CN104470541A - 用于治疗涉及运动神经元的疾患的lingo-2拮抗剂 - Google Patents

用于治疗涉及运动神经元的疾患的lingo-2拮抗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过给予LINGO-2拮抗剂治疗涉及包括肌萎缩侧索硬化症在内的运动神经元存活和轴突生长的疾病、病症或损伤的方法。一种用于促进运动神经元存活的示例性方法，包括使所述运动神经元与有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物接触，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。

Description

用于治疗涉及运动神经元的疾患的LINGO-2拮抗剂
发明背景
运动神经元是控制肌肉功能的神经元。它们位于中枢神经并具有延伸到中枢神经系统外的轴突以控制肌肉。通常，位于脑中的上位运动神经元将信号传递到位于脊髓的下位运动神经元，以及下位运动神经元指挥肌肉活动。当然，肌肉对于包括呼吸，吞咽，讲话和走路在内许多活动是重要的。因此运动神经元的损伤或运动神经元功能的降低具有可怕的临床后果，且已经识别了若干与运动神经元相关的疾患。
所述疾患包括但不限定于下述疾病、障碍和损伤：肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)、原发性侧索硬化(primary lateralsclerosis)(PLS)、进行性肌萎缩(progressive muscular atrophy)(PMA)、遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraparesis)(HSP)、X-连锁脊髓延髓性肌萎缩(X-linked spinobulbar muscular atrophy)(SBMA；甘乃迪病(Kennedy disease))、进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy)、假性延髓麻痹(pseudo-bulbar palsy)、脊髓性肌肉萎缩症(spinal muscularatrophy)(SMA)、小儿麻痹症后期综合症(postpolio syndrome)(PPS)、亨廷顿氏症(Huntington's disease)、原发性震颤(Essential tremor)(ET)、运动神经元疾病、瘫痪和帕金森氏病。ALS是这些中突出的疾病之一，每年100,000人中有1到2人发展成ALS。ALS是快速进行性疾病，其与上位和下位运动神经元的破坏相关，并导致自主肌肉运动的丧失。
一些疾病缓解治疗可用于ALS和其他运动神经元相关疾病，所述治疗包括使用利鲁唑(Riluzole)，其能够阻断与受损神经元相关的特定的钠通道。该治疗方法虽然可以减慢病程，但目前没有治疗运动神经元的方法。因此对于患有与运动神经元功能不足相关疾病的患者而言，极度需要促进运动神经元轴突再生和/或促进运动神经元存活的治疗。
发明概述
LINGO-2(FLJ31810，亮氨酸富集重复和免疫球蛋白样结构域包含nogo受体相互作用蛋白2，LERN3，亮氨酸富集重复神经元蛋白3，亮氨酸富集重复神经元蛋白6C，LRRN6C，PR031993或UNQ9234)在皮层神经元和背根神经节(DRG)神经元中表达，且负向调节运动神经元存活和运动神经元轴突长度。可使用LINGO-2拮抗剂在内和体外促进运动神经元的存活和生长。例如，抗体、其抗原结合片段和其衍生物可被用作LINGO-2的拮抗剂。可溶的LINGO-2多肽以及包含编码对应于LINGO-2区域多肽的核苷酸序列的核酸还可被用作LINGO-2拮抗剂。因而，本文提供了通过将运动神经元与LINGO-2拮抗剂相接触从而促进运动神经元存活和运动神经元轴突生长的方法。
本发明的某些实施方式包括以下(其中每个实施方式通过大写字母“E”后接数字表示)：
E1)一种分离的结合分子，其能够特异性结合与C09抗体相同的LINGO-2表位。
E2)E1的分离的结合分子，其中所述结合分子竞争性抑制C09抗体与LINGO-2的结合。
E3)一种包含C09抗体的至少一个互补决定区(CDR)的分离的结合分子。
E4)根据E1-E3中任一项的结合分子，其包含抗体或其抗原结合片段。
E5)E1-E4中任一项的结合分子，包含C09的可变重链(variableheavy domain)(VH)CDRs 1-3，其中一个或多个VH CDRs具有3个或更少的单氨基酸取代。
E6)E5的结合分子，包含C09的VH CDRs 1-3。
E7)E1-E6中任一项的结合分子，包括C09的可变轻链(variable lightdomain)(VL)CDRs 1-3，其中一个或多个VL CDRs具有3个或更少的单氨基酸取代。
E8)E7所述的结合分子，包含C09的VL CDRs 1-3。
E9)E1-E4中任一项的结合分子，包含C09的VH CDRs 1-3和VLCDRs 1-3。
E10)E1-E9中任一项的结合分子，包含VH，其中所述VH包含与C09的VH至少85％，90％或95％相同的氨基酸序列。
E11)E10的结合分子，其中所述VH包含与C09的VH相同的氨基酸序列。
E12)E1-E11中任一项的结合分子，包含VL，其中所述VL包含与C09的VL至少85％，90％或95％相同的氨基酸序列。
E13)E12的结合分子，其中所述VL包含与C09的VL相同的氨基酸序列。
E14)E1-E13中任一项的结合分子，包含VH和VL，其中所述VH和VL包含与C09的VH和VL至少85％，90％或95％相同的氨基酸序列。
E15)E14的结合分子，其中所述VH和VL包含与C09的VH和VL相同的氨基酸序列。
E16)E1-E15中任一项的结合分子，其中所述结合分子与LINGO-2LRR结构域结合。
E17)E16的结合分子，其中所述结合分子与LINGO-2的LRR7-LRR12中的表位结合。
E18)E16的结合分子，其中所述结分子与SEQ ID NO：2的氨基酸202-343中的表位结合。
E19)E1-E18中任一项的结合分子，其中所述结合分子与SEQ IDNO：2的氨基酸28-408或SEQ ID NO：2的氨基酸410-500的LINGO-2的区结合。
E20)E1-E19中任一项的结合分子，其中所述结合分子结合人、大鼠和小鼠LINGO-2。
E21)E1-E19中任一项的结合分子，其中所述结合分子结合人和大鼠LINGO-2。
E22)E1-E19中任一项的结合分子，其中所述结合分子结合人和小鼠LINGO-2。
E23)E1-E19中任一项的结合分子，其中所述结合分子结合人LINGO-2。
E24)E1-E23中任一项的结合分子，其中所述结合分子促进运动神经元存活。
E25)E1-E24中任一项的结合分子，其中所述结合分子促进运动神经元轴突生长。
E26)E1-E25中任一项的结合分子，其中所述结合分子促进少突胶质细胞分化。
E27)E1-E26中任一项的结合分子，其中所述结合分子促进髓鞘形成。
E28)E1-E27中任一项的结合分子，其中所述结合分子促进AKT磷酸化。
E29)E1-E28中任一项的结合分子，其包括人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
E30)E1-E28中任一项所述的结合分子，其包含自然产生的抗体、scFv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)或单链抗体。
E31)E1-E28中任一项的结合分子，其包括单克隆抗体。
E32)一种分离的多核苷酸，包含编码VH的核酸，其中所述VH包含C09的VH CDRs 1-3。
E33)一种分离的多核苷酸，包含编码VH的核酸，其中所述VH包含与C09的VH至少85％、90％、95％相同或相同的氨基酸序列。
E34)一种分离的多核苷酸，包含编码VL的核酸，其中所述VL包含C09的VL CDRs 1-3。
E35)一种分离的多核苷酸，包含编码VL的核酸，其中所述VL包含与C09的VL至少85％、90％、95％相同或相同的氨基酸序列。
E36)E32-E35中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL能够特异性地结合LINGO-2。
E37)E36的多核苷酸，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合与C09抗体相同的表位。
E38)E32-E37中任一项所述的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可以结合LINGO-2LLR结构域。
E39)E32-E37中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可以结合LINGO-2中位于LLR7-LLR12中的表位。
E40)E32-E37中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与SEQ ID NO：2的第28-408位氨基酸或SEQ ID NO：2的第410-500位氨基酸的LINGO-2的区域结合。
E41)E32-E37中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与LINGO-2的第202-343位氨基酸表位结合。
E42)E32-E41中任一项所述的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与人、大鼠和小鼠LINGO-2结合。
E43)E32-E41中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与人和大鼠LINGO-2结合。
E44)E32-E41中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与人和小鼠LINGO-2结合。
E45)E32-E41中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可与人LINGO-2结合。
E46)E32-E45中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可促进运动神经元存活。
E47)E32-E45中任一项的多核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含所述VH、所述VL，或所述VH和所述VL可促运动神经元轴突生长。
E48)编码E1-E31中任一项的结合分子的多核苷酸。
E49)包含E32-E48中任一项的多核苷酸的载体。
E50)含有包含编码VH的核酸的多核苷酸和编码VL的核酸的多核苷酸的组合物，其中所述VH和VL包含与C09的VH和VL至少85％、90％、95％相同或相同的核酸序列。
E51)含有包含编码VH的核酸的多核苷酸和编码VL的核酸的多核苷酸的组合物，其中VH CDRs 1-3和VL CDRs 1-3为C09的VH CDRs1-3和VL CDRs 1-3。
E52)E50或E51的组合物，其中包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在同一载体上。
E53)E50或E51的组合物，其中包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在不同的载体上。
E54)E50-E55中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可特异地性结合LINGO-2。
E55)E54的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段可特异地结合与C09抗体相同的表位。
E56)E50-E55中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2LRR结构域结合。
E57)E50-E55中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2的LRR2-LRR7中的表位结合。
E58)E50-E55中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与SEQ ID NO：2的第28-408位氨基酸或SEQID NO：2的第410-500位氨基酸的LINGO-2的区域结合。
E59)E50-E55中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2的第202-343位氨基酸表位结合。
E60)E50-E59中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人、大鼠和小鼠LINGO-2结合。
E61)E50-E59中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人和大鼠LINGO-2结合。
E62)E50-E59中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人和小鼠LINGO-2结合。
E63)E50-E59中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人LINGO-2结合。
E64)E50-E63中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可促进运动神经元存活。
E65)E50-E63中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可促进运动神经元轴突生长。
E66)由E32-E47中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。
E67)包含VH多肽和VL多肽的组合物，其中所述VH和VL包含与C09的VH和VL至少85％，90％，95％相同或相同的氨基酸序列。
E68)包含VH多肽和VL多肽的组合物，其中VH CDRs 1-3和VL CDRs 1-3为C09的VH CDRs 1-3和VL CDRs 1-3。
E69)E67或E68所述的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段能够特异地结合LINGO-2。
E70)E69的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段可以特异地与C09抗体相同的表位结合。
E71)E67-E70中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2LRR结构域结合。
E72)E67-E70中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2的LRR7-LRR12中的表位结合。
E73)E67-E70中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与SEQ ID NO：2的第28-408位氨基酸或SEQID NO：2的第410-500位氨基酸的LINGO-2区域结合。
E74)E67-E70中任一项所述的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与LINGO-2的第202-343位氨基酸表位结合。。
E75)E67-E74中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人、大鼠和小鼠LINGO-2结合。
E76)E67-E74中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人和大鼠LINGO-2结合。
E77)E67-E74中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人和小鼠LINGO-2结合。
E78)E67-E74中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可与人LINGO-2结合。
E79)E67-E78中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可促进运动神经元存活。
E80)E67-E78中任一项的组合物，其中包含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段可促进运动神经元轴突生长。
E81)包含E32-E48任一项的多核苷酸、E49的载体、E50-E65或E67-E80任一项的组合物或E66的多肽的宿主细胞。
E82)一种生产抗-LINGO-2结合分子的方法，包括培养E81的宿主细胞，并回收所述结合分子。
E83)抗-LINGO-2结合分子，由E82的方法生产。
E84)一种在样品中检测LINGO-2表达的方法，包括(a)将所述样品与E1-E31或E83中任一项的结合分子相接触和(b)检测所述样品中所述结合分子的结合。
E85)药物组合物，包含(a)E1-E31或E83中任一项的结合分子、E32-E48中任一项的多核苷酸、E49的载体、E50-E65或E67-E80中任一项的组合物、E66的多肽，或E81的宿主细胞和(b)载体。
E86)分离的核酸，包含编码SEQ ID NO：2多肽的可溶的片段或其变体的多核苷酸，其中所述多肽能够促进运动神经元存活。
E87)分离的核酸，包含编码SEQ ID NO：2多肽的可溶的片段或其变体的多核苷酸，其中所述多肽能够促进运动神经元的存活，减少轴突生长的抑制。
E88)E86或E87所述的核酸分子，包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO：2的第1到500位氨基酸组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
E89)E88的核酸，其中所述多肽包含与所述参考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
E90)E88的核酸，其中所述多肽包含与所述参考氨基酸序列相同的氨基酸序列。
E91)E86-E90中任一项的核酸，进一步包含编码融合至所述多肽的异源多肽的多核苷酸。
E92)E91的核酸，其中所述异源多肽选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向多肽、报告子多肽、纯化易化多肽、任何所述多肽的片段，和所述多肽或片段的两种或更多种组合所组成的组。
E93)E92的核酸，其中所述异源多肽选自由免疫球蛋白Fc、人血清白蛋白或其片段、组氨酸标签和运动神经元糖蛋白或其片段所组成的组。
E94)包含药学上可接受的载体和E86-E93中任一项的核酸的组合物。
E95)包含E86-E93中任一项核酸的载体。
E96)E95的载体，其中所述核酸可操作与表达控制序列连接。
E97)E96的载体，其中所述载体为病毒载体。
E98)E97的载体，其中所述病毒载体是选自由腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体(baculoviral vector)、爱泼斯坦-巴尔病毒载体(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒载体、牛痘(vaccinia)病毒载体和单纯疱疹病毒载体所组成的组。
E99)包含E86-E93中任一项的核酸或E95-E98中任一项的载体的宿主细胞。
E100)E99的宿主细胞，其表达所述多肽。
E101)由E86-E93中任一项核酸编码的分离的多肽。
E102)E101的多肽，其中所述多肽通过合成生产。
E103)E101或E102的多肽，其中所述多肽结合至聚合物。
E104)E103的多肽，其中所述聚合物是选自由聚亚烷基二醇、糖类聚合物、和多肽所组成的组。
E105)E104的多肽，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
E106)E103-E105中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合至1、2、3或4种聚合物。
E107)E106的多肽，其中所述聚合物的总分子量为20,000Da到40,000Da。
E108)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段能够促进运动神经元的存活。
E109)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102所述的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少运动神经元轴突生长抑制。
E110)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段能够促进少突胶质细胞分化。
E111)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段能够促进髓鞘形成。
E112)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段能够促进AKT磷酸化。
E113)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段结合LINGO-2LRR结构域。
E114)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO：2的第202-343位氨基酸表位。
E115)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO：2的第28-408位氨基酸或SEQ ID NO：2的第410-500位氨基酸的LINGO-2区域结合。
E116)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段与LIONGO-2LRRNT或LRRCT结构域结合。
E117)抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合E101或E102的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段与LINGO-2免疫球蛋白结构域结合。
E118)包含药学上可接受的载体和E102-E107中任一项的多肽的组合物。
E119)包含药学上可接受的载体和E99或E100的宿主细胞的组合物。
E120)用于促进运动神经元存活的方法，包括使所述运动神经元与有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物接触，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体(aptamer)；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E121)促进运动神经元轴突生长的方法，包括使所述运动神经元与包含LINGO-2拮抗剂的组合物接触，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E122)一种促进哺乳动物中运动神经元存活的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予
有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E123)一种促进哺乳动物中运动神经元轴突生长的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E124)一种治疗哺乳动物中与运动神经元存活相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予治疗有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E125)一种治疗哺乳动物中与运动神经元轴突生长相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予治疗有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E126)一种治疗哺乳动物中与少突胶质细胞死亡或缺少分化相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予治疗有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E127)一种治疗哺乳动物中与脱髓鞘相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予治疗有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E128)一种治疗哺乳动物中与髓鞘形成障碍相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予治疗有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：(i)可溶的LINGO-2多肽；(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；(iv)LINGO-2适体；和(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
E129)E120-E128中任一项的方法，其中LINGO-2拮抗剂是可溶的LINGO-2多肽。
E130)E129的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含E102-E107中任一项的多肽。
E131)E129的方法，其中可溶的LINGO-2多肽包含选自由以下所组成的组的LINGO-2区域：(i)LINGO-2Ig结构域或片段、变体或其衍生物，(ii)LINGO-2LRR结构域或片段、变体，或其衍生物，和(iii)所述LINGO-2结构域或片段、变体，或其衍生物的组合。
E132)E130或E131的方法，其中所述可溶的LINGO-2多肽缺乏选自由以下所组成的组的LINGO-2区域：(i)LINGO-2跨膜区或片段、变体、或其衍生物，(ii)LINGO-2胞内结构域或片段、变体、或其衍生物，(iii)所述LINGO-2结构域或片段、变体、或其衍生物的组合。
E133)E120-E128中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂是LINGO-2抗体或其抗原结合片段。
E134)E133的方法，其中所述LINGO-2抗体或其抗原结合片段是E1-E28和E80中任一项的结合分子。
E135)E120-E128中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含LINGO-2拮抗剂多核苷酸。
E136)E135的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂多核苷酸选自由以下所组成的组：(i)反义多核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干扰RNA(siRNA)；和(iv)小发夹RNA(shRNA)。
E137)E120-E128中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含LINGO-2适体。
E138)E122-E127中任一项的方法，其中所述哺乳动物已被诊断为患有涉及运动神经元的疾病、病症或损伤。
E139)E124、E125或E138中任一项的方法，其中所述疾病、病症或损伤选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、X-连锁脊髓延髓性肌萎缩(SBMA；甘乃迪病(Kennedy disease))、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、脊髓性肌肉萎縮症(SMA)、小儿麻痹症后期综合症(PPS)、亨廷顿氏症、原发性震颤(ET)、运动神经元疾病、瘫痪和帕金森氏病所组成的组。
E140)E139的方法，其中所述疾病、病症或损伤为肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
E141)E120-E140中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂通过推注注射(bolus injection)或慢性输注给予。
E142)E120-E140中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂被直接给予到中枢神经系统中。
E143)E120-E140中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂被全身性(systemically)给予。
E144)E120或E121中的方法，包括(a)用经由可操作地连接于表达控制序列的编码所述LINGO-2拮抗剂的多核苷酸转染所述运动神经元，以及(b)允许所述LINGO-2拮抗剂的表达。
E145)E122-E143中任一项所述的方法，包括(a)给予哺乳动物经由可操作地连接于表达控制序列的编码所述LINGO-2拮抗剂的多核苷酸，以及(b)允许所述LINGO-2拮抗剂的表达。
E146)E145的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体而被给予。
E146)E145的方法，其中所述表达载体为病毒载体。
E147)E146的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体痘病毒载体所组成的组。
E148)E145-E147中任一项所述的方法，其中所述的给予包括(a)提供包含所述多核苷酸的培养的宿主细胞，其中所述培养的宿主细胞表达所述LINGO-2拮抗剂；和(b)将所述培养的宿主细胞导入到所述哺乳动物以使得所述LINGO-2拮抗剂在所述哺乳动物中表达。
E149)E148中的方法，其中所述培养的宿主细胞是衍生自要接受治疗的哺乳动物。
E150)E146-E149中任一项的方法，其中所述载体经选自由局部给予、眼内给予、肠胃外给予、鞘内给予、硬膜下给予和皮下给予所组成的组的途径给予。
附图说明
图1-大鼠组织的Q-PCR。LINGO-2在成年大鼠脑组织中高表达。通过Q-PCR进行LINGO-2mRNA表达的定量。
图2–P6小鼠组织的Q-PCR。LINGO-2在出生后6天(P6)的小鼠脑和脊髓组织中高表达。LINGO-2的mRNA表达的定量由Q-PCR进行。
图3–大鼠神经元细胞群的Q-PCR。LINGO-2在皮层神经元和背根神经节(DRG)中高表达。通过Q-PCR进行LINGO-2mRNA表达的定量。
图4–LINGO-2-Fc和抗-LINGO-2抗体促进运动神经元存活。用亚砷酸钠处理人运动神经元30分钟并允许在人IgG(对照)、可溶的LINGO-2-Fc或抗-LINGO-2抗体C09Fab存在下回收。孵育后，用抗-βIII微管蛋白和抗-神经丝蛋白通过免疫细胞化学对运动神经元染色。
图5–LINGO-2-Fc促进运动神经元轴突生长。通过Nycodenz梯度离心分离源自胚胎第16天(E16)大鼠脊髓的运动神经元。用亚砷酸钠处理分离的运动神经元30分钟并允许在人IgG或可溶的LINGO-2-Fc存在下回收。孵育后，用抗-神经丝蛋白通过免疫细胞化学对运动神经元染色。
图6–SODG93A小鼠中LINGO-2的表达量有所上调。使用原位杂交测量了65天野生型和SODG93A小鼠中LINGO-2RNA水平。计数了每种类型的小鼠的腹侧角区中的LINGO-2阳性细胞的数量。图表显示LINGO-2阳性细胞的数量(左)和LINGO-2阳性细胞的百分率(右)。
图7–抗-LINGO-2抗体上调AKT磷酸化。通过Western印迹测量对照样品中和用抗-LINGO-2抗体C09或对照抗体处理的样品中AKT的磷酸化水平。
图8–抗-LINGO-2抗体促进少突胶质细胞分化。在对照样品中和用抗-LINGO-2抗体C09在1、3或10μg/ml下处理的样品中测量髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的水平。
发明详述
I.定义
除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。如有冲突，以包括该定义在内的本申请为准。除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。为了所有的目的，将本发明中提及的所有出版物、专利以及其它参考文献的全部内容通过引用并入本发明，其如同每个单独出版物或专利申请被特定地或单独地指明通过引用被并入本发明一样。
尽管类似或等同于本发明中所描述的那些的方法和材料可被用于本发明的实施和检测，但下文描述了合适的方法和物质。这些物质、方法和实例仅是用于说明的目的而不意为限制。根据详述的说明书和权利要求书，本发明的其它特征和优势将变得明显。
为了进一步限定本发明，提供了以下术语以及定义。
应该注意，术语“一个(a)”或“一个(an)”实体指的是一个或多个该实体。例如，“一个免疫球蛋白分子”被理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。同样地，术语“一个”、
“一个或多个”以及“至少一个”在本发明中可互换使用。
术语“多核苷酸”是指包含单个核酸和多个核酸，也指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，诸如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”指出现在多核苷酸中的任何一个或多个核酸片段，如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指从天然环境中移出的核酸分子(DNA或RNA)。例如，包含在载体内的编码抗-LINGO-2结合分子(如抗体或其抗原结合片段)的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的进一步的例子包括存在于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化(部分或完全)的多核苷酸。分离的RNA分子包括体外或体内的多核苷酸的RNA转录本。分离的多核苷酸或核酸进一步包括如合成生产的分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可包含如启动子、核糖体结合位点或转录终止子的调控元件。所述多核苷酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成，其中所述多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链区和双链区的混合物的RNA、包括DNA和RNA在内的杂交分子(其中所述DNA和RNA可以是单链的或更典型地是双链的，或者单链区和双链区的混合物)所构成。另外，多核苷酸可以由包括RNA或DNA或者RNA和DNA两者在内的三链区所构成。多核苷酸还可以包括一个或多个修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基以及不常参见的碱基例如肌背。对DNA和RNA可以作各种各样的修饰；因此“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢地修饰的形式。
如本发明所使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子所构成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)并不翻译成氨基酸，但其可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如，启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等并不是编码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上或在分离的多核苷酸构建体中，例如，在独立的(不同的)质粒上。并且，任何载体可包含单个编码区或包含两个或多个的编码区，例如单个载体可分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码抗-LINGO-2拮抗剂(如抗体或其片段、变体或衍生物)的核酸融合或不融合。异源编码区域包括但并不限于特定的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能结构域。
在一些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。就DNA而言，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括可操作地与一个或多个编码区域相结合的启动子和/或其他与一个多个编码区可操作结合的转录或翻译控制元件。可操作地结合是基因产物，如多肽的编码区与一个或多个调控序列以该方式结合，以使基因产物的表达在调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码预期基因产物的mRNA转录，并且两个DNA片段之间的连接性质没有干扰指导基因产物表达的表达调控序列的能力或者没有干扰待转录的DNA模板的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区和与之相关的启动子)是“可操作地结合”的。因此，如果启动子能够影响所述核酸转录，那么启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。启动子可以是仅在预先决定的细胞中指导基本的DNA转录的细胞特异性启动子。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号可与多核苷酸可操作地结合，从而指导细胞特异性转录。本发明公开了合适的启动子和其他转录控制区。
本领域技术人员已知各种转录控制区。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如但不限于，来自巨细胞病毒(与内含子-A结合的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强区段。其他转录控制区域包括来自脊椎动物基因的转录控制区，如肌动蛋白、热击蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区域包括组织特异性的启动子和增强子，以及淋巴因子可诱导的启动子(如通过干扰素或白介素诱导的启动子)。
相似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。这些翻译控制元件包括，但不限于核糖体结合位点、转录起始和终止密码子和源自小核糖核酸病毒的元件(尤其是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。
在其他实施方式中，多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)形式。
多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的其他编码区结合，所述分泌肽和信号肽指导由多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白链输出穿过粗面内质网已经开始，所述信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白中切除。本领域技术人员意识到，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于多肽N-末端的信号肽，其从完整或“全长”的多肽中切除以产生该多肽分泌的或“成熟的”形式。在一些实施方式中，使用天然的信号肽(例如，免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或所述序列的功能性衍生物，所述功能性衍生物保留了指导与其可操作地结合的多肽分泌的能力。或者，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可由人类组织型纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡萄糖苷酸酶的前导序列代替。
如本发明所使用的术语"多肽"意为包含单个"多肽"和多个"多肽"，并指由酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或两个以上氨基酸的任何单链或多链，且不指明产物的具体长度。因此，用于指两个或多个以上氨基酸的单链或多链的肽、二肽、三肽、寡肽、"蛋白质"、"氨基酸链"或任何其他术语都包含在“多肽”的定义内，且可用术语“多肽”替代任何上述肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语或与任何上述肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语互换使用。术语“多肽”还意指多肽表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由己知的保护/保护基团衍生化，以及蛋白水解切割或被非自然产生的氨基酸修饰。多肽可来源于天然的生物来源或由重组技术产生，但并不必须由设计的核酸序列翻译而来。它可以任何方式生成，包括化学合成。
多肽可以是长度约为3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多或2000个或更多的氨基酸。尽管它们并不必需具有该结构，多肽可以具有定义的三维结构。具有定义的三维结构的多肽被称为折叠的多肽，而不具有定义的三维结构但能够采用(adopt)大量不同的构象的多肽被称为未折叠的多肽。如本发明所使用的术语"糖蛋白"指蛋白与至少一个糖部分(moiety)偶联，其中所述糖部分通过氨基酸残基(如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的含氧或含氮侧链连接(attach)到蛋白上。
“分离的”多肽或片段、变体或其衍生物指不在其自然环境中的多肽。不需要特殊水平的纯化。例如，分离的多肽可从天然或自然的环境中分离出。宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，正如己用任何适当的技术分离、分馏、部分或充分纯化的天然或重组多肽。
多肽可由互相以肽键或修饰的肽键(即肽的电子等排体)连接的氨基酸组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸(如，非自然产生的氨基酸)。多肽可由天然过程修饰，例如翻译后加工，或由本领域熟知的化学修饰技术来修饰。
当术语"片段"、"变体"、"衍生物"和"类似物"是指LINGO-2拮抗剂时，其包括促进运动神经元存活的任何拮抗剂分子。这些术语还包括促进运动神经元轴突生长的任何拮抗剂分子。可溶的LINGO-2多肽可包括LINGO-2蛋白水解片段、缺失片段以及特别是当递送至动物时更易到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括包含天然多肽抗原性或免疫原性表位的任何多肽部分，其中所述表位包括线性以及三维表位。可溶的LINGO-2多肽可包括含有上述片段的变体LINGO-2区域以及具有因氨基酸取代、缺失或插入而改变的氨基酸序列的多肽。变体可以自然产生，例如等位变体。"等位变体"指占据生物体染色体上特定基因座的基因的替代形式。Genes II,Lewin,B.,ed,John Wiley&Sons,New York(1985)。可使用本领域公知的突变技术来生产非自然产生的变体。可溶的LINGO-2多肽可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。LINGO-2拮抗剂还可包括衍生分子。例如，可溶的LINGO-2多肽可包括这样的LINGO-2区，其己被改变以展现天然多肽中未发现的额外特征。实例包括融合蛋白和蛋白复合物。
保守的取代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述提及的极性、碱性或酸性组中一个成员被相同组中另一成员的任何取代可被认为是保守的取代。
非保守取代包括这些的取代，在其中(i)具有正电性侧链的残基(如Arg、His或Lys)取代负电性残基(如Glu或Asp)或被后者取代，(ii)亲水残基(如Ser或Thr)取代疏水残基(如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被后者取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基或被任何其它残基取代，或(iv)具有大体积疏水或芳香侧链的残基(如Val、Ile、Phe或Trp)取代具有较小侧链(如Ala、Ser)或无侧链(如Gly)的残基或被后者取代。
两多核苷酸或多肽序列间的术语“百分率序列同一性”是指通过比较窗，考虑必需引入添加或缺失(如缺口)以优化两序列间比对的序列间共享的完全匹配位置的数量。匹配的位置是任何位置，该位置中相同的核苷酸或氨基酸位于目标序列和参考序列两者中。同样，因为对目标序列核酸或氨基酸计数而不是对来自参考序列的核酸或氨基酸计数，因此不记入存在于参考序列的缺口。
通过如下方式计算序列同一性百分比：确定位置的数量(在该位置上，两序列中的氨基酸残基或核酸碱基相同)以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较框中位置的总数再将结果乘以100得到序列同一性百分比。通过使用现有的在线或下载的可提供的软件对两序列间的序列进行比对并确定序列同一性百分比。可从各种渠道获得适合用于蛋白和核酸序列比对的软件程序。确定序列同一性百分比的一个合适的软件为bl2seq，其是BLAST程序套件一部分，该BLSAT套件可从美国政府的国家生物信息中心BLSAT网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)处获得。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两序列间的比对。BLASTN用于比对核酸序列，而BLASTP用于比对氨基酸序列。其他合适的程序为，例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，生物信息程序EMBOSS套件的一部分，并且也能够从欧洲生物信息学研究所(EBI)于www.ebi.ac.uklTools/psa处获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽目标序列中的不同区域均可具有它们自己的序列同一性百分比。应当注意的是序列同一性百分比数值四舍五入至最接近的十分之一。例如80.11、80.12、80.13和80.14向下四舍五入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18,和80.19向上四舍五入至80.2。还应当注意所述数值的长度将永远是整数。
本领域技术人员将理解(appreciate)，为了计算序列同一性百分比而产生序列比对并不限定于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比对。序列比对可由多重序列比对驱动。可以产生多重序列比对的合适的软件为ClustalW2，该软件可从www.clustal.org处获得。另一个合适的软件是MUSCLE，其可从www.driveS.com！muscle/处获得。或者，ClustalW2和MUSCLE也可从例如EBI得到。
同样应当理解可通过将序列数据与异源数据，例如结构数据(如晶体蛋白结构)、功能数据(如突变的位置)或进化数据相整合来产生序列比对。整合异源数据以产生多重序列比对的合适的软件为T-Coffee，其可获得自www.tcoffee.org，或从EBI处获得。还应当理解可自动或手动进行(curate)用于计算序列同一性百分率的最终比对。
当指抗-LINGO-2抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括任何保留相应抗体或抗体多肽的至少一些抗原结合特性的多肽。除本发明中其他地方论述的特异性抗体片段外，多肽片段包括蛋白水解片段和缺失的片段。除非特别指出，本发明中所使用的参照抗体的“其片段”指免疫特异性片段，即抗原特异性片段。抗-LINGO-2抗体的变体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，且还包括由于氨基酸替换、缺失或插入而改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是自然发生的或非自然发生的。变体多肽可包括保守或非保守氨基酸替换、缺失或添加。变体多肽同样在本发明可指“多肽类似物”。本发明中所使用的抗-LINGO-2抗体或抗体多肽的“衍生物”指通过功能侧链基团的反应衍生的具有一个或多个化学残基的主题多肽(subjectpolypeptide)。“衍生物”还包括那些包含一个或多个20种标准氨基酸的自然产生的氨基酸衍生物的多肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；均聚丝氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可取代赖氨酸。抗-LINGO-2抗体和抗体多肽的衍生物可包括已改变的以展现出在参考抗体或抗体多肽中未发现的额外特征的多肽。
“多肽片段”指多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是“独立的(free-standing)”，或被包含在更大的多肽中，其中所述片段形成区域的一部分。多肽片段的代表性实例包括，例如，含有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸以及约1,000个氨基酸长度的片段。
“结合分子”或“抗原结合分子”其最宽泛的含义是指特异地结合抗原决定簇的分子。在一个实施方式中，所述结合分子特异性地结合LINGO-2(如全长的LINGO-2或成熟的LINGO-2)。在另一个实施方式中，抗原结合分子是抗体或其抗原结合片段。
本发明中描述了抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体和其衍生物。除非特指全长抗体(如自然产生的抗体)，术语“抗-LINGO-2抗体”包含全长抗体以及该抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，如自然产生的抗体或免疫球蛋白分子或工程抗体分子或与抗体分子以相似的方式与抗原相结合的片段。
在一些实施方式中，氨基酸替换是保守氨基酸替换。或者，通过例如饱和诱变，可随机地沿全部或部分编码序列引入突变，并且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体(如结合LINGO-2多肽(如人类、灵长类、鼠，或人类、灵长类、鼠LINGO-2的任意组合)的能力)。“人类”或“完全人类”抗体的这种变体(或其衍生物)还可指“优化的”或“为抗原结合而优化的”且包括具有提高的抗原亲和力的人类或完全人类抗体。
在一个实施方式中，所述LINGO-2拮抗剂是“抗体”或“免疫球蛋白”分子或其抗原结合片段，如自然产生的抗体或免疫球蛋白分子或工程化的抗体分子或与抗体分子以相似的方式与抗原相结合的片段。本发明中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重链的可变结构域，并且通常至少包括重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对的被很好地理解。参见例如Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.，1988)。
在自然产生的抗体中，存在于每个抗原结合结构域中的6个"互补决定区"或"CDR"是短的、非连续的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列当抗体在水性环境中采取其三维构型时被特别地放置以形成抗原结合结构域。被称为"框架"区的抗原结合结构域中氨基酸的剩余部分显示出较少的分子间可变性。框架区在很大程度上采用β-片构型，而且CDR形成环，其中所述环连接β-片结构并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。因此，框架区用来形成支架结构(scaffold)，其为了通过链间非共价相互作用以正确方向走位CDR而做准备。由定位的CDR所形成的抗原结合结构域界定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补性表面促进抗体对其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地鉴定分别包括CDR和框架区在内的氨基酸，因为它们己经被精确地定义(参见“Sequencesof Protein of Immunological Interest”Kabat,E.等，U.S.Department ofHealth and Human Services，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mo l.Biol.,196:901-917(1987)，其通过引用全文并入本)。
如果本领域使用和/或接受的术语有两个或多个的定义，本发明使用的定义意在包含所有这些定义，除非明确指出相反意义。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽可变区内发现的非连续抗原结合位点。这个特殊的区域己在Kabat等在美国健康与人类服务部发表的文章“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983)和Chothia等在J.MoI.Biol.196:901-917(1987)中发表的文章中描述，上述文献通过引用全部并入本发明。当将Kabat和Chothia的CDR定义相互比较时，根据Kabat和Chothia的CDR定义包括氨基酸残基的重叠或氨基酸残基的子集。然而，适用于抗体或其变体CDR的任一定义的应用意在本发明定义及使用的术语的范围之内。包括由以上引用的每一参考文献所定义的CDR的适当的氨基酸残基在下表1中列出以作比较。包含特定CDR的确切的残基数目取决于CDR的序列和大小而变化。已知抗体的可变区氨基酸序列，本领域的技术人员通常可确定哪些残基包含特定的CDR。
表1.CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR 31-35 26-32
VH CDR 50-65 52-58
VH CDR 95-102 95-102
VL CDR 24-34 26-32
VL CDR 50-56 50-52
VL CDR 59-97 91-96
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人提出的编号习惯(参见下)
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统指定于任何可变结构域序列，无需依赖序列本身以外的任何实验数据。如本发明使用的“Kabat编号”指由Kabat等所提出的编号系统(Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))。除非另有规定，LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物中特异性氨基酸残基的编号参考根据Kabat的编号系统。
在一个实施方式中，抗原结合分子包含参考抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方式中，抗原结合分子包含来自一个或多个的参考抗原分子的至少两个CDRs。在另一实施方式中，抗原结合分子包含来自一个或多个的参考抗原分子的至少三个CDRs。在另一实施方式中，抗原结合分子包含来自一个或多个的参考抗原分子的至少四个CDRs。在另一实施方式中，抗原结合分子包含来自一个或多个的参考抗原分子的至少五个CDRs。在另一实施方式中，抗原结合分子包含来自一个或多个的参考抗原分子的至少六个CDRs。在一些实施方式中，参考抗体分子是C09。包含至少一个可被包含于受治疗者抗原结合分子的CDR的示例性抗体分子在本领域是已知的并且在本发明描述了示例性分子。
除非特指全长的抗体(如自然产生抗体)，术语"抗-LINGO-2抗体"包括全长的抗体以及该抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，如自然产生的抗体或免疫球蛋白分子或工程抗体分子或以类似的方式将抗原结合于抗体分子的片段。
抗体或其抗原结合片段包括但不限于多克隆的、单克隆的、多特异性的、人类的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域在内的片段、由Fab表达文库所产生的片段，以及抗个体基因型(抗-Id)抗体(包括例如本发明所公开的结合分子的抗-Id抗体)。scFv分子是本领域中已知的并描述于例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、gA和IgY)、分类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
包括单链抗体的抗体片段可包括单独的可变区或与下列全部或一部分组合在一起的可变区：铰链区、CH1、CH 2和CH 3结构域。本发明还提供抗原结合片段，其也包括可变区与铰链区、CH1、CH 2和CH 3结构域的任何组合。抗体或其免疫特异性片段可以来自包括鸟和哺乳动物在内的任何动物来源。在一些实施方式中，所述抗体是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方式中，所述可变区可以是condricthoid来源的(例如来自鲨鱼)。
如本发明所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包括重链部分在内的多肽包括以下至少一个：CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH 2结构域、CH 3结构域或者其变体或片段。例如，结合多肽可包括含有CH 1结构域；含有CH1结构域的多肽链、铰链结构域的至少一部分和CH 2结构域的多肽链；含有CH 1结构域和CH 3结构域的多肽链；含有CH 1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH 3结构域的多肽链；或者含有CH l结构域、铰链结构域的至少一部分、CH 2结构域和CH 3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。此外，本发明所用的结合多肽可缺少CH 2结构域的至少一部分(例如CH 2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以使它们在氨基酸序列上不同于自然产生的免疫球蛋白分子。结合多肽的重链部分可源自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，重链部分可包含部分源于IgG1分子的铰链区和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，重链部分可包含部分源自IgG1分子和含部分源自IgG4分子的嵌合的铰链。
如本发明所用，术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。通常，轻链部分包括至少一个VL或CL结构域。
本发明所公开的抗-LINGO-2抗体，或抗原结合片段、变体，或其衍生物可根据抗原(如本发明所公开的目标多肽(如全长或成熟的LINGO-2))的表位或部分来描述或说明，其中所述抗体或其结合片段、变体特异性识别或结合所述目标多肽的表位或部分。特异地与抗体的抗原结合域相互作用的目标多肽的部分为“表位”或“抗原决定簇”。目标多肽可包含单一的表位，但典型地包含至少两个表位，且能够包括任何数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应当注意到目标多肽上的“表位”可以是或可以包含非多肽元素，如表位可以包括糖侧链。
抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是约4到5个氨基酸。肽或多肽表位可包含至少七个、至少九个或至少约15到约30个氨基酸。由于CDR可识别抗原肽或其呈三级结构形式的多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是邻接的，并且在一些情形中，甚至可以不在相同的肽链上。由抗-LINGO-2抗体所识别的肽或多肽表位可包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或约15到约30个邻接或非邻接的LINGO-2氨基酸序列。
“特异性地结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域结合至表位，且该结合需要抗原结合结构域与表位之间的若干互补。相比结合于随机的、不相关的表位，当抗体更容易地通过抗原结合结构域结合表位时，根据所述定义，可以说抗体“特异性结合”于表位。本发明使用术语“特异性”来限定某种抗体结合于某种表位的相对亲和力。例如，对于给定的表位，可认为抗体“A”比抗体“B”具有更高的特异性，或可认为相对于相关表位“D”，抗体“A”以更高特异性结合于表位“C”。
“优先结合”的意义是相对于相关的、相似的、同源的或同功的(analogous)表位，抗体更容易地特异性结合于一个表位。因此，相对于先关表位，“优先结合”于给定表位的抗体更可能结合于给定表位即使该抗体可与相关表位发生交叉反应。
通过非限制性的实施例，如果抗体结合第一个表位的解离常数(KD)低于第二个表位的抗体的KD，可认为抗体优先结合于第一个表位。在另一个非限制性的实施例中，如果抗体结合于第一个表位的亲和力比第二个表位的抗体的KD低至少一个数量级，可认为抗体优先结合第一个表位。在另一个非限制性的实施例中，如果抗体结合于第一个表位的亲和力比第二个表位的抗体的KD低至少两个数量级，可认为抗体优先结合第一个表位。
在另一非限制性的实施例中，如果抗体结合第一个表位的解离速率(K(off))低于第二个表位的抗体K(off)，可认为抗体优先结合第一个表位。在另一非限制性的实施例中，如果抗体结合第一个表位的亲和力比第二个表位的抗体的K(off)低至少一个数量级，可认为抗体优先结合第一个表位。在另一非限制性的实施例中，如果抗体结合第一个表位的亲和力比第二个表位的抗体的K(off)低至少两个数量级，可认为抗体优先结合第一个表位。可以说本发明所公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(K(off))结合本发明所公开的目标多肽(如人类、灵长类、鼠LINGO-2或人类、灵长类、鼠LINGO-2的任意组合)或其片段或变体。可以说抗体以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1或10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(K(off))结合本发明所公开的目标多肽(如人类、灵长类、鼠LINGO-2或人类、灵长类、鼠LINGO-2的任意组合)或其片段或变体。
可以说本发明所公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1、或5×104M-1sec-1的结合速率(K(on))结合本发明所公开的目标多肽(如人类、灵长类、鼠LINGO-2或人类、灵长类、鼠LINGO-2的任意组合)或其片段或变体。可以说本发明所公开的抗体以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、或5×06M-1sec-1或107M-1sec-1的结合速率(K(on))结合本发明所公开的目标多肽(如人类、灵长类、鼠LINGO-2或人类、灵长类、鼠LINGO-2的任意组合)或其片段或变体。
如果抗体以某种程度优先结合于其表位，所述程度为在一定程度上阻断相关抗体(reference antibody)结合于该表位，那么，可认为该抗体竞争性抑制相关抗体与给定表位的结合。可用本领域任何已知方法测定竞争性抑制，例如，竞争性ELISA试验。可认为抗体至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％竞争性抑制相关抗体和给定表位的结合。
如本发明所使用的术语“亲和力(affinity)”指单个表位与免疫球蛋白分子的CDR结合的强度测量。参见，例如，Harlow等Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.)第27-28页。如本发明所使用的术语“亲合性(avidity)”指免疫球蛋白群与一个抗原之间的复合物总体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如，Harlow第29-34页。亲合性与群体中个体免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力有关，还与免疫球蛋白和抗原的化合价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(例如多聚体)的抗原之间的相互作用，将是一种高亲合性。
抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可根据它们的交叉反应性来描述或说明。如本发明所使用的术语“交叉反应性”指抗体(特别是针对一个抗原)与第二抗原反应的能力；两种不同的抗原物质间关联程度的测量。因此如果抗体与表位结合而不是与诱导抗体形成的表位结合，则抗体是交叉反应性的。交叉反应性的抗原通常包含许多相同的互补结构特征作为诱导抗原，且在一些情况下，可以实际上比原始抗原更为适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，其中它们结合有联系但却不相同的表位，如与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％的同一性(使用本领域已知方法计算得出，并描述于本发明)的表位。如果抗体不结合与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％的同一性(使用本领域已知方法计算得出，并描述于本发明)的表位，则可以说抗体具有极小或没有交叉反应性。如果抗体不结合前述表位的任何其他类似物、直系物(ortholog)或同系物，则可认为抗体对某些抗原“高特异性”。
如前所述，众所周知各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维结构。如本发明所使用的术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链氨基末端的可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最靠近氨基末端的)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并为免疫球蛋白重链分子饺链区的氨基末端。
如本发明所使用的术语“CH2结构域”包括部分重链分子，使用常规的编号方案，所述部分重链分子例如，大约从抗体的残基244延伸至残基360(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231至340，EU编号系统；参见Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”(1983))。CH2结构域的独特之处在于不与另一结构域紧密配对。相反，两个N-连接的分支糖链被括在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。文献还详细记录CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端，包含大约108个残基。
如本发明所使用的术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。铰链区包含大约25个残基且是柔韧的，因此使两个N-末端的抗原结合区得以独立移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上铰链结构域、铰链结构域和铰链结构域(Roux等，J.Immunol.161:4083(1998))。
如本发明所使用的术语“二硫键“包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含一个疏基，所述巯基可与另一个巯基形成二硫键或桥。在大多数自然产生的IgG分子中，CH1和CK区由二硫键连接，两条重链在对应于使用Kabat编号系统的239和242位(EU编号系统226或229位)由两个二硫键连接。
如本发明所使用的术语“嵌合抗体”是指任何抗体，其中，免疫反应区或免疫反应位点获得自或源自第一种类，且恒定区(可为根据本发明的完整的、部分的或修饰的)获得自第二种类。在优选的实施方式中，目标结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)而恒定区是人类的。
如本发明所使用的，“人类”或“完全人类”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体且包括从人类免疫球蛋白库中或从转基因动物分离的抗体，其中所述转基因动物表达一种或多种人类免疫球蛋白但不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述并且例如Kucherlapati等的美国专利第5,939,598号。“人类”或“完全人类”抗体还包括包含至少重链可变结构域或至少重链和轻链的可变结构域，其中所述可变结构域具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。“人类”或“完全人类”抗体还包括如前所描述的“人类”或“完全人类”抗体，其包括、基本由或由本发明所描述的抗体分子(如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成，其中抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物免疫特异性地结合LINGO-2多肽或其片段或变体。
可使用本领域技术人员己知的标准技术将突变引入编码人类抗-LINGO-2抗体的核苷酸序列中，包括但不限于引起氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，变体(包括衍生物)可编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在一个实施方式中，一个或多个存在于抗体CDR中的半胱氨酸残基被改变为不同的氨基酸残基。
如本发明所使用的术语“工程抗体”指重链和轻链中的任一个或两者的可变结构域通过从己知特异性的抗体中至少部分取代一个或一个以上CDR来改变的抗体，并且，如果必要的话，取代部分框架区并改变序列。尽管CDR可来自与作为框架区来源的抗体同类甚至同亚类的抗体，但理想的是，CDR将来自不同类的抗体，和/或来自不同物种的抗体。来自己知特异性的非人类抗体中的一个或一个以上“供体”CDR嫁接于人重链或轻链框架区的工程抗体称为“人源化抗体”。在某些实施例中，可不必用供体可变区的完整CDR取代所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域。相反，只需转移维持目标结合位点活性所需的残基。已在例如美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号中提出的解释，本领域技术人员将能够通过常规实验或反复试验获得功能性工程抗体或人源化抗体。
应当进一步认识到人源化抗体的重链或轻链或重链和轻链两者的可变结构域中的框架区可包含单独的人源残基，在这些情况中所述人源化抗体的框架区被称为“完全人类框架区”。或者，如果必要的话，可在人源化抗体重链或轻链或前述两者中的可变结构域的人类框架区的相应位置上工程化供体可变结构域框架区的一个或多个的残基以保持与LINGO-2抗原正确结合或与LINGO-2抗原增强结合。在这一方法中已被工程化的人类框架区将因此包含人类和供体框架残基的混合，并在本发明中被称为“部分人类框架区”。
例如抗-LINGO-2抗体人源化基本遵循Winter及其同事的方法(Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988))，通过替换啮齿类或突变啮齿类抗-LINGO-2的CDRs或CDR序列到人类抗体的相应序列来进行。还参见美国专利第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,859,205号；在此引入作为参考。得到的人源化抗-LINGO-2抗体将包括至少一个在人源化抗体的重链和/或轻链的可变结构域的完全人类框架区中的啮齿类或突变的啮齿类CDR。在一些情况下，人源化抗-LINGO-2抗体的一个或多个可变结构域的框架区中的残基被替换为相应的非人类(例如，啮齿类)残基(例如参见美国专利第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号和第6,180,370号)，其中获得的人源化抗-LINGO-2抗体将包含重链和/或轻链的可变结构域中的部分人类框架区。
此外，人源化抗体可包含在受体抗体(recipient antibody)或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改造抗体的性能(例如，以获得需要的亲和力)。一般而言，人源化抗体将基本上包含全部至少一个、通常是两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDRs对应于非人免疫球蛋白的CDRs且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白序列的框架区。人源化抗体还任选地将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般地包含人免疫球蛋白恒定区的一部分。更多细节参见Jones等,Nature 331:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)；在此引入作为参考。相应地，该“人源化”抗体可包括抗体，该抗体中基本上少于完整人类可变结构域已被替换成来自非人类物种的相应序列。实际上，人源化抗体通常是人类抗体，其中至少一些CDR残基以及有可能一些框架残基被替换为啮齿类抗体中类似位点的残基。例如参见美国专利第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,859,205号。同样参见美国专利第6,180,370号和国际公开WO01/27160，其中公开了人源化抗体以及生产具有提高对预先决定的抗原的亲和力的人源化抗体的技术。
如本发明所使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语指以任何方式把两个以上元件或组分连接起来，所述任何方式包括化学结合和重组方法。“框内融合”指以保持原ORF的正确翻译阅读框的方式，把两个或两个以上开放阅读框(ORF)连接起来以形成一个连续的较长ORF。因此，所得重组融合蛋白是单一蛋白，所述单一蛋白包含两个或多个对应于原ORF编码的多肽的片段(在自然界中所述片段通常并不如此结合)。虽然因此阅读框在整个融合片段中是连续的，但所述片段可由例如框内连接序列在物理上或空间上分离。
在多肽的上下文中“直线序列”或“序列”是多肽中的氨基酸从氨基至竣基末端方向的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
如本发明所使用的术语“表达”指基因产生生化物质(例如，RNA或多肽)的过程。所述过程包括基因在细胞内功能性体现的任何表现形式，包括但不限于基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。这包括但不限于：基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，及这种mRNA翻译成多肽。如果最终期望的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本发明所用，基因产物可以是核酸(如由基因的转录所生产的信使RNA)或从转录本翻译得到的多肽。本发明描述的基因产物进一步包括转录后修饰的核酸(如多腺苷化)或翻译后修饰的多肽(如甲基化、糖基化、添加脂类、与其他蛋白亚基缔合、蛋白酶切等)。
如本文所用"治疗有效量"指的是以必要的剂量和时间段对达到期望的治疗结果有效的量。治疗结果可以是例如症状的减轻、延长的存活、改善的活动性以及诸如此类。治疗结果不必是“治愈”。
如本文所用“预防有效量”指的是以必要的剂量和时间段对达到期望的预防结果有效的量。通常，由于在疾病之前或其较早阶段将预防剂量用于受治疗者，所以预防有效量将少于治疗有效量。
如本发明所使用的术语“治疗”或“处理”指治疗性处理和预防或防治性措施，其目标是预防或延缓(减少)不期望的生理改变或生理失调，例如自身免疫状况的进展。有利的或理想的临床结果包括但不限于：病症的缓和、疾病程度的降低、病情稳定(即无恶化)、疾病进展的延迟或减缓、病情的改善或减轻和缓解(部分或全部的)，无论可检测或不可检测的。“治疗”还可指相比未接受治疗的预期存活时间延长存活时间。需要治疗的那些受治者包括己有病症或失调的受治者和倾向于患上病症或失调的受治者或待预防病症或失调的受治者。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指任何受试者，特别是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人类、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、如豚鼠、兔、大鼠、小鼠的宠物动物、如猿、猴子、猩猩和黑猩猩的灵长类、如狗和狼的犬类、如猫、狮子和老虎的猫类、如马、驴和斑马的马科动物、如牛、猪和羊的食物动物、如鹿和长颈鹿的有蹄类动物、熊等。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人类受试者。
如本发明所用，短语如“将从LINGO-2拮抗剂的给药中受益的受试者”和“需要治疗的动物”包括将从LINGO-2拮抗剂的给药中受益的如哺乳动物受试者的受试者，所述LINGO-2拮抗剂用于检测抗-LINGO-2多肽(如用于诊断步骤)和/或从使用如抗-LINGO-2抗体的LINGO-2拮抗剂治疗如ALS疾病的缓和或预防。
术语“RNA干扰”或“RNAi”是指沉默或减少通过siRNA的基因表达。它是动物和植物中序列特异性的转录后基因沉默过程，其由双链区与该沉默的基因序列同源的siRNA所启动。所述基因对于生物体可以是内源或外源性的，整合到染色体中存在或存在于未整合到基因组中的转染载体中。该基因的表达被完全或部分抑制。RNAi也可被认为抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全的或部分的。
II.LINGO-2
LINGO-2在皮层神经元和背根神经节(DRG)神经元中表达，且负向调节运动神经元存活和运动神经元轴突长度。
自然产生的人LINGO-2是一个606氨基酸的多肽。报道了Genbank中登录号为MN_152570的编码人LINGO-2mRNA的多核苷酸：
报道了Genbank中登录号为NP_689783的人LINGO-2(由SEQ ID NO：1的核酸651到2471位编码)的多肽序列：
MLHTAISCWQPFDGLAVVLIFMGSTIGCPARCECSAQNKSVSCHRRRLIAIPEGIPIETKILDLSKNRLKSVNPEEFISYPLLEEIDLSDNIIANVEPGAFNNLFNLRSLRLKGNRLKLVPLGVFTGLSNLTKLDISENKIVILLDYMFQDLHNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLLSLEQLTLEKCNLTAVPTEALSHLRSLISLHLKHLNINNMPVYAFKRLFHLKHLEIDYWPLLDMMPANSLYGLNLTSLSVTNTNLSTVPFLAFKHLVYLTHLNLSYNPISTIEAGMFSDLIRLQELHIVGAQLRTIEPHSFQGLRFLRVLNVSQNLLETLEENVFSSPRALEVLSINNNPLACDCRLLWILQRQPTLQFGGQQPMCAGPDTIRERSFKDFHSTALSFYFTCKKPKIREKKLQHLLVDEGQTVQLECSADGDPQPVISWVTPRRRFTTTKSNGRATVLGDGTLEIRFAQDQDSGMYVCIASNAAGNDTFTASLTVKGFASDRFLYANRTPMYMTDSNDTISNGTNANTFSLDLKTILVSTAMGCFTFLGVVLFCFLLLFVWSRGKGKHKNSIDLEYVPRKNNGAVVEGEVAGPRRFNMKMI(SEQ ID NO：2).
报道了Genbank中登录号为NM_175516.4的编码小鼠LINGO-2mRNA的多核苷酸：
报道了Genbank中登录号为NP_780725的小鼠LINGO-2多肽序列：
报道了Genbank中登录号为NM_001107926.1的编码大鼠LINGO-2mRNA的多核苷酸：
报道了Genbank中登录号为NP_001101396的大鼠LINGO-2多肽序列：
自然产生的人LINGO-2多肽(还称为FLJ31810、亮氨酸富集重复和免疫球蛋白样结构域包含nogo受体相互作用蛋白2，LERN3，亮氨酸富集重复神经元蛋白3C，亮氨酸富集重复神经元蛋白6C，LRRN6C，PR031993或UNQ9234)是606个氨基酸的大约68Kda的蛋白(SEQ IDNO：2)。LINGO-2是LINGO蛋白家族的成员，所述家族包括至少三种其它人类旁系同源物LINGO-1、LINGO-3和LINGO-4。参见Mi等人，Nature Neurosci.7:221-28(2004)。人类LINGO-2多肽包含一段亮氨酸富集重复(包括N-末端帽(LRRNT)和C-末端帽(LRRCT))。LINGO-2还包括Ig结构域、跨膜区和胞内结构域。另外，自然产生的LINGO-2蛋白在蛋白的N-末端包含信号序列。如本领域技术人员将理解的，本发明报告的LINGO-2各结构域的长度是近似的。基于SEQ IDNO：2的氨基酸序列，表2列出了LINGO-2的近似边界。
表2－LINGO-2结构域
己经研究了大鼠和小鼠中LINGO-2的组织分布。通过定量PCR(Q-PCR)确定了成年大鼠LINGO-2的表达位于中枢神经系统中。通过定量PCR(Q-PCR)确定了在P6(出生后第6天)小鼠中，LINGO-2的表达位于皮层神经元和背根神经节中(参见图1和2)。
III.使用LINGO-2拮抗剂的方法
尽管LINGO-1和LINGO-2共享近60.7％氨基酸序列同一性，如本发明所证明的，这些多肽的拮抗作用对细胞产生不同影响。更为具体地，LINGO-2拮抗剂不促进髓鞘再生而LINGO-1拮抗剂促进髓鞘再生。另外，LINGO-1和LINGO-2的表达模式有所不同。特别是，LINGO-2在脊髓中的表达量高于在脑中的表达量，而LINGO-1在脑中的表达量高于在脊髓中的表达量。
本发明中提供了在动物中治疗患有与运动神经元存活或运动神经元轴突生长有关的疾病、障碍或损伤(如肌萎缩侧索硬化症)的方法。在一些实施方式中，所述方法包括、基本上由或由向动物给予有效量的LINGO-2拮抗剂组成。在某些实施方式中，所述LINGO-2拮抗剂选自由可溶的LINGO-2多肽、LINGO-2抗体或其抗原结合片段、LINGO-2拮抗剂多肽、LINGO-2适体、和其组合所组成的组。
另外本发明提供了一种(在哺乳动物或体外)促进运动神经元存活或运动神经元轴突生长的方法，包括、基本上由或由将运动神经元与有效量的LINGO-2拮抗剂相接触组成。其中所述运动神经元在哺乳动物中，所述的量可以是治疗有效的量。在某些实施方式中所述LINGO-2拮抗剂选自由可溶的LINGO-2多肽、LINGO-2抗体或其抗原结合片段、LINGO-2拮抗剂多肽、LINGO-2适体、和其组合所组成的组。
本发明公开的在治疗方法中要使用的LINGO-2拮抗剂，如可溶的LINGO-2多肽、LINGO-2抗体或其抗原结合片段、LINGO-2拮抗剂多肽、LINGO-2适体可以进行制备并作为治疗剂使用，其阻断、减少、预防或抑制LINGO-2的活性以负向调节轴突生长或神经元存活。
在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂可促进具体运动神经元类型的轴突生长。例如LINGO-2拮抗剂可促进上位运动神经元或下位运动神经元的轴突生长。LINGO-2拮抗剂可促进α运动神经元或γ运动神经元的轴突生长。LINGO-2拮抗剂可促进躯体运动神经元、特殊内脏运动神经元(双叉运动神经元)或一般内脏运动神经元(内脏运动神经元)的轴突生长。
在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂可促进特定类型的运动神经元存活。例如LINGO-2拮抗剂可促进上位运动神经元或下位运动神经元的存活。LINGO-2拮抗剂可促进α运动神经元或γ运动神经元的存活。LINGO-2拮抗剂可促进躯体运动神经元、特殊内脏运动神经元(双叉运动神经元)或一般内脏运动神经元(内脏运动神经元)的存活。
在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂可促进少突胶质细胞分化。
在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂可促进AKT磷酸化。在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂可促进DRG细胞中AKT磷酸化。
进一步的实施方式包括一种诱导运动神经元存活以治疗涉及运动神经元破坏的疾病、障碍或损伤的方法，包括可选地在哺乳动物疾病、障碍或损伤位点附近给予有效量的LINGO-2拮抗剂以减少运动神经元轴突延伸抑制。
可通过直接给予如可溶的LINGO-2多肽、LINGO-2抗体或其抗原结合片段、LINGO-2拮抗剂多肽或LINGO-2适体的方式向患者给予LINGO-2拮抗剂。或者，可以通过产生特异性LINGO-2拮抗剂的表达载体来给予LINGO-2拮抗剂。在某些实施方式中，在治疗方法中给予LINGO-2拮抗剂的方式包括：(1))用表达LINGO-2拮抗剂的核酸例如载体来转化或转染可移植的宿主细胞；以及(2)将转化的宿主细胞移植入哺乳动物中。在一些实施方式中，所述宿主细胞移植到疾病、病症或损伤部位。在一些实施方式中，将可移植的宿主细胞从哺乳动物中取出、短暂培养、用编码LINGO-2拮抗剂的分离的核酸转化或转染并移植回其所取自的相同哺乳动物中。可以但不要求将所述细胞从其被植入的相同部位取出。有时被称为活体外(ex vivo)基因治疗的这种实施方式可在一段时间内提供连续的LINGO-2拮抗剂供应。
可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或病症包括与运动神经元存活相关的疾病、病症或损伤。这些疾病包括，但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、X-连锁脊髓延髓性肌萎缩(SBMA；甘乃迪病(Kennedy disease))、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、脊髓性肌肉萎縮症(SMA)、小儿麻痹症后期综合症(PPS)、亨廷顿氏症、原发性震颤(ET)、运动神经元疾病、瘫痪、帕金森氏病和其他运动功能相关疾病。
在一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂的给予足以减少或预防与减少的运送神经元功能相关的特定症状。例如LINGO-2拮抗剂可提高、稳定或预防肌肉萎缩、肌无力、肌束颤动、肌纤维震颤(fibrilliation)、张力低下，反射降低，乏力，亢进，反射亢进，阵挛，瘫痪(如四肢瘫、截瘫或单瘫)、痉挛、巴宾斯基试验(Babinski test)、休息震颤、手足徐动症、舞蹈病(chorea)、舞蹈症(ballismus)、迟发性运动障碍(tardivedyskinesia)、强直(ridigity)、肌张力障碍、共济失调、辨距不良(dysmetria)、轮替运动障碍(dysdiadochokinesia)、眼球震颤、延迟在发起运动、运动迟缓或其他运动障碍。
IV.可溶的LINGO-2多肽
LINGO-2多肽包括可溶的LINGO-2多肽的片段、变体或其衍生物。上面的表2描述了人类LINGO-2多肽的各个结构域。相似的结构域结构可以由其它物种的LINGO-2多肽如小鼠LINGO-2(SEQ IDNO：4)推导。可溶的LINGO-2多肽通常缺乏LINGO-2多肽的跨膜结构域，并任选地缺乏LINGO-2多肽的胞质结构域。例如，某些可溶的人类LINGO-2多肽缺乏包含人类LINGO-2的跨膜结构域在内的SEQ ID NO：2的氨基酸546-566。另外，某些可溶的LINGO-2多肽包含LINGO-2多肽的LRR结构域和Ig结构域。
变体LINGO-2多肽还可在相应的野生型多肽上变化。特别地，某些氨基酸取代可被引入LINGO-2序列而不明显失去LINGO-2生物活性。在示例性的实施方式中，变体LINGO-2多肽包括一个或多个氨基酸取代，并且/或者包含与选自由如下组成的组的参照氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸28至408、SEQ ID NO：2的氨基酸28至500或LINGO-2的等价片段类似物(如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6)。在序列上不同于LINGO-2的任何给定片段的变体LINGO-2多肽可包括一个或多个氨基酸取代(保守或非保守的)、一个或多个缺失、和/或一个或多个插入。在某些实施方式中，可溶的LINGO-2多肽在例如哺乳动物中促进运动神经元存活或运动神经元轴突生长。
可溶的LINOG-2多肽可包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的至少6个，例如10个、15个、20个、25个、30个、40个、55个、60个、70个、100个或更多氨基酸的片段。另外，可溶的LINGO-2多肽可包括至少1个，例如5个、10个、15个或20个保守氨基酸取代。还考虑与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的参照LINGO2多肽至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的可溶的LINGO-2多肽的相应片段。在某些实施方式中，可溶的LINGO-2多肽在例如哺乳动物中促进运动神经元存活或运动神经元轴突生长。
“LINGO-2参照氨基酸序列”或“参照氨基酸序列”是指不引入任何氨基酸取代的特定序列。如本领域普通技术人员将理解的，如果没有取代，“分离的多肽”包括与参照氨基酸序列相同的氨基酸序列。
另外的可溶的LINGO-2多肽包括但不限于，人类LINGO-2多肽片段，其包括、基本上由或由下列所组成：SEQ ID NO：2的氨基酸1至57；SEQ ID NO：2的氨基酸1至79；SEQ ID NO：2的氨基酸1至103；SEQ ID NO：2的氨基酸1至127；SEQ ID NO：2的氨基酸1至151；SEQ ID NO：2的氨基酸1至175；SEQ ID NO：2的氨基酸1至199；SEQ ID NO：2的氨基酸1至223；SEQ ID NO：2的氨基酸1至247；SEQ ID NO：2的氨基酸1至271；SEQ ID NO：2的氨基酸1至295；SEQ ID NO：2的氨基酸1至319；SEQ ID NO：2的氨基酸1至343；SEQ ID NO：2的氨基酸1至408；SEQ ID NO：2的氨基酸1至500；SEQ ID NO：2的氨基酸1至545；SEQ ID NO：2的氨基酸28至57；SEQ ID NO：2的氨基酸28至79；SEQ ID NO：2的氨基酸28至103；SEQ ID NO：2的氨基酸28至127；SEQ ID NO：2的氨基酸28至151；SEQ ID NO：2的氨基酸28至175；SEQ ID NO：2的氨基酸28至199；SEQ ID NO：2的氨基酸28至223；SEQ ID NO：2的氨基酸28至247；SEQ ID NO：2的氨基酸28至271；SEQ ID NO：2的氨基酸28至295；SEQ ID NO：2的氨基酸28至319；SEQ ID NO：2的氨基酸28至343；SEQ ID NO：2的氨基酸28至408；SEQ ID NO：2的氨基酸28至500；SEQ ID NO：2的氨基酸28至545；SEQ ID NO：2的氨基酸58至79；SEQ ID NO：2的氨基酸58至103；SEQ ID NO：2的氨基酸58至127；SEQ ID NO：2的氨基酸58至151；SEQ ID NO：2的氨基酸58至175；SEQ ID NO：2的氨基酸58至199；SEQ ID NO：2的氨基酸58至223；SEQ ID NO：2的氨基酸58至247；SEQ ID NO：2的氨基酸58至271；SEQ ID NO：2的氨基酸58至295；SEQ ID NO：2的氨基酸58至319；SEQ ID NO：2的氨基酸58至343；SEQ ID NO：2的氨基酸58至408；SEQ ID NO：2的氨基酸58至500；SEQ ID NO：2的氨基酸58至545；SEQ ID NO：2的氨基酸82至103；SEQ ID NO：2的氨基酸82至127；SEQ ID NO：2的氨基酸82至151；SEQ ID NO：2的氨基酸82至175；SEQ ID NO：2的氨基酸82至199；SEQ ID NO：2的氨基酸82至233；SEQ ID NO：2的氨基酸82至247；SEQ ID NO：2的氨基酸82至271；SEQ ID NO：2的氨基酸82至295；SEQ ID NO：2的氨基酸82至319；SEQ ID NO：2的氨基酸82至343；SEQ ID NO：2的氨基酸82至408；SEQ ID NO：2的氨基酸82至500；SEQ ID NO：2的氨基酸82至545；SEQ ID NO：2的氨基酸106至127；SEQ ID NO：2的氨基酸106至151；SEQ ID NO：2的氨基酸106至175；SEQ ID NO：2的氨基酸106至199；SEQ ID NO：2的氨基酸106至223；SEQ ID NO：2的氨基酸106至247；SEQ ID NO：2的氨基酸106至271；SEQ ID NO：2的氨基酸106至295；SEQ ID NO：2的氨基酸106至319；SEQ ID NO：2的氨基酸106至343；SEQ ID NO：2的氨基酸106至408；SEQ ID NO：2的氨基酸106至500；SEQ ID NO：2的氨基酸106至545；SEQ ID NO：2的氨基酸130至151；SEQ ID NO：2的氨基酸130至175；SEQ ID NO：2的氨基酸130至199；SEQ ID NO：2的氨基酸130至223；SEQ ID NO：2的氨基酸130至247；SEQ ID NO：2的氨基酸130至271；SEQ ID NO：2的氨基酸130至295；SEQ ID NO：2的氨基酸130至319；SEQ ID NO：2的氨基酸130至343；SEQ ID NO：2的氨基酸130至408；SEQ ID NO：2的氨基酸130至500；SEQ ID NO：2的氨基酸130至545；SEQ ID NO：2的氨基酸154至175；SEQ ID NO：2的氨基酸154至199；SEQ ID NO：2的氨基酸154至223；SEQ ID NO：2的氨基酸154至247；SEQ ID NO：2的氨基酸154至271；SEQ ID NO：2的氨基酸154至295；SEQ ID NO：2的氨基酸154至319；SEQ ID NO：2的氨基酸154至343；SEQ ID NO：2的氨基酸154至408；SEQ ID NO：2的氨基酸154至500；SEQ ID NO：2的氨基酸154至545；SEQ ID NO：2的氨基酸178至199；SEQ ID NO：2的氨基酸178至223；SEQ ID NO：2的氨基酸178至247；SEQ ID NO：2的氨基酸178至271；SEQ ID NO：2的氨基酸178至295；SEQ ID NO：2的氨基酸178至319；SEQ ID NO：2的氨基酸178至343；SEQ ID NO：2的氨基酸178至408；SEQ ID NO：2的氨基酸178至500；SEQ ID NO：2的氨基酸178至545；SEQ ID NO：2的氨基酸202至223；SEQ ID NO：2的氨基酸202至247；SEQ ID NO：2的氨基酸202至271；SEQ ID NO：2的氨基酸202至295；SEQ ID NO：2的氨基酸202至319；SEQ ID NO：2的氨基酸202至343；SEQ ID NO：2的氨基酸202至408；SEQ ID NO：2的氨基酸202至500；SEQ ID NO：2的氨基酸202至545；SEQ ID NO：2的氨基酸226至247；SEQ ID NO：2的氨基酸226至271；SEQ ID NO：2的氨基酸226至295；SEQ ID NO：2的氨基酸226至319；SEQ ID NO：2的氨基酸226至343；SEQ ID NO：2的氨基酸226至408；SEQ ID NO：2的氨基酸226至500；SEQ ID NO：2的氨基酸226至545；SEQ ID NO：2的氨基酸250至271；SEQ ID NO：2的氨基酸250至295；SEQ ID NO：2的氨基酸250至319；SEQ ID NO：2的氨基酸250至343；SEQ ID NO：2的氨基酸250至408；SEQ ID NO：2的氨基酸250至500；SEQ ID NO：2的氨基酸250至545；SEQ ID NO：2的氨基酸274至295；SEQ ID NO：2的氨基酸274至319；SEQ ID NO：2的氨基酸274至343；SEQ ID NO：2的氨基酸274至408；SEQ ID NO：2的氨基酸274至500；SEQ ID NO：2的氨基酸274至545；SEQ ID NO：2的氨基酸298至319；SEQ ID NO：2的氨基酸298至343；SEQ ID NO：2的氨基酸298至408；SEQ ID NO：2的氨基酸298至500；SEQ ID NO：2的氨基酸298至545；SEQ ID NO：2的氨基酸322至343；SEQ ID NO：2的氨基酸322至408；SEQ ID NO：2的氨基酸322至500；SEQ ID NO：2的氨基酸322至545；SEQ ID NO：2的氨基酸355至408；SEQ ID NO：2的氨基酸355至500；SEQ ID NO：2的氨基酸355至545；SEQ ID NO：2的氨基酸410至500；SEQ ID NO：2的氨基酸410至545；或这种多肽的片段、变体或衍生物。在某些实施方式中，可溶的LINGO-2多肽例如在哺乳动物中促进运动神经元存活或运动神经元轴突生长。
如本领域普通技术人员将理解的，基于例如对LINGO-2结构域区的替代性预测，如以上所列的LINGO-2片段在长度上可以在任一端变化例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(更长或更短)。还考虑与本文所述的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其片段至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的可溶的LINGO-2多肽的相应片段。
可溶的LINGO-2多肽可以包括两种或更多种可溶的LINGO-2多肽的任何组合。因此，考虑同二聚体或异二聚体的可溶的LINGO-2多肽二聚体。本文所述的两种或更多种可溶的LINGO-2多肽可直接连接，或可经由合适的肽接头连接。这样的肽接头在本文其他地方描述。
此外，以上所列的任何片段可在N-末端进一步包括分泌性信号肽，例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至28或SEQ ID NO：2的氨基酸1至29。还可使用如本文别处所述的其它分泌性信号肽。
可溶的LINGO-2多肽可以是环状的。可溶的LINGO-2多肽的环化降低了线性肽的构象自由度并导致结构更加受限的分子。肽环化的许多方法在本领域中是已知的。例如，通过在肽的N-末端和C-末端氨基酸残基之间形成酰胺键的“主链对主链”环化。该“主链对主链”环化方法包括在两个ω-硫代氨基酸残基(例如半肮氨酸、半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的某些可溶的LINGO-2肽包括在肽的N-末端和C-末端的修饰以形成环状LINGO-2多肽。这样的修饰包括但不限于半胱氨酸残基、乙酰化的半胱氨酸残基、具有NH2多肽和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其它方法描述在Li&Roller.Curr.Top.Med.Chem.3:325-341(2002)中，其通过引用整体并入本文。
V.抗体和其抗原结合片段
LINGO-2拮抗剂还包括LINGO-2特异性抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其为LINGO-2活性的拮抗剂，如抗体C09。例如，某些LINGO-2抗体对于在运动神经元中表达的LINGO-2的结合阻断运动神经元轴突存活的抑制，或阻断运动神经元轴突生长。在某些实施方式中，抗LINGO-2拮抗剂抗体例如在哺乳动物中促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
在某些实施方式中，结合分子(如抗体或其抗原结合片段，变体，或衍生物，例如C09抗体)结合LINGO-2并促进运动神经元存活或促进运动神经元轴突生长。
在某些实施方式中，抗-LINGO-2抗体结合人类、大鼠、小鼠的LINGO-2或结合人类、大鼠和小鼠LINGO-2的任意组合。
A.抗LINGO-2抗体多肽
还提供了分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)其可特异性结合与抗体C09相同的LINGO-2表位。在另一实施方式中，分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可特异性结合与包括C09的VH和VL的抗体相同的LINGO-2表位。在另一实施方式中，分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可特异性结合与包括C09的VH或VL的抗体相同的LINGO-2表位。
在另一实施方式中，分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可特异性结合LINGO-2并竞争性抑制C09与LINGO-2(如人类、大鼠、小鼠LINGO-2或人类、大鼠和小鼠LINGO-2的任意组合)的特异性结合。在另一实施方式中，分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可特异性结合LINGO-2并竞争性抑制包括C09的VH和VL的抗体与LINGO-2(如人类、大鼠、小鼠LINGO-2或人类、大鼠和小鼠LINGO-2的任意组合)的特异性结合。在另一实施方式中，分离的结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物)可特异性结合LINGO-2并竞争性抑制包括C09的VH或VL的抗体与LINGO-2(如人类、大鼠、小鼠LINGO-2或人类、大鼠和小鼠LINGO-2的任意组合)的特异性结合。
在某些实施方式中，结合分子具有与参考抗-LINGO-2抗体分子的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，所述结合分子与参考抗体共享至少96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些实施方式中，所述参考抗体是C09。
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR具有与来自VH氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9(参见表3)的CDR1、CDR2或CDR3区至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列，其中包括编码VH结构域的抗体或其抗原结合片段能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
表3－参考VH CDR1、CDR2和CDR3序列*
*通过Kabat系统确定(参见上文)
N＝核苷酸序列，P＝多肽序列
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR具有与分别具有氨基酸序列SEQ ID NO：7、8或9的CDR1、CDR3或CDR3至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列，其中包括编码VH结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR具有(除了1、2、3、4或5个保守氨基酸替换外)分别与具有SEQ ID NO：7、8或9的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中包括编码VH结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：VH结构域，其具有与SEQ ID NO：10的VH氨基酸序列(参见表4)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中包括编码VH结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
表4－参考VH序列
N＝核苷酸序列，P＝多肽序列
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR具有与来自VL氨基酸序列SEQ ID NO：11、12或13(参见表5)的CDR1、CDR2或CDR3区至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列，其中包括编码VH结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
表5－参考VL CDR1、CDR2和CDR3序列*
*通过Kabat系统确定(参见上文)
N＝核苷酸序列，P＝多肽序列
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(Vl结构域)，其中Vl结构域的至少一个CDR具有与分别具有氨基酸序列SEQ ID NO：11、12或13的CDR1、CDR3或CDR3至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列，其中包括编码VL结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR具有(除了1、2、3、4或5个保守氨基酸替换外)分别与具有SEQ ID NO：11、12或13的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中包括编码VL结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
在另一实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括、基本由或由下列所组成：VL结构域，其具有与SEQ ID NO：14的VL氨基酸序列(参见表6)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中包括编码VL结构域的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物能够特异地或优先地结合LINGO-2。在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物促进运动神经元的存活或促进运动神经元轴突生长。
表6－参考VL序列
N＝核苷酸序列，P＝多肽序列
某些拮抗剂抗体可特异地或优先地结合特定的LINGO-2多肽片段或结构域，例如，本发明描述的LINGO-2多肽、片段、变体或衍生物。
合适的抗-LINGO-2抗体的生物活性变体同样是有用的。该变体将保留需要的亲本抗-LINGO-2抗体的结合特异性。制造抗体变体的方法通常是本领域可得的。
能够特异地结合LINGO-2并保留所需活性的多肽的精确化学结构取决于若干因素。分子中存在可离子化的氨基和羧基，一个具体的多肽可通过作为酸式盐或碱式盐获得，或以中性形式获得。如本发明所使用的抗-LINGO-2抗体的定义包括所有这些当置于合适的环境条件中保留了生物学活性的制备物。进一步的，可通过使用糖部分(moiety)(糖基化)或通过其他补充的分子(如脂质、磷酸、乙酰基等)进行衍生化来增强多肽的核酸序列的一级结构。还可以通过轭合糖类的方式进行增强。通过生产宿主的转录后加工系统实现这种增强的一些方面；可在体外引入其他这种修饰。在任何情况下，本发明所使用的抗-LINGO-2抗体的定义均包括该修饰，只要抗-LINGO-2抗体所需的特性不被破坏即可。可以预期在各种测定中，这种修饰可以通过提高或减少多肽活性的方式定性地或定量地影响多肽活性。进一步的，可通过氧化、还原或其他衍生化的方式修饰肽链中的单独氨基酸残基，并且可切割所述多肽以获得保留活性的片段。这种变动不破坏所需的性能(如特异性结合LINGO-2、结合亲和力和相关的活性，如抑制运动神经元死亡和促进运动神经元轴突生长的能力)不从本发明所使用的感兴趣的抗-LINGO-2抗体的定义中去除多肽序列。
本领域提供了大量有关多肽变体的制备和使用的指导。在制备抗-LINGO-2结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的变体中，本领域技术人员能够容易地确定哪些针对天然蛋白的核苷酸或氨基酸序列的修饰将产生适合作为药物组合物的治疗活性组分的变体。
有可能仅在抗体分子的框架区或仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是如没有或很少对抗体的抗原结合能力产生影响的沉默或中性错意突变。这些类型的突变对于优化密码子使用或提高杂交瘤抗体的生成是有用的。或者，非中性错意突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性错意突变的位置可能位于框架区，而大多数非中性错意突变的位置可能位于CDR中，尽管这并不是绝对的要求。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性能的突变分子，如未改变抗原结合活性或改变了抗原结合活性(如提高抗原结合活性或改变抗体特异性)的突变分子。突变后，所编码的蛋白可通过常规方法表达，且可使用本文中描述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术确定编码蛋白的功能和/或生物活性(如免疫特异性地结合LINGO-2多肽的至少一个表位)。
在某些实施方式中，抗-LINGO-2抗体包括至少一个优化的互补决定区(CDR)。“优化的CDR”意指已修饰并选择优化序列的CDR，其中所述选择基于持续或提高的结合亲和力和/或被赋予到包括优化的CDR的抗-LINGO-2抗体上的抗-LINGO-2的活性。“抗-LINGO-2活性”可包括，例如调节一个或多个下述与LINGO-2有关的活性，例如LINGO-2依赖的运动神经元死亡、LINGO-2以来的运动神经元轴突生长抑制或任何其他与LINGO-2有关的活性。抗-LINGO-2活性还可被归因于在与LINGO-2表达相关疾病中的降低的发生率或严重性，所述疾病包括但不限于特定类型的运动神经元相关疾病，如肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病和原发性震颤(ET)。所述修饰可参与CDR中氨基酸残基的替换，因而抗-LINGO-2抗体保留对LINGO-2抗原的特异性并具有提高的结合亲和力和/或提高的抗-LINGO-2活性。
B.编码抗LINGO-2抗体的多核苷酸
本文同样提供了编码本发明抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的核酸分子。
在一个实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)的核酸组成，其中VH结构域的至少一个CDR由与选自SEQ ID NO：18(参见表4)中VH编码序列的VHCDR 1、2或3多核苷酸序列为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的核酸序列所编码。在某些实施方式中，多核苷酸编码促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突形成的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物。
在其他实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)的核酸组成，其中VH结构域的至少一个CDR的序列选自由下述组成的组：(a)包括SEQ ID NO：7所列出的氨基酸序列的CDR1序列；(b)包括SEQ ID NO：8所列出的氨基酸序列的CDR2序列；和(c)包括SEQ ID NO：9所列出的氨基酸序列的CDR3序列。在某些实施方式中，多核苷酸编码促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突形成的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物。
在进一步的他实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码VH结构域的核酸组成，所述VH结构域具有与包括SEQ ID NO：10的参考VH结构域多肽序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中抗-LINGO-2抗体包括特异或优先结合LINGO-2的编码的VH结构域。在某些实施方式中，编码抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸促进运动神经元存活或运动神经元轴突形成。
在一个实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)的核酸组成，其中VL结构域的至少一个CDR由核酸序列编码，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：22(参见表6)的VL编码序列VLCDR 1、2或3多核苷酸序列为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的核酸序列。在某些实施方式中，编码抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸促进运动神经元存活或运动神经元轴突形成。
在其他实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码免疫球蛋白VL结构域的核酸组成，其中VL结构域的至少一个CDR的序列选自由下述组成的组：(a)包括SEQ ID NO：11所列出的氨基酸序列的CDR1序列；(b)包括SEQ ID NO：12所列出的氨基酸序列的CDR2序列；和(c)包括SEQ ID NO：13所列出的氨基酸序列的CDR3序列。在某些实施方式中，多核苷酸编码促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突形成的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物。
在进一步的他实施方式中，分离的多核苷酸包括、基本由或由编码VL结构域的核酸组成，所述VL结构域具有与包括SEQ ID NO：14的参考VL结构域多肽序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中抗-LINGO-2抗体包括特异或优先结合LINGO-2的编码的VL结构域。在某些实施方式中，编码抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸促进运动神经元存活或运动神经元轴突形成。
任何前述所需的多核苷酸可进一步包括额外的核酸，所述核酸编码，如指导编码的多肽分泌的信号肽、本文所描述的抗体恒定区或本文所描述的其他异源多肽。本文还提供了包括一个或多个前述多核苷酸的组合物。
在一个实施方式中，组合物包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码如本文所述的VH结构域，以及其中所述第二多核苷酸编码如本文所述的VL结构域。具体地，提供了一种组合物，所述组合物包括、基本由或由如SEQ ID NO：18所列出的VH结构域编码多核苷酸以及VL结构域编码多核苷酸，例如如SEQ ID NO：22所列出的编码VL结构域的多核苷酸。还提供了一种组合物，所述组合物包括、基本由或由包括编码SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9的核酸的VH结构域编码多核苷酸，以及包括编码SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核酸的VL结构域编码多核苷酸。
还提供了描述于其他地方的多核苷酸的片段。此外还考虑了本文描述的编码融合多肽、Fab片段和其他衍生物的额外的多核苷酸。
多核苷酸可通过本领域已知的任何方法制造或生产。例如，如果抗体的核苷酸是已知的，则编码所述抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸组装而成(例如描述于Kutmeier等，BioTechniques 17:242(1994))，简单而言，涉及合成包含编码抗体部分序列的重叠寡核苷酸、退火和连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可从合适的原料的核酸中产生。如果无法获得包含编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，则可化学合成或从合适的原料(如抗体cDNA文库，或从核酸，如poly A+RNA，分离自表达抗体或其他抗-LINGO-2抗体的任何组织或细胞(如选择表达抗体的杂交瘤细胞)所产生的cDNA文库)中，通过使用合成的与序列3’和5’末端杂交的引物PCR扩增或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针例如从编码此抗体或其他抗-LINGO-2抗体的cDNA文库中鉴定出cDNA克隆的方式获得编码抗体的核酸分子。通过PCR产生的扩增的核酸可之后使用本领域任何已知的方法被克隆入可复制克隆载体中。
一旦确定了抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的核苷酸些和相应的氨基酸序列，可使用本领域已知核苷酸操作方法，如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(例如参见描述于Sambrook等,(1990)Molecular Cloning,A Laboraory Manual(2nd ed.；Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)和Ausubel等,eds.(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,NY)，两者的全部都通过引用并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
编码抗-LINGO-2结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗-LINGO-2抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA、混合有单链和双链区域的DNA、单链和双链的RNA以及混合有单链和双链区域的RNA、包括可以是单链的DNA和RNA的杂交分子，或更通常地，双链或单链和双链的混合。另外，编码抗-LINGO-2结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域组成。编码抗-LINGO-2结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以包含一种或多种修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA框架。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基以及不常参见的碱基例如肌背。对DNA和RNA可以作各种各样的修饰；因此“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢地修饰的形式。
可通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失引入到免疫球蛋白的核酸序列中，从而在编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸的替换、添加或缺失的方式产生编码衍生自免疫球蛋白(如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的多核苷酸。可通过标准技术，如定点突变和PCR介导的诱变的方式引入突变。可在一个或多个非必须氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。
C.抗LINGO-2抗体的特征
在其他实施方式中，结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异或优先结合LINGO-2的至少一个表位，其中所述表位包括、基本由或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的至少约4到5个氨基酸、至少7个、至少9个或在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的至少约15到约30个之间的氨基酸组成。所描述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的给定表位的氨基酸可以是但不必需是连续或线性的。在某些实施方式中，LINGO-2的至少一个表位包括、基本由或由通过LINGO-2的细胞外结构域形成的作为在细胞表面表达或作为可溶的片段(如与IgG Fc区融合)的非线性表位组成。因此，在某些实施方式中，LINGO-2的至少一个表位包括、基本由或由至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少约15至约30个、至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的连续或非连续的氨基酸组成。其中，非连续的氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其他实施方式中，抗体或其结合片段、变体或衍生物特异或优先集合LINGO-2的至少一个表位，其中所述表位包括、基本由或由前述SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的除了一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个连续或不连续的氨基酸组成，且可包括修饰蛋白的额外的多肽(如糖蛋白)从而使LINGO-2抗体较靶蛋白的未修饰版本而言以更高的亲和力结合到修饰的靶蛋白上。或者，LINGO-2抗体根本不结合靶蛋白的未修饰版本。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-2的LLR结构域。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸28-408中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸58-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸82-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸106-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸130-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸154-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸178-343中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸202-343中的表位、SEQID NO：2的氨基酸226-343中的表位或SEQ ID NO：2的氨基酸250-343中的表位。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸202-223中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸202-247中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸202-271中的表位、SEQ IDNO：2的氨基酸202-295中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸202-319中的表位或SEQ ID NO：2的氨基酸202-343中的表位。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸226-247中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸226-271中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸226-295中的表位、SEQ IDNO：2的氨基酸226-319中的表位或SEQ ID NO：2的氨基酸226-343中的表位。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸250-271中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸250-295中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸250-319中的表位或SEQ IDNO：2的氨基酸250-343中的表位。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸274-295中的表位、SEQ ID NO：2的氨基酸274-319中的表位或SEQ ID NO：2的氨基酸274-343中的表位。
在其他的实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合SEQ ID NO：2的氨基酸298-319中的表位或SEQ ID NO：2的氨基酸298-343中的表位。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地结合于上述LINGO-2或者片段或变体的至少一个表位，即相比于结合于不相关或随机的表位，其更易于结合于这样的表位；优先地结合于上述LINGO-2或者片段或变体的至少一个表位，即相比于结合于相关、相似、同源或类似的表位，其更易于结合于这样的表位；竞争性地抑制自身特异性或优先地结合于上述LINGO-2或者片段或变体的某一表位的参照抗体的结合；或者结合于上述LINGO-2或者片段或变体的至少一个表位，其亲合力的特征在于解离常数KD小于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10-5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M。在特定方面，抗体或其片段相对于鼠LINGO-2多肽或其片段优先地结合于人类LINGO-2多肽或其片段。
如在抗体结合解离常数的上下文中所使用的，术语“约”允许在用来测量抗体亲合力的方法中固有的差异的程度。例如，取决于所使用仪器的精密水平、基于被测样品的数量的标准误差以及舍入误差，术语“约10-2M”可以包括例如0.05M至0.005M。
在特定的实施方式中，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-2多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1。或者，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-2多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、10-5秒-15×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1。
在其它实施方式中，抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-2多肽或者其片段或变体的结合速率(k(on))大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1。或者，抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-2多肽或者其片段或变体的结合速率(k(on))大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、5×106M-1秒-1或107M-1秒-1。
在某些LINGO-2拮抗剂抗体或其抗原结合片段中，一个或多个恒定区结构域中的至少一部分己缺失或以被改变以便提供期望的生物化学特性，例如与具有大约相同的免疫原性的完整、未改变的抗体进行比较时，减少的效应子功能、非共价二聚化的能力、提高的定位于肿瘤部位的能力、减少的血清半衰期或提高的血清半衰期。例如，某些抗体是结构域缺失的抗体，其包括类似于免疫球蛋白重链的多肽链但缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如CH2结构域的全部或部分将缺失。
在某些LINGO-2拮抗剂抗体或其抗原结合片段中，可以利用本领域己知技术将Fc部分突变以降低效应子功能。例如，恒定区的修饰可被用来修饰二硫键或者低聚糖部分，其由于提高的抗原特异性或抗体灵活性而允许增强的定位。所得的生理谱、生物利用度和修饰的其它生化效应可以利用熟知的免疫学技术容易地测量和量化而不需过度实验。
在某些实施方式中，LINGO-2拮抗剂抗体或其抗原结合片段将不在待治疗的动物(如人)中引起有害的免疫应答。在一个实施方式中，可使用本领域已知技术修饰LINGO-2拮抗剂抗体或其抗原结合片段以减少它们的免疫原性。例如，抗体可被人源化、灵长类源化、去免疫源化，或制备嵌合抗体。这些类型的抗体来自非人类抗体(典型的是鼠或灵长类抗体)，其保留或基本保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人体内产生较低的免疫原性。上述抗体可使用多种方法获得，包括(a)将完整的非人类可变结构域嫁接于人恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一个部分嫁接于保留或未保留关键性框架残基的人类框架和恒定区中；或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过取代表面残基用类似人类的部分“隐藏”它们。这些方法在Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-6855(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.44:65-92(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31:169-217(1994)，和美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370中公开，上述所有文献通过引用全部并入本文。
可利用本领域已知方法，从前体或亲本抗体中制备修饰形式的抗体或其抗原结合片段。本文更详细地讨论了示例性的技术。
可使用本领域已知的技术制造或生产LINGO-2抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组地生产”的，即，所述抗体分子或其片段是使用重组DNA技术生产的。本文更详细地讨论了制造抗体分子或其片段的示例性的技术。
LINGO-2拮抗剂抗体或其片段可通过本领域已知的任何适当的方法制备，所述方法包括如通过杂交瘤或噬菌体展示生成多克隆抗体或制备单克隆抗体。
可用多个宿主表达载体系统表达抗体分子。可用两种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码重链衍生的多肽以及第二种载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可含有相同的选择标记，使得等量表达重链和轻链多肽。或者，可以使用单个载体，其编码重链和轻链多肽的两者。在这种情况下，轻链有利地(advantageously)置于重链的前面以避免毒性的游离重链过量(Proudfoot,Nature 322:52(1986)；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980))。还可以用单个编码重链衍生多肽和轻链衍生多肽的载体转染宿主细胞。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
通过常规技术将表达载体或载体转入宿主细胞，然后通过常规技术培养以生产抗体。因此提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体或其重链或轻链的多核苷酸，其可操作地与异源启动子相连。在某些实施方式中，为了表达双链抗体，将编码重链和轻链两者的质粒共表达于宿主细胞中，从而表达整个免疫球蛋白分子。
一旦抗体被重组表达，可用纯化免疫球蛋白分子的任何本领域已知的方法纯化，例如，通过层析法(例如，离子交换层析，亲和层析(尤其是通过蛋白A后的特定抗原的亲和层析)和定型柱层析)、离心法、差别溶解法或通过纯化蛋白的任何其他标准技术。或者，增加抗体亲和性的方法在US 2002 0123057A1中公开。
在一个实施方式中，结合分子或抗原结合分子包含合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或整个缺失(“结构域缺失”的抗体)。在某些实施方式中，相容的修饰抗体(compatible modified antibodies)将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域被删除(△CH2构建体)。在其他实施方式中，可用短的连接肽取代缺失的结构域以提供可变区的柔性和移动自由度。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体的分解代谢速率的调节特性，这种构建体在某些情况下可以是被期望的。可使用编码IgG1人类恒定结构域的载体(例如来自Biogen IDEC Incorporated)来产生结构域缺失的构建体(参见例如WO02/060955A2和W002/096948A2)。这一示例性载体被工程化以缺失CH2结构域并提供表达缺失了结构域的IgG1恒定区的合成载体。
本发明还提供了抗体的使用，所述抗体包括、基本由或由本文所描述的抗体分子(如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成，其中抗体或其片段免疫特异性地结合LINGO-2多肽。
VI.多肽和抗体缀合物和融合物
本发明还提供了LINGO-2多肽，如LINGO-2拮抗剂多肽与异源多肽融合形成的LINGO-2融合蛋白。还提供了抗-LINGO-2抗体与异源多肽融合的蛋白。LINGO-2融合蛋白和抗体融合物可用于实现各种目的，如增加血清半衰期、改善的生物利用率、特定的器官或组织类型的体内靶向、改善的重组表达效力、改善的宿主细胞分泌、易于纯化和较高的亲合力。取决于有待实现的目的，异源性多肽可以是惰性的或具有生物学活性的。而且，可以选择稳定地融合至LINGO-2拮抗剂多肽或抗体，或者在体内或体外可裂解。用于实现不同目的的异源部分是本领域已知的。
作为表达LINGO-2拮抗剂融合多肽或抗体的替代品，可预先形成所选的异源部分并且将其与LINGO-2拮抗剂多肽或抗体化学地轭合。大多数情况下，无论融合还是缀合于LINGO-2拮抗剂多肽或抗体，所选的异源部分将相似地起作用。因此，在下列异源氨基酸序列的讨论中，除非另外说明，否则应当理解的是，异源序列可以以融合蛋白的形式或作为化学辄合物连接至LINGO-2拮抗剂多肽或抗体。
一些方法采用了LINGO-2多肽，其中LINGO-2多肽融合至Fc结构域，即Ig重链恒定区的C-端部分。在一个实施方式中，可溶的LINGO-2多肽被融合至铰链和Fc区。LINGO-2-Fc融合物的潜在优点包括溶解性、体内稳定性和多价例如二聚化。所用的Fc区可以是IgA、IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。或者，它可以是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。还可以使用IgG Fc区，如IgG1Fc区或IgG4Fc区。用于构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料和方法是本领域已知的，并且可被用于获得LINGO-2融合物而无需过多的实验。一些方法使用LINGO-2融合蛋白，例如Capon等人的美国专利第5,428,130号和第5,565,335号中描述的那些。
完全完整的野生型Fc区表现出Fc融合蛋白中可能不必要和不被期望的功能子效应。因此可在融合蛋白的Fc区中去除某些结合位点。例如，由于与轻链的共表达是不必要的，从IgE的Fc区的CH2结构域除去重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot等人，Immunol.Today8:111-14(1987))，以使该位点不干扰有效分泌。同样，可缺失或用其他氨基酸替换存在于Fc区的负责与免疫球蛋白轻链结合的半胱氨酸残基，从而这些半胱氨酸残基不干扰Fc区的正确折叠。跨膜结构域序列例如IgM中存在的那些通常也可被除去。
在某些实施方式中，使用IgG1的Fc区。或者，可将免疫球蛋白γ的其他亚类(γ-2、γ-3和γ-4)的Fc区用于分泌盒中。免疫球蛋白γ-1的IgG1Fc区包括至少一部分铰链区、CH2区和CH3区。在一些实施方式中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是CH2缺失的Fc，其包括一部分铰链区和CH3区但是没有CH2区。CH2缺失的Fc己经由Gillies等人Hum.Antibod.Hybridomas 1:47(1990)描述。在一些实施方式中，使用IgA、IgD、IgE或IgM中的一个Fc区。
可以以数种不同的构象构建LINGO-2-Fc融合蛋白。在一个构象中，可溶的LINGO-2多肽的C-末端被直接融合至Fc铰链多肽的N-末端。在一个略微不同的构象中，如2-10个氨基酸的短多肽，被整合入可溶的LINGO-2多肽的N-末端和Fc多肽的C-末端之间的融合体中。这样的连接提供了构象的柔性，改善了在某些情况下的生物活性。如果铰链区的足够部分在Fc多肽中保留，则LINGO-2-Fc融合体将二聚化，从而形成二价分子。单体Fc融合体的同源群体将产生单特异性的，二价二聚体。具有不同的特异性的两个单体Fc融合体的混合物将产生双特异性的二价二聚体。
LINGO-2多肽或抗-LINGO-2抗体多肽抗体可进一步重组地融合至异源多肽的N-末端或C-末端。例如，LINGO-2拮抗剂多肽或抗体可重组地融合或缀合于在检测测定中作为标签的分子和效应分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公开WO 92/08495；WO 91114438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；和EP 396,387。
融合蛋白包括、基本由或由LINGO-2拮抗剂多肽组成，或还提供了抑制LINGO-2功能的抗体融合体。在某些实施方式中，与LINGO-2拮抗剂多肽或抗体融合的异源多肽在功能上是有用的或对于靶向LINGO-2拮抗剂多肽或抗体是有用的。在某些实施方式中，可溶的LINGO-2拮抗剂多肽，如包括LRR结构域、Ig结构域或整个细胞外结构域(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸28至545)的LINGO-2多肽或任何其他本文描述的LINGO-2多肽片段、变体或衍生物与异源多肽多肽融合以形成LINGO-2拮抗剂融合多肽。信号序列是对启动蛋白跨内质网膜转运的氨基酸序列进行编码的多核苷酸。对于构建免疫融合素(immunofusin)来说有用的信号序列包括抗体轻链信号序列例如抗体14.18(Gillies等人，J.Immunol.Meth.125:191-202(1989))、抗体重链信号序列例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人，Nature286:5774(1980))。或者，可使用其他的信号序列。参见例如Watson，Nucl.Acids Res.12:5145(1984)。信号肽通常在内质网的腔内被信号肽酶裂解。这导致含有Fc区和可溶的LINGO-2多肽的免疫融合素蛋白的分泌。
在一些实施方式中，DNA序列编码在融合蛋白和LINGO-2多肽之间的蛋白水解裂解位点。裂解位点提供所编码的融合蛋白的蛋白水解裂解，从而从靶蛋白中分离融合的结构域(如Fc结构域)。
LINGO-2拮抗剂多肽和抗体包括被修饰的衍生物，即通过共价连接任何类型的分子以致共价连接不防止LINGO-2拮抗剂多肽或抗体抑制LINGO-2的生物学功能。例如，但是以非限制性的方式，LINGO-2拮抗剂多肽和抗体可被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、膦酸化(phosphylation)、磷酸化、酰胺化、经由已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞配体或其他蛋白连接等。可通过已知的技术进行许多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特异性的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可包含一个或多个非经典的氨基酸。
一些实施方式涉及可溶的LINGO-2多肽或LINGO-2抗体，其中一种或多种聚合物被轭合(共价连接)至LINGO-2多肽或抗体。适于这种轭合的聚合物的实例包括多肽(上文所讨论的)、糖聚合物和聚亚烷基二醇链。通常但不必须地，聚合物缀合于可溶的LINGO-2多肽或LINGO-2抗体以便改善下列中的一个或多个：溶解度、稳定性或生物利用率。
通常用来与LINGO-2拮抗剂多肽或抗体轭合的聚合物的类型是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是最常用的。PEG部分例如1、2、3、4或5个PEG聚合物可缀合于每个LINGO-2拮抗剂多肽或抗体以与单独的LINGO-2拮抗剂多肽或抗体相比增加血清半衰期。PEG部分是非抗原性的并且基本上是生物学惰性的。PEG部分可以是支链或非支链的。
连接至LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的PEG部分的数目和单独的PEG链的分子量可变化。通常，聚合物的分子量越大，结合至多肽的聚合物链越少。通常，结合至LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的总聚合物质量为20kDa至40k Da。因此，如果连接一条聚合物链，所述链的分子量通常20-40kDa。如果连接两条链，每条链的分子量通常是10-20kDa。如果连接三条链，分子量通常是7-14kDa。
聚合物例如PEG可经由多肽上任何适合的暴露的反应性基团连接至LINGO-2拮抗剂多肽或抗体。暴露的反应性基团可以是例如内部赖氨酸残基的N-末端氨基基团或ε-氨基基团，或两者。活化的聚合物可在LINGO-2拮抗剂多肽或抗体上的任何游离氨基基团上反应并共价连接。LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的游离的竣基基团、适当活化的羰基基团、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分和疏基基团(如果可得的话)也可用作连接聚合物的反应性基团。
在共轭反应中，取决于多肽浓度，通常使用每摩尔多肽约1.0至约10摩尔的活化的聚合物。通常，所选择的比例代表将反应最大化同时将可损害LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的期望的药理学活性的副反应(常常是非特异性的)最小化之间的平衡。在某些实施方式中，保留LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的至少50％的生物活性(如例如在本文所描述的或本领域已知的测定中的任一个中所证实的)。在进一步的实施方式中，保留了将近100％。
VII.LINGO-2多核苷酸拮抗剂
还可以使用多核苷酸拮抗LINGO-2的功能。因此LINGO-2多核苷酸拮抗剂可促进运动神经元存活和/或促进运动神经元轴突生长。具体的实施方式包括一种治疗运动神经元相关病症的方法，包括给予有效量的LINGO-2多核苷酸拮抗剂，其中所述多核苷酸拮抗剂包括能够特异地结合编码LINGO-2多核苷酸的核酸分子。LINGO-2多核苷酸拮抗剂防止LINGO-2的表达(knockdown降低)。在某些实施方式中，LINGO-2多核苷酸拮抗剂在例如哺乳动物中促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突生长。LINGO-2多核苷酸拮抗剂包括但不限于反义分子、核酶、siRNA、shRNA和RNAi。通常，这种结合分子被分别给予于动物(参见例如O'Connor,J.Neurochem.56:560(1991))，但是这种结合分子也可由宿主细胞摄取并在体内表达的多核苷酸在体内表达。还参见Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRCPress，Boca Raton,FL(1988)。
可通过化学合成(Hohjoh,FEBS Lett 521:195-199,2002)，dsRNA的水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)，通过使用T7RNA聚合酶的体外转录(Donzeet等人，Nucleic Acids Res30:e46,2002；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052，2002)以及通过使用例如大肠杆菌核糖核酸酶III的核酸酶的双链RNA水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947(2002))在体外产生介导RNAi的分子，所述分子包括但不限于siRNA。
还可通过将两个寡核昔酸彼此返火来形成siRNA分子，所述siRNA分子通常具有下列通用结构，其包括双链和单链部分两者：
其中N、X和Y是核苷酸；X与Y形成氢键；“：”表示两个碱基之间的氢键；x是具有1和约100之间的值的自然数；而且m和n是独立地具有0和约100之间的值的整数。在一些实施方式中，N、X和Y分别为A、G、C和T或U。非自然产生的碱基和核苷酸可存在，尤其是在合成的siRNA(例如，将两个寡核苷酸退火的产物)的情况下。双链的中央部分称为“核心”并且具有作为测量单位的碱基对(bp)；单链的部分是突出端，其具有作为测量单位的核苷酸(nt)。所显示的突出端为3’突出端，但是具有5’突出端的分子也可以预见。还可以预见的是没有突出端(即m＝0和n＝0)的以及在核心的一侧具有突出端而另一侧没有突出端(例如m＝0和n≥1，或反过来)的siRNA分子。
Paddiso等人(Genes&Dev.16:948-958(2002))己经使用折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNAi的工具。因此，这种短发夹RNA(shRNA)分子还被有利地用于本发明的方法中。功能性shRNA的茎和环的长度是变化的；茎长度可以从约25nt变化至约30nt的任意之间变化，而环的大小可在4nt至约25nt之间变化而不影响沉默活性。不希望被任何特定的理论所束缚，相信这些shRNA类似于DICER核糖核酸酶的dsRNA产物，并且在任何情况下都具有抑制特定基因表达的相同能力。
在本发明的一些实施方式中，从慢病毒载体(例如pLL3.7)表达shRNA。
反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成来控制基因表达。反义技术在例如Okano，J.Neurochem.56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(作为基因表达的反义抑制剂的寡聚脱氧核苷酸)，CRC Press，BocaRaton，FL(1988)中讨论。三螺旋形成在例如Lee等人，Nucleic Acids Research6:3073(1979)；Cooney等人，Science 241:456(1988)和Dervan等人，Science 251:1300(1991)中讨论。所述方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，编码LINGO-2的多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度上为约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计DNA寡核苷酸以与参与转录的基因区域互补，从而防止转录和靶蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并且阻断mRNA分子翻译为靶多肽。
并不要求反义分子的完全互补性。与编码LINGO-2的RNA的至少一部分互补的序列指的是具有足以能够与RNA杂交以形成稳定的双链体或三链体的互补性的序列。杂交的能力将取决于互补程度和反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越大，其可能含有的错配碱基越多，并仍形成稳定的双链体(或视情况而定的三链体)。本领域技术人员可通过使用用来确定杂交复合体熔点的标准步骤来查明错配的可接受程度。
与信使RNA的5’端互补的寡核苷酸例如一直到并包括AUG起始密码子在内的5’非翻译序列应最有效地抑制翻译。然而，与mRNA的3’非翻译序列互补的序列也己经显示对mRNA翻译的有效抑制。通常参见Wagner，R.,Nature 372:333-335(1994)。因此，与5’或3’非翻译的非编码区互补的寡核苷酸可被用于抑制LINGO-2翻译的反义方法中。与mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是较低效的翻译抑制剂，但是可被使用。反义核酸通常长度是至少6个核苷酸，例如长度约6个至约50个核昔酸的寡核苷酸。在特定的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
用于本发明公开的治疗方法中的多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或者其嵌合混合物或衍生物或修饰型。可在碱基多肽、糖多肽或磷酸主链上修饰寡核昔酸以改善如分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可包括其他的附加基团，如肽(例如用于在体内靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的剂(参见例如Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556(1989)；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652(1987))；1988年12月15日公开的PCT公布第W088/09810号)或跨血脑屏障转运的剂(参见例如1988年4月25日公开的PCT公布第W089/10134号)、杂交触发的裂解剂(参见例如Krol等人，BioTechniques 6:958-976(1988))或嵌入剂(参见例如Zon，Pharm.Res.5:539-549(1988))。为此，寡核苷酸可轭合至另一个分子，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂等。
多核苷酸组合物进一步包括催化性RNA或核酶(参见例如1990年10月4日公开的PCT国际公布WO 90/11364；Sarver等人，Science 247:1222-1225(1990))。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指示的位置裂解mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有两个碱基的下列序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生是本领域中熟知的，并且被更全面地描述于Haseloff和Gerlach,Nature 334:585-591(1988)中。在某些实施方式中，核酶被工程化以使裂解识别位点位于靠近靶mRNA的5’端；即增加效力并将非功能性mRNA转录物的胞内蓄积最小化。
如在反义方法中一样，核酶可由修饰的寡核苷酸所组成(例如为了改善的稳定性、靶向等)，并且可被递送至在体内表达LINGO-2的细胞。编码核酶的DNA构建物可以以如上文所描述的相同的方式被引入细胞中以便引入反义的编码DNA。递送的一个方法包括使用在强的组成型或诱导型启动子(例如诸如pol III或pol II启动子)控制下“编码”核酶的DNA构建物，以便转染的细胞将产生足以破坏内源LINGO-2信使并抑制翻译的量的核酶。由于核酶与反义分子不同，是催化性的，因此为了效力需要较低的胞内浓度。
VIII.LINGO-2适体拮抗剂
在另一个实施方式中，LINGO-2拮抗剂是适体。适体可以是这样的核苷酸或多肽，其具有独特的序列，具有与所期望的靶(例如多肽)特异性地结合的特性，而且是对给定的靶有特异性的配体。核苷酸适体包括与LINGO-2结合的双链DNA和单链RNA分子。在某些实施方式中，LINGO-2适体拮抗剂在例如哺乳动物中促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突生长。
可使用本领域己知的方法，例如经由通过指数富集(ExponentialEnrichment)的配体系统进化(SELEX)过程来选择核酸适体。SELEX是用于与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如例如美国专利第5,475,096、5,580,737、5,567,588、5,707,796、5,763,177，6,011,577和6,699,843号中所描述的，其通过引用全文并入本文。鉴定适体的另一种筛选方法描述在美国专利第5,270,163号中(其也通过引用并入本文)。SELEX过程是以核酸形成各种二维和三维结构的能力，以及在核苷酸单体中可得的作为实际上任何化合物的配体(形成特异性结合对儿)的化学多功能为基础的，无论是单体的或聚合的，包括其他核酸分子和多肽。任何大小的分子或组合物可作为靶。
使用LINGO-2的蛋白结构，使用SELEX过程筛选对LINGO-2起作用的适体将允许对抑制LINGO-2介导的过程的适体的鉴定。
多肽适体是根据它们与LINGO-2结合并从而阻断LINGO-2作用的能力所选择的随机肽。多肽适体可包括在两个末端与蛋白支架相连的短的可变肽结构域。这一双重的结构约束将肽适体的结合亲和力大大增加至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。参见例如Hoppe-Seyler F等人(2000)J Mol Med 78(8):426-430。短的可变肽的长度通常为约10至20个氨基酸，而且支架可以是具有良好的溶解性和紧凑度特性的任何蛋白。支架蛋白的一个非限制性实例是细菌蛋白硫氧还蛋白-A。参见例如CohenBA等人(1998)PNAS 95(24):14272-14277。
多肽适体是作为蛋白功能的主要抑制剂起作用的肽或小多肽。肽适体与靶蛋白特异性地结合，阻断它们的功能能力(Kolonin等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:14,266-14,271)。以高亲和力和特异性与靶蛋白结合的肽适体可通过本领域已知的多种技术来分离。可通过酵母双杂交筛选(Xu,C.w.等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:12,473-12,478)或通过核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937-4942)从随机的肽文库中分离肽适体。还可从噬菌体文库(Hoogenboom,H.R.等人(1998)Immunotechnology 4:1-20)或者化学生成的肽文库将它们分离。另外，多肽适体还可以使用配体调节的肽适体(LiRPA)的筛选来选择。参见例如Binkowski BF等人,(2005)Chem&Biol 12(7):847-855，其通过引用并入本文。尽管合成肽适体的困难方法使得它们的使用比多核昔酸适体更加复杂，但是它们具有无限制的化学多样性。多核苷酸适体被限制是因为它们仅利用四种核苷酸碱基，而肽适体将具有大大扩展的所有组成成分(repertoire)(即20种氨基酸)。
如本文其他地方对其他多肽所描述的，肽适体可以被修饰(例如缀合于多聚体或融合至蛋白)。
IX.载体和宿主细胞
宿主表达系统代表通过其产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的LINGO-2拮抗剂多肽或抗体的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。细菌细胞例如大肠杆菌或者真核细胞(例如用于完整重组抗体分子的表达)被用于重组抗体分子的表达。例如，与载体例如来自人类巨细胞病毒的主要的中间早期基因(intermediate early gene)启动子元件联合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是有效的抗体表达系统(Foeckin等人，Gene 45:101(1986)；Cockett等人,Bio/Technology 8:2(1990))。
包括编码LINGO-2拮抗剂(如，可溶的LINGO-2多肽、LINGO-2抗体、LINGO-2拮抗剂多核苷酸或LINGO-2适体)核酸的载体可用于生产拮抗剂。这些核酸可操作地连接的载体和表达控制序列的选择取决于所期望的功能特性，例如蛋白表达和有待转化的宿主细胞。
可用于调节可操作地连接的编码序列的表达的表达控制元件是本领域已知的。实例包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其他调节元件。当使用诱导型启动子时，它可通过例如宿主细胞培养基中营养状态上的变化或温度上的变化来控制。
在一个实施方式中，可使用称NEOSPLA(美国专利第6,159,730号)的Biogen IDEC,Inc.公司的表达载体。该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。己经发现，当在CHO细胞中转染，之后在含有G418的培养基上选择和甲氨蝶呤扩增时，该载体产生非常高水平的表达。当然，能够在细胞中引起表达的任何表达载体可用于本发明。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison,WI获得)。另外的细胞表达载体是本领域已知的并且是商业上可得的。通常，这种载体包含用于括入所期望的DNA片段的方便的限制性位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pm12d(International Biotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录病毒表达载体pMIG和pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315和AAV载体。其他示例性载体系统被公开于例如美国专利第6,413,777号中。
X.基因治疗
可在哺乳动物体内例如人类患者体内使用治疗神经系统疾病、病症或损伤的基因治疗方法来产生LINGO-2拮抗剂，其中促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突生长将是治疗性的受益。这包括给予编码适合的LINGO-2拮抗剂的、可操作地连接至适合的表达控制序列的核酸。通常这些序列被并入病毒载体中。适合于这种基因治疗的病毒载体包括腺病毒载体、甲病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、埃巴病毒载体、乳多空载体病毒、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。病毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。通常使用在其El基因或E3基因中有缺失的腺病毒载体。当使用腺病毒载体时，载体通常不具有可选择的标记基因。
XI.药物组合物
LINGO-2拮抗剂可配制成药物组合物以用于向哺乳动物包括人类给予。药物组合物包括药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二纳、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素纳、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
组合物可通过任何适合的方法来给予，例如胃肠外地、心室内地、口服地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、经鼻地、向颊地、阴道地或经由植入型药盒。本文使用的术语“胃肠外的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、病灶内的或颅内的注射或输注技术。如之前所描述的，本发明的方法中使用的LINGO-2拮抗剂在神经系统中起作用以促进运动神经元存活和/或运动神经元轴突生长。相应地，在某些方法中，LINGO-2拮抗剂以穿过血脑屏障的方式被给予。该穿过可源于LINGO-2拮抗剂分子本身固有的物理化学特性，源于药物制剂中的其他成分，或源于突破血脑屏障的机械装置例如针、插管或手术工具的使用。当LINGO-2拮抗剂是天生并不穿过血脑屏障的分子例如与促进所述穿过的部分形成的融合物之时，适当的给予途径是例如鞘内或颅内的。当LINGO-2拮抗剂是天生穿过血脑屏障的分子时，给予的途径可以是通过下文描述的各种途径中的一种或多种。
用于本发明所提供的方法中的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油脂性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用适合的分散剂或增湿剂和悬浮剂来配制。无菌的可注射的制剂还可以是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液，例如溶于1，3-丁二醇中的悬浮液。可使用的可接受的介质和溶剂是水、林格氏溶液和等渗的氧化纳溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的单-或双-甘油。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物作为天然的药学上可接受的油在可注射的制剂中是有用的，所述油例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油性溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常在药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的配制中所使用的相似的分散剂。也可为了配制的目的使用通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用的表面活性剂例如吐温、司盘(Span)和其他乳化剂或其他生物利用率增强剂。
胃肠外制剂可以是单一的推注注射(bolus)剂量、输注或加载的推注注射剂量，以及之后的维持剂量。这些组合物可以特定的固定的或可变的间隔例如每天一次或以“根据需要”为基础来给予。
某些药物组合物可以以可接受的剂型包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液口服给予。某些药物组合物还可通过经鼻的气溶胶或吸入进行给予。使用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用率的吸收促进剂，和/或其他常规的增溶剂或分散剂，这种组合物可被配制为溶于盐水的溶液。
可与运载体材料组合以产生单一剂型的LINGO-2拮抗剂的量将根据被处理的宿主、所使用的拮抗剂的类型和给予的特定模式而变化。组合物可作为单一剂量、多重剂量或经过一段确定的时间的输注而给予。还可调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性或预防性应答)。
本发明提供的方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的LINGO-2拮抗剂。这种治疗有效量或预防有效量可根据因素例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重而变化。治疗有效量或预防有效量也是治疗上有益的作用超过任何有毒或有害作用的量。
用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，其包括所使用的特定的LINGO-2拮抗剂、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食以及给予的时间、排泄率、药物组合和被治疗的特定疾病的严重度。通过医疗看护者对这些因素的判断是在本领域普通技术的范围内的。量还将取决于待治疗的个体患者、给予途径、制剂类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重度和所期望的作用。所使用的量可通过本领域中熟知的药理学和药物代谢动力学原理来确定。
LINGO-2拮抗剂可直接给予至神经系统、侧脑室内(intracerebroventricularly)、鞘内或可全身性给予。给予的组合物可被配制以给予每天0.001-10mg/kg体重的LINGO-2拮抗剂。在一些实施方式中，剂量是每天0.01-1.0mg/kg体重。在一些实施方式中，剂量是每天0.001-0.5mg/kg体重。
为了用LINGO-2拮抗剂抗体治疗，剂量的范围可为例如从约0.0001至100mg/kg宿主体重，以及更通常地0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，例如至少1mg/kg。上述范围中的剂量中间值也意为在本发明的范围内。可每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间表对受治疗者给予这样的剂量。示例性的治疗要求以一段长时间例如至少六个月给予多次剂量。另外的示例性治疗方案要求每两周给予一次或每月给予一次或每3至6个月给予一次。示例性的剂量时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下所给予的每种抗体的剂量落在所指示的范围内。
在一些实施方式中，可用编码LINGO-2拮抗剂多核苷酸的核酸分子处理受治疗者。核酸的剂量在每位患者中是在约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA的范围内。感染性病毒载体的剂量是每剂10-100或更多个病毒颗粒。
补充的活性化合物也可掺入组合物中。例如，可溶的LINGO-2多肽或融合蛋白可与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同给予。
可使用将LINGO-2拮抗剂递送至所选的靶组织的任何适合的方法，其包括含水溶液的推注注射或控制释放的系统的植入。控制释放的植入物的使用减少了对重复注射的需要。
本发明的方法中使用的LINGO-2拮抗剂可直接输注至脑中。用于化合物的直接脑部输注的各种植入物是已知的并且对于向患有神经病症的人类患者递送治疗性化合物是有效的。这些包括使用泵向脑的慢性输注、立体走向地(stereotactically)植入、短暂的间质导管、永久的颅内导管植入物和手术植入的可生物降解的植入物。参见例如Gill等人，如上文；Scharfen等人，“High Activity Iodine-125Interstitial Implant ForGliomas(用于神经胶质瘤的高活性腆-125间质植入物)，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4):583-591(1992)；Gaspar等人，“Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas(用于复发的恶性神经胶质瘤的永久性125I植入物)，”Int.J.Radiation OncologyBiol.Phys.43(5):977-982(1999)；第6章，第577-580页，Bellezza等人，“Stereotactic Interstitial Brachytherapy(立体走向的间质短程疗法)”在Gildenberg等人，Textbook of Stereotacticand FunctionalNeurosurgery(立体走向和功能性神经外科教科书)，McGraw-Hill(1998)中；和Brem等人，“The Safety of Interstitial Chemotherapy withBCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapyin the Treatment ofNewly Diagnosed Malignant Gliomas：Phase 1Trial(新诊断的恶性神经胶质瘤的治疗中使用加载BCNU的聚合物的问质化学治疗和之后的放射治疗的安全性：1期实验),”J.Neuro-Oncology 26:111-23(1995)。
组合物还可包含分散在作为化合物的适合的递送或支持系统的生物相容性载体物质中的LINGO-2拮抗剂。缓释载体的适合的实例包括成型的制品(例如栓剂或胶囊)形式的半透性聚合物基质。可植入的或微胶囊缓释的基质包括聚交酯(美国专利第3,773,319号；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。
在本发明的一些实施方式中，LINGO-2拮抗剂通过向脑的适合区域的直接输注而给予于患者。参见例如Gill等人，“Direct brain infusion ofglialcell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease(帕金森病中神经胶质细胞系来源的神经营养因子的直接脑输注)，”Nature Med.9：589-95(2003)。替代技术是可得的并且可被应用于给予根据本发明的LINGO-2拮抗剂。例如，可使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来完成导管或植入物的立体定向放置。注射了120ml的欧乃派克(omnipaque)、350mg碘/ml，具有2mm的切片厚度的对比增强的计算机断层显影术(CT)扫描可允许三维的多面治疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该设备允许以磁共振成像研究为基础的计划，其为了清晰的靶确认而合并CT和MRI靶信息。
为了该目的，可使用为了与GE CT扫描仪(General ElectricCompany，Milwaukee，WI)一起使用而修改的Leksell立体定向系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Well(BRW)立体定向系统(Radionics，Burlington，MA)。因此，在植入那天的早上，BRW立体定向框的环形基部环可被连接至患者的颅骨。连续的CT切片可以以3mm的间隔获得，尽管具有石墨棒定位框的(靶组织)区被固定至基部板。可在VAX 11/780计算机(Digital EquipmentCorporation，Maynard，Mass.)上运行计算机化的治疗计划程序，使用石墨棒成像的CT坐标而在CT空间和BRW空间之间作图。
为了期望的治疗或预防活性，在用于人类之前，如本文所描述的脱髓鞘或髓鞘形成障碍病症的治疗方法通常被体外检测，而然后在可接受的动物模型中进行体内检测。适合的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员熟知的。例如，证实LINGO-2拮抗剂的分化和存活作用的体外测定被描述于本文。LINGO-2拮抗剂对轴突的髓鞘形成的作用可如实施例中所述进行体外检测。最后，可通过产生表达LINGO-2拮抗剂的转基因小鼠或通过向本文描述的模型中的小鼠或大鼠给予LINGO-2拮抗剂来进行体内检测。
实施例
实施例1：LINGO-2在中枢神经系统中特异性表达
通过定量PCR(Q-PCR)测定由以下方法评价LINGO-2在大鼠和小鼠组织中的表达量。大鼠RNA购自Clontech以及小鼠RNA从P6小鼠组织中制备。使用Absolutely RNA Miniprep Kit(Stratagene)按照制造商的指示提取mRNA。从mRNA中合成组织特异性第一链cDNA并用于Taqman RT-PCR(基本按照如Mi等人，Nature Neuroscience 7：221-228(2004)所记载的进行)以定量LINGO-2mRNA水平，其使用(i)正向引物5’-ACCTTGTATACCTGACCCACCTTAA-3’(SEQ ID NO：23)，(ii)反向引物5’-AGAGAACATGCCTGCTTCAATAGTG-3’(大鼠)(SEQ ID NO：24)或5’-AGAGAACATGCCAGCTTCAATAGTG-3’(小鼠)(SEQ ID NO：25)以及(iii)MGB探针(Applied Biosystems)5’--CCTCTCCTACAATCCC-3’(SEQ ID NO：26)。使用TaqMan GeneExpression系统(Mx3000P)定量mRNA水平。
通过首先将组织中LINGO-2mRNA水平对同一组织中β-肌动蛋白mRNA水平进行标准化来确定相对的LINGO-2表达水平。使用引物组Rn0067869_ml(大鼠)或Mn00607939(小鼠)(Applied Biosystems)平行定量β-肌动蛋白mRNA水平。然后，通过比较每个组织中标准化的LINGO-2mRNA水平与通用组(Universal set)大鼠和小鼠的肺组织中标准化的表达水平(两者均被指定的值为1)来确定相对LINGO-2mRNA水平。大鼠的相对LINGO-2表达水平被示于图1中，P6小鼠组织的相对LINGO-2表达水平被示于图2中。在大鼠中，LINGO-2在脑中表达程度最高。在胸腺、胃、肝、结肠、心脏、胎盘、肾、脾、乳腺和肺中表达水平较低或未在背景上检出。在P6小鼠组织中，LINGO-2在脑和脊髓中表达程度最高。显著地，脊髓表达水平高于脑表达水平。这与已经得到的LINGO-1的观察结果相反，LINGO-1在脑中的表达高于脊髓中的表达。LINGO-2在心脏、肾、肝、脾、肠、肺、皮肤和胃中低表达或未在背景上检出。
实施例2：LINGO-2在皮层和DRG神经元中高表达
通过定量PCR(Q-PCR)测定由以下方法评价LINGO-2在大鼠神经元细胞中的表达量。RNA获取自大鼠神经元细胞群，并使用Absolutely RNA Miniprep Kit(Stratagene)按照制造商的指示提取mRNA。从RNA合成第一链cDNA并用于Taqman RT-PCR(基本按照描述于Mi等人，Nature Neuroscience 7：221-228(2004)所述进行)定量LINGO-2mRNA水平，其使用实施例1中描述的SEQ ID NO：23-26的引物。使用TaqMan Gene Expression系统(Mx3000P)定量mRNA水平。
通过首先将神经元细胞群中LINGO-2mRNA水平相对同一神经元细胞群中肌动蛋白mRNA水平进行标准化来确定相对的LINGO-2表达水平。然后，通过比较每个组织中标准化的LINGO-2mRNA水平与少突胶质细胞前体细胞(OPC)中标准化的表达水平(其被指定的值为1)来确定相对的LINGO-2mRNA水平。相对的LINGO-2表达水平被示于图3中。LINGO-2在皮层和背根神经节(DRG)中表达程度最高。在星形胶质细胞中检测到表达，但相对皮层和背根神经节而言表达较少。小胶质细胞中LINGO-2表达水平最低。
实施例3：构建和纯化LINGO-2-Fc融合蛋白
通过将人LINGO-2细胞外部分(残基1-500)与人IgG1的铰链区和Fc融合而制备构建体。可溶的LINGO-2：Fc蛋白的序列表示于下：
实施例4：LINGO-2特异性单克隆抗体的纯化
通过筛选包含3.5×1010独特克隆的人幼稚噬粒Fab文库(huanphageid Fab library)来制备特异性结合LINGO-2的抗-LINGO-2抗体。如前文所记载的方式进行筛选并鉴定C09抗体。表3-6中提供了C09的序列。结合实验表明C09抗体结合LINGO-2，但不结合LINGO-1。此外，C09抗体结合包含LINGO-2的LRR7-LRR12但缺少LINGO-2的LRR1-LRR6的LINGO构建体。
实施例5：通过可溶的LINGO-2或抗-LINGO-2抗体阻断LINGO-2从而促进人运动神经元存活
源自人胚胎干细胞(hEScs)(Lonza)的人运动神经元在96孔板中用0.025％胰蛋白酶/EDTA胰酶消化，然后在MotorBlast培养液(Lonza)中以5×104/孔的细胞浓度重铺到4孔培养腔式载玻片(4-chamber slide)上。细胞在37℃，含5％CO2的湿润空气下孵育过夜。
用0.5mM的亚砷酸钠处理细胞30分钟。亚砷酸钠提供诱导细胞死亡的氧化损害(oxidative insult)。将细胞洗涤三次，然后将新鲜的含有50μg/mL可溶的LINGO-2-Fc、10μg/mL抗-LINGO-2C09Fab或对照hIgG的MotorBlast培养液加入到细胞中。在37℃，含5％CO2的湿润空气下孵育细胞培养物24小时，然后用4％多聚甲醛固定。
使用抗βIII微管蛋白(Covance)和抗神经丝(Millipore)对细胞进行免疫细胞化学技术以对运动神经元染色(图4)。
如图4所示，亚砷酸钠处理减少了运动神经元的数量。然而可溶的LINGO-2-Fc和抗LINGO-2C09Fab两者均减轻了亚砷酸钠诱导的运动神经元死亡。
实施例6：通过可溶的LINGO-2阻断LINGO-2促进运动神经元轴突生长
使用Nycodenz梯度离心从胚胎第16天(E16)大鼠脊髓中分离出运动神经元。将E16大鼠胚胎的脊髓解剖出，并在0.025％胰蛋白酶，37℃下孵育40分钟。用含有三倍体积的Dulbecco's modified Eagle's培养基，一倍体积的营养混合物F-12Ham(DMEMlF12)和0.004％的DNase的培养基更换胰蛋白酶溶液。孵育5分钟脊髓细胞，然后通过轻柔研磨解离直到细胞悬液均匀。所得的脊髓悬液在4％牛血清白蛋白(BSA)垫上分层，并且100×g 4℃离心所述溶液收集细胞沉淀。细胞沉淀重悬于含有0.004％DNase的DMEM/F12培养液中，并在8.01％、7.66％和7.05％的Nycodenz梯度中分层。500×g离心所述梯度。运动神经元被鉴定为在培养基界面处白色、浑浊的物质，且收集7.05％的溶液。
将收集的运动神经元以5×104细胞/孔的细胞密度在包被有10μg/mL多聚-D赖氨酸和10μg/mL lamini的4孔培养腔式载玻片上铺开，所述神经元在运动神经元培养基中(1:1比率的Neurobasal培养基，补充有2％B27和0.5mM谷氨酰胺，和DMEM/F12培养基(3:1)，补充有0.4μg/mL氢化可的松，5μg/mL胰岛素，和10％胎牛血清(FBS))，。用10ng/mL神经营养因子-3、10ng/mL脑衍生的神经营养因子、10ng/mL胶质细胞系衍生的神经营养因子、10ng/mL纤毛神经营养因子和抗生素补充所获得的培养液。细胞在37℃，含5％CO2的湿润空气下孵育过夜，然后用0.5mM的亚砷酸钠处理细胞30分钟。细胞经三次洗涤，然后加入新鲜的含有50μg/mL可溶的LINGO-2-Fc或对照hIgG的运动神经元生长培养液。在37℃，含5％CO2的湿润空气下孵育所得的细胞培养物24小时，然后用4％多聚甲醛固定。
使用抗神经丝(Millipore)对细胞进行免疫组化以对运动神经元染色(图5)。每个神经元中最长的神经突被认为是轴突，并用Openlab软件测量了轴突长度。如图5所示，用亚砷酸钠处理细胞后，与hIgG对照处理的细胞比，可溶的LINGO-2促进约20％的运动神经元轴突生长。
实施例7：SODG93A小鼠中LINGO-2表达水平上调
含有突变的铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)DNA的转基因小鼠(如SODG39A)形成与人肌萎缩侧索硬化症(ALS)病人相似的麻痹的运动神经元疾病，并通常被用作ALS模型。Narai等，Neural.Int.1:e16(2009)。
用磷酸缓冲盐水(PBS)灌注65天SODG39A或年龄相匹配(matched)的对照野生型小鼠，并解剖出脊髓。用4％多聚甲醛固定脊髓，并将脊髓的胸廓区域包埋于最佳切割温度(O.C.T.)化合物中用于冷冻切片。用地高辛标记的LINGO-2反义RNA探针5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAGAAGCCCTTTCCCATCT-3(SEQID NO：28)和地高辛标记的正义RNA探针5’-T AA TACGACTCACTATAGGGACAGAAGCCCTTTCCCATCT-3’(SEQ ID NO：29)探测冰冻切片。
然后用tyramide信号扩增(TSA)加荧光抗地高辛缀合的抗体试剂盒(Perkin Elmer)按照制造商的指示对切片进行染色。
进行定量分析，其中用Openlab软件在20×下计数每一载玻片上腹侧角区域中的LINGO-2阳性细胞的数量。分析了SODG39A和野生型小鼠两者的各三只动物。从图6可以看出，当用原位杂交测量时，65天SODG39A小鼠脊髓腹侧角中LINGO-2的表达水平上调。与野生型对照小鼠相比，SODG39A小鼠中LINGO-2阳性细胞的数量增加了2倍且有更高的染色强度。
实施例8：LINGO-2拮抗剂促进ALS中运动神经元生长和存活
用PBS(溶媒对照)对照抗体或抗-LINGO-2抗体(如C09)处理表达人SODG93A的转基因小鼠和年龄相匹配的对照。在每周的基础上，通过腹膜内注射进行处理。小鼠在84到90天龄时处死并进行肌肉量和组织学评估(如评估运动神经元存活)。监测其他小鼠再一段时间(例如约134天)以观察疾病的进展(如从左至右的能力和右侧斜卧以及握力)。
实施例9：LINGO-2拮抗剂上调AKT磷酸化
运动神经元在等浓度的抗-LINGO-2抗体，C09)或对照抗体的存在下孵育。收集细胞裂解物并通过Western分析检测磷酸化的AKT蛋白的水平。β-肌动蛋白的水平作为对照也进行了检测。如图7所示，抗-LINGO-2抗体增加了AKT磷酸化。
实施例10：LINGO-2拮抗剂促进少突胶质细胞的分化
通过用增加的量的C09抗体处理少突胶质细胞前体细胞以及通过Western印迹测试髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和髓鞘碱性蛋白(MBP)，从而在体外研究抗-LINGO-2抗体的作用。如图8所示，用C09抗体处理以剂量依赖的方式增加了MAG和MBP的水平。MPB是成熟少突胶质细胞的标记。因此这些数据表明LINGO-2拮抗剂促进少突胶质细胞的分化。

Claims (56)

1.一种能够特异性结合LINGO-2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够促进运动神经元的存活。
2.分离的核酸，其包含编码SEQ ID NO：2多肽的可溶片段或其变体的多核苷酸，其中所述多肽能够促进运动神经元的存活。
3.分离的核酸，其包含编码SEQ ID NO：2多肽的可溶性片段或其变体的多核苷酸，其中所述多肽能够促进运动神经元的存活减少轴突生长的抑制。
4.权利要求2或3的核酸，包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO：2的氨基酸1到500组成的组的参考氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
5.权利要求3的核酸，其中所述多肽包含与所述参考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
6.权利要求4的核酸，其中所述多肽包含与所述参考氨基酸序列相同的氨基酸序列。
7.权利要求2-6中任一项的核酸，进一步包含编码融合至所述多肽的异源多肽的多核苷酸。
8.权利要求7的核酸，其中所述异源多肽选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向性多肽、报告多肽、纯化易化多肽、任何所述多肽的片段，和两种或更多种所述多肽或片段的组合所组成的组。
9.权利要求8的核酸，其中所述异源多肽选自由免疫球蛋白Fc、人血清白蛋白或其片段、组氨酸标签，和运动神经元糖蛋白或其片段所组成的组。
10.包含药学上可接受的载体和权利要求2-9中任一项的核酸的组合物。
11.包含权利要求2-9中任一项的核酸的载体。
12.权利要求11的载体，其中所述核酸可操作地连接于表达控制序列。
13.权利要求12的载体，其中所述载体是病毒载体。
14.权利要求13的载体，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体和单纯疱疹病毒载体所组成的组。
15.包含权利要求2-9中任一项的核酸或权利要求11-14中任一项的载体的宿主细胞。
16.权利要求15的宿主细胞，其表达所述多肽。
17.由权利要求2-9中任一项的核酸编码的分离的多肽。
18.权利要求17的多肽，其中所述多肽通过合成生产。
19.权利要求17或18的多肽，其中所述多肽缀合于聚合物。
20.权利要求19的多肽，其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖类聚合物、多肽所组成的组。
21.权利要求20的多肽，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
22.权利要求19-21中任一项的多肽，其中所述多肽缀合于1、2、3或4种聚合物。
23.权利要求22的多肽，其中所述聚合物的总分子量为20,000Da到40,000Da。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其能够特异地结合权利要求17或18的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段能够促进运动神经元的存活。
25.一种抗体或其抗原结合片段，其能够特异结合权利要求17或18的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段能够促进运动神经元的存活减少轴突生长的抑制。
26.包含药学上可接受的载体权利要求17-23中任一项多肽的组合物。
27.包含药学上可接受的载体权利要求15或16的宿主细胞的组合物。
28.一种用于促进运动神经元存活的方法，包括使所述运动神经元与有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物接触，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
29.一种促进运动神经元轴突生长的方法，包括使所述运动神经元与包含LINGO-2拮抗剂的组合物接触，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
30.一种促进哺乳动物中运动神经元存活的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
31.一种促进哺乳动物中运动神经元轴突生长的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
32.一种治疗哺乳动物中与运动神经元存活相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
33.一种治疗哺乳动物中与运动神经元轴突生长相关的疾病、病症或损伤的方法，包括对其有需要的哺乳动物给予有效量的包含LINGO-2拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-2拮抗剂选自由以下所组成的组：
(i)可溶的LINGO-2多肽；
(ii)LINGO-2抗体或其抗原结合片段；
(iii)LINGO-2拮抗剂多核苷酸；
(iv)LINGO-2适体；和
(v)两种或更多种所述LINGO-2拮抗剂的组合。
34.权利要求28-33中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂是可溶的LINGO-2多肽。
35.权利要求34的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含权利要求17-23中任一项的多肽。
36.权利要求35的方法，其中所述可溶的LINGO-2多肽包含选自由以下所组成的组的LINGO-2区域：
(i)LINGO-2Ig结构域或其片段、变体或衍生物，
(ii)LINGO-2LRR结构域或其片段、变体或衍生物，
(iii)所述LINGO-2结构域或其片段、变体或衍生物的组合。
37.权利要求35或36的方法，其中所述可溶LINGO-2多肽缺乏选自由以下所组成的组的LINGO-2区域：
(i)LINGO-2跨膜结构域或其片段、变体或衍生物，
(ii)LINGO-2胞内结构域或其片段、变体或衍生物，和
(iii)所述LINGO-2结构域或其片段、变体或衍生物的组合。
38.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂是LINGO-2抗体或其抗原结合片段。
39.权利要求119的方法，其中所述LINGO-2抗体或其抗原结合片段是权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
40.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含LINGO-2拮抗剂多核苷酸。
41.权利要求40的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂多核苷酸选自由以下所组成的组：
(i)反义多核苷酸；
(ii)核酶；
(iii)小干扰RNA(siRNA)；和
(iv)小发夹RNA(shRNA)。
42.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂包含LINGO-2适体。
43.权利要求30至33中任一项的方法，其中所述哺乳动物已被诊断为患有涉及运动神经元的疾病、病症或损伤。
44.权利要求32，33和34中任一项的方法，其中所述疾病、病症或损伤选自肌萎缩侧索硬化症(ALS)、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、X-连锁脊髓延髓性肌萎缩(SBMA；甘乃迪病(Kennedy disease))、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、脊髓性肌肉萎缩症(SMA)、小儿麻痹症后期综合症(PPS)、亨廷顿氏症、原发性震颤(ET)、运动神经元疾病、瘫痪和帕金森氏病所组成的组。
45.权利要求44的方法，其中所述疾病、病症或损伤为肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
46.权利要求28至45中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂通过推注注射或慢性输注给予。
47.权利要求28至45中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂被直接给予到中枢神经系统中。
48.权利要求28至45中任一项的方法，其中所述LINGO-2拮抗剂被全身性给予。
49.权利要求28或29的方法，包括(a)用经可操作地连接于表达控制序列的编码所述LINGO-2拮抗剂的多核苷酸转染所述运动神经元，以及(b)允许所述LINGO-2拮抗剂的表达。
50.权利要求30至48中任一项的方法，包括(a)给予哺乳动物经可操作地连接于表达控制序列的编码所述LINGO-2拮抗剂的多核苷酸，以及(b)允许所述LINGO-2拮抗剂的表达。
51.权利要求50的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体而被给予。
52.权利要求51的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
53.权利要求52所述的方法，其中病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、和痘病毒载体所组成的组。
54.权利要求50至53中任一项的方法，其中所述给予包括(a)提供包含所述多核苷酸的培养的宿主细胞，其中所述培养的宿主细胞表达所述LINGO-2拮抗剂；和(b)将所述培养的宿主细胞导入到所述哺乳动物中以使所述LINGO-2拮抗剂在所述哺乳动物中表达。
55.权利要求54的方法，其中所述培养的宿主细胞源于要进行治疗的哺乳动物。
56.权利要求51至55中任一项的方法，其中所述载体由选自由局部给予、眼内给予、肠胃外给予、鞘内给予、硬膜下给予和皮下给予所组成的组的途径给予。
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