CZ294425B6

CZ294425B6 - Způsob výroby anti-humánního antigenového receptoru, anti-humánní antigenový receptor, řetězec VH a VL, souprava pro selekci anti-humánních antigenových receptorů a farmaceutická kompozice, obsahující uvedený receptor

Info

Publication number: CZ294425B6
Application number: CZ19993614A
Authority: CZ
Inventors: Peter Kufer; Tobias Raum
Original assignee: Micromet Ag
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2005-01-12
Also published as: NO994983L; HUP0100794A1; SI0970126T1; JP3876002B2; EP0970126A2; PT970126E; DK0970126T3; IL132062A; TR199902553T2; HU221818B1; EP0970126B1; US7227002B1; JP2001519824A; DE69800716T2; AU742045B2; KR100663319B1; BRPI9809391B8; IL132062A0; KR20050052549A; WO1998046645A2

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby anti-humánního antigenového receptoru, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje b) selekci kombinace funkčně přeskupených imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH je odvozen od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a řetězec VL je odvozen od přirozeně se vyskytujícího repertoáru humánních buněk B a tyto řetězce se exprimují z rekombinantního vektoru, a c) použití třídicího systému in vitro pro vazbu k humánnímu cílovému antigenu, přičemž před selekčním stupněm b) se provede a) vytřídění buď uvedeného řetězce VH nebo uvedeného řetězce pro vazbu k uvedenému antigenu společně z řetězcem V jiného antigenového receptoru, specifického pro uvedený cílový antigen; anti-humánního antigenového receptoru; řetězce VH a VL, soupravy pro selekci anti-humánních antigenových receptorů; a farmaceutické kompozice obsahující uvedený receptor.ŕ

Description

Způsob výroby anti-humánního antigenového receptorů, anti-humánní antigenový receptor, řetězec VH a VL, souprava pro selekci anti-humánních antigenových receptorů a farmaceutická kompozice, obsahující uvedený receptor

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu produkce anti-lidského antigenního receptorů, který je málo imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto způsob obsahuje kroky selekce a kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, kde alespoň uvedený řetězec VH pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, a zmíněný řetězec VL pochází z repertoáru přirozeně se vyskytujících lidských B buněk, přičemž uvedené řetězce jsou exprimovány pomocí rekombinantního vektoru a používají in vitro detekční (expoziční) systém na vazbu k lidskému antigenu.

Předkládaný vynález se dále týká receptorů, které jsou jen slabé imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a jsou namířeny proti lidským antigenům, přičemž uvedené receptory se dají získat způsobem podle vynálezu. Uvedené receptory jsou výhodně protilátky nebo jejich fragmenty nebo imunokonjugáty, obsahující řetězce VH/VL zmíněné protilátky. Receptory podle vynálezu jsou namířeny zejména proti lidským nádorovým antigenům, výhodně proti lidskému nádorovému antigenu 17-1 A, známému také jako EpCAM, EGP nebo GA 733-2. A nakonec se předkládaný vynález týká diagnostických souprav (kitů), použitelných pro provádění způsobu podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systémy savců, jako je lidský imunitní systém, rozpoznávají imunokompetentní buňky a molekuly, které jsou specifické pro autoantigeny. Porucha regulace imunitního systému z tohoto hlediska může mít za následek autoimunitní nemoci, jako je revmatoidní artritida. Obecně je tudíž imunitní dohled vzhledem k autoreaktivním protilátkám nebo T buňkám vysoce prospěšný. Avšak může nastat případ, kdy je výhodné mít autoreaktivní protilátky, které jsou namířeny proti antigenům, exprimovaným v savčím a zejména v lidském těle. Takové antigeny jsou například nádorové antigeny. Například bylo ukázáno, že lidský antigen 17-1A nebo EpCAM, povrchový glykoprotein, exprimovaný buňkami jednoduchého epitelu a maligními nádory, které z něho vycházejí, je vhodný cíl pro monoklonální protilátku při léčbě rakoviny, zejména u pacientů s minimální reziduální nemocí, kteří mají diseminované nádorové buňky, které mohou později způsobit solidní metastázy a tak zhoršit pacientovu prognózu. U pacientů s minimální reziduální kolorektální rakovinou snížila myší monoklonální protilátka, specifická pro lidský antigen 171A, pětiletou úmrtnost o 30 % ve srovnání s neléčenými pacienty při systémové aplikaci v pěti dávkách během čtyř měsíců po chirurgickém odstranění primárního nádoru. Každý pacient byl léčen celkem 900 mg protilátky (Reithmiiller, Lancet, 343, 1177-1183, 1994). Ale v průběhu léčby protilátkou se u pacientů vyvinula silná protilátková reakce proti myšímu imunoglobulinu. Tyto lidské proti-myší protilátky (HAMAs) silně omezují kontinuální podávání protilátkové léčby a stoupající měrou snižují její účinnost. Kromě toho předem vytvořené HAMAs, indukované dřívější protilátkovou léčbou nebo jiným kontaktem s myším imunoglobulinem, mohou vážně interferovat s pozdější léčbou protilátkou.

Aby se předešlo těmto problémům, jsou výhodnější léčebné protilátky minimálně imunogenní.

Pro dosažení tohoto cíle se může například uvažovat o tom, že léčebné protilátky nebo jejich deriváty jsou kompletně lidské svou aminokyselinovou sekvencí a imunogenní profil lidské idiotypové protilátky se minimalizuje použitím variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, u kterých je pravděpodobné, že budou tolerovány lidským imunitním systémem.

Ale příprava lidských protilátek proti lidským antigenům čelí dvěma hlavním problémům:

1) ukázalo se, že hybridom nebo jiné techniky buněčné imortalizace jsou zcela neúčinné pro vznik buněčných linií, produkujících lidské protilátky, ve srovnání s technologií myších hybridomů.

2) autoreaktivní protilátky jsou relativně účinně zbaveny receptorů přirozeně se vyskytujících protilátek díky mechanizmu zprostředkované autotolerance.

Lidské protilátky se všeobecně staly dostupnější díky použitelnosti transgenních myší, exprimujících lidské protilátky (Brůggemann, Immunol. Today, 17, 391-397, 1996), a díky technikám kombinační protilátkové knihovny a fágové expozice (tj. technika „phage display“, pro kterou není dosud ustálený český termín, umožňuje detekovat gen, např. cDNA, klonovaný do fága, „exponovaný“ po expresi v bakteriích, např. pomocí protilátek, a pak izolovat klon exprimující požadovaný gen), které umožňují in vitro kombinaci variabilních oblastí imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců (VH a VL) a in vitro selekci podle specifické vazby antigenu (Winter, Annu. Rev. Immunol., 2, 433-455, 1994). Použitím metody fágové expozice mohou být snadno izolovány vzácné jevy, jako je jedna specifická vazebná skupina z 10⁷ až 10⁹ různých párů VL/VH nebo VH/VL, což je obzvláště spolehlivé, když byl repertoár variabilních oblastí obohacen o specifické vazebné skupiny použitím B lymfocytů z imunizovaných hostitelů jako zdroje pro klonování repertoáru.

Avšak často je v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek výskyt specifických vazebných skupin podstatně snížen. To je pravdivé zejména u případů protilátek, vázajících se na autoantigeny. Náhodné kombinace oblastí VL a VH autotolerantního hostitele, mající za následek kombinační protilátkové knihovny obvyklé velikosti (10⁷ až 10⁹ nezávislých klonů), často nejsou postačující pro úspěšnou in vitro selekci autoreaktivních protilátek metodou fágové expozice.

Jednou strategií, jak obejít tento problém, je použití velmi rozsáhlých kombinačních protilátkových knihoven, které svou velikostí kompenzují malý výskyt autoreaktivních protilátek v přirozeně se vyskytujících repertoárech. Aleje obtížné získat kombinační protilátkové knihovny, překračující velikost 10⁹ nezávislých klonů, díky současnému technickému limitu účinnosti transformace plazmidové DNA do buněk E. coli.

Aby se zabránilo systematické chybě, vyvolané autotolerancí v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek, kdy jsou autoreaktivní protilátky zachycovány ve snížené míře a významně se snižují šance na izolaci protilátek specificky rozpoznávajících autoantigeny, byly vyvinuty postupy, používající semisyntetické nebo zcela syntetické repertoáry řetězců VH a/nebo VL. Například byl klonován téměř úplný repertoár nepřestavěných segmentů lidského V genu z genomové DNA a použit pro in vitro rekombinace funkčních genů variabilní oblasti, připomínající V-J- nebo V-D-J- rekombinace in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol., 227, 381-388, 1992, Nissim, EMBO J., 13, 692-698, 1994, Griffiths, EMBO J., 13, 3245-3260, 1994). Obvykle je diverzita spojení V-D-/D-J- a D-segmentu, která je převážně zodpovědná za neobvyklou délku a sekvenční variabilitu těžkého řetězce CDR3, a také diverzita spojení V-J-, která přispívá k sekvenční variabilitě lehkého řetězce CDR3, imitována náhodnými sekvencemi, používajícímu degenerované oligonukleotidy v postupech plně syntetických a semisyntetických (Hoogenboom, 1994, viz výše, Nissim, viz výše, Griffiths, viz výše, Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4457-4461, 1992).

Ale u párů VL/VH nebo VH/VL, vybraných pro vazbu k lidskému antigenu z těchto semisyntetických nebo zcela syntetických repertoárů, založených na sekvencích lidského V genu, je riziko, že mohou tvořit imunogenní epitopy, které mohou u lidí indukovat nežádoucí imunitní reakci (Hoogenboom, TIBTECH, 15, 62-70, 1997), zejména oblasti CDR3, pocházející z repertoárů úplně randomizovaných (náhodných) sekvencí, jsou předurčené ke tvorbě potenciálně imunogenních epitopů, protože nikdy nebyly vystaveny imunitnímu dohledu člověka, aniž by byly

-2CZ 294425 B6 rozpoznány jako cizorodý antigen a v důsledku toho později eliminovány. Stejně tak to platí pro lidské protilátky z transgenních myší, exprimujících lidské protilátky, protože tyto molekuly imunoglobulinů byly vybrány proto, že je toleruje myší, ale už ne lidský imunitní systém.

Podstata vynálezu

Technickým problémem, který je řešen předkládaným vynálezem, bylo poskytnout způsob, který umožňuje přípravu receptorů, které jsou slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a které mohou být použity pro cílení antigenů v lidském těle. Řešení uvedeného technického problému bylo dosaženo provedeními vynálezu, jejichž význaky jsou popsány v patentových nárocích.

Vynález se takto týká způsobu výroby anti-humánního antigenového receptoru, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje b) selekci kombinace funkčně přeskupených imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH je odvozen od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a řetězec VL je odvozen od přirozeně se vyskytujícího repertoáru humánních buněk B a tyto řetězce se exprimují z rekombinantního vektoru, a c) použití třídicího systému in vitro pro vazbu k humánnímu cílovému antigenu, přičemž před selekčním stupněm b) se provede a) vytřídění buď uvedeného řetězce VH nebo uvedeného řetězce pro vazbu k uvedenému antigenu společně z řetězcem V jiného antigenového receptoru, specifického pro uvedený cílový antigen.

Výhodně jsou alespoň imunoglobulinový řetězec VH a případně imunoglobulinový řetězec VL odvozeny od humánního repertoáru IgD.

Výhodně se kombinace funkčně přeskupených imunoglobulinových řetězců VH a VL exprimuje z jedné knihovny nebo z několika různých knihoven.

Výhodně je humánním antigenem nádorový antigen, výhodněji humánní antigen 17-1 A.

Výhodně řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 a 381) a na obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Výhodně při způsobu podle vynálezu selekce b) zahrnuje

i) navázání třídicího vehikula, exprimujícího antigenový receptor

a) na imobilizovaný cílový antigen nebo jeho fragmenty, nebo

b) na případně značené buňky, exprimující cílový antigen, nebo

c) na rozpustný, výhodně značený cílový antigen nebo jeho fragmenty, ii) odstranění nespecificky vázaného třídicího vehikula [a) a b)] vymytím a následnou eluci specificky navázaného třídicího vehikula, nebo iii) pozitivní obohacení třídicího vehikula, vázaného na cílový antigen [b) a c)J, z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenzí buněk, exprimujících cílový antigen, a takto izolovaná třídicí vehikula, zahrnující jejich antigenové receptory, se případně rozmnoží replikací a potom se podrobí dalším cyklům selekce in vitro, popsaným v i) až iii).

-3CZ 294425 B6

Výhodně selekce vhodné kombinace zahrnuje

a) testování jednoho a téhož řetězce VH v kombinaci s různými řetězci VL na vazbu k uvedenému humánnímu antigenu, nebo

b) testování jednoho a téhož řetězce VL v kombinaci s různými řetězci VH na vazbu k uvedenému humánnímu antigenu.

Způsob podle vynálezu výhodně po selekci dále zahrnuje 1) získání humánních řetězců VH a VL nebo odpovídajících nukleových kyselin a fúzí těchto řetězců ke stejným nebo jiným řetězcům VH nebo VL, k imunoglobulinovým konstantním oblastem těžkých řetězců CH nebo k imunoglobulinovým konstantním oblastem lehkých řetězců CL, zejména ke konstantním oblastem řetězců, odvozených od humánního IgGl nebo IgG3, nebo kjejich částem nebo kneimunoglobulinovým řetězcům a k odpovídajícím nukleovým kyselinám, nebo/a 2) získání humánních řetězců a fyzické připojení uvedených řetězců k neproteinovým farmaceutickým činidlům nebo/a biologicky účinným molekulám, přičemž uvedené řetězce VH a VL jsou výhodně exprimovány za sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem RT-PCR amplifikace mRNA, odvozené od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B.

Předmětem vynálezu je také anti-humánní antigenový receptor, výhodně protilátka nebo její fragment, zejména receptor, který je specifický pro humánní nádorový antigen, obsahující kombinaci funkčně přeskupených řetězců VH a VL, přičemž oba řetězce V obsahují soubor strukturotvorných oblastí FR a komplementárně determinujících oblastí CDR, alespoň řetězec VH je odvozen od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a řetězec VL je odvozen od přirozeně se vyskytujícího humánního repertoáru buněk B a tento anti-humánní antigenový receptor je připravitelný výše uvedeným způsobem podle vynálezu.

Výhodně je antihumánní antigenový receptor specifický pro nativní humánní antigen 17-lAa, jehož řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a jehož řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Předmětem vynálezu je také řetězec VH nebo alespoň jedna komplementárně determinující oblast CDR, obsažené v anti-humánním antigenovém receptorů podle vynálezu.

Předmětem vynálezu je také řetězec VL nebo alespoň jedna komplementárně determinující oblast CDR, obsažené v anti-humánním antigenovém receptorů podle vynálezu.

Výhodný je řetězec, ve kterém CDE je CDR3.

Předmětem vynálezu je také souprava pro selekci anti-humánních antigenových receptorů podle vynálezu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje repertoár řetězců VH, odvozený od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a repertoár řetězců VL, odvozených od humánních buněk B.

Předmětem vynálezu je dále anti-humánní antigenový receptor, který je odvozen od humánních sekvencí a je specifický pro nativní humánní antigen 17-1A a který je výhodně připravitelný způsobem podle vynálezu.

Výhodně posledně uvedený anti-humánní antigenový receptor rozpoznává epitop extracelulámí domény antigenu 17-1 A, který výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidu č. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 a 79 a jehož řetězec VH obsahuje alespoň jednu komplementárně determinující oblast CDR jedné ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až

381) a na obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a jehož řetězec VL obsahuje alespoň jednu

-4CZ 294425 B6 komplementárně determinující oblast CDR sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Předmětem vynálezu je konečně farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje receptor podle vynálezu nebo řetězec VH podle vynálezu a případně farmaceuticky přijatelný nosič.

Způsob podle předkládaného vynálezu je výhodný pro přípravu receptorů, které mohou být použity pro cílení antigenů u lidí a které samy nejsou imunogenní buď vůbec nebo alespoň ne do významné míry. Tyto receptory mohou být výhodně použity pro léčbu celé řady nemocí, jako nádorů nebo autoimunitních chorob, rejekce (odhojení) štěpu po transplantaci a infekčních nemocí, a to tím, že se cílí na buněčné receptory, a nebo k léčení nemocí alergických, zánětlivých, endokrinních a degenerativních tím, že se cílí na klíčové molekuly, zapojené do patologického procesu.

Imunoglobulinové řetězce VH/VL receptorů předkládaného vynálezu mohou být ovšem dále zkoumány, co se týče jejich sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí s použitím technik v oboru známých, viz např. Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Jakmile byla jedno určena sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinová sekvence, mohou být receptory podle vynálezu připraveny také jinými metodami, jako jsou syntetické nebo semisyntetické metody, poskytující syntetické nebo semisyntetické receptory, nebo vtransgenních myších, exprimujících lidské imunoglobulinové receptory, čili receptory, nesoucí vlastnosti vyjmenované výše v tomto textu a tvořené takovými syntetickými nebo semisyntetickými metodami nebo v transgenních myších, jsou také zahrnuty do rámce předkládaného vynálezu.

Po navázání receptorů na lidský antigen může být receptor dále purifíkován. Například nenavázané receptory, které nanesou antigenní specifitu, mohou být odstraněny promýváním. Navázaný receptor může být eluován z lidského antigenů a dále purifíkován, mohou být použity další cykly exprese, vazby a selekce požadovaného receptorů, dokud není požadovaný receptor a/nebo odpovídající rekombinantní vektor izolován v čisté formě.

Způsob předkládaného vynálezu tedy používá třídění variabilních oblastí imunoglobulinů lidským imunitním systémem. Receptory pocházejí z repertoáru, vybraného in vitro z lidských kombinačních protilátkových knihoven, výlučně nebo přednostně vytvořených z repertoáru přirozeně se vyskytujících protilátek, exprimovaných zralými lidskými lymfocyty B, které jsou v podstatě nesenzibilizované, nebo lidskými B buňkami, které jsou v podstatě anergní.

Ale imunoglobulinové variabilní domény mohou také pocházet z celé řady dalších zdrojů, které představují tyto předem vybrané populace B buněk.

Vědecký podklad, pokud se týká původu B buněk, fungujících jako zdroj uvedených řetězců VH nebo VL, může být vysvětlen následovně:

Zralé nesenzibilizované (naivní) B lymfocyty, které exprimují IgD a IgM jako membránové antigenní receptory, vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální selekci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními, a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů.

Kontakt nezralých B buněk, které exprimují výlučně IgM, s autoantigenem v kostní dřeni má za následek klonální deleci nebo anergii v závislosti na valenci antigenů. Anergní B buňky, ačkoliv exprimují povrchový IgD, jsou neschopné odpovídat tímto receptorem na antigen; bez přístupu do primárních folikulů a v nepřítomnosti pomocných T buněk tyto buňky mají poločas života krátký pouze několik dnů.

-5CZ 294425 B6

Na rozdíl od toho zralé naivní B lymfocyty, které se nesetkaly s autoantigenem a mají tudíž přístup do primárních folikulů, mají poločas života dlouhý několik týdnů. Navzdory popsaným mechanizmům, zprostředkovávajícím autotoleranci, si tyto populace dlouho žijících zralých naivních B lymfocytů stále udržují potenciálně autoreaktivní B buňky, je ale nepravděpodobné, že naleznou specifickou pomoc T buněk díky T buněčné toleranci, a tak je zadržena jejich proliferace a sekrece protilátek. Ukazuje se, že neodpovídavost B buněk na mnoho autoantigenů, které se vyskytují v nízkých hladinách, je tohoto typu, ovlivňující pomocné T buňky, ale ne B buňky. V předkládaném vynálezu jsou tyto dlouho žijící neodpovídavé potenciálně autoreaktivní zralé naivní B lymfocyty identifikovány jako nej slibnější repertoár přirozeně se vyskytujících lidských protilátek pro konstrukci kombinačních protilátkových knihoven, vhodných zejména pro výběr lidských protilátek k lidským antigenům, například metodou fágové expozice.

Lze očekávat, že tento vysoce selektovaný repertoár protilátek, použitý jako základ pro předkládaný vynález, pocházející hlavně z B buněk s dlouhým poločasem života in vivo, které jsou tudíž vystaveny lidskému imunitnímu systému po delší dobu, je významně ochuzen o protilátkové molekuly tvořící epitopy, zejména ve vysoce variabilních oblastech CDR3, které jsou imunogenní pro lidský imunitní systém. Proto se očekává, že lidské protilátky, vybrané z tohoto repertoáru protilátek, mají u člověka nižší imunogenní profil, než lidské protilátky, vybírané z semisyntetických nebo plně syntetických knihoven lidských protilátek.

Zralé naivní (nesenzibilizované) B buňky, které jsou aktivovány kontaktem s cizorodým antigenem, zastaví exprese IgD a počnou klonální proliferací a diferenciaci na plazmatické buňky secernující rozpustný imunoglobulin, časným stadiím protilátkové reakce dominují protilátky IgM, zatímco později jsou převládající izotypy IgG a IgA, přičemž IgE přispívá malou, ale biologicky důležitou částí protilátkové reakce. Na rozdíl od IgD-negativních zralých, antigenem aktivovaných B lymfocytů, exprimujících IgM, IgG, IgA nebo IgE, IgD-pozitivní zralé naivní B buňky dosud nepodstoupily klonální proliferací, takže kombinační IgD knihovny nezachycují nadměrně protilátkové specifíty, které jsou v současné době nebo byly dříve zapojeny do imunitních reakcí obvykle řízených cizorodým antigenem, tudíž se snižuje diverzita repertoáru a plýtvá se místem v knihovně pro protilátkové kandidáty, u nichž je nepravděpodobná vazba autoantigenu. To je ve zřetelném kontrastu se stavem techniky, který doporučuje použití lidské IgM kombinační protilátkové knihovny pro in vitro selekci lidských protilátek proti lidským antigenům z repertoárů přirozeně se vyskytujících lidských protilátek (Hoogenboom, 1997, výše).

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedený antigenní receptor imunoglobulin nebo jeho fragment.

Fragment imunoglobulinu může být každý fragment, který je v oboru znám, jako jsou fragmenty Fab nebo F(ab)₂.

V obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený fragment imunoglobulinu fragment Fv.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu pocházejí alespoň uvedený VH a volitelně uvedený VL imunoglobulinový řetězec z repertoáru lidského IgD.

Byl učiněn závěr, že tento receptor a výhodně repertoár protilátek, vybraných pro nízkou imunogeničnost, jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních

B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální delecí, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a pak žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě repertoáru protilátek

-6CZ 294425 B6 zralých naivních B lymfocytů, lidské IgD knihovny pouze dále představují ty krátce žijící B buňky, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, aleje nepravděpodobně, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky, připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený in vitro detekční systém technika fágové expozice.

Systém fágové expozice byl v minulosti obyčejně použit pro selekci celé řady peptidů a proteinů, které se vážou na specifické cíle. Na základě této znalosti mohou být imunoglobulinové řetězce VH a VL pohodlně klonovány do vektorů, které také obsahují molekuly, použitelné pro systémy fágové expozice. Takové molekuly a vektory jsou v oboru dobře známy (Winter, výše, Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2, 119-124, 1991) a není třeba je zde detailněji vysvětlovat.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedená kombinace přestavěných řetězců exprimována v jedné nebo více různých knihovnách.

Toto provedení je zejména výhodné, je-li známo, že řetězec VH nebo VL se váže na specifický cíl a vybere se odpovídající druhý řetězec V, který vytváří nebo zlepšuje vazbu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený lidský antigen je nádorový antigen.

Jestliže lidský antigen je nádorový antigen, je uvedený antigen výhodně exprimován na povrchu uvedeného nádoru. V tomto případě jsou řetězce VH a VL výhodně spojeny s toxinem. Vazba může být provedena na úrovni nukleové kyseliny metodami genetického inženýrství nebo na proteinové úrovni pomocí například chemické vazby/kondenzace.

Je zejména výhodné, když uvedený nádorový antigen je antigen 17-1 A.

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu uvedený řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí, ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), a/nebo uvedený řetězec VL obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí, ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Receptory s těmito specifickými oblastmi VH a VL, kde uvedená oblast VL může být spojena s oběmi oblastmi VH, jsou první lidské protilátky, které jsou specifické pro lidský antigen 17-1 A.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený krok selekce zahrnuje

I) vazbu expozičního prostředku (nosiče) exprimujícího antigenní receptor

a) na imobilizovaný cílový antigen nebo jeho fragmenty,

b) na volitelně značené buňky, exprimující cílový antigen nebo jeho fragmenty, nebo

c) na rozpustný, výhodně značený cílový antigen nebo jeho fragmenty,

II) odmytí nespecificky navázaného expozičního prostředku (a a b) a následnou eluci specificky vázaného expozičního prostředku nespecifickými (např. pufr s nízkým pH) nebo specifickými prostředky (např. specifická protilátka k cílovému antigenu), nebo

III) pozitivní obohacení expozičního prostředku, navázaného na cílový antigen (b a c) z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenze buněk, exprimujících cílový antigen pomocí

-7 CZ 294425 B6 například magnetických perliček, vázajících značený cílový antigen, nebo značených buněk, exprimujících cílový antigen, takto izolované expoziční prostředky santigenními receptory mohou být dle volby dále množeny replikací a podrobeny dalším kolům in vitro selekce, jak se popisuje.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu se před uvedeným selekčním krokem vybírá buď řetězec VH nebo VL pro vazbu uvedeného antigenu, spolu s náhradním řetězcem V.

Tento dvoustupňový postup může použít templátovou protilátku, specifickou pro cílový antigen, 10 z různých druhů, například myší monoklonální protilátku proti lidskému cílovému antigenu.

Nejdříve se repertoár lidských VH nebo VL spojí s jedním náhradním řetězcem VH nebo VL z myší templátové protilátky, která je exponována prostřednictvím např. vláknitého fága a vybrána in vitro vazbou antigenu. Celý rozsah knihovny je tedy přístupný výlučně repertoáru lidských VL nebo VH a mohou být izolovány kandidátní protilátky lidských řetězců VL nebo 15 VH, které jsou schopné přispět ke specifické vazbě lidského cílového antigenu. Ve druhém kroku se náhradní variabilní oblast templátové protilátky zamění odpovídající variabilní oblastí z lidského repertoáru, a pak následuje druhé kolo in vitro selekce; celý rozsah knihovny je opět výlučně přístupný jednomu repertoáru oblastí VH nebo VL, a tak dvoustupňový postup umožňuje v podmínkách omezené velikosti knihovny screening mnohem více kandidátů oblasti VL a VH 20 pro vazbu antigenu než jednostupňový.

Tento dvoustupňový selekční postup pro screening lidských IgD kombinačních protilátkových knihoven metodou fágové expozice byl výhodně použit pro klonování sekvencí DNA, kódujících variabilní oblastí lidských protilátek, které se specificky vážou na lidský antigen 17-1 A. Nejdříve 25 byl spojen Fd segment těžkého řetězce (VH+CH1) myší monoklonální protilátky (Gottlinger, Int.

J. Cancer, 38, 47-53, 1986), který se specificky váže na lidský antigen 17-1A, s repertoárem lidských lehkých řetězců kappa a lambda. Výsledné knihovny byly exponovány prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika koly „rýžování“ (specifického vychytávání) na imobilizovaném rekombinantním lidském antigenu 17-1A. Rozpustné Fab fragmenty byly 30 exprimovány několika klony po každém kole „rýžování“ a testovaly se pomocí ELISA na vazbu antigenu. Ukázalo se, že každá silná vazebná skupina, obohacená během „rýžovací“ procedury, obsahuje tentýž lidský lehký řetězec kappa, což bylo potvrzeno sekvenční analýzou. Tento lidský lehký řetězec, nadále nazýván K8, byl pak spojen s knihovnou lidského těžkého řetězce IgD, která byla opět exponována prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika 35 koly „rýžování“ na imobilizovaném rekombinantním lidském antigenu 17-1A. Několik Fab fragmentů bylo exprimováno několika klony po každém kole „rýžování“ a opět se testovaly pomocí ELISA na vazbu antigenu. Sekvenční analýza vazebných skupin, obohacených během „rýžovací“ procedury, odhalila dvě různé variabilní oblasti těžkého řetězce, nazvané D4.5 a D7.2, každá z nich se spojuje s lehkým řetězcem K8 za vzniku odlišných lidských antigenních vazeb40 ných míst se specifitou pro lidský antigen 17-1 A. Repertoáry lidských lehkých a těžkých řetězců se klonovaly z několika preparátů celkové RNA, izolované ze vzorků lidské krve a kostní dřeně několika dárců s použitím reakce RT-PCR (reverzní transkriptáza + polymerázová řetězová reakce), specifické pro lehké řetězce kappa nebo lambda, jakož i těžké řetězce IgD. Protože je nemožné selektivně amplifikovat repertoár lehkých řetězců, které jsou spojeny s IgD těžkými 45 řetězci in vivo, pokud nejsou pro preparát RNA purifikovány IgD pozitivní B buňky, použité knihovny lehkých řetězců nejsou omezeny na repertoár protilátek zralých naivních nebo anergních B lymfocytů. Ale díky převaze těžkého řetězce v rozpoznávání antigenu tento fakt nijak neubírá výhody IgD repertoáru pro selekci lidských protilátek k autoantigenům. Kromě toho, a to je nejdůležitější, díky vystavení lidskému imunitnímu systému selekce těchto lehkých 50 řetězců stále zaručuje nízký imunogenní profil u člověka.

V dalším zvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený náhradní řetězec myší VH nebo VL řetězec.

-8CZ 294425 B6

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu uvedená selekce vhodných kombinací zahrnuje

a) testování jednoho a téhož VH řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VL řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenu, nebo

b) testování jednoho a téhož VL řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VH řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenu.

Toto provedení se opět výhodně použije, jestliže je známo, že buď VL nebo VH řetězec specificky interaguje s lidskou cílovou molekulou. Poté může být příslušný druhý řetězec vybrán na základě výhodně zlepšené vazby na cílovou molekulu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje uvedený způsob kroky získávání lidských řetězců VH a VL nebo odpovídajících nukleových kyselin po selekci a fúzování uvedených řetězců ke stejným nebo jiným řetězcům VH nebo VL, k imunoglobulinovým konstantním oblastem těžkých (CH) nebo lehkých (CL) řetězců nebo jejich částem, nebo k dalším biologicky aktivním molekulám, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, malé organické sloučeniny, hormony, neurotransmitery, peptidomimetika, PNA (Milner, Nátuře Medicine, 1, 879-880, 1995, Hupp, Cell, 83, 237-345, 1995, Gibbs a Oliff, Cell, 79, 193-198, 1994). Další funkční molekula může být spojena buď fyzikálně, např. chemickými prostředky k řetězcům VH a VL, nebo může být fúzována technikami rekombinantní DNA v oboru známými.

Toto provedení vynálezu je použitelné obzvláště pro vývoj specifických léků, které mohou být použity pro cílení požadovaných antigenů v lidském těle. Například, jestliže jsou zacíleny nádorové antigeny, mohou být VH a VL řetězce na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyselin fúzovány se skupinou toxinu, výsledkem je imunotoxin; s extracelulámí částí buněčného receptorů nebo rozpustného cytokinu či jejich částí, výsledkem jsou konstrukty zesilující imunitní reakci proti nádorům; nebo s protilátkovým Fv fragmentem, výsledkem je protilátkový derivát s dvojí specifitou.

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu pocházejí uvedené konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3.

Konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3 se používají zejména tehdy, mají-li být buňky, exprimující cílový antigen v lidském těle, zničeny. V oboru je známo, že tyto podtřídy IgG účinně zprostředkovávají buněčnou cytotoxicitu, závislou na protilátkách (ADCC) a přispívají ke zničení buněk, rozpoznaných a navázaných těmito podtřídami protilátek.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu jsou uvedené VH a/nebo VL řetězce spojeny s neproteinovým přípravkem (léčivem) s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou radioizotopy nebo látky používané pro chemoterapii, výsledkem je specifičtější in vivo cílení uvedených přípravků.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu jsou uvedené VH nebo VL řetězce exprimovány ze sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem amplifikace metodou RTPCR mRNA, pocházejících ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní.

Je výhodné amplifikovat VH nebo VL řetězec pomocí RT-PCR, jakmile byl jednou identifikován a izolován vhodný zdroj. Pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR se dává přednost použití mRNA z jaderných buněk lidské kostní dřeně nebo výhodněji z lidské krve, protože tyto dva tkáňové kompartmenty jsou nej snadněji přístupné zdroje B buněk u lidí. Dále se preferuje oddělit před izolací RNA anergní B buňky nebo výhodněji zralé naivní B lymfocyty od jaderných buněk uvedených tkáňových kompartmentů použitím např. magnetických perliček

-9CZ 294425 B6 nebo třídění buněk založené na průtokové cytometrii. Tento postup zaručuje, že oba VH a VL řetězce, amplifíkované pomocí RT-PCR, pocházejí z favorizované populace B buněk. Alternativně, je-li pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR použita mRNA z celé frakce jaderných buněk z uvedených tkáňových kompartmentů, je výhodné amplifíkovat VH oblast jako polovinu Fd segmentu těžkého řetězce (VH-CH1) lidského IgD s použitím 3'-koncového PCR primerů specifického pro IgD, např. ukázaného v tabulce 1, se kterým vzniknou výlučně PCR produkty z lidského IgD těžkého řetězce, exprimovaného pouze v zralých naivních B lymfocytech a v anergních lidských B buňkách.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu obsahuje anti-lidský antigenní receptor, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kombinaci funkčně přestavěných VH a VL řetězců výhodně ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, a které je možno získat způsobem podle vynálezu popsaného výše.

Výhody protilátky podle vynálezu zde byly nastíněny výše. Je třeba zdůraznit, že odpovídající protilátky namířené proti lidským antigenům a pocházející z lidských zdrojů, které jsou pro člověka slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní, nebyly doposud v oboru izolovány. Proto jsou protilátky podle vynálezu výchozí bod pro zcela nový vývoj protilátek, které mohou být použity v různých odvětvích medicíny a farmacie.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor protilátka nebo její fragment.

V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor specifický pro lidský nádorový antigen, nejvýhodněji pro lidský antigen 17-1 A.

Vynález se dále týká receptoru, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze sekvencí, ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí, ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Navíc se vynález týká VH řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru podle vynálezu.

Vynález se také týká VL řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru vynálezu.

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedená část VH řetězce doména CDR3.

Dále se vynález týká soupravy, obsahující funkčně přestavěné VH a VL řetězce imunoglobulinu, kde alespoň jeden z VH a VL řetězců pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, uvedené řetězce jsou schopné exprese rekombinantními vektory in vitro detekčního (expozičního) systému.

Souprava podle vynálezu je výhodně použita pro provádění způsobu podle vynálezu a tedy k získání receptorů požadované specifičnosti.

V uvedené soupravě je in vitro detekční systém výhodně systém fágové expozice („phage display“).

Vynález se dále týká protilátky, vyznačující se tím, že pochází z lidských sekvencí a je specifická pro lidský antigen 17-1 A.

Způsobem podle vynálezu byla poprvé vyvinuta lidská protilátka, která je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Jak bylo zdůrazněno dříve, tento vývoj nebyl zanedbatelný problém, protože lidské protilátky proti lidským nádorovým antigenům jsou obvykle podrobeny mechanizmům,

-10CZ 294425 B6 zprostředkovávajícím autotoleranci imunitního systému, což má za následek eliminaci B lymfocytů, exprimujících autoreaktivní protilátky in vivo. Ze známých nádorových antigenů je antigen

17-1A mnohem Siřeji exprimovaný na značné části normálních epitelových tkání než jiné nádorové antigeny, kromě své exprese na epitelových nádorech.

Antigen 17-1A se proto v současné době považuje spíše za představitele panepitelového antigenu než za nádorový antigen, za který byl pokládán v době svého prvního popisu. Pro srovnání, další takzvané nádorové antigeny, nalezené na epitelových nádorech, jako erb-B2 (Her2/neu), Muc-1 (PEM) nebo Thompson-Friedreichův antigen obvykle vykazují na normálních epitelových tkáních mnohem omezenější vzorec exprese. Tudíž se očekává, že selektivní tlak autotolerance proti B lymfocytům, exprimujícím 17-1A reaktivní protilátky třebas jen s malou afinitou, je mimořádně silný, protože se zdá téměř nemožné, aby se tyto B buňky vyhnuly po delší časové období setkání s antigenem 17-1A, díky všudypřítomností tohoto antigenu. Bylo překvapivě zjištěno, že z repertoáru protilátek lidských B buněk, jako jsou např. zralé naivní B lymfocyty, mohou být izolovány 17-1A specifické protilátky nebo alespoň odpovídající těžké řetězce. Je známo, že tyto B buňky mají dlouhý poločas života in vivo a už se jim podařilo vyhnout se před svou maturací depleci navzdory přítomnosti antigenu 17-1A dokonce i v místě maturace; anergie B buněk v případě antigenu 17-1A nenastává, protože tento typ B buněčné tolerance je vyvoláván pouze rozpustným autoantigenem. Pouze dlouho žijící B buňky, kterým se podařilo přežít navzdory své potenciální 17-1A reaktivitě, představují repertoár variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, u něhož je pravděpodobné, že bude lidským imunitním systémem dobře tolerován při použití pro konstrukci lidských protilátek a protilátkových derivátů určených k tomu, aby byly opakovaně systémově podávány lidem, protože již byly buněčným dohledem imunitního systému prověřeny a pak byly z imunogenních sekvencí vyloučeny. Předkládaný vynález se tudíž také týká lidských protilátek, specifických pro antigen 17-1A a vhodných pro opakovanou aplikaci in vivo nehledě na způsob, kterým jsou získány, protože se s velkou pravděpodobností očekává, že lidské protilátkové sekvence s uvedenou vysokou kompatibilitou in vivo budou nalezeny, například způsobem podle vynálezu, také v repertoáru B buněk zdravých lidí. Ve shodě s tím byla nyní poprvé vyvinuta lidská protilátka, která může být výhodně použita pro sledování a/nebo zničení nádorových buněk, nesoucích antigen 17-1 A.

Protilátka vynálezu je tudíž výhodně slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka. Ve výhodném provedení lze uvedenou protilátku získat způsobem, jak je popsán výše. V dalším výhodném provedení protilátka vynálezu rozpoznává epitop extracelulární domény antigenu 17-IA, který výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidů č. 8, 11, 13, 14, 59, 60 a 79. VH řetězec protilátky vynálezu výhodně zahrnuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí, ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), a/nebo VL řetězec obsahuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí, ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Zejména výhodná je protilátka, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí, ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu z následujících dvou sekvencí, ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Byl učiněn závěr, že tento receptor, a výhodně repertoár protilátek, vybraných pro nízkou imunogeničnost, jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální deleci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě zralých naivních B lymfocytů lidské IgD knihovny pouze představují repertoár protilátek krátce žijících B buněk, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, ale je nepravděpodobné, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky,

- 11 CZ 294425 B6 připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.

Kromě toho se předkládaný vynález týká farmaceutického přípravku, obsahujícího alespoň jeden zvýše uvedených receptorů podle vynálezu nebo jejich části, buď samotné nebo v kombinaci, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou v oboru známy a zahrnují fyziologické roztoky pufrované fosforečnany, vodu, emulze, jako jsou emulze olej/voda, různé typy smáčedel, sterilní roztoky apod. Přípravky obsahující tyto nosiče mohou být formulovány obvyklými známými způsoby. Tyto farmaceutické přípravky mohou být pacientovi podávány ve vhodné dávce. Podávání vhodných přípravků se může provádět různými způsoby, např. intravenózním, intraperitoneálním, subkutánním, intramuskulárním, lokálním nebo intradermálním podáváním.

Vynález se tedy také týká použití receptorů, nebo jeho části, připraveného způsobem podle vynálezu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu, prevenci a/nebo oddálení nádoru u pacienta, výhodně když je nádor epitelového původu.

Přehled obrázků

Obrázek 1: Klonovací místo pComb3H s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH1, konstantní doména těžkého řetězce, LI/2, prokaryotické vedoucí sekvence. Doména označená jako gen III v pComb3H kóduje neinfekční část produktu genu III vláknitých fágů, jako např. VCSM13.

Obrázek 2: Schéma plazmidu pComb3H a plně exprimovaného fágu M13. Na pComb3H je ukázána organizace vedoucí sekvence (L)ompA, lehkého řetězce, vedoucí sekvence (L)pelB, těžkého řetězce a genu III. Plně exprimovaný fág Ml3 exponuje na svém povrchu fonotyp určitého proti látkového Fab fragmentu, skládajícího se z lehkého řetězce a Fd segmentu (VH+CH1) těžkého řetězce, spojeného s neinfekční částí produktu genu III a obsahuje odpovídající genotyp jako jednovláknovou DNA kódující těžký a lehký řetězec vystaveného Fab fragmentu. Infekční protein genu III je poskytnut pomocným fágem VCSM13.

Obrázek 3: ELIS A rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment chimérického M79 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla polyklonální proti-lidskou imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“, druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.5-9 mají kombinaci chimérického M79 Fd segmentu s jedním náhodným řetězcem kappa a představují negativní kontroly.

Obrázek 4: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje k8 lehký řetězec a jeden Fd segment lidského Ig delta řetězce. ELISA destičky se inkubovaly přes nos s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS - 2,2 azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osay). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“, druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.2-6 mají kombinaci k8 lehkého řetězce s jedním náhodným Ed segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.

- 12CZ 294425 B6

Obrázek 5: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment D4.5 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osay). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“, druhé číslo je číslo klonu, S. je zkratka pro klony před prvním kolem selekce. Klony S.l-3 mají kombinaci k8 lehkého řetězce s jedním náhodným Fd segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.

Obrázek 6: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského lehkého řetězce kappa 8. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.

Obrázek 7: DNA sekvence variabilní oblasti lidského D4.5 těžkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 351. Hranice mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH1 konstantní oblasti Ig delta je lokalizována mezi nt 382 a nt 383 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 384.

Obrázek 8: DNA sekvence variabilní oblastí lidského D7.2 těžkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 309. Hranice mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH1 konstantní oblasti Ig delta je lokalizována mezi nt 340 a nt 341 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 343.

Obrázek 9: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského kappa 5.1 lehkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.

Obrázek 10: Analýza průtokovou cytometrií proti látkových Fab fragmentů a kontrolních protilátek M79 na 17-1A pozitivních buňkách Kato pro testování vazebné aktivity periplazmatického preparátu, obsahujícího fragment k8-D4.5-Fab. Buňky Kato se inkubovaly I) s irelevantním periplazmatickým preparátem, II) s 10 pg/ml chimérického (bivalentního !) M79, III) speriplazmatickým preparátem k8-D4.5 a IV) s periplazmatickým preparátem k8-D4.5 naředěným v poměru 1:10. Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

Obrázek 11: Analýza průtokovou cytometrií protilátkových Fab fragmentů a kompletních protilátek na 17-1A pozitivních buňkách Kato, buňkách CHO transfekovaných a netransfekovaných 17-1 A, v uvedeném pořadí, pro testování vazebné aktivity periplazmatických preparátů (pp) obsahujících k8-D4.5-, k5.1-D4.5- nebo irelevantní k-D4.5-Fab fragmenty. Buňky Kato se inkubovaly I) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára) nebo II) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). Buňky CHO transfekované 17-1A se inkubovaly III) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára), IV) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k8-D4.5-pp (plná čára) nebo V) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). V bodech III), IV) a V) se inkubace a detekce relevantních pp (k5.1-D4.5-Fab-pp a k8-D4.5-Fab-pp, v uvedeném pořadí) a myší protilátky M79 prováděla také na netransfekovaných buňkách CHO (tečkované čáry). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

-13 CZ 294425 B6

Obrázek 12: Klonovací místo pEF-ADA s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.

Obrázek 13: Klonovací místo pEF-DHFR s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH 1/2/3, konstantní doména těžkého řetězce 1/2/3, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.

Obrázek 14: SDS-PAGE preparátů lidské protilátky H79. Na 12,5% polyakrylamidovém gelu v redukujícím a neredukujících podmínkách se pouštělo přibližně 10 pg každé protilátky a obarvilo se Coomassie modří.

Dráha 1: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu).

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční).

Dráha 3: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkách.

Dráha 4: varianta H79 lidského IgGl (neredukční),

Dráha 5: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkách.

Obrázek 15: SDS-PAGE preparátů lidských protilátek H79 a HD70. Na 12,5% denaturujícím polyakrylamidovém gelu v neredukčních (gel 1) a redukujících (gel 2) podmínkách se pouštělo 10 pg H79 a 3,5 pg HD70 a obarvily se Coomassie modří.

Gel 1:

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční).

Dráha 3: varianta HD70 lidského IgGl (neredukční).

Gel 2:

Dráha 4: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu).

Dráha 5: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkách.

Dráha 6: varianta HD70 lidského IgGl v redukčních podmínkách.

Obrázek 16: Analýza průtokovou cytometrií buněk Kato pozitivních na 17-1A pro testování vazebné aktivity purifíkovaného H79 lidského IgGl, jakož i purifikovaného H79 myšího IgGl. Buňky Kato se inkubovaly slgG izotypovými kontrolami (10 pg/ml lidského IgGl a myšího IgGl), pozitivní kontrolami (M79 a chimerizovaná M74 v 10 pg/ml, obě 17-1A specifické) a s H79 lidským IgGl nebo H79 myším IgGl (každý 10 pg/ml a 1 pg/ml). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

Obrázek 17: Analýza průtokovou cytometrií protilátek (každá v koncentraci 20 pg/ml) na buňkách Kato pozitivních na 17-1 A, na buňkách CHO transfekovaných a netransfekovaných s 17-1 A, pro testovaní vazebné aktivity puntíkovaných protilátek H79 lidského IgGl, H79 myšího IgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex a izotypových kontrol (lidský IgGl, myší IgGl a 2a). I) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, II) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, III) HD70 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, IV) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, V) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, VI) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, VII) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1A, VIII) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, IX) HD70 (plná

- 14CZ 294425 B6 čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17—1 A, X) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1A, XI) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, XII) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A. Obrázky VIIXII také ukazují výsledky inkubace a detekce relevantních protilátek na netransfekovaných buňkách CHO (tečkovaná čára).

Obrázek 18: Test buněčné toxicity závislé na protilátce značené ⁵¹Cr. Pro měření uvolňování ⁵¹Cr se inkubovaly nestimulované lidské mononukleámí buňky periferní krve (PBMC, 5 x 10⁵ buněk) jako efektorové buňky se značenými cílovými buňkami (buňky Kato značené 2 hodiny s ⁵¹Cr) a protilátkami v různých koncentracích 4 nebo 20 hodin při 37 °C. Jako negativní kontroly (H79=H79hulgGl) byly použity odpovídající nevázající izotypy (h-IgG = lidský IgGl, mIgG2a = myší IgG2a). Specifická lýze se vypočítala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) (cpm, spontánní, uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm - counts per minuté = impulzy za minutu).

Obrázek 19: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené M79 (pozitivní kontrola). Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 20: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 21: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku, značeného M79 (pozitivní kontrola). Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 22: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku, značeného H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly smyší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 23: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku, značené myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší IgG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 24: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku, značené izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

-15 CZ 294425 B6

Obrázek 25: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku, značeného myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně z karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou speroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 26: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku, značeného izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 27: Analýza epitopů myší protilátky M79 a lidských protilátek H79 a HD70, každá z nich je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Protilátky se inkubovaly s mřížkou uspořádaných peptidů, obsahující 119 polypeptidů ze 13 aminokyselin, vždy posunutých o dvě aminokyseliny a pokrývajících celou extracelulámí aminokyselinovou sekvenci lidského antigenu 17-1A. Peptidy byly kovalentně připojeny svými C-koncovými částmi na membránu Pep Spots (Jerini Biotools, Berlin) jako jednotlivé body. Navázaná myší M79 protilátka byla přímo detekována na membráně Pep Spots anti-myší imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP), po které následovala detekce chemiluminiscencí. Signály, které jsou způsobeny díky reaktivitě sekundární protilátky samotné s jednotlivými peptidovými body, jsou ukázány na odpovídajícím kontrolním značení membrány Pep Spots. Po subtrakci základního pozadí se ukázalo, že značení vpeptidovém bodě 87, peptidových bodech 38 a 95 představuje specifickou vazbu myší protilátky M79. Kvůli vysokému stupni zkřížené reaktivity sekundární anti-lidské imunoglobulinové protilátky konjugované s HRP s několika peptidovými body, byly navázané lidské protilátky H79 a HD70 přeneseny z membrány Pep Spots na blotovací membránu pomocí elektropřenosu a následně detekovány uvedenou anti-lidskou sekundární protilátkou a chemiluminiscencí. Specifická vazba lidské protilátky H79 byla detekována hlavně v peptidových bodech 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79, kde v případě lidské protilátky HD70 nebyla detekována žádná vazba.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce kombinačních protilátkových knihoven a fágová expozice

Knihovna DNA fragmentů Fd lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (Ig) a Ig těžkého řetězce byla konstruována pomocí metody RT-PCR, se sadami primerů specifických pro řetězce kappa, lambda a Fd delta, z celkové RNA izolované z lymfocytů periferní krve (PBL) a vzorků kostní dřeně ze čtyř a deseti lidských dárců, podle Chomczynského (Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987). Podle standardních metod byla syntetizována cDNA (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 2. vydání).

Byly vybrány následující sady primerů, které dávají vzniknout rozpoznávacím místům pro 5'-XhoI a 3'- Spěl na fragmentech těžkého řetězce a rozpoznávacím místům pro 5'- Sací a 3'- Xbal pro lehké řetězce:

Pro amplifikaci metodou PCR cDNA fragmentů Fd delta se pět různých specifických primerů pro

5'-VH-rodinu kombinovalo sjedním primerem pro 3-CH1 delta, pro amplifikaci PCR

-16CZ 294425 B6 fragmentů kappa (K) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VK-rodinu kombinovalo s jedním primerem 3'-CK a pro amplifikaci fragmentů lambda (L) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VL-rodinu kombinovalo s jedním primerem 3'-CL.

Sady primerů pro amplifikaci DNA fragmentů Fab (5' až 3') jsou uvedeny v tabulce 1.

Pro amplifikaci byl použit následující program PCR:

Denaturace v 94 °C 15 s, nasedání primerů v 52 °C 50 s a prodloužení v 72 °C 90 s, 40 cyklů, po kterých následovalo konečné prodloužení v 72 °C 10 minut.

Tabulka 1: Sady primerů

Fd fragment těžkého řetězce:

5’ primer:

VH 1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG

VH2: CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGG

VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG

V H4B: CAGGTGCAG CTACTCGAGTGGGG

VH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG

3’ primer:

CD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT

Fragment řetězce kappa:

5’ primer:

VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC

VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC

VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC

VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC

VK6: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC

3' primer:

CK1D:GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG

GGCGAACTCAG

- 17CZ 294425 B6

Fragment řetězce lambda:

5' primer:

VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC

VL2: TCTG CCGAGCTCCAG CCTGCCTCCGTG

VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG

VL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGC.CC

VL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC

VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC

3’ primer:

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG

450 ng fragmentů lehkého řetězce kappa (štěpených se Sací a Xbal) se ligovalo se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment) odvozeného zpComb (Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 7978-7982, 1991), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena fragmentem Fd chimerizované myší protilátky M79 (obsahující CH1 lidského IgGl) namířenému proti extracelulámí části proteinu 17-1A (viz obr. 1 pro klonovací místa pComb3H).

Výsledná kombinační protilátková DNA knihovna pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV, kyveta s roztečí elektrod 0,2 cm, 25 FD, 200 Ohm, na přístroji Biorad Gene-Pulser), čímž vznikla knihovna o velikosti 4x 10⁷ nezávislých klonů. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin, kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů M13, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA, kódující jeden lidský lehký řetězce a Fd segment chimérického M79 a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translační fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága (technika fágové expozice, „phage display“), viz obr. 2.

Tato fágová knihovna, nesoucí klonovaný Fab repertoár, se sklidila z tkáňového supernatantu pomocí precipitace s PEG8000/NaCl a stočením, resuspendovala se v TBS/1% BSA a inkubovala se s rekombinantním S17-1A, imobilizovaným na 96 jamkových destičkách pro test ELISA. S17-1A byl připraven, jak je popsáno (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995). Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky s TBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2 a po neutralizaci eluátu s 2 M Tris, pH 12, se použily k infekci kultury nových neinfikovaných E. coli XL1 Blue. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen byla izolována plazmidová DNA, obsahující vybraný Fab repertoár.

-18CZ 294425 B6

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v lOml kulturách LB-Carb/20 mM MgCI₂ a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním izopropyl-P-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Tato in vitro selekce, jakož i exprese rozpustných fragmentů Fab, se prováděla podle Burtona (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10134-10137, 1991). Buňky se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly čtyřmi koly zmražení (etanol/suchý led) a rozmražení (37 °C) a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů, vázajících se k S17-1A. Vazebnou aktivitu vykázalo 23 klonů z 27. Po sekvencování se ukázalo, že dva klony s nejsilnějším signálem (viz obr. 3) mají totožné řetězce kappa a byly nazvány k8, viz obr. 6.

Tento lidský lehký řetězec kappa k8 byl nyní použit jako vazebný partner pro skupinu těžkého řetězce lidského Ig delta, 2250 ng DNA Fd fragmentů lidského těžkého řetězce delta (štěpených s Xhol a Spěl) se ligovalo se 7000 ng fagemidového vektoru pComb3H (štěpeného s Xhol a Spěl, velký DNA fragment) obsahujícího DNA fragment k8 v pozici lehkého řetězce.

Výběr repertoáru lidského řetězce delta jako zdroje pro variabilní oblasti těžkého řetězce, které se specificky vážou na antigen 17-1A, jsou-li spojeny s lehkým řetězcem k8, se jevilo jako nejvhodnější. Řetězce delta jsou produkovány pouze ve zralých naivních a pro autoantigen specifických anergních B buňkách, které ještě nepodstoupily proliferaci nebo proliferovat nebudou, proto je diverzita jejich repertoáru těžkých řetězců vyšší a výskyt jedné každé specifity ve srovnání s repertoárem těžkých řetězců jiných imunoglobulinových izotypů je nižší.

Transformace knihovny Fd fragmentů pComb-k8-delta do celkem 1500 μΐ E. coli XL1 Blue pěti stejnými elektroporacemi (2,5 kV, 0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm) vedla ke konečnému počtu 1,1 x 10⁹ nezávislých klonů.

In vitro selekce této kombinační protilátkové knihovny se prováděla, jak je popsáno výše pro repertoár lidských lehkých řetězců. Po čtyřech kolech „rýžování“ byly z osmi klonů připraveny rozpustné Fab fragmenty.

Periplazmatické preparáty se testovaly ELISA. Jeden z klonů vykázal silnou vazbu silnou vazbu antigenu (viz obr. 4). Tento klon byl nazván D4.5 a DNA Fd delta fragmentu se sekvencovala s reverzník primerem specifickým pro delta CH1 (viz obr. 7).

Další Fab fragment, vázající S17-1A, se izoloval po dalších kolech „rýžování“, poprvé se objevil v sedmém kole s výrazně slabším signálem v testu ELISA ve srovnání s D4.5 (viz obr. 4). Klon byl označen D7.2 a opět se určila sekvence DNA s použitím primeru specifického pro delta (viz obr. 8).

Aby se identifikovaly další partneři lehkých řetězců, kteří se spojují s Fd segmentem těžkého řetězce delta za vzniku Fab fragmentu specifického pro 17-1A, prováděl se pokus s přestavbou („reshuffling“):

450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce kappa a 450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce lambda (oba štěpené se Sací a Xbal) se zvlášť ligovaly se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena D4.5 Fd fragmentem.

Každá z výsledných kombinačních protilátkových knihoven (Kappa a lambda) pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV,

0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm, na přístroji Biorad gene-pulser), což mělo za následek knihovnu o velikosti 0,5 x 10⁷ nezávislých klonů pro knihovnu kappa a 1,4 x 10⁷ nezávislých

- 19CZ 294425 B6 klonů pro knihovnu lambda. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin, kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů Ml3, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA, kódující jeden lidský lehký řetězec a D4.5 Fd segment těžkého řetězce a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translační fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága.

Obě fágové knihovny, nesoucí klonované Fab repertoáry (kappa a lambda), se sklidily z tkáňového supernatantu pomocí precipitace s PEG88000/NaCl a stočením, resuspendovaly se vTBS/1% BSA a inkubovaly se s rekombinantním S17-1A, imobilizovaným na 96jamkových destičkách pro test ELISA. Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky s TBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, z obou knihoven (kappa a lambda), byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2, a po neutralizaci eluátu s 2M Tris, pH 12, se použily k infekci kultur nových neinfíkovaných E. coli XL1 Blue, jedna kultura pro knihovnu kappa a druhá pro knihovnu lambda. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen se izolovala plazmidová DNA, obsahující vybraný Fab repertoár z každého kola „rýžování“.

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v lOml kulturách LB-Carb/20 mM MgCl₂ a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním izopropyl-P-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Buňky se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly zmražením a rozmražením a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů, vázajících se k S17-1A.

Celkově se testovalo 45 klonů z knihovny kappa a 45 klonů z knihovny lambda, pocházejících hlavně z pátého kola „rýžování“, ale do menší míry také z jiných kol, na vazbu antigenu 17-1A. Pouze jeden klon označený k5.1 (knihovna kappa), který se objevil v 5. kole, vykazoval vazebnou aktivitu (viz obr. 5). Určila se sekvence DNA V-oblasti kappa k5.1 (viz obr. 9).

Příklad 2

Bakteriální exprese v E. coli XL1 Blue

Jak bylo již dříve uvedeno v příkladu 1, E. coli XLÍ Blue, transformované s pComb3H, obsahující jeden lehký řetězec a Fd segment jednoho těžkého řetězce, produkující po vynětí fragmentu genu III a indukci s IPTG rozpustnou Fab v dostatečném množství. Fd segment těžkého řetězce a lehký řetězec jsou přesunovány do periplazmy, kde se spojují a tvoří funkční Fab fragmenty.

Pro lepší periplazmatické preparáty se buňky pěstovaly v médiu SB, doplněném o 20 mM MgCl₂a po sklizení se resuspendovaly v BS. Čtyřmi koly zmrazování v -70 °C a rozmrazování v 37 °C se tepelným šokem porušila vnější membrána bakterií a rozpustné periplazmatické proteiny, obsahující Fab fragmenty, byly uvolněny do supernatantu. Po odstranění neporušených buněk a buněčného detritu stočením se odebraly supernatanty, obsahující protilátkové Fab fragmenty a použily se pro další práci.

-20CZ 294425 B6

Nejdříve se testovaly periplazmatické preparáty k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab na vazbu k mobilizovanému antigenů s 17-1 A, oba vykázaly silné ELISA signály (viz příklad 1).

Detekce k8-D4.5- a k5.1-D4.5-Fab fragmentů, navázaných k imobilizovanému antigenů s 17-1 A, se prováděla s použitím polyklonální biotinylované protilátky proti lidskému lehkému řetězci kappa (1 pg/ml PBS), detekované avidinem s konjugovanou křenovou peroxidázou (1 pg/ml PBS). Signál se vyvolal přidáním substrátového roztoku, obsahujícího 2,2' azino-bis(3ethylbenz-thiazolin-6-sulfonovou kyselinu) a peroxoboritan sodný a detekoval se ve vlnové délce 405 nm.

Test vazby dvou 17-1A pozitivních lidských Fab fragmentů (k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab) na buňky Kato (buněčná linie karcinomu žaludku, exprimující 17-1 A), buňky CHO transfekované 17-1A (CHO/17-1A) a netransfekované buňky CHO, se opět prováděl na periplazmatických preparátech. Transfekované buněčné linie CHO se tvořily subklonováním DNA fragmentu, kódujícího úplnou aminokyselinovou sekvenci antigenů 17-1A, známého také jako GA733-2 (Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990), do eukaryotického expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) podle standardních postupů (Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Springer Harbor, NY, 1989). Výsledný plazmid se linearizoval sNdel a transfekoval do DHFR deficitních CHO buněk pro trvalou expresi. Exprese transmembránového 17-1A se zvýšila postupnou genovou amplifíkací, vyvolanou posloupným přidáváním stoupajících koncentrací inhibitoru DHFR metotrexátu (MTX) do konečné koncentrace 500 nM, rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi byly 20 nM a 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566, 1990).

200 000 buněk (buněk Kato, CHO/17-1A nebo CHO) se inkubovalo s jedním z periplazmatických preparátů, obsahujících relevantní nebo irelevantní Fab, po které následovala biotinylovaná polyklonální anti-lidská protilátka lehkého řetězce kappa (20 pg/ml PBS) a streptavidin konjugovaný s FITC. Značené buňky se pak analyzovaly průtokovou cytometrií.

Periplazmatické preparáty, obsahující k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab, vykazovaly zřetelné signály ve srovnání s irelevantním periplazmatickým preparátem (negativní kontrola), ale netransfekované CHO buňky značeny nebyly, což dokazovalo specifičnost na antigen 17-1 A. Jako pozitivní kontrola pro buňky 17-1A pozitivní byla použita protilátka anti-17-ΙΑ M79 (Gottlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986) a myší IgG2a protilátka jako izotypová kontrola (viz obr. 10 a 11).

Příklad 3

Eukaryotická exprese v buňkách CHO

Bakterie obvykle nejsou schopné produkovat kompletní funkční imunoglobuliny, ačkoliv exprimují funkční Fab fragmenty.

Pro produkci kompletních funkčních protilátek se musí použít savčí buňky, a proto byly lehký řetězec k8 a variabilní doména těžkého řetězce D4.5 subklonovány do savčích expresních vektorů.

a) Lehké řetězce (k8 a k5.1):

Aby vznikla vhodná koncová restrikční místa, byly DNA fragmenty k8 a k5.1 znovu amplifíkovány pomocí PCR, čímž vznikly fragmenty kappa s místem Bsu361 na 5' konci, a také místa

Sáli a Notl na 3' konci.

-21 CZ 294425 B6

Tyto fragmenty (k8 a k5.1) byly subklonovány do plazmidu BSPOLL pomocí Bsu36I a Notl, pak se přidaly savčí vedoucí sekvence, a pak byly sekvencovány, aby se zabránilo mutacím vyvolaným PCR.

S použitím EcoRI a Sáli, k8 a k5.1 byly vyňaty z BSPOLL a subklonovány do eukaryotického expresního vektoru pEF-ADA (viz obr. 12), odvozeného z expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) nahrazením cDNA, kódující myší dihydrofolátreduktázu (DHFR), cDNA, kódující myší adenosindeaminázu (ADA).

Pro každý druh lehkého řetězce (k8 a k5.1) bylo 10⁷ buněk CHO transfekováno se 100 pg linearizované plazmidové DNA a pak pěstováno v podmínkách vybraných dle aktivity adenosindeaminázy (ADA), kódované expresním vektorem.

Přežívající ADA pozitivní buňky se pěstovaly pro další transfekci s těžkými řetězci, nesoucími variabilní doménu D4:5 nebo D7.2.

b) Variabilní doména 4.5 těžkého řetězce:

ZFd fragmentu D4.5 delta se opět amplifikovala variabilní oblast pomocí PCR za vzniku restrikčních míst Bsu36I na obou koncích.

Výsledný DNA fragment V-D4.5 byl pak subklonován s použitím stejných restrikčních míst do eukaryotického expresního vektoru pEF-DHFR, již obsahujícího eukaryotickou vedoucí sekvenci, jakož i DNA fragment, kódující konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl (viz obr. 13). Variabilní oblast D4.5 těžkého řetězce tak byla vložena mezi vedoucí sekvenci a konstantní oblast těžkého řetězce.

Variabilní oblast se sekvencovala a kompletní klon byl označen H79V-D4.5 hu IgGl.

Pro pozdější značení tkání byla konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl nahrazena konstantní oblastí těžkého řetězce myšího IgGl s použitím Xbal pro subklonování. Tento plazmid byl označen H79V-D4.5 MIgGI.

Každá z obou variant D4.5 těžkého řetězce, lidský a myší IgGl, byla transfekována do 10⁷ CHO buněk, které již exprimovaly lehký řetězec k8. Varianta lidského IgGl byla také transfekována do buněk CHO exprimujících lehký řetězec k5.1. Pro transfekci těžkého řetězce bylo použito 100 pg linearizované plazmidové DNA.

Variabilní oblast Fd fragmentu D7.2 těžkého řetězce byla také subklonována do pEF-DHFR za vzniku plazmidu, exprimujícího těžký řetězec lidského IgGl, jak je popsáno pro VD4.5. Tento expresní plazmid byl pak transfekován do buněk CHO, které již exprimovaly lehký řetězec k8, jak je popsáno výše pro H79V-D4.5 hu IgGl.

Transfekované buňky byly podrobeny selekci dle aktivity ADA a DHFR, jak bylo popsáno (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566, 1990).

Výsledné buněčné linie byly označeny H79-huIgGl (VD4.5huIgGl-k8), H79-MIgGl (VD4.5MIgGl-k8), D7.2 (VD7.2huIgGl-k8) a HD70 (VD4.5huIgGl-k5.1).

Supernatanty ze čtyř různých konfluentních 30ml tkáňových kultur starých tři dny, z nichž každá produkovala jednu ze čtyř anti-17-lA-protilátek (H79-huIgGl, H79-MIgGl, D7.2 a HD70), se testovaly pomocí ELISA na vazbu k imobilizovanému s 17-1 A. Kromě D7.2, která vykazovala v testu ELISA slabý signál, tři ostatní protilátky prokázaly silné signály, o nichž se usoudilo, že představují vazebnou afinitu v rozsahu myší protilátky M79.

-22CZ 294425 B6

Produkce protilátek ve velkém měřítku se prováděla v rotačních lahvích s použitím 500 ml média.

Protilátky H79-huIgGl, D7.2 a HD70 se purifíkovaly s použitím afínitní kolony proteinu A. Protilátka H79-MIgGl se purifíkovala pomocí afínitní chromatografie s anti-myším IgG.

Čistota a molekulová hmotnost .rekombinantních protilátek se určovala pomocí SDS-PAGE v redukčních a neredukčních podmínkách (obr. 14 a 15).

Purifíkace proteinů a SDS-PAGE se prováděly podle standardních postupů.

Příklad 4

Funkční analýza protilátek H79 a HD70

IV. 1. Test na imobilizovaném antigenů

Supematant zkonfluentní 30ml tkáňové kultury transfektant lidského a myšího IgGl, staré tři dny, jakož i odpovídající preparáty purifíkované protilátky, se testovaly na vazbu na mobilizovaný S17-1A pomocí ELISA a srovnávaly se s myší M79 anti-17-ΙΑ protilátkou. Detekce se prováděla, jak je popsáno ve II.

Ukázalo se, že protilátky H79 (varianty hulgGI a MIgGI) a HD70 mají velmi podobné vazebné afinity v rozsahu myší M79.

IV.2. Určení afinit

Měření povrchovou plazmonovou rezonancí se provádělo za použití zařízení BIACORE 2000 (Biacore AB, Freiburg, Německo). Imobilizace rekombinantního rozpustného antigenů 17-1A v každé průtokové komůrce a analýza interakce se prováděly automatickým způsobem v BIACORE 2000. Antigen se kovalentně navázal k senzorovému čipu CM5 prostřednictvím primárních aminových skupin. Po aktivaci karboxylované dextranové matrix senzorového čipu CM5 jednou injekcí 80 μΐ 0.1 M N-hydroxysukcinimidu/0,4 M N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimidu (NHS/EDC9) do všech čtyřech průtokových komůrek, byly průtokové komůrky 1, 2, 3 a 4 postupně zapojeny do průtokové dráhy v průběhu vstřikování antigenů s 17-1A (60 pg/ml v 10 mM acetátu sodném, pH 4,7). Různé kontaktní časy 17-1A s aktivovaným povrchem vedly k přibližně 2500 jednotkám odpovědi (RU) (9 RU v průtokové komůrce 1, 1400 RU v průtokové komůrce 2 780 RU v průtokové komůrce 3 a 290 RU v průtokové komůrce 4). Přebytek aktivovaných esterů se blokoval injekcí 85 μΐ 1 M ethanolaminu pH 5 do všech čtyřech průtokových komůrek. Vazebné pokusy se prováděly v 25 °C v pufru pH 7,4, obsahujícím 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA a 0,005% surfaktant P20. Vazebná kinetika protilátek k imobilizovanému rekombinantnímu 17-1A se určovala infikováním koncentrací protilátek v rozmezí od 0,5 do 2 μΜ. Senzorový čip se regeneroval mezi každým během 100 mM glycinem, 500 mM NaCl, 0,005% Tweenem pH 3. Asociační adisociační rychlostní konstanty, K_on a K_Off se analyzovaly s použitím vyhodnocovacího programu BIA od Biacore AB, jak popsáno (Karlsson, J. Immunol. Meth., 145, 229-240, 1991).

Prováděly se dvě sady afinitních determinant (1. sada: M79, H79, D7.2, Panorex, 2. sada: Panorex, HD70), myší Panorex byl také zahrnut do 2. sady jako vnitřní reference.

Ukázalo se, že K_D D7.2 je pod minimální detekční hodnotou 10¹ M a není proto ukázána v tabulce 2.

-23 CZ 294425 B6

Tabulka 2

Rychlosti K_D, K_on a K_oít lidských a relevantních myších protilátek 17-1A

Protilátka	Kon (MÝj	Koff (s¹)	K_D (M)
1.sada
myší M79	6,0x10⁴	4,5 x 10²	7,5 x 10’⁷
lidská H79	2,1 x 10⁴	7,2 x 10’³	3,4 x 10’⁷
myší Panorex	1,1 x 10⁵	2,2 x 10“²	2,0 x lO ⁷
2. sada
lidská HD70	0,9 x 10⁵	3,5 x 10“²	3,9 x 10’⁷
myší Panorex	1,0 x 10⁵	2,7x 10~²	2,7 x 10⁷

IV.3. Průtoková cytometrie eukaryotických buněk exprimujících 17-1A

Purifíkované protilátkové preparáty H79 (varianta lidského a myšího IgGl), HD70 (lidský IgGl) a D7.2 (lidský IgGl) se testovaly analýzou FACS na buňkách. Kato exprimujících 17-1A, buňkách CHO transfekovaných 17-1A a netransfekovaných buňkách CHO.

x 10⁵ buněk se inkubovalo s purifikovanými protilátkami H79-huIgGl, H79-MIgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (= lidský CHIgGl lidské C kappa varianty myší anti-17-ΙΑ protilátky M74 (Gottlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986)), myší IgG2a, myší IgGl nebo lidský IgGl (20 pg/ml každé protilátky). Detekce protilátek navázaných na buňky se prováděla s protilátkami (každá 20 pg/ml) proti-myším IgG nebo proti-lidským IgG značenými FITC. Inkubace se prováděla 45-60 minut na ledu.

H79 lidský IgGl, H79 myší IgGl a HD70 vykázaly jasnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky, jakož i M79 a Panorex. D7.2 ukázal slabou, ale významnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky. Žádná protilátka se nenavázala na netransfekované buňky CHO a IgG kontroly byly negativní na buňkách Kato, buňkách CHO/17-1A a netransfekovaných buňkách CHO (viz obr. 16 a 17).

IV.4. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (uvolňování ⁵¹Cr)

Pro uvolňování ⁵¹Cr byly jako efektorové buňky izolovány mononukleámí buňky lidské periferní krve (PBMC) zdravých dárců z čerstvě připravené vrstvy sražených buněk. PBMC se oddělily stočením na hustotním gradientu Ficollu s následným stočením ve 100 x g. Nestimulované PBMC (5 x 10⁵ buněk) se přidaly do objemu 100 μΐ média RPMI 1640 s 10% FCS do každé jamky na mikrotitrační destičce s plochým dnem a inkubovaly přes noc v 37 °C. Cílové buňky se značily 2 hodiny s ⁵¹Cr. Značené cílové buňky (100 μΐ) a protilátky v různých koncentracích (50 μΐ) se přidaly k PBMC a inkubovaly 18 hodin v 37 °C. Odpovídající nevázající izotypy byly použity jako negativní kontroly. Specifická lýze se počítala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) - (cpm, spontánní uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm - „counts per minuté“ = impulzy za minutu). ^V

V tomto testu uvolňování ⁵¹Cr se prokázalo, že lidské anti-17-ΙΑ protilátky H79 a HD70 zprostředkovávají vysokou cytotoxicitu pro 17-1A pozitivní buněčnou linii Kato ze žaludečního karcinomu. Ukázalo se, že myší anti-17-ΙΑ protilátky M79 a Panorex zprostředkovávají usmrcování buněk na zřetelně nižší úrovni.

-24CZ 294425 B6

IV.5. Test na lidských tkáních

Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku a z tkáně normální sliznice tračníku se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). V tomto pokusu byla použita myší IgGl varianta protilátky H79, aby se zabránilo nespecifickému značení, způsobenému přítomností lidského imunoglobulinu v lidské tkáni. Detekce navázané H79MIgGl se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem. Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem.

Výsledky se vyhodnocovaly světelným mikroskopem

H79MIgGl a také myší monoklonální protilátka M79 (pozitivní kontrola) vykázaly silné značení v normální sliznici tračníku (M79, obr. 19, H79MIgGl, obr. 20) a slabší značení v buňkách karcinomu tračníku (M79, obr. 21, H79MIgGl, obr. 22). Na rozdíl od toho izotypové kontroly nevykázaly žádné značené v tkáních sliznice tračníku a karcinomu tračníku (M79, obr. 23 a 25 a H79MIgGl, obr. 24 a 26).

Příklad 5

Analýza epitopů H79 a HD70

Pro srovnání 17-1A epitopů, rozpoznávaných lidskými protilátkami H79 a HD70 a myší templátovou protilátkou M79, byly syntetizovány 13-memí peptidy, odvozené z aminokyselinové sekvence extracelulámí části antigenu 17-1A jako jednotlivé body na membráně Pep Spots. Tyto peptidy pokrývají veškerou extracelulámí aminokyselinovou sekvencí antigenu 17-1A (jak byla definována autorem Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990) tak, že se překrývají v 11 aminokyselinách s každým sousedním peptidem, kdy první aminokyselina peptidů 1 je totožná sN-koncovou aminokyselinou antigenu 17-1A a poslední aminokyselina peptidů 119 je totožná s C-koncovou aminokyselinou extracelulámí části antigenu 171A (tab. 3).

-25 CZ 294425 B6

Tabulka 3

Syntetizované peptidy (čísla odpovídají číslům peptidových bodů)

I. TATFAAAQEECVC

3.AAAQEECVCENYK

5. EECVCENYKLAVN

7. CENYKLAVNCFVN

9. KLAVNCFVNNNRQ

II. NCFVNNNRQCQCT

13. NNNRQCQCTSVGA

15. QCQCTSVGAQNTV

17. TSVGAQNTVICSK

19. AQNTVICSKLAAK

21. VICSKLAAKCLVM

23. KLAAKCLVMKAEM

25. KCLVMKAEMNGSK

27. MKAEMNGSKLGRR

29. MNGSKLGRRAKPE

31.KLGRRAKPEGALQ

33. RAKPEGALQNNDG

35. EGALQNNDGLYDP

37. QNNDGLYDPDCDE

39. GLYDPDCDESGLF

41. PDCDESGLFKAKQ

43. ESGLFKAKQCNGT

45. FKAKQCNGTSTCW

47. QCNGTSTCWCVNT

49. TSTCWCVNTAGVR

51. WCVNTAGVRRTDK

53. TAGVRRTDKDTEI

55. RRTDKDTEITCSE

57. KDTEITCSERVRT

59. ITCSERVRTYWII

61. ERVRTYWIIIELK

63. TYWlilELKHKAR

65. IIELKHKAREKPY

67. KHKAREKPYDSKS

69. REKPYDSKSLRTA

71.YDSKSLRTALQKE

73. SLRTALQKEITTR

75. ALQKEITTRYQLD

77. EITTRYQLDPKFI

2. TFAAAQEECVCEN

4.AQEECVCENYKLA

6. CVCENYKLAVNCF

8. NYKLAVNCFVNNN

10. AVNCFVNNNRQCQ

12. FVNNNRQCQCTSV

14. NRQCQCTSVGAQN

16. QCTSVGAQNTVIC

18. VGAQNTVICSKLA

20. NTVtCSKLAAKCL

22. CSKLAAKCLVMKA

24. AAKCLVMKAEMNG

26. LVMKAEMNGSKLG

28. AEMNGSKLGRRAK

30. GSKLGRRAKPEGA

32. GRRAKPEGALQNN

34. KPEGALQNNDGLY

36. ALQNNDGLYDPDC

38. NDGLYDPDCDESG

40. YDPDCDESGLFKA

42. CDESGLFKAKQCN

44. GLFKAKQCNGTST

46. AKQCNGTSTCWCV

48. NGTSTCWCVNTAG

50. TCWCVNTAGVRRT

52. VNTAGVRRTDKDT

54. GVRRTDKDTEITC

56. TDKDTEITCSERV

58. TEITCSERVRTYW

60. CSERVRTYWIIIE

62. VRTYWIIIELKHK

64. WIIIELKHKAREK

66.ELKHKAREKPYDS

68. KAREKPYDSKSLR

70. KPYDSKSLRTALQ

72. SKSLRTALQKEIT

74. RTALQKEITTRYQ

76. QKEITTRYQLDPK

78. TTRYQLDPKFITS

-26CZ 294425 B6

79. RYQLDPKFITSIL

81. DPKFITSILYENN

83. ITSILYENNVITI

85. LYENNVITIDLVQ

87. NVITIDLVQNSSQ

89. IDLVQNSSQKTQN

91. QNSSQKTQNDVDI

93. QKTQNDVDIADVA

95. NDVDIADVAYYFE

97. IADVAYYFEKDVK

99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTVNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG

111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK

80. QLDPKFITSILYE

82. KFITSILYENNVI

84. SILYENNVITIDL

86. ENNVITIDLVQNS

88. ITIDLVQNSSQKT

90. LVQNSSQKTQNDV

92. SSQKTQNDVDIAD

94. TQNDVDIADVAYY

96. VDIADVAYYFEKD

98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG

Membrána Pep Spots se syntetizovanými peptidy se třepala 10 minut v methanolu a pak se promývala třikrát po deseti minutách v pufru TBS pH 8. Pak se membrána blokovala jednu hodinu blokovacím roztokem na bázi kaseinu, který obsahoval 0,05 g/ml sacharózy, a pak se znovu třepala v TBS pH 8/0,05% Tween 20 (TBS-T). Každá z protilátek 17-1A se inkubovala při teplotě místnosti spolu s membránou tři hodiny v blokovacím roztoku (1 pg protilátky/ml). Po třech promytích v TBS-T, každé deset minut, se spolu s membránou inkubovala dvě hodiny při teplotě místnosti sekundární protilátka (proti-myší/proti-lidská, 1 pg/ml blokovacího roztoku), konjugovaná s křenovou peroxidázou (HRP). Pak se membrána promývala třikrát deset minut v TBS-T. Detekce navázaných protilátek se prováděla v případě M79 přímo na membráně Pep Spots podle protokolu výrobce chemiluminiscenčního kitu (Boehringer). Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27. Membrána se regenerovala po třech promytích s TBS-T (10 minut) v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCl pH 6,7, 100 mM 2-merkaptoethanol a 2% (w/v) SDS 30 minut v 50 °C a pak použila znovu pro mapování epitopu další protilátky.

Kvůli vysokému stupni nespecifické vazby proti-lidské imunoglobulinové sekundární protilátky k polypeptidovým bodům na membráně se v případě HD70 a H79 prováděl frakcionovaný elektropřenos na druhou přenosovou membránu, následovaný detekcí s proti-lidskou sekundární protilátkou podle Růdigera (EMBO, 16, 1501-1507, 1997). Inkubace se sekundární protilátkou a detekce protilátky na membránách se prováděla, jak je popsáno výše. Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27.

Jak je na tomto obrázku ukázáno (obr. 27), výsledky mapování epitopů, založeného na peptidech naznačují, že epitop rozpoznávaný myší templátovou protilátkou M79, představovaný převážně peptidovými body 38 a 95, se pronikavě liší od epitopu rozpoznávaného lidskou protilátkou H79, představovanou převážně peptidovými body 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79. Protože lidská protilátka HD70 vůbec neukázala detekovatelnou vazbu, může se dále předpokládat, že se její epitop také liší od epitopu myší protilátky M79 a že epitopy lidských protilátek H79 a HD70 také nejsou totožné.

-27CZ 294425 B6

Nepřítomnost detekovatelných vazebných signálů v případě lidské protilátky HD70 se může vysvětlit jejím možným rozpoznáváním buď konformačního, spojitého nebo nespojitého epitopu nebo epitopu částečně nebo úplně sestávajícího ze sacharidu, v každém případě lze těžko očekávat napodobení takových epitopů krátkými peptidy.

Přehled sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-28CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-29CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-30CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC 3 8 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT C AGTCTCC 3 8 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 58 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-31 CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC

GAACTCAG 58 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-32CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-33 CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: j iná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-34CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-35 CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-36CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

-37CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-38CZ 294425 B6 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-39CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-40CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-41 CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-42CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-43 CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:

Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala 15 10

-44CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:

Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin. 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn

5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:

Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 15 10

-45 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:

Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:

Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys

5 10

-46CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:

Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe 15 10

-47CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn 15 10

-48CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:

Glu Ser Gly Leu

Phe Lys Ala Lys Gin

Cys Asn Gly Thr (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:

Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:

Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 15 10

-49CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:

Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:

Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly 15 10

-50CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:

Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:

Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:

Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys 15 10

-51 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:

Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:

Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys 15 10

-52CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:

Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:

Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr 15 10

-53 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:

Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:

Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:

Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu 15 10

-54CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:

Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:

Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:

Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 15 10

-55CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:

Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:

Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:

Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser 15 10

-56CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:

Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:

Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala 15 10

-57CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:

Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10

-58CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:

Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:

Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:

Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 15 10

-59CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:

Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:

Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser 15 10

-60CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn 15 10

-61 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:

Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile

10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:

Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:

Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu 15 10

-62CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:

Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:

Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:

Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin 15 10

-63 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:

Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:

Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:

Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 15 10

-64CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:

Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile

10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala ¹ 5 10

-65CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:

Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:

Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:

Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp

10

-66CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:

Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:

Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu 15 10

-67CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:

Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:

Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:

Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met 15 10

-68CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly 15 10

-69CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:

His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:

Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:

Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp 15 10

-70CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:

Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:

Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile ¹ 5 io

-71 CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys 15 10

-72CZ 294425 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:

Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:

Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met 15 10

-73 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:

Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly Leu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 321 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321

-74CZ 294425 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:

GAG Glu 1

CTC Leu

CAG ATG

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG

TCT Ser

GCT Ala

TCT Ser

GTG Val 15

GGA Gly

48

Gin

Met

Thr Gin Ser Pro Ser Ser

Leu

5

10

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGT

CGG

ACA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

TAT

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

TTA

AAT

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

144

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

192

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

CAA

CCT

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

GAA

GAT

TCT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAG

AGT

TAC

GAC

ATC

CCG

TAC

288

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Asp

Ile

Pro

Tyr

85

90

95

ACT

TTT

GGC

CAG

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:

-75 CZ 294425 B6

Glu

Leu

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Asp

Ile

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 414 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..414 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:

-76CZ 294425 B6

GAG GTG

CAG Gin 110

CTG Leu

CTC Leu

GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC

CAG CCT GGG AGG

48

Glu

Val

Glu

Ser Gly 115

Gly

Val

Gin 120

Pro Gly

Arg

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGT

AGC

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

125

130

135

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

cly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

140

145

150

155

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Val

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Ala

Asp

Ser

val

160

165

170

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

175

180

185

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT·

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

190

195

200

GCG

AAA

GAT

ATG

GGG

TGG

GGC

AGT

GGC

TGG

AGA

CCC

TAC

336

Ala

Lys

Asp

Met

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly

Trp

Arg

Pro

Tyr

205

210

215

GGT

ATG

GAC

GTC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCA

384

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ala

220

225

230

235

CCC

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

414

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

240

245

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 138 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:

-77CZ 294425 B6

Glu 1

Val

Gin

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Gly 10

Val

Gin

Pro

Gly Arg 15

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Gly

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 60

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 65

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Lys

Asp

Met 100

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly 105

Trp

Arg

Pro

Tyr

Tyr 110

Tyr

Gly

Met

Asp 115

Val

Trp

Gly

Gin

Gly 120

Thr

Val

Thr

Val 125

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

130 135 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 372 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..372 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:

-78CZ 294425 B6

GAG Glu

GTG CAG

CTG Leu

CTC GAG

TCT GGG GGA GTC GTG GTA CAG

CCT Pro

GGG Gly

48

Val 140

Gin

Leu

Glu

Ser 145

cly

Gly

Val

Val 150

Gin

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTT

GAT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Tyr

155

160

165

170

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

175

180

185

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Val

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

190

195

200

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

205

210

215

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

220

225

230

GCG

AAA

AAG

GAA

GGC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

336

Ala

Lys

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

235

240

245

250

TCA

GCA

CCC

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

372

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

255 260 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 124 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:

-79CZ 294425 B6

Glu Val 1

Gin Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Val 10

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Tyr

20

25

30

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Val

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

100

105

110

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

115 120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:

-80CZ 294425 B6

GAG CTC

CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA

TCT GTA

GGA Gly 140

48

Glu 125

Leu

Gin Met

Thr

Gin Ser Pro Ser Ser Leu

Ser

Ala

Ser

Val

130

135

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

TAT

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

145

150

155

TTA

ΆΑΤ

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

144

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

Ile

160

165

170

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGC

GGC

192

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

175

180

185

AGT

GAA

TCT

GGG

ACA

AAT

TAC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTG

CAG

CCT

240

Ser

Glu

Ser

dy

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

190

195

200

GAA

GAT

TTT

GCT

ACT

TAC

TTT

TGT

CAA

CAG

TCT

GAC

AGT

TTG

CCG

ATC

288

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

205

210

215

220

ACC

TTC

GGC

CAA

GGG

ACA

CGA

CTG

GAC

ATT

CAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

Ile

Gin

225

230

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:

-81 CZ 294425 B6

Glu

Leu

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

60

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

Ile

Gin

100 105

Claims

1. Způsob přípravy anti-humánního antigenového receptorů, vyznačený tím, že zahrnuje b) selekci kombinace funkčně přeskupených imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH je odvozen od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a řetězec VL je odvozen od přirozeně se vyskytujícího repertoáru humánních buněk B a tyto řetězce se exprimují z rekombinantního vektoru, a c) použití třídicího systému in vitro pro vazbu k humánnímu cílovému antigenů, přičemž před selekčním stupněm b) se provede a) vytřídění buď uvedeného řetězce VH nebo uvedeného řetězce pro vazbu k uvedenému antigenů společně s řetězcem V jiného antigenového receptorů, specifického pro uvedený cílový antigen.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že alespoň imunoglobulinový řetězec VH a případně imunoglobulinový řetězec VL jsou odvozeny od humánního repertoáru IgD.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že kombinace funkčně přeskupených imunoglobulinových řetězců VH a VL se exprimuje z jedné knihovny nebo z několika různých knihoven.

4. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že humánním antigenem je nádorový antigen, zejména humánní antigen 17-1 A.

5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a na obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

-82CZ 294425 B6

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že selekce b) zahrnuje

i) navázání třídicího vehikula, exprimujícího antigenový receptor

a) na imobilizovaný cílový antigen nebo jeho fragmenty, nebo

b) na případně značené buňky, exprimující cílový antigen, nebo

c) na rozpustný, výhodně značený cílový antigen nebo jeho fragmenty, ii) odstranění nespecificky vázaného třídicího vehikula [a) a b)] vymytím a následnou eluci specificky navázaného třídicího vehikula, nebo iii) pozitivní obohacení třídicího vehikula, vázaného na cílový antigen [b) a c)], z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenzí buněk, exprimujících cílový antigen, a takto izolovaná třídicí vehikula, zahrnující jejich antigenové receptory, se případně rozmnoží replikací a potom se podrobí dalším cyklům selekce in vitro, popsaným v i) až iii).

7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že selekce vhodné kombinace zahrnuje

8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že po selekci dále zahrnuje 1) získání humánních řetězců VH a VL nebo odpovídajících nukleových kyselin a fúzi těchto řetězců ke stejným nebo jiným řetězcům VH nebo VL, k imunoglobulinovým konstantním oblastem těžkých řetězců CH nebo k imunoglobulinovým konstantním oblastem lehkých řetězců CL, zejména ke konstantním oblastem řetězců, odvozených od humánního IgGl nebo IgG3, nebo k jejich částem nebo k neimunoglobulinovým řetězcům a k odpovídajícím nukleovým kyselinám, nebo/a 2) získání humánních řetězců a fyzické připojení uvedených řetězců k neproteinovým farmaceutickým činidlům nebo/a biologicky účinným molekulám, přičemž uvedené řetězce VH a VL jsou výhodně exprimovány za sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem RT-PCR amplifikace mRNA, odvozené od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B.

9. Anti-humánní antigenový receptor, výhodně protilátka nebo její fragment, zejména receptor, který je specifický pro humánní nádorový antigen, obsahující kombinaci funkčně přeskupených řetězců VH a VL, přičemž oba řetězce V obsahují soubor strukturovaných oblastí FR a komplementárně determinujících oblastí CDR, alespoň řetězec VH je odvozen od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a řetězec VL je odvozen od přirozeně se vyskytujícího humánního repertoáru buněk B a tento anti-humánní antigenový receptor je připravítelný způsobem podle některého z nároků 1 až 8.

10. Anti-humánní antigenový receptor podle nároku 8, který je specifický pro nativní humánní antigen 17-1A a jehož řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a jehož řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

-83CZ 294425 B6

11. Řetězec VH nebo alespoň jedna komplementárně determinující oblast CDR, obsažené v anti-humánním antigenovém receptorů podle některého z nároků 9 nebo 10.

12. Řetězec VL nebo alespoň jedna komplementárně determinují oblast CDR, obsažené v antihumánním antigenovém receptorů podle některého z nároků 9 nebo 10.

13. Řetězec podle nároku 11 nebo 12, ve kterém CDR je CDR3.

14. Souprava pro selekci anti-humánních antigenových receptorů podle nároků 9 a 10, vyznačená tím, že obsahuje repertoár řetězců VH, odvozený od nestimulovaných zralých humánních lymfocytů B a repertoár řetězců VL, odvozených od humánních buněk B.

15. Anti-humánní antigenový receptor, který je odvozen od humánních sekvencí a je specifický pro nativní humánní antigen 17-1 A.

16. Anti-humánní antigenový receptor podle nároku 15, který je připravitelný způsobem podle některého z nároků 1 až 8.

17. Anti-humánní antigenový receptor podle nároku 15 nebo 16, rozpoznávající epitop extracelulární domény antigenu 17-1 A, který výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidu č. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 a 79 a jehož řetězec VH obsahuje alespoň jednu komplementárně determinující oblast CDR jedné ze dvou sekvencí, uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a na obr. 8 (nukleotidy 1 až 339), nebo/a jehož řetězec VL obsahuje alespoň jednu komplementárně determinující oblast CDR sekvencí, uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a na obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

18. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje receptor podle nároku 9 nebo 10, řetězec VH podle nároku 11 nebo/a anti-humánní antigenový receptor podle nároku 11 nebo/a anti-humánní antigenový receptor podle některého z nároků 15 až 17 a případně farmaceuticky přijatelný nosič.