎら著（１９８６）B Ｎａｔｕｒｅ、３２２．４４５−４４８）　、このようなＥＳ細胞はウシ、ネズ ミ、ヒツジ、ブタ及び非人類霊長類の種、並びにラット、ウサギ及びギニアビッ グを含む数多くの任意の種に由来しうる。ＥＳ細胞は好ましくはマウス又はラッ ト起源、最も好ましくはマウス起源である。

組換えコンピテント哺乳動物へのＤＮＡフラグメントの導入方法は、複数種のＤ ＮＡ分子の同時形質転換を満足せしめる任意の方法によるものでありうる。接合 体又はＢＳ細胞へのＤＮＡフラグメントの導入方法は、接合体（受精した卵母細 胞）の場合は前核、又はＥＳ細胞の場合は核へのマイクロインジェクションが好 ましい。他方、本発明のＤＮＡセグメントはリン酸カルシウム仲介形質転換によ り適当なりＮＡフラグメントを導入することによってＢＳ細胞の中で形成されう る。硫酸デキストラン仲介形質転換及び当業者に知られているその他の方法、例 えばエレクトロポレーションも利用できる。

一般に、遺伝子導入に関して接合体を標的とするとき、本明細書の方法に従って 得られる第１世代遺伝子導入哩乳動物はトランス遺伝子に関してヘテロ接合又は キメラであろう。従ってこのトランス遺伝子は一般にこの遺伝子導入哺乳動物の 全ての体細胞及びそれが提供する配偶子の半分において見い出せるであろう。従 って、本発明はトランス遺伝子に関してホモ接合である子孫、即ち、二倍体動物 細胞当り２コピーのトランス遺伝子が存在している子孫（一方は母性染色体内に 含まれ、そして他方は関連の父性由来染色体内に含まれている）を形成するよう 、２種類のこのようなヘテロ接合遺伝子導入動物を飼育することも提供する。こ の場合、このトランス遺伝子は、一般に提供される配偶千金てを含む、動物の全 ての有核細胞の中に見い出され、従ってその後の子孫に常に継代されるであろう 。この接合体より提供される第１世代動物がキメラ動物（即ち、その一部の細胞 のみがトランス遺伝子を含む）である可能性もある。

これは例えば、初期の胚細胞がそのトランス遺伝子を失った場合、又はマイクロ インジェクトされた接合体のゲノムがトランス遺伝子が組込まれる前に複製した 場合に起こりつる。遺伝子導入細胞の子孫が生殖系列の中で存在している限り、 このようなキメラ動物の子孫から遺伝子導入動物を得ることが可能である。

ＢＳ細胞の場合において、着床及び妊娠後に得られる動物は一般にキメラ（モザ イク）動物であり、このような動物に由来する細胞のサブ集団はこのＤＮＡセグ メント（トランス遺伝子）を含む。このような動物は当業者によく知られた方法 によって交雑繁殖させて、動物の体細胞及び生殖系列細胞のそれぞれの中に該Ｄ ＮＡセグメントを含む完全な遺伝子導入動物を形成せしめることができる。

組換えＤＮＡセグメントは任意の特定のＤＮＡ配列に限定されない。

コード配列は全つくの合成起源であるか（あつらえの合成核酸を日常的に自動化 ＤＮＡ合成装置により得るか、又は商業的に購入できつる）、又はｍＲＮＡ配列 の逆転写に由来するか、もしくはゲノムＤＮＡ配列に直接由来しつる。遺伝子導 入細胞及び動物を作成するのに利用するＤＮＡは好ましくは、ｃＤＮＡよりもゲ ノムＤＮＡを含んで成る。その理由は、トランス遺伝子の発現を組織特異的発現 及び時期特異的発現に限定することが好ましいからである。このトランス遺伝子 がゲノムＤＮＡに由来するとき、重要なシス作用調節配列、例えばエンハンサ− 及びその他の調節因子が、イントロンの中であるか又はその構造遺伝子から離れ た領域の中で含まれていることができる。このような調節配列は転写及びＲＮＡ プロセシングの際に失われ、従ってｃＤＮ八由へトランス遺伝子からは一般に得 られない。

ゲノムＤＮＡに由来する配列は一般に遺伝子の少なくとも一部をコードするだろ うが、しかし他方、非転写ＤＮＡ領域をコードするか又は非組換え遺伝子座の領 域をコードすることができる。後者の例はイムノグロブリン及びＴ細胞抗原レセ プター遺伝子座が含まれる。

しかしながら一般に、該ＤＮＡセグメントはＲＮＡ転写体；好ましくはポリペプ チドをコードするｍＲＮＡ転写体をコードする配列を含む。重要なポリペプチド の例には乳タンパク質、例えばラクトフェリン、リゾチーム、ラクトアルブミン 、胆汁酸塩−刺激化リパーゼ、分泌イムノグロブリン等：血清タンパク質、例え ばアルブミン、イムノグロブリン、■因子、■因子、組織プラスミノゲン活性剤 等：並びにその他のタンパク質、例えばシストロフィン、嚢胞性繊維症関連タン パク質及び工業的に重要な酵素が含まれる。工業的に重要な酵素の例には細菌及 び菌類のプロテアーゼ、リパーゼ、キチナーゼ及びリギナーゼが含まれる。

本発明のＤＮＡ分子及びセグメントは遺伝子治療のためにも利用されつる。例え ば、ある種の固体は有害な表現型を提供するＩ又は複数の欠陥遺伝子を有しうる 。このような場合において、特定の細胞の集団、例えば骨髄幹細胞、肺幹細胞等 をこの固体から抽出し、次いでこのような幹細胞の中に正常の野生型遺伝子を導 入する本明細書に記載の方法及び組成物によって改質して（ランダム組込み又は 遺伝子ターゲツティングのいづれかにより）この有害な表現型に関連する病因を 治す又は緩和することができる。このように改質せしめた細胞を次にこの固体に 再導入して、所望の遺伝子を有する成熟細胞のタイプの子孫を発生させる。この ような遺伝子治療の例には正常な嚢胞性繊維遺伝子、正常なヘモグロブリン遺伝 子等をコードする遺伝子セグメントの作製が含まれる。

トランス遺伝子をコードするポリペプチドが適切な調節配列をも含むとき、これ はポリペプチドの発現を及ぼす。一般に、組織特異的及び／又は時期特異的発現 をもたらすシス作用調節配列コントロール発現が選ばれる。更に、このようなポ リペプチドのある程度の分泌を所望するとき、組織特異的発現が生ずる特定の細 胞タイプにおいて機能する分泌シグナル配列をコードする適当なりＮＡ配列を本 発明に従って形成せしめたＤＮＡセグメントの中に含ませることもできる。組換 えＤＮＡセグメントのためのＤＮＡ配列の選択は、特定のポリペプチド又は特定 の用途に従って、当業者により容易に明らかとなるであろう。

本発明のある態様において、該ＤＮＡフラグメントは［重複」遺伝子部分である 。しかしながら、本発明は非重複ＤＮＡフラグメントも含み、この場合、相同領 域は少なくとも一方のフラグメントの少なくとも一端にリゲートされたヌクレオ チド配列である。好ましい態様において、少なくとも２種類の異なるＤＮＡフラ グメントはその５′及び３′末端それぞれにリゲートされた実質的に相同な合成 りＮＡ配列を有する。

該ＤＮＡセグメントを組立てるのに必要とされるＤＮＡフラグメントの種類の数 及び組換え作業の回数は相間領域の長さ、ＤＮＡフラグメントの長さ及び組換え ＤＮＡセグメントの長さに依存する。相同領域の長さは相同の程度になる程度依 存する。本明細書で用いる、２種類のＤＮＡ配列間の「実質的な相同」とは、こ れらの配列部分が十分に相同であり、これらのＤＮＡフラグメントを組換えコン ピテント細胞の中に同特導入すると検出可能な組換えが促進されることを意味す る。２種類の配列部分は、もしそのヌクレオチド配列が他方のものと少なくとも ４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、そし て最も好ましくは１００％同一であるならば、実質的に相同である。この理由は 、相同性の値における低下は、対応する有効な相同性組換えの頻度の低下をもた らすからである。配列相同性に対する実際の低限界値は、相同の程度であって更 に下げることによって組換えコンピテント哺乳動物細胞におけるＤＮＡフラグメ ントの検出可能な相同性組換えが仲介されなくなるような相同の値として機能的 に定義できる。

相同配列部分の間で非相同性が存在しているとき、この非相同性は相同配列部分 全体にわたって分布しているのではなく、むしろこの相同配列部分とは別の領域 にあることが好ましい。あらゆる場合において、相同性の程度が低いほど、相同 性組換えを促進するために相同領域を長くすべきである。哺乳動物細胞における 相同性組換えのためには１４ｂｐの１００％相同ぐらいで十分であるが（Ｒｕｂ ｎｉｔｚ、　Ｊ。

とＳｕｂｒａｍａｎｉ、ら、（１９８４）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ 、　、　４．２２５３−２２５８）　、各相同配列に関してより長い相同配列部 分、例えば５００ｂｐ、より好ましくは１０００ｂｐ、次に最も好ましくは約１ ８００ｂｐ、そして最も好ましくは１８００ｂｐが好ましい。

正しい遺伝子導入（正しい組換え及び完全なりＮＡ上セグメント組込み）の頻度 は、ＤＮＡフラグメントの種類の数、種々の重複領域の相同性のサイズ及び程度 、並びに組換えたＤＮＡセグメント及び宿主ゲノムにおける固有の性質に依存す る。いくつかの態様において、正しい遺伝子導入の頻度は選別を必要としないほ ど十分に高い。例えば接合体の場合において、相同性組換え及び組込みの頻度は 組換え体の選別のための手段を利用せずに大量の接合体をマイクロインジェクト することが不可能でないほどである。即ち、トランス遺伝子は、相同性組換えに 基づいて選択表現型を授ける陽性選択マーカーをコードする必要がない。しかし ながら、形質転換に基づいて選択表現型、例えばネオマイシン耐性を授ける遺伝 子、をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡフラグメントのいづれかに、このような選 択遺伝子を含ませることによって利用できる。

好ましくは、遺伝子導入動物を得るためにマイクロインジェクトするべき接合体 の数は１．０００以下、より好ましくは２００以下である。

動物へと発育するマイクロインジェクトせしめた接合体のパーセンテージは好ま しくは少なくとも１％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なく とも２５％である。生まれた動物のうち、好ましくは少なくとも１％、より好ま しくは少なくとも１０％が遺伝子導入型である。生まれた遺伝子導入動物のうち 、好ましくは少な（とも１０％、より好ましくは少なくとも５０％が完全な組換 えＤＮＡセグメントのコピーを含む。

本発明の態様において、該ＤＮＡフラグメントは任意の実用的な長さである。そ の最小サイズは、相同性組換えを促進せしめるのに十分なる相同の長さの領域が あるとの要件のみにより規制される。各ＤＮＡフラグメントは好ましくは約５０ ｋｂ、より好ましくは約１００ｋｂの長さを有する。しかしながらＤＮＡフラグ メントは１００ｋｂより長くてもよい。たとえこのフラグメントの長さが、この ようなフラグメントの操作の際に実質的なサブフラグメンテーションを起こすよ うな長さであったとしても、このようなフラグメントを相同性組換えによるＤＮ Ａセグメントの形成に利用できる。その理由は、このようなサブフラグメントは 互いに組換えをしてフラグメントを再構成することができるからである。これは 、多数のフラグメントのコピーを利用し、且つフラグメンテーションパターンが ランダムであり、従ってサブフラグメントが重複した相同領域を育する場合に起 こる。

このような状況においては、該ＤＮＡフラグメントは以下に記載の通り、同−ｒ 　ＤＮＡ分子」であると考えられることができる。

ＤＮＡセグメントは数百塩基対のｃＤＮＡクローンぐらいの小ささであるか、又 は組織特異性及び時期特異性を得るのに必要な調節領域を含む数メガの塩基の遺 伝子座ぐらいの大きさでありうる。好ましくは、組換えしたＤＮＡセグメントは ３．５〜１０００ｋｂ、好ましくは５０〜５００ｋｂ；より好ましくはｉｏｏ〜 ５００ｋｂ　、そして最も好ましくは２００〜５００ｋｂの長さを有する。しか しながら、このような組換えＤＮＡフラグメントは１０００ｋｂより大きくてよ い。

本発明の更なる他の態様において、一般的に少なくとも約５０ｋｂの長さ、好ま しくは少なくとも７５ｋｂの長さ、より好ましくは少なくとも１００ｋｂの長さ 、そして最も好ましくは少なくとも２００ｋｂの長さの同−ｒ　ＤＮＡＮＡ分子 少なくとも２つ、組換えコンピテント哩乳動物細胞の中に直接導入する。機械剪 断がこのような大きなりＮＡ分子を断片化することができるが、得られるフラグ メントはランダムなサイズとなる。更に、分子の多数のコピーを同時に導入する ため、機械剪断又はその他のプロセスは重複フラグメントのプールを提供する。

細胞の中で、重複フラグメントは次にその相同領域で組換えをする。十分な数の ＤＮＡ分子を例えばマイクロインジェクションにより導入した場合、生ずる重複 フラグメントの数は、少なくともｌっの完全組換え分子が少なくとも２本のフラ グメントの相同性組換えによって細胞の中で形成されるような数である。

マイクロインジェクションにより導入する場合、ＤＮＡ分子のコピーの数はＤＮ Ａ分子のサイズにある程度依存するであろう。一般に、マイクロインジェクトす る溶液の容量が細胞のサイズにより規制され、且つ溶液の濃度がマイクロインジ ェクション操作の粘度規制によって記載されるため、少なめの数のコピーがマイ クロインジェクトされる。一般に、２〜１，０００、好ましくは１０〜２００　 、最も好ましくハ２５〜１００のＤＮＡ分子をマイクロインジェクトする。

ＹＡＣベクター、ＰＩを基礎とするベクター及びＦを基礎とするプラスミドを含 む、このような大きなりＮＡ分子をクローニングするための方法は報告されてお り、そして上記に説明した。マイクロインジェクションした分子のフラグメンテ ーションは、平行試験サンプルを同じ剪断力にかけることによって確認できる。

次に試験サンプルのフラグメンテーションを電気泳動技術、電子顕微鏡、勾配遠 心又はその他の当業者に知られている技術によって独立に決定する。

遺伝子導入動物のゲノムの中にランダムに組込まれつるＤＮＡセグメントの形成 に加えて、本発明はＥＳ細胞を選別するのに用いることのできる陽性−陰性選択 ベクターに相当するＤＮＡセグメントの作製を含む。ここでこのベクターはゲノ ムの中に特定部位にて組込まれ陽性−陰性選択ベクターに相当するＤＮＡセグメ ントの作製は図４に示している。ここで示している通り、陰性選択ベクターはＰ ＮＳベクター（ｒ　ＰＮＳセグメント」と呼ぶ）の３′末端に位置する。ＰＮＳ ベクターのイントロン内にあるのは陽性選択マーカーである。図４のＰＮＳベク ターにおいて２つの標的領域も示し、それぞれは導入すべきＥＳ細胞のゲノム内 の標的ＤＮＡ配列と相同である。ＰＮＳベクターの非相同性ランダム組換えが起 こると、陰性選択マーカーは組込まれる。このようなＰＮＳベクターを含む細胞 をその後選別する。ＰＮＳベクターが標的領域を介して相同性組換えによってゲ ノムの中に組込まれたなら、陰性選択マーカーは切り出され、従ってゲノムの中 に含まれなくなる。このような相同性組換えが起きた細胞は、イントロン内に含 まれている陽性選択マーカーに基づいて選別されつる。

本発明に従ってこのようなＰＮＳベクターを作製するのに用いられるＤＮＡフラ グメントも図４に示している。示している通り、重複領域を含む３種のＤＮＡフ ラグメントを、ＥＳ細胞の核の中への同時マイクロインジェクションによるＰＮ Ｓベクターの作製に用いている。異なるＤＮＡフラグメント間の対応の重複領域 を示し、そしてＰＮＳベクターにおいて示している組換え領域に対応させている 。相同性組換えによってＤＮＡセグメントが組込まれたＥＳ細胞を選別し、その 後トランス遺伝子としてこのＤＮＡセグメントを含むキメラ動物を得るために受 容雌動物の中に着床させる。

以下の実施例において、ヒト血清アルブミンをコードする組換えＤＮＡセグメン トを適当なりＮＡフラグメントの同時導入によってマウス接合体の中で形成させ ている。これより得られる遺伝子導入マウスは、マウスの肝臓においてヒト血清 アルブミン含有遺伝子セグメントの組織特異的発現を示した。

実施例２及び３に更に示している通り、転位させていないヒトイムノグロブリン 遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントは、マウス接合体の前核の中にマイクロ インジェクトすると相同組換えする。実施例２において、２種類のＹＡＣ由来フ ラグメントをマイクロインジェクトして相同性組換えさせて、より大きな組換え ＤＮＡセグメントを作っている。実施例３においては、大きな非縮合ＹＡＣＤＮ Ａ分子の複数のコピーをマイクロインジェクトしている。マイクロインジェクシ ョンに関するプロセスは、このような大きなりＮＡ分子に機械剪断力をかけさせ つる。しかしながら、形成された場合に生ずるフラグメントは、マイクロインジ ェクトしたＤＮＡ分子と配列において相当する組換えＤＮＡセグメントを再生す るように相同組換えすることができる。

特定の実施例は本発明にとっての最良の態様を開示しているが、本発明の範囲を 逸脱することなくあらゆる改良が本開示内容になされることが当業者にとって明 らかであろう。

実施例１ インビボ相同性組換えにより作製したヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）トランス遺 伝子を含む遺伝子導入マウス遺伝子導入マウスの中でｈＳＡ遺伝子を作製するた めに３種の重複ゲノムｈＳＡクローンを利用した。３種のクローンはλＨＡＬ− ＨＡ　１　。

る。簡単に述べると、ゲノムライブラリーをヒト繊維芽細胞ＤＮＡのＥｃｏＲ１ 部分消化より作製した。クローンλＨＡＬ−３Ｗに関しては、このライブラリー の３！Ｐ−標識ヒトアルブミンゲノムクローンとの、３ＸのＳＳＣ及びＩＯＸの デンハーヅ溶液の中でのプレハイブリダイゼーションの後の、ＩＭのＮａＣ１， ５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の ＳＤＳ、１００μｇ　／ｍｌの剪断処理サケ精子ＤＮＡ及びｌＯＸのデンハーヅ 溶液の中での６５゛Ｃに一夜のハイブリダイゼーションによってスクリーンした 。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを０．２ＸのＳＳＣ及び０．１％の ＳＯＳの中で６５℃で洗った。λＨＡＬ−）ＩＡＩクローンの単離方法は同じで あるが、ただしヒト繊維芽細胞ライブラリーをスクリーンするのにλＩ（ＡＬ− ３Ｗの５′末端に由来する０、９ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ−ＥｃｏＲ［フラグメント を用いた。クローンλＨＡＬ−Ｈ１４は部分Ｈｉｎｄｕ消化ヒト肝＠　ＤＮＡに より作製したライブラリーから単離した。

これら３種のｈＳＡ）了−ジクローンを３種の重複線状ＤＮＡフラグメントを作 製するのに用い、これらは混成において完全ｈＳＡ遺伝子及びフランキング領域 を構成する（図５参照）。最も５′側のフラグメントエは、λＨＡＬ−ＨＡ　１ より単離した１７ｋｂの部分ＥｃｏＲＩ　（図５の「Ｒ」）フラグメントであり 、１３ｋｂの５′フランキング配列及び３９０４ｂｐの転写開始部位（＋１）下 流部を含む。中央のフラグメント■はλＨＡＬ−３Ｗの１３．　ｌｋｂのＡｃｙ 　Ｉ　（＝ＡｈａｌＩ　；図中においては「Ａ」）−ＳａｃＩ　（ｒｓｃＪ　） フラグメントであり、そして＋１４０５−　＋１４５４６ｂｌ）までにわたって いる。最も３′側のフラグメント■はλＨＡＬ−Ｈ１４の６、７ｋｂのＸｈｏＩ 　（ｒＸＪ　）−ＳａｌＩフラグメント（図５）であり、そしてこれは＋１２６ ９４−＋１９．斗ｋｂにわたり、そして２．５ｋｂの３′フランキング配列を含 む。重複領域は２．５ｋｂ（フラグメントＩと■）及び１．８５ｋｂ（フラグメ ント■と■）である。この両方の領域はエキソンとイントロンを含む。フラグメ ント１．　Ｉ［及び■は、１７．　Ｏｋｂの構造ｈＳＡ遺伝子を含んで成る、３ ３ｋｂの領域に及ぶ。図５において、黒枠はエキソンを示し、白領域はイントロ ン及びフランキング配列を示す。相同性組換え現象の固有フラグメント診断を行 うために用いた制限部位をこの図の下方に示している。更にこの図において、Ａ ＴＧはｈＳＡについての翻訳開始コドンを表わし、モしてＴＡＡは翻訳終結コド ンを表わしている。

３種のフラグメント全てをサブクローンした。マイクロインジェクションの前に 、表示の制限酵素を用いてプラスミドの配列を完全に除去した。このフラグメン トは低融点アガロースから精製した。

はとんどの場合のように（表Ｉを参照）、このフラグメントをフレノウＤＮＡポ リメラーゼによって処理して突き出し接着末端を補完した。生ずるプラント末端 化フラグメントを次に細菌性アルカリホスファターゼにより処理して５′リン酸 基を除去した。次にこの重複ＤＮＡフラグメントを濃縮し、そして公開された方 法（Ｈｏｇａｎら著（１９８６）ｒＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕ ｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ　Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に従って、受精マウ ス卵の雄性前核の中に同時注入した。注入した分子の数は約２５〜約１００個／ 卵細胞で変え、個々のフラグメントの比は約１．１：１とした。Ｈｏｇａｎら著 （前述）の方法に従って胚を疑似妊娠雌性マウスの子宮に着床させた。

３種の重複フラグメントの正しい相同性組換え及びマウスゲノムの中への新生ト ランス遺伝子の組込みをアッセイするため、新生児に由来するゲノムＤＮＡを以 下の指定消化、次いでｈＳＡ　ｃＤＮＡプローブによるサザンハイプリダイゼー ションにかけた：Ｂｓｔ　Ｅ　Ｉｔ　：正しい組換えが起きているなら、ｈＳＡ 遺伝子領域の外側を切断して、１．８ｋｂのバンドをもたらす（図５参照）：Ｎ ｃｏ　Ｉ　：正しい組換えが起きているなら、重複領域の外側も切断して、８． １及び９．４ｋｂのバンドをもたらす；Ｎｃｏ　Ｉ　＋Ｈｉｎｄｌｌ［：重複領 域の外側の数箇所を切断し、完全フラグメントの存在を指標する： ＨｉｎｃＩ［：重複領域の中を切断し、これらの領域における正しい整列を指標 するいくつかのバンドをもたらす。

染色体ＤＮＡを生後３日のマウスの種々の器官（肝臓を含む）又は成マウスの尾 部のいづれかから単離した。全長ｈＳＡ　ｃＤＮＡプローブを用いるサザンブロ ツテイングによって遺伝子導入動物を同定した。

１７匹のマウスに関する結果を図６及び７に示す。これらのマウスに由来するＤ ＮＡ（１０μｇ）をＮｃｏ　Ｉ　（図６）　；Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ　（図７）：Ｎ ｅｏ　ｒ　＋ＨｉｎｄｌｌＩ（二重消化；データーは示していない）；及びＨｉ ｎｃＩ［（データーは示していない）により消化し；０．６％のアガロースゲル に泳動し、ハイボンド−Ｎ（アマージャム社）に転写し、そして全長ｈＳＡ　ｃ ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。９，４及び８．１（Ｎｃｏ　Ｉ消化） 又は１８ｋｂ　（Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ消化）のノλイブリダイズ用ノくンドは、同 時注入ＤＮＡフラグメントがフラグメントＩと■、及び■と■それぞれに由来す る重複領域を含む場合にのみ存在している。この１８ｋｂのＢｓｔ　Ｅ　ＩＦフ ラグメントは両方の重複領域にまたがり、そして完全な１７ｋｂの構造ｈＳＡ遺 伝子を含む。全部で２０匹の遺伝子導入マウスが、全ての診断バンドの存在によ る判断に従い、完全ｈＳＡ遺伝子座を含むことが明らかとなった。残りの７匹の マウスのうち、６匹はフラグメントＩと■の組換えに由来する組込まれたＤＮＡ を有しく図６及び７のレーン番号２３．２５．２９．３１及び４６）、１匹は■ と■の組換え生成物を含んでいた（図示せず）。完全遺伝子座を有する少なくと も４匹のマウス（２２，５３，６３及び６７）は、いくつかの組織に関してｈＳ Ａ　ＤＮＡが存在していないこと、又は１個以下のコピー数による判定に従い、 モザイクであった（データ示さず）。

まとめると、これらのサザンプロットは、初期実験において、生まれた１０７匹 のマウスのうち、２７匹が遺伝子導入体であり、その２７匹の遺伝子導入動物の うちの２０匹にこれら３種のフラグメントが正しく組換えられ、且つ組込まれて いたことを示した。

これらの結果を以下の表工にまとめる。

完全ｈＳＡ座を有する　１６／２３　４／４　２０／２７遺伝子導入マウス ｈＳＡを発現するマウス　９／１４°　４／　４　１３／　１８＊：マイクロイ ンジェクションの前に、ｈＳＡ　ＤＮＡフラグメントをクレノウボリメラーゼ及 び細菌性アルカリホスファターゼ処理にかけて脱リン酸化プラント末端を生じせ しめた。

零＊：５匹の非発現性マウスのうちの少なくとも３匹は完全ｈＳＡ遺伝子に関し てモザイクであった。この分析に関して図２に示している非発現性マウスは２２ （モザイク）、２６及び３３番である。

図６及び７において見い出せる通り、３種全ての重複ＤＮＡフラグメント間の相 同性組換えは優先的な組込みを提供し、そしてこれは７４％の遺伝子導入マウス において検出された。更に、遺伝子導入マウスの全てが少なくとも２種の重複フ ラグメント間での相同性組換えに由来するｈＳＡフラグメントを含んでいた。

完全なｈＳＡ　）ランス遺伝子を含む２０匹のマウスのうちの１０匹を転写レベ ルで遺伝子の発現について分析した。既に記載されている通りに（Ｋａｗａｓａ ｋｉ、日、Ｓ、のＰＣＲプロトコール（Ｉｎｎｉｓ、Ｍ、ら纒）；２ｌ−２７（ Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　１９９０） 、１μｇの全肝臓ＤＮＡに基づいて、逆転写酵素（ＲＴ）反応に続いてポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。生ずるｃＤＮＡに由来する領域を、ｈＳＡエ キソン１２及び１４の部分に相補するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅さ せた。ｍｓＡ配列に対する低相同性及び増幅領域がゲノムフラグメント■と■の 間での重複部におけるだいたいの転写配列を含むように、ＰＣＲプライマーを選 んだ。Ｓａｃ　Ｉによる消化は１８１及び１４９ｂｐのバンドをもたらし、Ｄｄ ｅ　Ｉによる消化は１９２及び１３８ｂｐのバンドをもたらした。

コントロールマウスの肝臓ＲＮＡに基づ＜ＲＴ−ＰＣＲは増幅を全つくもたらさ なかった（データーは示していない）。同様に、組換えｈＳＡフラグメントは含 むが、完全ｈＳＡ遺伝子座を含まない６匹のマウスに基づ＜　ＲＴ−ＰＣＲは増 幅をもたらさなかった。ＰＣＲは本質的にＫａｗａｓａｋｉら（前述）に記載の 通り、３５周期の変性（９２°Ｃで１分）、アニール（４１″Ｃで１分）及び伸 長（７２℃で２分）にわたって行った。

ＭｇＣ１ｔ濃度は２．５ｍＭとした。前進プライマーの配列（エキラン１２にお ける１３８５３〜１３８７８）　； ５　’　−ＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡ−３’　：リバ ースプライマ（エキラン１４において１５９６４〜１５９９１）　；５　’　− ＡＧＣＴＴＡＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴ−３’　：図８ において、レーンＨはヒト肝臓ＲＮＡより増幅したＤＮＡであり：レーン２１． ４４及び５１はｆｉＳＡ遺伝子導入マウスの肝臓ＲＮＡより増幅したＤＮＡであ り；レーンＳはＳａｃ　Ｉにより消化した増幅ＤＮＡであり：レーンＤはＤｄｅ 　Ｉにより切断した増幅ＤＮＡであり：そしてサイズマーカーはｌｋｂのＢＤＬ ラダーである。サンプルは６％のアクリルアミドゲル上で分けた。

図９において、レーンＨは全ヒト肝ＩＩ　ＲＮＡであり（１μｇ）；レーンＣは コントロールマウスのポリＡ十選別した肝臓ＲＮＡである２０（μｇ）；レーン ２１は完全ｈＳＡ遺伝子に関して遺伝子導入されたマウスのＲＮＡであり（１０ μｇのポリＡ＋ＲＮＡ）：レーン５４は組換えｈＳＡＤＮＡフラグメントＩと■ に関して遺伝子導入されたマウス由来のＲＮＡであり（１０μｇのポリＡ＋ＲＮ Ａ）；レーン５３はｈＳＡ遺伝子に関して遺伝子導入されたマウスのＲＮＡであ り（２０μｇの全ＲＮＡ）　；そしてＣはコントロールマウスのＲＮＡである（ ２０μｇの全ＲＮＡ）。結果は全てのマウスを代表している一マウス２１及び５ ３は比較的高い発現レベルをを示した。全及びポリＡ＋ＲＮＡ画分をＭａｎｉａ ｔｉｓら著のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ；Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８２）の記載 に従ってマウスの肝臓から単離し：１％のホルアミドゲルに泳動し：ハイポンド −Ｎに転写し、そしてｈＳＡのエキラン１４に相補する末端標識化ｈＳＡ特異的 合成プライマー（ＲＴ−ＰＣＲにおいても使用、上記参照）にハイブリダイズさ せた。図９において、ｒＡＩｂ　ＪはｈＳＡ　ｍＲＮＡの位置を示している。１ ８Ｓ及び２８ＳリポソームＲＮＡバンドが標識プライマーの特異的ハイブリダイ ゼーションによって識別できる。

まとめると、これらの実験が示すには、正しいサイズのバンドが完全ｈＳＡ遺伝 子に関して遺伝子導入された１０匹のマウスのうちの７匹のＲＮＡサンプルから 増幅された。２種類の酵素を用いる制限分析は、ｈＳＡとしての増幅バンドの同 定を実証した。ｈＳＡ特異的プローブを用いるノーザンプロットによる、各遺伝 子導入マウスに由来する全及びポリＡ十選択肝臓ＲＮＡの分析はこれらの発見を 実証し、且つｈＳＡ転写体が正しいサイズであることを実証した。異常な転写体 は観察されなかった。これらの１０匹のマウスの中のヒト血清アルブミン転写体 はヒト肝臓におけるよりも１０’〜１０’分の１のレベルで検出された。

マウス血清におけるｈＳＡ　（即ちタンパク質）の特異的検出のための定量ラジ オイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行った。セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） に結合せしめたモノクローナル抗−ｈＳＡ抗体（ＣＬ２５１３Ａ　；　Ｃｅｄｅ ｒｌａｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　；　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ ）の懸濁物を、ｈＳＡを１０μｇ／ｍｌまで加えた正常マウス血清（ＮＭＳ）と （図１０のべた塗り点）；遺伝子導入マウスの血清と（マウス５３番の血清の代 表カーブ；白抜き円）；又はＮＳＭのみと（大きいべた塗り点）インキュベート した。ＲＩＡ手順は本質的に、Ｎｕｉ　ｊｅｎｓ、　Ｊ、　Ｈ，ら著Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４゜１２９４１−１２９４９に記載の通りである。セ ファローズ結合化ｈＳＡは１２５Ｉで標識したアフィニイティー精製抗−ｈＳＡ ポリクローナルウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）とのインキュベ ーションにより定量した。

放射性ヨード化する前に、これらの精製抗体をＮＭＳ−セファローズとインキュ ベートしてマウス血清アルブミン交差反応性抗体を除去した。その後、セファロ ーズ−結合化放射活性を測定した。付加された標識抗体のパーセンテージとして 図１０に結果を示す。血清の量を表示する（横座標）。遺伝子導入マウスの血清 中のｈＳＡのレベルを平行の投与量一応答曲線より計算した。このＲＩＡの低濃 度検出限界値は約５ｎｇであった。ＨＳＡは完全ｈＳＡを含むマウス由来の血清 においてのみ検出された。

ウェスタンプロットに関して、手順は本質的にＮｕｉｊｅｎｓ、Ｊ、Ｈ，ら著（ １９９０）Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４．４４３−４５０に記載の 通りである。セファローズ結合化モノクローナル抗−ＩＳＡ抗体により１００μ ｍのサンプルからＨＳＡを免疫沈殿させ、そして非還元５ＯＳ−サンプル緩衝液 ｌＯμｍの中で解離させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０−１５％ｗ／ｖ）、それ に続くポリクローナルｌ！Ｊ−抗ｈＳＡ抗体によるイムノブロッティングによっ て１μｍのサンプルを分析した。図１１において、レーンｌは正常マウス血清、 レーン２はマウス５３番血清（２，５μｇ／ｍｌのｈＳＡを含む）、レーン３は ２５０ｎＨの精製ｈＳＡが加えられている正常マウス血清、レーン４は２５０ｎ ｇの精製ｈＳＡ、レーン６は２５０ｎｇの精製ｍＳＡ、そしてレーン５は２５ｎ ｇの精製ｈＳＡであって、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥに直接かけたものである。

これらの試験をまとめると、完全ｈＳＡ遺伝子に関する遺伝子導入されたマウス １８匹のうち１３匹がｈＳＡを発現し、そしてこれらの１３匹のｈＳＡ陽性マウ スは、ＲＴ−ＰＣＲ（前記）によりｈＳＡ　ＲＮＡを発現することが見い出せた １０匹のマウス全てを含んでいた。ウェスタンプロット分析（図１１）は、ＲＩ Ａにより最初に樹立された通り（図１０）　、ｈＳＡ遺伝子導入マウスによるｈ ＳＡ遺伝子の正しい翻訳を実証した。

実施例２ インビボ相同性組換えにより形成されるゲノム軽鎖ヒトＩｇ）ラン以下は重複Ｄ ＮＡフラグメントからのイムノグロブリントランス遺伝子のインビボ作製の代表 例である。

ヒトに軽鎖の地図はＬｏｒｅｎｚ、　Ｗ、　ら著（１９８７）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５゜９６６７−９６７７に詳細されている。

全てのＣに、３′エンハンサ−１全てのＪセグメント及び少なくとも５つのＶセ グメントを含む４５０ｋｂのＸｈｏ　Ｉ〜ＮｏｔＩフラグメントを単離した。

簡潔に述べると、新鮮なヒト胎盤組織からＭａｒｚｌｕｆｆ、　Ｗ、　Ｆ、ら著 （１９８５Ｘ　ｒＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎ、５ｌａｔｉ ｏｎ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｍｍ ｅｓとＳ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＩＩ、頁８９−１２９．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ 、０ｘｆｏｒｄ）に従って核を単離した。単離した核（又はＰＢＳ洗浄したヒト 精母細胞）を低融点アガロースマトリックスの中に包埋し、次いでＥＤＴＡ及び プロテイナーゼＫにより高分子量ＤＮＡが露出するまで溶解し、そして制限酵素 ＮｏｔＩ及びＸｈｏ　Ｉによりこのアガロースの中で消化した。

これはＭ、　ＦｉｎｎｅｙのｒＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されている（Ｆ、Ａｕ５ｕｂｅｒら 纒、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、付録４．１９８８゜第２．５．１章 ）。これにより消化せしめたＤＮＡを次に、Ａｎａｎｄ、　Ｒ，ら著（１９８９ ）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１７．３４２５−３４３３に記載の 通りに、パルス電場ゲル電気泳動により分画した。Ｎｏｔ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉ フラグメントに富む両分をサザンハイプリダイゼーシ３ンによりアッセイして、 このフラグメントによりコードされるｌ又は複数種の配列を検定した。このＮｏ ｔ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを含むこれらの画分をプールし、そして酵 母細胞の中のベクターｐＹＡＣＮＮの中にクローンした。ｐＹＡＣＮＮは、−３ ′の存在下におけるリゲーションによって作られる。

重鎖のＮｏｔ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを含むＹＡＣクローンを、した 。クローンしたインサートは、前述したＭ、　Ｆｉｎｎｅｙに詳細の通りにパル ス電場ゲル電気泳動によって高分子量酵母ＤＮＡから単離した。

上記のもの全てと少なくとも２０個より多くのＶセグメントを含む、７５０ｋｂ のＭｌｕ　Ｉ　〜Ｎｏｔ　Ｉフラグメントを同様に単離し、そしてＢｓ５ＨＩＩ により消化して約４００ｋｂのフラグメントを作った。

４５０ｋｂのＸｈｏ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメントと約４００ｋｂのＭｌｕ　 Ｉ　〜Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントは、Ｂｓ５ＨＩＩ及びＸｈｏ　Ｉ制限部位によ り規定される配列重複を有する。１ｍＭのスペルミンの添加によりこれらのＤＮ Ａフラグメントを縮合させ、次いで先に記載した通りに単細胞の胚の核の中に直 接マイクロインジェクトさせて、各フラグメントの複数のコピーが各注入接合体 の中に存在するようにさせた。これらの２種のフラグメントのマウス接合体のマ イクロインジェクションに基づく相同性組換えは、この４５０ｋｂのＸｈｏ　Ｉ 　／　Ｎｏｔ　Ｉフラグメントに見い出せるものの他に少なくとも更に１５〜２ ０のＶセグメントを含むトランス遺伝子をもたらす。

実施例３ インビボ相同性組換えにより形成されるヒトラクトフェリントラ全体ゲノムクロ ーンを得るため、２つのヒトゲノムコスミドライブラリーを、プローブとしてｈ ＬＦ　ｃＤＮＡクローン（１９９１年６月に公開されたＰＣＴ公開番号第ＰＣＴ ／ＵＳ９０１０６８７４号に詳細）を用いてスクリーンした。単離した１４のク ローンのうち、２クローン（１３，１及び１３．２と命名；それぞれ各ヒトコス ミドライブラリーに由来）は全体ｈＬＦ遺伝子を含み、これは第１及び最後（１ ７番目）のｈＬＦエキソンラン異的なプライマーとのハイブリダイゼーション並 びにＤＮＡシーケシングによって決定した。これらのコスミドベクーンは３５− ４０ｋｂｐのサイズの範囲にあった。クローン１３．１は約４ｋｂの付加された ３′フランキング配列；クローン１３．２は付加された５′フランキング配列を 含んでいた。

最も５′側のＡｐａ　Ｉ部位は、ｈＬＦシグナル配列におけるエキソンエに位置 している。エキソンエのすぐ５′側の４ｏｏｂｐの領域をシーケンス化した。こ の領域はｈＬＦ遺伝子の転写開始部位及びＴＡＴＡボックスを含んでいた。この 領域はＢａｍＨＩ制限部位も含んでいた。

乳腺に特異的な発現ベクターを作製するには、１６ｋｂｌ）のαｓ！ウシカゼイ ンプロモーター領域をゲノムｈＬＦクローンに融合させることが必要であった。

しかしながら、約６０ｋｂのこのような作製体の全体のサイズは（１６ｋｂ　（ プロモーター）＋８ｋｂ（コスミドベクター）＋　３５−４０ｋｂ（ｈＬＦゲノ ムクローン）　＝５９−６４ｋｂ）　、常用のクローニングベクターの利用を難 しくする。従って、　１６ｋｂｐのαｓｌカゼインプロモーターを９ｋｂの構造 ｈＬＦ遺伝子領域の５′に融合し、そしてこのフラグメントを、クローン１３． １の最も３′側の３０ｋｂｐを含む重複ｈＬＦフラグメントと一緒に同時導入し た。

クローン１３．２に由来するＢａｍＨＩフラグメント（エキランＩを含む）をプ ラスミドｐＵｃ１　ａにサブクローンした。このクローンより、Ａｐａ　Ｉ（部 分消化）及び５ａｌＩ消化によって８．９ｋｂのＡｐａＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　７ラ グメントを単離した。このフラグメントはｈＬＦシグナル配列のほとんど及びｈ ＬＦの５　’　ＵＴＲの全体を欠いている。この欠失領域を有する配列は、５’ ＡｐａＩ部位からｈＬＦ　ＴＡＴＡボックスから下流の領域にまで及ぶ２種類の 相補ＤＮＡ鎖（６８−及び６２−マー）を合成することによって得た。これらの プライマーをアニールさせた後、５’Ｃ１ａＩ突き出し及び３’　ＡｐａＩ突き 出しを有するＤＮＡフラグメントが作られた。この合成Ｃ１ａ　Ｉ　−Ａｐａ　 Ｉフラグメント及び前述した８、　９ｋｂｐのＡｐａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラグ メントをｐ−１６ｋｂのＣＳの中に、及び１６ｋｂのαｓｌカゼインプロモータ ーの代わりに８　ｋｂｐを含む類似のプラスミドの中にリゲートさせた。このこ とは、ｈＬＦゲノム遺伝子の５′部（９ｋｂｐ）に融合した１６ｋｂｐ又は８　 ｋｂｐのウシαｓｌカゼインプロモーターを含む２種類のプラスミドをもたらす 。これらのフラグメントを切断しく　Ｎｏｔｌ　−５ａｌｌ）　、モしてｈＬＦ コスニスクローン１３．１に由来する３′側の３０ｋｂｌ）のＣ１ａｌフラグメ ントと同時導入させた。

同時導入したフラグメントは２．７ｋｂｐの重複を育していた。

接合体のマイクロインジェクション及び遺伝子導入動物の作製は、遺伝子導入マ ウスに関する実施例１に記載の通り及び遺伝子導入ウシの種に関するＰＣＴ公開 番号第ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６８７４号に記載の通りに行った。

実施例４ インビボ相同性組換えにより形成されるゲノム軽鎖ヒト１ｇトランス遺伝子： 単独の大きなりＮＡ上セグメントマイクロインジェクション以下は重複ＤＮＡフ ラグメントに由来するイムノグロブリントランス遺伝子のインビボ作製の他の実 施例である。

この実施例は実施例２と同じであるが、ただし７５０ｋｂのＭｌｕＩ〜Ｎｏｔ　 Ｉ　ＤＮＡ分子の複数のコピーを、スペルミンにょる縮合を行うことなくマウス 接合体の核の中に直接マイクロインジェクトした。

遺伝子導入子孫に由来するＤＮＡの分析は、動物のゲノムの中に組込まれた全長 ７５０ｋｂ　ＤＮＡ　トランス遺伝子の存在を実証した。

本発明の好ましい態様を詳細してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく改良 がなされることを当業者は理解するであろう。

ＦＩＧ、　５ ８ｃａｌ ＨＣ２１５４５３Ｃ” ０００５　０．５　５　５０ 試験量μ１ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　クリンペンフォルト、ボールオランダ国、エフエル−２３３３ ，セーアーライデン、二一ルス　ポールベク　１ｌ−１３（７２）発明者　ピー ペル、フランク オランダ国、エヌエル−２３３３，セーアーライデン、二一ルス　ポールベク　 １ｌ−１３（７２）発明者　ストエイカー、ラインオランダ国、エヌエル−２３ ３３，セーアーライデン、二一ルス　ポールベク　１１−１３

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞の中でＤＮＡセグメントを作製するための方法であって、組換えコンピ テント哺乳動物細胞の中に少なくとも第１及び第２ＤＮＡフラグメントを導入す る段階を含んで成り、前記ＤＮＡフラグメントのそれぞれは５′及び３′配列部 分を有しており、前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２ＤＮＡ フラグメントの５′配列部分と実質的に相同であり、ここで前記の第１及び第２ ＤＮＡフラグメントは前記細胞の中で相同組換えして長さ５０ｋｂ以上の組換え ＤＮＡセグメントを形成し、前記組換えＤＮＡセグメントは前記細胞のゲノムの 中に組込まれる、方法。
2. ２．前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、肝細胞、白血球、造血幹細胞 、繊維芽細胞、ＥＳ細胞及び接合体より成る群から選ばれる、請求項１に記載の 方法。
3. ３．前記細胞が接合体である、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記の同時導入段階がマイクロインジェクションによって行われる、請求項 １に記載の方法。
5. ５．前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項１に記載の 方法。
6. ６．前記タンパク質がヒトイムノグロブリンである、請求項６に記載の方法。
7. ７．前記タンパク質がヒトラクトフェリンである、請求項６に記載の方法。
8. ８．細胞の中でＤＮＡセグメントを作製するための方法であって、組換えコンピ テント哺乳動物細胞の中に少なくとも第１及び第２ＤＮＡフラグメントを導入す る段階を含んで成り、前記ＤＮＡフラグメントのそれぞれは５′及び３′配列部 分を有しており、前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２ＤＮＡ フラグメントの５′配列部分と実質的に相同であり、ここで前記の第１及び第２ ＤＮＡフラグメントは前記細胞の中で相同組換えして、前記細胞のゲノムの中に 組込まれた組換えＤＮＡセグメントを形成し、そして前記ＤＮＡセグメントは、 前記の第１と第２フラグメントとの間での相同性組換えを検出するのに用いるこ とができる陽性選択マーカーをコードしない、方法。
9. ９．胚標的細胞の中でＤＮＡセグメントを作製するための方法であって、哺乳動 物胚標的細胞の中に少なくとも第１及び第２ＤＮＡフラグメントを導入する段階 を含んで成り、前記ＤＮＡフラグメントのそれぞれは５′及び３′配列部分を有 しており、前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２ＤＮＡフラグ メントの５′配列部分と実質的に相同であり、ここで前記の第１及び第２ＤＮＡ フラグメントは前記胚標的細胞の中で相同組換えして組換えＤＮＡセグメントを 形成し、前記組換えＤＮＡセグメントは前記胚標的細胞のゲノムの中に組込まれ る、方法。
10. １０．前記胚標的細胞が接合体である、請求項２に記載の方法。
11. １１．細胞の中でＤＮＡセグメントを作製するための方法であって、組換えコン ピテント哺乳動物細胞の中に少なくとも第１、第２及び第３ＤＮＡフラグメント を導入する段階を含んで成り、前記ＤＮＡフラグメントのそれぞれは５′及び３ ′配列部分を有しており、前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第 ２ＤＮＡフラグメントの５′配列部分と実質的に相同であり、そして前記第２Ｄ ＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第３ＤＮＡフラグメントの５′配列部分 と実質的に相同であり、ここで前記の第１、第２及び第３ＤＮＡフラグメントは 前記細胞の中で相同値換えして組換えＤＮＡセグメントを形成し、前記組換えＤ ＮＡセグメントは前記細胞のゲノムの中に組込まれる、方法。
12. １２．前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、肝細胞、白血球、造血幹細 胞、繊維芽細胞、ＥＳ細胞及び接合体より成る群から選ばれる、請求項１１に記 載の方法。
13. １３．前記細胞が接合体である、請求項１１に記載の方法。
14. １４．前記の導入段階をマイクロインジェクションによって行う、請求項１１に 記載の方法。
15. １５．前記組換えＤＮＡセグメントが少なくとも５０ｋｂの長さである、請求項 １１に記載の方法。
16. １６．前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項１１に記 載の方法。
17. １７．前記タンパク質がｈＳＡである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．細胞のゲノムの中に組込まれたトランス遺伝子を含む遺伝子導入哺乳動物 細胞を生産するための方法であって、組換えコンピテント哺乳動物細胞の中に同 一のＤＮＡ分子の複数のコピーをマイクロインジェクトする段階を含んで成り、 前記ＤＮＡ分子はマイクロインジェクションに基づいてこのようなＤＮＡ分子の フラグメントの形成がもたらされるような長さを有し、前記フラグメントが生ず ると、それらは前記ＤＮＡ分子を再生するように前記細胞の中で組換えをするこ とが可能である方法。
19. １９．組換えコンピテント哺乳動物細胞の中に約５０ｋｂより長い同一のＤＮＡ 分子の複数のコピーを導入する段階を含んで成る、遺伝子導入細胞を生産するた めの方法。
20. ２０．トランス遺伝子を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物細胞であって：第１と第 ２ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された長さ５０ｋｂ以上の組換 えＤＮＡセグメント（各前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有し ており：前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は、前記第２ＤＮＡフラグ メントの５′配列部分と実質的に相同である）を含んで成る細胞。
21. ２１．前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、肝細胞、白血球、造血幹細 胞、繊維芽細胞、ＥＳ細胞及び接合体より成る群から選ばれる、請求項２０に記 載の方法。
22. ２２．前記細胞が接合体である、請求項２０に記載の方法。
23. ２３．前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項２０に記 載の方法。
24. ２４．前記タンパク質がヒトイムノグロブリンである、請求項２３に記載の方法 。
25. ２５．前記タンパク質がヒトラクトフェリンである、請求項２３に記載の方法。
26. ２６．トランス遺伝子を含む遺伝子導入哺乳動物細胞であって：少なくとも第１ 、第２及び第３ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された組換えＤＭ セグメント（各前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有しており； 前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２ＤＮＡフラグメントの５ ′配列部分と実質的に相同であり、そしてこの第２フラグメントの３′配列部分 は前記第３ＤＮＡフラグメントの５′配列部分と実質的に相同である）を含んで 成る細胞。
27. ２７．前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、肝細胞、白血球、造血幹細 胞、繊維芽細胞、ＥＳ細胞及び接合体より成る群から選ばれる、請求項２６に記 載の方法。
28. ２８．前記細胞が接合体である、請求項２６に記載の方法。
29. ２９．前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項２６に記 載の方法。
30. ３０．前記タンパク質がｈＳＡである、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．約５０ｋｂより長いトランス遺伝子を含んで成る遺伝子導入哺乳動物細胞 。
32. ３２．前記トランス遺伝子がタンパク質をコードする、請求項３１に記載の細胞 。
33. ３３．トランス遺伝子を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物であって：第１と第２Ｄ ＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された組換えＤＮＡセグメント（各 前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有しており；前記第１ＤＮＡ フラグメントの３′配列部分は、前記第２ＤＮＡフラグメントの５′配列部分と 実質的に相同である）を含んで成る哺乳動物。
34. ３４．前記組換えＤＮＡセグメントが少なくとも長さ５０ｋｂである、請求項３ ３に記載の哺乳動物。
35. ３５．前記組換ＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項３３に記載 の哺乳動物。
36. ３６．前記タンパク質がヒトイムノグロブリンである、請求項３５に記載の哺乳 動物。
37. ３７．前記タンパク質がヒトラクトフェリンである、請求項３５に記載の哺乳動 物。
38. ３８．前記哺乳動物がネズミの種の群から選ばれる、請求項３３に記載の哺乳動 物。
39. ３９．前記哺乳動物がウシの種の群から選ばれる、請求項３３に記載の哺乳動物 。
40. ４０．トランス遺伝子を含む遺伝子導入非ヒト哺乳動物であって：少なくとも第 １、第２及び第３ＤＮＡフラグメントの相同性組換えにより形成された組換えＤ ＮＡセグメント（各前記ＤＮＡフラグメントは５′及び３′配列部分を有してお り；前記第１ＤＮＡフラグメントの３′配列部分は前記第２ＤＮＡフラグメント の５′配列部分と実質的に相同であり、そしてこの第２フラグメントの３′配列 部分は前記第３ＤＮＡフラグメントの５′配列部分と実質的に相同である）を含 んで成る哺乳動物。
41. ４１．前記組換えＤＮＡセグメントがタンパク質をコードする、請求項４０に記 載の哺乳動物。
42. ４２．前記タンパク質がｈＳＡである、請求項４１に記載の哺乳動物。
43. ４３．前記哺乳動物がネズミの種の群より選ばれる、請求項４０に記載の哺乳動 物。
44. ４４．前記哺乳動物がウシの種の群より選ばれる、請求項４０に記載の哺乳動物 。
45. ４５．５０ｋｂより長いトランス遺伝子を含んで成る遺伝子導入非ヒト哺乳動物 。
46. ４６．前記哺乳動物がネズミの種の群より選ばれる、請求項４５に記載の哺乳動 物。
47. ４７．前記哺乳動物がウシの種の群より選ばれる、請求項４５に記載の哺乳動物 。
48. ４８．前記トランス遺伝子がタンパク質をコードする、請求項４５に記載の哺乳 動物。