RS61374B1 - Anti-tnf alfa-antitela i njihovi funkcionalni fragmenti - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela i njihove funkcionalne fragmente, koji su sposobni da se vežu za faktor nekroze tumora alfa (TNFα), na postupke za njihovo dobijanje, i na njihove terapeutske upotrebe.

STANJE TEHNIKE

[0002] TNFα je homo-trimerni pro-inflamatorni citokin koji se oslobađa od strane i interaguje sa ćelijama imunog sistema. Takođe je pokazano da je TNFα pojačano regulisan u brojnim humanim bolestima, uključujući hronične bolesti kao što je reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerozni kolitis i multiple skleroza.

[0003] Antitela koja su specifična za TNFα su predložena za profilaksu i za lečenje endotoksičnog šoka (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) i Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) razmatraju terapeutski potencijal anti-TNFα antitela u lečenju septičkog šoka. Upotreba anti-TNFα antitela u lečenju septičkog šoka je takođe razmatrana od strane Kirschenbaum et al., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Artritis indukovan kolagenom može efikasno da se leči korišćenjem anti-TNFα monoklonskog antitela (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

[0004] Upotreba anti-TNFα antitela u lečenju reumatoidnog artritisa i Kronove bolesti je razmotrena u Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) i kod Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Antitela specifična za TNFα koja su prethodno korišćena u takvim tretmanima su generalno himerna antitela, kao što su ona koja se opisuju u U.S. Pat. br.5,919,452.

[0005] U prethodnom stanju tehnike su opisana monoklonska antitela koja su specifična za TNFα. Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) opisuju mišja monoklonska antitela koja su specifična za rekombinantni TNFα. Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) opisuje upotrebu mišjih monoklonskih antitela koja su specifična za rekombinantni TNFα u definisanju neutralizujućih epitopa na TNFα. Dalje, u međunarodnoj prijavi patenta WO 92/11383, prikazana su rekombinantna antitela, uključujući CDR-graftovana antitela, koja su specifična za TNFα. Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) opisuje upotrebu takvih CDR-graftovanih antitela u lečenju reumatoidnog artritisa. U.S. Pat Br.5,919,452 prikazuje anti-TNFα himerna antitela i njihovu upotrebu u lečenju patologija koje su povezane sa prisustvom TNFα. Dalje, anti-TNFα antitela su prikazana u Stephens et al. (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2246570, GB-A-2297145, US 8,673,310, US 2014/0193400, EP 2390267 B1, US 8,293,235, US 8,697,074, WO 2009/155723 A2 i WO 2006/131013 A2.

[0006] Rekombinantni molekuli anti-TNFα antitela iz prethodnog stanja tehnike generalno imaju smanjeni afinitet za TNFa u poređenju sa antitelima iz kojih su dobijeni hipervarijabilni regioni ili CDR-i. Svi inhibitori TNFα koji su su trenutno prisutni na tržištu su davani intravenozno ili subkutanozno u nedeljnim ili dužim intervalima kao injekcije bolusa, dovodeći do većih početnih koncentracija koje postepeno opadaju do sledeće injekcije.

[0007] Trenutno odobreni anti-TNFa bioterapeutici uključuju (i) infliksimab, himerno IgG anti-humano monoklonsko antitelo (Remicade®); (ii) etanercept, TNFR2 dimerni kombinovani protein, sa IgG1 Fc (Enbrel®); (iii) adalimumab, puno humano monoklonsko antitelo (mAt) (Humira®) i (iv) certolizumab, PEGilovan Fab fragment (Cimzia®). Međutim, razni bioslični molekuli su u razvoju, i imitator infliksimaba koji je poznat pod imenom Remsima je već odobren u Evropi.

[0008] Infliksimab ima relativno nizak afinitet prema TNFα (KD> 0.2 nM; Weir et al., 2006, Therapy 3: 535) i ograničen potencijal neutralizacije u L929 testu. Dodatno, infliksimab u suštini ne pokazuje ukrštenu reaktivnost sa TNFα poreklom iz cinomolgus ili rezus majmuna. Za anti-TNFα antitela, međutim, ukrštena reaktivnost sa TNFα poreklom iz majmuna je visoko poželjna, kako ovo omogućava izvođenje testova na životinjama sa primatima, odražavajući situaciju kod ljudi u mnogim aspektima.

[0009] Etanercept, iako bivalentni molekul, vezuje se za TNFα u odnosu jedan trimer po jednom molekulu etanercepta, isključujući obrazovanje velikih kompleksa antigen-bioterapeutika (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis, 8: 601). Ne inhibira LPS-indukovanu sekreciju citokina u monocitima (Kirchner et al., 2004, Cytokine, 28: 67).

[0010] Potencija adalimumaba je slična onoj za infliksimab. Još jedan nedostatak adalimumaba je njegova slaba stabilnost, npr., kao što je određeno u testu toplotnog odvijanja. Temperatura topljenja (Tm) adalimumaba u takvom testu je određena da bude 67.5 °C. Niža Tmvrednost antitela, međutim, niža je njihova opšta stabilnost. Niža vrednost Tmčini antitela manje pogodnim za farmaceutsku upotrebu, npr. za oralno davanje.

[0011] Potencija certolizumaba je blago veća u odnosu na infliksimab, ali još uvek nije zadovoljavajuća. Certolizumab ne inhibira proliferaciju T-ćelija u MLR (Vos et al., 2011, Gastroenterology, 140: 221).

[0012] EP 2623515 A1 prikazuje anti-TNFα antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente (Fab), pri čemu potencija dobijenih humanizovanih fragmentata Fab je uporediva sa ili je malo bolja od one za infliksimab u testu neutralizacije L929 i antitelo sa ukrštenom aktivnosti se slabo vezuje za rezusni TNFα.

[0013] WO 2012/007880 A2 prikazuje modifikovani antigen vezujući molekul sa jednim domenom (SDAB) u obliku kombinovanih proteina koji se sastoje iz jednog ili više vezujućih domena jednog antigena koji se vezuju za jednu ili više meta (npr. TNFα, linker i jedan ili više molekula polimera).

[0014] WO 2015/144852 A1 ispituje svojstva anti-TNFα scFv označenog sa "scFv1". Ovaj scFv je pokazao kapacitet neutralizacije TNFα u PK-15 ćelijskom testu koji je bio uporediv sa onim za infliksimab.

[0015] WO 2015/065987 A1 opisuje anti-TNFα antitela, anti-IL-6 antitela, i bispecifična antitela koja se vezuju za oba antigena. Određena anti-TNFa antitela su pokazala određenu ukrštenu reaktivnost sa TNFa poreklom iz cinomolgus majmuna.

[0016] U "Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH, Weinheim, na stranama 885-904, M. Wiekowski et al. daju sažetak karakteristika infliksimaba, koji je takođe poznat pod imenom Remicade.

[0017] U "Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH, Weinheim, na stranama 697-732, H. Kupper et al. daju sažetak informacija o odobrenom antitelu adalimumabu.

[0018] Melmed Gil Y. et al opisuju u "Certolizumab pegol", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, vol. 7, br. 8, 2008, na stranama 641-642, pegilovan fragment antitela certolizumab pegol.

[0019] M. Sohini et al. rezimira u "Golimumab", MABS, Landes Bioscience, US, vo. 1, br. 5, 2009, na stranama 422-431, podaci o antitelu golimumabu. Golimumab je visoko afinitetno antitelo, koje se karakteriše sa KDod oko 17 pM.

[0020] Naučna publikacija "CDP571: anti-TNF monoclonal antibody, BAY 103356, BAY W 3356, Humicade2, Drugs in R & D, ADIS International, Auckland, NZ, vol.4, br.3, 2003, na stranama 174-178 odnosi se na humanizovano antitelo "Humicade" (CDP 571; BAY 103356), monoklonsko anti-TNFa antitelo sa visokim afinitetom.

[0021] Postoji potreba za unapređenim molekulima antitela za lečenje hroničnih inflamatornih bolesti kao što su inflamatorne bolesti creva. Molekuli antitela trebaju najmanje da imaju (i) visok afinitet za humani TNFα (tj. KD< 125 pM), (ii) visoku potenciju da inhibiraju TNFα-indukovanu apoptozu kod L929 ćelija, (iii) visoku potenciju da inhibiraju LPS-indukovanu sekreciju citokina, (iv) značajan afinitet prema TNFa iz cinomolgus i rezus majmuna (npr. KD< 1 nM), i (v) visoku temperaturu topljenja varijabilnog domena kao što je određeno u eksperimentu termalnog razdvajanja (npr. Tm> 70°C).

SUŠTINA PRONALASKA

[0022] Pronalazači iz predmetne prijave su pronašli da određena anti-TNFα antitela i njihovi funkcionalni fragmenti ispoljavaju kombinaciju poželjnih svojstava, uključujući visok afinitet za humani TNFα (KD< 125 pM), potenciju za inhibiranje TNFα-indukovane apoptoze kod L929 ćelija veću od one za infliksimab, potenciju za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije citokina veću od one za adalimumab, i značajan afinitet (KD< 1 nM) prema TNFα iz životinja kao što je cinomolgus majmun (Macaca fascicularis) i/ili rezus makaki (Macaca mulatta). Dodatno, antitela i njegovi funkcionalni fragmenti su bili specifični za TNFα time što se nisu značajno vezivali za TNFβ, i ispoljavaju značajnu stabilnost, kao što je određeno u testu termalnog razdvajanja varijabilnog domena.

[0023] Pronalazak obezbeđuje molekule antitela i njegove funkcionalne fragmente.

[0024] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na predmet koji je definisan u sledećim stavkama (1) do (43):

(1) Antitelo ili njegov funkcionalni fragment sposoban za vezivanje sa humanim faktorom nekroze tumora alfa (TNFα), pri čemu pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment sadrži (i) VLdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazna u SEQ ID NO:14, i (ii) VHdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazna u SEQ ID NO.13.

(2) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavci (1), pri čemu pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment se specifično vezuje za humani TNFα.

(3) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavci (1) ili (2), pri čemu se pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment ne vezuje značajno za TNFβ.

(4) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu pomenuto antitelo ili funkcionalni fragment

(i) se vezuje za humani TNFα sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 125 pM;

(ii) ukršteno reaguje sa Macaca mulatta TNFα i sa Macaca fascicularis TNFα;

(iii) ima veću potenciju i odnosu na infliksimab, kao što je određeno sa L929 testom; i/ili (iv) je sposobno da se veže za humani TNFαTrimeru stehiometriji (antitelo : TNFαTrimer) od najmanje 2.

(5) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 100 pM, poželjno manjom od 50 pM.

(6) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za TNFα iz Macaca mulatta sa KDmanjom od 1 nM.

(7) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za TNFα iz Macaca fascicularis sa KDmanjom od 1 nM.

(8) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta da inhibira TNFa-indukovanu apoptozu u odnosu na onu kod infliksimaba (relativna potencija), određeno u L929 testu, je veća od 5, i gde je pomenuta relativna potencija odnos IC50vrednosti u ng/mL infliksimaba u testu L929 u odnosu na IC50vrednost u ng/mL antitela u scFv formatu u L929 testu.

(9) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je temperatura topljenja varijabilnog domena antitela u scFv formatu, kao što je određeno diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, najmanje 65°C.

(10) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je temperatura topljenja varijabilnog domena antitela u scFv formatu, kao što je određeno diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, najmanje 68°C.

(11) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je temperatura topljenja, kao što je određeno sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, najmanje 70°C.

(12) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je gubitak u sadržaju monomera, posle pet uzastopnih ciklusa zamrzavanja-otapanja, manji od 0.2%.

(13) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je gubitak u sadržaju monomera, nakon skladištenja tokom četiri nedelje na 4°C, manji od 1%.

(14) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta da blokira interakciju između humanog TNFα i receptora I TNF (TNFRI), u odnosu na infliksimab (relativna potencija), kao što je određeno sa ELISA testom za inhibiciju, najmanje 2, pri čemu pomenuta relativna potencija je odnos vrednosti IC50u ng/mL infliksimaba prema vrednosti IC50u ng/mL antitela u scFv formatu.

(15) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta da blokira interakciju između humanog TNFα i receptora II TNF (TNFRII), u odnosu na infliksimab (relativna potencija), kao što je određeno sa ELISA testom za inhibiciju, je najmanje 2, pri čemu pomenuta relativna potencija je odnos vrednosti IC50u ng/mL infliksimaba prema vrednosti IC50u ng/mL antitela u scFv formatu.

(16) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno da inhibira ćelijsku proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi u reakciji pomešanih limfocita.

(17) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno da inhibira LPS-indukovanu sekreciju interleukina-1β od strane CD14<+>monocita.

(18) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavki (17), pri čemu IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β je manja od 1 nM.

(19) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavki (18), pri čemu pomenuta IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β, na molarnoj osnovi, je niža od one za adalimumab.

(20) Antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno da inhibira LPS-indukovanu sekreciju TNFα od strane CD14<+>monocita.

(21) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavki (20), pri čemu IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα je manja od 1 nM.

(22) Antitelo ili funkcionalni fragment prema stavki (21), pri čemu pomenuta IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα, na molarnoj osnovi, je niža od one za adalimumab. (23) Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je imunoglobulin G (IgG).

(24) Funkcionalni fragment prema bilo kojoj od stavki (1) ili (22), koji je jednolančani varijabilni fragment (scFv).

(25) Funkcionalni fragment prema stavki (24), pri čemu pomenuti scFv ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:15.

(26) Funkcionalni fragment prema bilo kojoj od stavki (1) do (22), koji je diatelo.

(27) Funkcionalni fragment prema stavki (26), pri čemu se pomenuto diatelo sastoji iz ili sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:51.

(28) Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki.

(29) Vektor ili plazmid koji se sastoji iz nukleinske kiseline prema stavki (28).

(30) Ćelija koja se sastoji iz nukleinske kiseline prema stavki (28) ili vektor ili plazmid prema stavki (29).

(31) Postupak za dobijanje antitela ili funkcionalnog fragmenta prema bilo kojoj od stavki (1) do (27), koji se sastoji iz gajenja u kulturi ćelije prema stavki (30) u medijumu pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili funkcionalni fragment, i dobijanje antitela ili funkcionalnog fragmenta iz ćelija ili iz medijuma.

(32) Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz antitela ili funkcionalnog fragmenta prema bilo kojoj od stavki (1) do (27), i po potrebi farmaceutski prihvatljivog nosača i/ili ekscipijenta.

(33) Antitelo ili funkcionalni fragment kako je definisano u bilo kojoj od stavki (1) do (27) za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja ili poremećaja povezanog sa TNFα.

(34) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (33), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj je izabran sa liste bolesti i poremećaja koji su navedeni u odeljku "Poremećaji koje treba lečiti" u tekstu ispod.

(35) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (33), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj je inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta.

(36) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (35), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalog trakta je inflamatorna bolest creva.

(37) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (35) ili (36), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je Kronova bolest.

(38) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (37), pri čemu pomenuta Kronova bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji iz bolesti ileuma, debelog creva, ileo-debelog creva, i/ili izolovana Kronova bolest (želudačni, dvanaestopalačni i/ili jejunuma) i uključujući koja ne sužavaju/ne-prodiru, koji sužavaju, koji prodiru i ponašanje perianalnih bolesti, omogućavajući bilo koju kombinaciju lokalizacije i ponašanje bolesti prema bilo kom od gore pomenutih.

(39) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (35) ili (36), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je ulcerozni kolitis.

(40) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (39), pri čemu pomenuti ulcerozni kolitis je izabran iz grupe koja se sastoji iz ulcerativnog proktitisa, proktosigmoiditisa, kolitisa leve strane, pan-ulceroznog kolitisa, i puhitisa.

(41) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema stavki (35) ili (36), pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je mikroskopski kolitis.

(42) Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema bilo kojoj od stavki (33) do (41), pri čemu pomenuti postupak obuhvata oralno davanje antitela ili funkcionalnog fragmenta subjektu.

KRATAK OPIS NACRTA

[0025]

Slika 1: Šematski prikaz postupka humanizacije.

Slika 2: SE-HPLC hromatogrami prečišćenih humanizovanih scFv preparata scFv. scFv monomer eluira u retencionim vremenima između 8.5 i 9.5 minuta, dok se komponente pufera eluiraju na >10 min. Svi signali sa mrtve zapremine kolone do odgovarajućeg scFv monomera su bile integrisane kao agregati/oligomeri i korišćeni su za izračunavanje relativne površine signala.

Slika 3: Krive toplotnog odvajanja sa DSF merenja dva scFv konstrukta. Za svaki konstrukt prikazani su duplikati merenja. Dobijene Tmvrednosti su određene uklapanjem podataka sa Boltzmanovom jednačinom da se dobije srednja vrednost prelaza.

Slika 4: Vremenski tok sadržaja monomera dva scFv konstrukta tokom skladištenja. Sadržaj monomera kao što je određeno sa SE-HPLC je bio prikazan grafički za temperature skladištenja 4, -20 i <-65°C u trajanju od 4 nedelje.

Slika 5: Preklapanje SE-HPLC hromatograma za dva scFv molekula. Za svaki scFv uzorak (10 mg/ml) na d0 i posle skladištenja od 4 nedelja na 4°C je prikazano. Dodatno, hromatogram uzorka posle 5 ciklusa zamrzavanja i otapanja je prikazan. Insertovan panel prikazuje približno 15-puta uveličanje y-ose za svaki molekul da bi se takođe vizuelizovale male promene u sadržaju monomera.

Slika 6: Vremenski tok sadržaja monomera humanizovanih scFv-a tokom skladištenja. Sadržaj monomera kao što je određeno sa SE-HPLC je prikazan grafički uza 10 mg/mL uzorke na temperaturi skladištenja od 37°C u trajanju od 4 nedelje.

Slika 7: Potencija za neutralizvanje humanog TNFα u L929 testu iz dva scFv-a. Krive doza-odgovora za scFv-e i referentno antitelo infliksimab su prikazane za svaki eksperiment. Najveće koncentracije scFv i infliksimaba kao i negativne kontrole su bile postavljene do 100% i 0% rasta.

Slika 8: Potencija dva scFv-a za neutralizovanje TNFα poreklom iz ne-humanog primata i čoveka u L929 testu. Prikazane su krive doza-odgovora za neutralizaciju TNFα poreklom iz čoveka, cinomolgus majmuna i rezus majmuna. Najveća koncentracija scFv i negativnih kontrola su bile postavljene do 100% i 0% rasta.

Slika 9: Potencija dva scFv-a da blokiraju interakciju TNFα-TNFRI. Prikazane su krive doza-odgovora. Najveća koncentracija scFv i negativnih kontrola su bile postavljene do 0% i 100% vezivanja TNFα sa TNFRI.

Slika 10: Potencija dva scFv-a da blokiraju interakciju TNFα-TNFRII. Prikazane su krive dozaodgovora. Najveća koncentracija scFv i negativnih kontrola su bile postavljene do 0% i 100% vezivanja TNFα sa TNFRII.

Slika 11: Ciljna specifičnost scFv. Potencijal za inhibiranje interakcije biotinilovanog TNFα sa scFv pomoću TNFα i TNFβ analizirana je kompetitivnom ELISA. Prikazani su efekti TNFα i TNFβ koji zavise od doze.

Slika 12 prikazuje obrazovanje16-22-H5-scFv:TNFα kompleksa određeno sa SE-HPLC (Primer 4).

Slika 13 prikazuje istovremeno vezivanje dva TNFα molekula sa 16-22-H5-scDb određeno sa SPR (Primer 5).

Slika 14A prikazuje obrazovanje 16-22-H5-IgG:TNFα kompleksa (Primer 5).

Slika 14B prikazuje obrazovanje 16-22-H5-scDb:TNFα kompleksa (Primer 5).

Slika 15 prikazuje inhibiciju proliferacije ćelija u MLR nakon anti-TNFα tretmana. *: p < 0.05; **: p < 0.01 u poređenju sa IgG kontrolom (Primer 6).

Slika 16 pokazuje sposobnost različitih formata antitela 16-22-H5 i adalimumaba da inhibiraju LPS-indukovanu sekreciju IL-1β (Slika 16A) i TNFα (Slika 16B) u monocitima na način koji zavisi od doze (Primer 7).

DETALJAN OPIS

[0026] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji je sposoban da se veže za humani TNFα, kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0027] U kontekstu predmetne prijave, termin "antitelo" je korišćen kao sinonim za "imunoglobulin" (Ig), koji je definisan kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj podklasi), i uključuje sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. U kontekstu predmetnog pronalaska, "funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment za vezivanje antigena ili drugog derivata parentalnog antitela koje u suštini održava jedno ili više svojstava takvog parentalnog antitela naznačenog u stavkama (1) do (27) koje su ovde gore navedene. "Fragment za vezivanje antigena" antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment (npr., varijabilni region IgG) koji zadržava region za vezivanje antigena. "Region za vezivanje antigena" antitela se obično nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona u antitelu, tj., CDR-1, -2, i/ili-3 regiona. "Fragmenti za vezivanje antigena" iz pronalaska uključuju domen F(ab’)2fragmenta i Fab fragment. "Funkcionalni fragmenti" iz pronalaska uključuju, scFv, dsFv, diatela, triatela, tetratela i Fc kombinovane proteine. F(ab’)2ili Fab mogu da budu konstruisani da minimizuju ili u potpunosti uklone intermolekulske disulfidne interakcije koje se pojavljuju između CH1 i CL domena. Antitela ili funkcionalni fragmenti iz predmetnog pronalaska mogu da budu deo bi- ili multifunkcionalnih konstrukata.

[0028] Poželjni funkcionalni fragmenti u predmetnom pronalasku su scFv i diatela.

[0029] scFv je jednolančani Fv fragment u kome su varijabilni laki ("VL") i varijabilni teški ("VH") domeni povezani sa peptidnim mostom.

[0030] Diatelo je dimer koji se sastoji iz dva fragmenta, svaki ima varijabilne regione spojene zajedno pomoću linkera ili slično (ovde naznačeni kao fragmenti koji obrazuju diatelo), i obično sadrže dva VL-a i VH-a. Fragmenti za obrazovanje diatela uključuju one koji se sastoje iz VLi VH, VLi VL, VHi VH, itd., poželjno VHi VL. U fragmentima za obrazovanje diatela, linker koji povezuje varijabilne regione nije specifično ograničen, ali poželjno je dovoljno kratak da bi se izbegle nekovalentne veze između varijabilnih regiona u istom fragmentu. Dužina takvog linkera može biti određena od strane stručnjaka iz oblasti tehnike po potrebi, ali uobičajno 2-14 aminokiselina, poželjno 3-9 aminokiselina, naročito 4-6 aminokiselina. U ovom slučaju, VLi VHkodirani na istom fragmentu su spojeni pomoću linkera dovoljno kratkog da bi se izbegle nekovalentne veze između VLi VHna istom lancu i da bi se izbeglo obrazovanje fragmenata jednolančanih varijabilnih regiona tako da mogu da se obrazuju dimeri sa drugim fragmentom. Dimeri mogu da budu obrazovani ili pomoću kovalentnih ili nekovalentnih veza ili oba između fragmenata koji obrazuju diatela.

[0031] Osim toga, fragmenti koji obrazuju diatela mogu da budu spojeni pomoću linkera ili slično da bi se obrazovala jednolančana diatela (sc(Fv)2). Povezivanjem fragmenata koji obrazuju diatela upotrebom dugačkog linkera od oko 15-20 aminokiselina, nekovalentne veze mogu da budu obrazovane između fragmenata koji obrazuju antitela koji se nalaze na istom lancu da bi se obrazovali dimeri. Na osnovu istog principa koji je koriščen za dobijanje diatela, polimerizovana antitela kao što su trimeri ili tetrameri mogu takođe da se dobiju povezivanjem tri ili više fragmenata za obrazovanje diatela.

[0032] Poželjno, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska specifično se vezuje za TNFα. Kao što je ovde korišćeno, antitelo ili njegov funkcionalni fragment "specifično prepoznaje", ili "specifično se vezuje za" humani TNFα, gde je antitelo ili funkcionalni fragment sposobno da razlikuje između humanog TNFα i jednog ili više referentnih molekula. Poželjno, IC50vredost za vezivanje svakog od referentnih molekula je najmanje 1,000 puta veća u odnosu na IC50vrednost za vezivanje sa TNFα, kao što je posebno opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje definisana referenca), "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost antitela ili funkcionalnog fragmenta da napravi razliku između humanog TNFα i nesrodnog molekula, kao što je određeno, na primer, u skladu sa postupcima testova za određivanje specifičnosti koji su poznati u oblasti tehnike. Takvi postupci obuhvataju testove „Western blot“ i ELISA. Na primer, može da se izvede standardni ELISA test. Uobičajno, određivanje specifičnosti vezivanja je izvedeno korišćenjem ne jednog referentnog biomolekula, već niza od tri do pet nesrodnih biomolekula, kao što je mleko u prahu, BSA, transferin ili slično. U jednom izvođenju, specifično vezivanje se odnosi na sposobnost antitela ili fragmenta da napravi razliku između humanog TNFα i humanog TNFβ.

[0033] Antitelo iz pronalaska ili funkcionalni fragment iz pronalaska se sastoji iz VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:14 i VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:13. VLdomen se sastoji iz CDR1 regiona (CDRL1), CDR2 regiona (CDRL2), CDR3 regiona (CDRL3) i regiona koji obuhvata okvire čitanja. VH domen se sastoji iz CDR1 regiona (CDRH1), CDR2 regiona (CDRH2), CDR3 regiona (CDRH3) i i regiona koji obuhvata okvire čitanja.

[0034] Termin "CDR" se odnosi na jedan od šest hipervarijabilnih regiona u varijabilnim domenima antitela koji uglavnom doprinose vezivanju antigena. Jedna od najčešće korišćenih definicija za šest CDR-a je obezbeđena od strane Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Kao što je ovde korišćeno, Kabat-ova definicija CDR-a se primenjuje samo za CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog domena lakog lanca (CDR L1, CDR L2, CDR L3, ili L1, L2, L3), kao i za CDR2 i CDR3 varijabilnog domena teškog lanca (CDR H2, CDR H3, ili H2, H3). CDR1 varijabilnog domena teškog lanca (CDR H1 ili H1), međutim, kao što je ovde korišćen je definisan sledećim ostacima (Kabat numerisanje): Počinje sa položajem 26 i završava se pre položaja 36.

[0035] CDR1 region VLdomena sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:7. CDR2 region VLdomena sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:8. CDR3 region VLdomaina sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:9.

[0036] CDR1 region VHdomena sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:10. CDR2 region VHdomena sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:11. CDR3 region VHdomena sastoji se iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:12.

[0037] Antitelo iz pronalaska ili funkcionalni fragment iz pronalaska se sastoji iz VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO:13. Dalje, antitelo ili funkcionalni fragment se sastoji iz VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO:14.

[0038] U posebno poželjnom izvođenju, funkcionalni fragment je jednolančano antitelo (scFv) koje se sastoji iz VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:13 i VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:14. VHdomen i VLdomen su poželjno spojeni peptidnim linkerom. Peptidni linker (ovde označen sa "linkerA") obično je dužine oko 10 do oko 30 aminokiselina, poželjnije od oko 15 do oko 25 aminokiselina. LinkerA se obično sastoji iz ostataka Gly i Ser, ali takođe su moguće i druge aminokiseline. U poželjnim izvođenjima linker se sastoji iz više ponovaka sekvence GGGGS (SEQ ID NO:50), npr. 2 do 6, ili 3 do 5, ili 4 uzastopnih ponovaka aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:50. Najpoželjnije, linkerA se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:49. scFv može da ima sledeću strukturu (sa N-krajem na levo i C-krajem na desno):

VL-LinkerA-VH; ili

VH-LinkerA-VL.

[0039] Najpoželjnije, funkcionalni fragment je jednolančano antitelo (scFv) koje se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:15.

[0040] U drugom posebno poželjnom izvođenju, funkcionalni fragment je diatelo koje se sastoji iz VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:13 i VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:14. VH domen i VL domen su povezani sa peptidnim linkerom. Peptidni linker (ovde označen sa "linkerB") poželjno ima dužinu od oko 2 do oko 10 aminokiselina, poželjnije od oko 5 aminokiselina. LinkerB se obično sastoji iz ostataka Gly i Ser, ali druge aminokiseline su takođe moguće. Najpoželjnije, linkerB se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:50.

[0041] Diatelo je poželjno monospecifično diatelo, tj. koje je usmereno samo prema jednom epitopu. Diatelo je poželjno homodimer. Diatelo može da bude dimer dva polipeptidna lanca koja su ne-

1

kovalentno vezana jedan sa drugim. Svaki monomer može da bude polipeptidni lanac koji ima strukturu:

VL-LinkerB-VH; ili

VH-LinkerB-VL.

[0042] Osim toga, fragmenti za obrazovanje diatela mogu da budu spojeni pomoću linkerA ili slično da se obrazuju jednolančana antitela (sc(Fv)2). Spajanjem fragmenata za obrazovanje diatela korišćenjem dugog linkera od oko 15-20 aminokiselina, nekovalentne veze mogu da se obrazuju između fragmenata za obrazovanje diatela koji se nalaze na istom lancu da se dobiju dimeri. Primeri uređenja jednolančanih diatela uključuju sledeće.

VH- linkerB - VL- linkerA - VHlinkerB - VL

VL- linkerB - VH- linkerA - VL- linkerB - VH

[0043] Poželjno diatelo iz pronalaska ima sledeću strukturu:

VL- linkerB - VH- linkerA - VL- linkerB - VH

[0044] Najpoželjnije antitelo se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:51.

[0045] Na osnovu istog principa koji se korisiti za dobijanje diatela, polimerizovana antitela kao što su trimeri ili tetrameri mogu takođe da se dobiju spajanjem tri ili više fragmenata koji obrazuju diatelo.

[0046] U drugom posebnom izvođenju antitelo iz pronalaska je imunoglobulin, poželjno imunoglobulin G (IgG). Podklasa IgG iz pronalaska nije ograničena i uključuje IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Poželjno, IgG iz pronalaska je podklase 1, tj. molekul IgG1. U jednom izvođenju, svaki laki lanac molekula IgG iz pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:52, i/ili svaki težak lanac molekula IgG iz pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:53. Specifično IgG iz pronalaska sastoji se iz dva laka lanca i dva teška lanca, pri čemu svaki od dva laka lanca ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:52, i svaki od dva teška lanca ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:53.

Afinitet

[0047] Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ima visok afinitet prema humanom TNFα. Termin "KD," se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska se vezuje za humani TNFα sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) manjom od približno 2x10<-10>M, poželjno manjom od 1.5x10<-10>M, poželjno manjom od 1.25x10<-10>M, poželjnije manjom od 1x10<-10>M, najpoželjnije manjom od 7.5x10<-11>M ili čak manjom od 5x10<-11>M, kao što je određeno korišćenjem tehnologije površinske plazmon rezonancije (SPR) u BIACORE instrumentu. Posebno, određivanje KDje izvedeno kao što je opisano u Primeru 2, odeljku 2.1.1.

Ukrštena reaktivnost sa TNFα iz cinomolgus majmuna ili iz rezus makaka

[0048] U posebnim izvođenjima, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska u suštini ima afinitet prema TNFα iz životinja kao što su cinomolgus majmuni (Macaca fascicularis) i/ili rezus makaki (Macaca mulatta). Ovo je prednost, kao što preklinički testovi anti-humanih TNFa antitela kao što su ispitivanja toksičnosti su poželjno izvedeni sa takvim životinjama. Prema tome, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska poželjeno ima ukrštenu reaktivnost sa TNFα iz životinja kao što su cinomolgus majmuni i/ili rezus makaki. Merenja afiniteta su izvedena kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.1.

[0049] U jednom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ukršteno reaguje sa TNFα iz Macaca fascicularis. Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska poželjno ima afinitet prema Macaca fascicularis TNFα koji je manji od 20-puta, poželjno je manji od 10-puta, još više posebno manji od 5-puta različit od onog za TNFα. Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska se vezuje za TNFα iz Macaca fascicularis sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD), pri čemu je odnos RM.fascicularis(i) KDza vezivanje sa TNFα iz Macaca fascicularis prema (ii) KDza vezivanjem sa humanim TNFα manji od 20.

RM.fascicularisje poželjno manje od 20, poželjno manje od 10, još više poželjno manje od 5.

[0050] U drugom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ukršteno reaguje sa TNFα iz Macaca mulatta. Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska poželjno ima afinitet prema Macaca mulatta TNFα koji je manji od 20-puta, posebno manji od 10-puta različit od od onog za TNFa. Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska se vezuje za TNFa iz Macaca mulatta sa ravnotežnom konstantnom disocijacije (KD), pri čemu je odnos RM.mulatta(i) KDza vezivanje sa TNFα iz Macaca mulatta prema (ii) KDza vezivanje sa humanim TNFα je manji od 20.

RM.mulattaje poželjno manje od 20, poželjno manje od 10.

[0051] U još drugom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ukršteno reaguje sa TNFα iz Macaca fascicularis i sa TNFα iz Macaca mulatta. Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska poželjno ima afinitet prema Macaca fascicularis TNFα koji je manji od 20-puta, poželjno manji od 10-puta, još određenije manju od 5-puta različito od onog za TNFα, i poželjno ima afinitet za Macaca mulatta TNFα koji je manji od 20-puta, poželjnije manji od 10-puta različito od onog za humani TNFα. Odnos RM.fascicularisantitela ili funkcionalnog fragmenta je poželjno manji od 20, poželjno manji od 10, još određenije manji od 5, i odnos RM.mulattaantitela ili funkcionalnog fragmenta je poželjno manji od 20, poželjno manji od 10.

Potencija za inhibiranje TNFα-indukovane apoptoze L929 ćelija

[0052] Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ima visoku potenciju za inhibiranje TNFαindukovane apoptoze L929 ćelija. U posebnom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ima potenciju da inhibira TNFα-indukovanu apoptozu L929 ćelija veću od one za poznato antitelo infliksimab.

[0053] Potencija u odnosu na infliksimab može da bude određena u L929 testu kao što je opisano u Prmeru 2, odeljak 2.1.2 u ovoj prijavi. Relativna potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska je veća od 1.5, poželjno je veća od 2, poželjnije je veća od 3, još poželjnije je veća od 5, poželjnije je veća od 7.5, ili je čak veća od 10, pri čemu je odnos relativne potencije (i) IC50vrednosti infliksimaba u L929 testu u odnosu na (ii) IC50vrednost antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska u L929 testu, i pri čemu IC50ukazuje na koncentraciju u ng/mL odgovarajućeg molekula koja je potrebna da bi se postiglo 50% maksimuma inhibicije TNFα-indukovane apoptoze L929 ćelija.

[0054] U drugom izvođenju, relativna potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska je veća od 1.5, poželjno je veća od 2, poželjnije je veća od 3, poželjnije je veća od 5, poželjnije je veća od 7.5, ili je čak veća od 10, pri čemu je odnos relativne potencije (i) IC90vrednosti infliksimaba u L929 testu prema (ii) IC90vrednosti antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska u L929 testu, i pri čemu IC90vrednost ukazuje na koncentraciju u ng/mL odgovarajućeg molekula koja je potrebna da bi se postiglo 90% maksimuma inhibicije TNFα indukovane apoptoze L929 ćelija.

Inhibicija LPS-indukovane sekrecije citokina

[0055] Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposobno da inhibira LPS-indukovanu sekreciju citokina iz monocita. LPS-indukovana sekrecija citokina iz monocita može da bude određena kao što je opisano u Primeru 7.

[0056] U jednom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposoban da inhibira LPS-indukovanu sekreciju interleukina-1β iz CD14<+>monocita. IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β je poželjno manja od 1 nM i/ili manja od 100 pg/mL. IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β, na molarnoj osnovi i/ili na osnovi težina-pozapremini, je poželjno niža od one za adalimumab.

[0057] U drugom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposoban da inhibira LPS-indukovanu sekreciju TNFα iz CD14<+>monocita. IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα je poželjno manja od 1 nM i/ili manja od 150 pg/mL. IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα, na molarnoj osnovi i/ili na osnovi težina-po-zapremini, je poželjno niža od one za adalimumab.

Inhibicija proliferacije ćelija

[0058] Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je obično sposoban da inhibira ćelijsku proliferaciju mononuklearnih ćelija iz periferne krvi u reakciji pomešanih limfocita. Inhibicija ćelijske proliferacije može da se odredi kao što je opisano u Primeru 6. Indeks stimulacije antitela ili funkcionalnog fragmenta, npr. scFv ili diatela iz pronalaska, određen prema Primeru 6, je poželjno manji od 5, poželjnije manji od 4.5. U posebnim izvođenjima, indeks stimulacije antitela, npr. IgG iz pronalaska, je manji od 4 ili je čak manji od 3.

Inhibicija interakcije između TNFα i receptora za TNF

[0059] Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposoban za inibiranje interakcije između humanog TNFα i receptora I zaTNF (TNFRI). Inhibicija interakcije između humanog TNFα i TNFRI može da bude u inhibiciji ELISA kao što je opisano u tekstu ispod u Primeru 2, odeljak 2.1.3.

[0060] Potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska da bi se inhibirala interakcija između humanog TNFα i TNFRI, u odnosu na onu za infliksimab (relativna potencija), kao što je određeno u ELISA testu inhibicije, je poželjno najmanje 2, pri čemu je pomenuta relativna potencija odnos vrednosti IC50u ng/mL infliksimaba prema IC50vrednosti u ng/mL antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.

[0061] Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposoban da inhibira interakciju između humanog TNFα i receptora II za TNF (TNFRII). Inibicija interakcije između humanog TNFα i TNFRII može da bude određena u ELISA testu inhibicije kao što je opisano u tekstu ispod u Primeru 2, odeljak 2.1.3.

[0062] Potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska da inhibira interakciju između humanog TNFα i TNFRII, u odnosu na onu za infliksimab (relativna potencija), kao što je određeno u testu inhibicije ELISA, je poželjno najmanje 2, poželjnije najmanje 3, pri čemu je pomenuta relativna potencija odnos IC50vrednosti u ng/mL infliksimaba prema IC50vrednosti u ng/mL antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.

1

Stehiometrija i ukršteno vezivanje

[0063] Antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je obično sposoban za vezivanje sa humanim TNFαTrimer u stehiometrijskom odnosu (antitelo: TNFαTrimer) od najmanje 2. Stehiometrija (antitelo : TNFαTrimer) je poželjno veća od 2, ili najmanje 2.5, ili najmanje 3. U jednom izvođenju, stehiometrija (antitelo: TNFαTrimer) je oko 3. Stehiometrija (antitelo : TNFαTrimer) može da bude određena kao što je opisano u Primeru 4 u tekstu ispod.

[0064] U drugom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je sposoban da obrazuje kompleks sa humanim TNFα, gde pomenuti kompleks sadrži najmanje dva molekula TNFα i najmanje tri molekula antitela ili funkcionalnog fragmenta. Funkcionalni fragment u skladu sa ovim izvođenjem sadrži najmanje dva različita mesta vezivanja za TNFα kao što su, npr. diatela. Obrazovanje kompleksa može da bude određeno kao što je opisano u Primeru 5 u tekstu ispod.

[0065] U jednom izvođenju, antitelo je IgG, i sposobno je da obrazuje kompleks od najmanje 600 kDa sa TNFα. U drugom izvođenju, funkcionalni fragment je diatelo, i sposoban je da obrazuje kompleks od najmanje 300 kDa sa TNFa.

Selektivnost za metu

[0066] U određenim izvođenjima, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska ima visoku selektivnost za metu, tj. može da napravi razliku između TNFα i TNFβ. Poželjno, IC50vrednost TNFβ je najmanje 1,000 puta veća od IC50vrednosti TNFα, kao što je određeno u kompetitivnoj ELISA što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4. Poželjnije, IC50vrednost TNFβ je najmanje 5,000 puta, najpoželjnije najmanje 10,000 veća od IC50vrednosti TNFα, kao što je određeno u kompetitivnoj ELISA što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4.

Prinos u ekspresiji i prinos u ponovom savijanju

[0067] U drugim izvođenjima, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska, poželjno scFv ili diatelo, može da bude rekombinantno ekprimiran u visokom prinosu kod mikroorganizama kao što su bakterije ili u drugim ćelijama. Poželjno, prinos ekspresije kod E. coli, koji je određen kao što je opisano u Primeru 2, je najmanje 0.25 g/L. Ovo se posebno odnosi na funkcionalne fragmente kao što su scFvs-i.

[0068] Prinos ponovnog savijanja, određen kao što je opisano u Primeru 2, je najmanje 5 mg/L, poželjnije najmanje 10 mg/L, poželjnije najmanje 15 mg/L, i najpoželjnije najmanje 20 mg/L. Ovo se posebno odnosi na funkcionalne fragmente kao što su scFv-i.

Stabilnost

[0069] Obično, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska, poželjno scFv ili diatelo, ima visoku stabilnost. Stabilnost može da bude ispitana korišćenjem različitih postupaka. "Temperatura topljenja" Tmvarijabilnog domena antitela ili funkcionalnog fragmenta iz pronalaska, određena diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF) kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.4, je poželjno najmanje 65°C, poželjnije najmanje 68°C, najpoželjnije najmanje 70°C. "Temperatura topljenja varijabilnog domena", kao što se ovde koristi, odnosi se na temperaturu topljenja scFv koji se sastoji iz sekvence VL - LinkerA - VH, pri čemu se aminokiselinska sekvenca LinkerA sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:49. Na primer, temperatura topljenja varijabilnog domena IgG je definisana kao temperatura topljenja njegovog odgovarajućeg scFv kao što je definisano gore u tekstu.

[0070] Gubitak u sadržaju monomera (u koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) posle skladištenja od četiri nedelje na 4°C, određeno analitičkom hromatografijom za isključivanje veličina kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, je poželjno manji od 5%, poželjnije manji od 3%, poželjnije je manji od 1%, najpoželjnije manji 0.5%. Gubitak u sadržaju monomera (u koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) posle skladištenja četiri nedelje na -20°C, određeno analitičkom hromatografijom za isključivanje veličina kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, je poželjno manji od 5%, poželjnije je manji od 3%, poželjnije manji od 1%, najpoželjnije manji od 0.5%. Gubitak u sadržaju monomera (na koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) posle skladištenja četiri nedelje na -65°C, određeno analitičkom hromatografijom za isključivanje veličina kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, je poželjno manji od 5%, poželjnije manji od 3%, poželjnije manji od 1%, najpoželjnije manji od 0.5%.

[0071] Gubitak monomera nakon pet uzastopnih ciklusa zamrzavanja-otapanja, određeno kao što se opisuje u Primeru 2, je manje od 5%, poželjnije manje od 1%, poželjnije manje od 0.5%, najpoželjnije manje od 0.2%, npr.0.1% ili 0.0%.

Antitela i funkcionalni fragmenti

[0072] Posebna izvođenja iz pronalaska se odnose na funkcionalne fragmente ovde opisanih antitela. Funkcionalni fragmenti uključuju F(ab’)2fragment, Fab fragment, scFv, diatela, triatela i tetratela. Poželjno, funkcionalni fragment je jednolančano antitelo (scFv) ili diatelo. Poželjnije, ne-CDR sekvence scFv ili diatela su humane sekvence.

[0073] Poželjno, da bi se minimizovao potencijal za imunogenost kod ljudi izabrana skela akceptora je sastavljen iz regiona okvira čitanja poreklom iz humanih konsenzusnih sekvenci ili humanih germinativnih sekvenci. U posebnim regionima okvira čitanja I do III varijabilnog lakog domena se sastoji iz humanih Vκ1 konsenzusnih sekvenci prema SEQ ID NO: 56 do 58 i regionom okvira čitanja IV λ germinativno zasnovanoj sekvenci koja je izabrana iz SEQ ID NO:59 do 62. Kako ostaci koji nisu humani konsenzusni ili humani germinativni ostaci mogu uzrokovati imunske reakcije broj takvih ostataka u svakom varijabilnom domenu (VH ili VL) treba da bude nizak što je više moguće, poželjno niži od 7, poželjnije niži od 4, najpoželjnije 0.

[0074] Poželjno antitelo je monoklonsko antitelo. Termin "monoklonsko antitelo" kao što se ovde koristi nije ograničeno na antitela poizvedena korišćenjem tehnologije hibridoma. Termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, i ne postupkom pomoću koga je proizveden. Monoklonska antitela mogu da se dobiju koristeći širok spektar tehnika koje su poznate u oblasti tehnike uključujuči upotrebu hibridoma, rekombinantnih, i postupaka fagnog prikaza, ili njihove kombinacije. (Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

[0075] U drugim izvođenjima, uključujući izvođenja koja se odnose na in vivo upotrebu anti-TNFα antitela kod ljudi, himerna, primatizovana, humanizovana, ili humana antitela mogu da budu korišćena. U poželjnom izvođenju, antitelo je humano antitelo ili humanizovano antitelo, poželjnije monoklonsko humano antitelo ili monoklonsko humanizovano antitelo.

[0076] Termin "himerno" antitelo kao što se ovde koristi odnosi se na antitelo koje ima varijabilne sekvence koje su izvedene iz ne-humanog imunoglobulina, kao što je antitelo iz pacova ili miša, i konstantnih regiona humanih imunoglobulina, uobičajeno izabranih iz matrice humanog imunoglobulina. U oblasti tehnike su poznati postupci za proizvodnju himernih antitela. Videti, npr., Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol.Methods 125: 191-202; U.S. Pat. Nos.5,807,715; 4,816,567; i 4,816397.

[0077] Različiti rekombinantni postupci su dostupni stručnjaku koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike da bi se omogućili ne-humana (npr., mišja) antitela koja su više slična humanim dobijanjem

1

imunoglobulina, njihovi imunoglobulinski lanci ili fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2ili druge ciljanje podsekvence za vezivanje antitela), koje sadrže minimalne sekvence koje su dobijene iz takvih ne-humanih imunoglobulina. Generalno, dobijeno rekombinantno antitelo će u suštini sadržati svaki od najmanje jednog, i obično dva, varijabilna domena, u kojima svaki ili u suštini svaki od CDR regiona odgovaraju onima u ne-humanom imunoglobulinu i svaki ili u suštini svaki od FR regiona su oni koji pripadaju humanoj imunoglobulinskoj sekvenci, posebno humanoj imunoglobulinskoj konsezusnoj sekvenci. CDR-graftovana antitela su molekuli antitela koji imaju jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR-i) iz antitela koje je originalno poreklom iz ne-humanih vrsta koje vezuje željeni antigen i regione okvira čitanja (FR) iz humanog imunoglobulinskog molekula (EP239400; PCT objava WO 91/09967; U.S. Patent Br-i. 5,225,539; 5,530,101 i 5,585,089). Često, u postupku koji je poznat pod imenom "humanizacija", ostaci okvira regiona u regionima humanog okvira čitanja će dodatno biti zamenjeni sa odgovarajućim ostatkom iz CDR donorskog antitela da bi se izmenilo, poželjno unapredilo, vezivanje antigena. Ove supstitucije u okvirima čitanja su identifikovane postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike, npr., modelovanjem interakcija C i ostataka regiona okvira čitanja da bi se identifikovali ostaci u regionima okvira čitanja koji su važni za vezivanje antigei poređenje sekvence da bi se identifikovali neuobičajeni ostaci u regionima okvira čitanja na određenim položajima. Videti, npr., Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7 i Queen etal, U.S. Patent Br.-i: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370. Antitela mogu da se održavaju više humanim korišćenjem različitih dodatnih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike uključujući, na primer, oblaganje ili restrutuiranje površine (engl.„veneering or resurfacing“) (EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka et al, 1994, Prot. Eng.7:805-814; Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973, i mešanje lanaca (U.S. Patent No. 5,565,332). CDR-graftovano ili humanizovano antitelo može takođe da sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično izabranog uzorka imunoglobulina.

[0078] U nekim izvođenjima, humanizovana antitela su dobijena kao što se opisuje u Queen et al, U.S. Patent No-i: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370.

[0079] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitela su humana antitela. Potpuno "humana" anti-TNFα antitela mogu da budu poželjna za terapeutsko lečenje humanih pacijenata. Kao što se ovde koristi, "humana antitela" uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i koji ne eksprimiraju endogene imunoglobuline. Humana antitela mogu da se dobiju različitim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike uključujući postupke fagnog prikaza koji su opisani gore u teksu korišćenjem biblioteka antitela dobijenih iz sekvenci humanih imunoglobulina. Videti U.S. Patent Br-e. 4,444,887 i 4,716,111; i PCT objave WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; i WO 91/10741. Humana antitela mogu takođe da budu proizvedena korišćenjem transgenih miševa koji nisu sposobni za eksprimiranje funkcionalnih endogenih imunoglobulina, ali koji mogu da eksprimiraju gene humanog imunoglobulina. Videti, npr., PCT objave WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Patent Br-i. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Potpuno humana antitela koja prepoznaju izabrani epitop mogu da se dobiju upotrebom postupka poznatog pod imenom "umerena selekcija." U ovom pristupu izabrano ne-humano monoklonsko antitelo, npr., mišje antitelo, je korišćeno za usmeravanje selekcije potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (Jespers et al, 1988, Biotechnology 12:899-903).

[0080] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitela su primatizovana antitela. Termin "primatizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje se sastoji iz varijabilnog regiona majmuna i humanih konstantnih

1

regiona. Postupci za proizvodnju primatizovanih antitela su poznati u oblasti tehnike. Videti npr., U.S. Patent Nos.5,658,570; 5,681,722; i 5,693,780.

[0081] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitela su derivatizovana antitela. Na primer, derivatizovana antitela koja su bila modifikovana, npr., glikozilacijom, acetilovanjem, pegilovanjem, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom (videti u tekstu ispod diskusiju o konjugatima antitela), itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može da bude izvedena korišćenjem poznatih postupaka, uključujući specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Dodatno, derivat može da sadrži jednu ili više ne-klasičinih aminokiselina.

[0082] U još drugim aspektima, anti-TNFα antitelo ima jednu ili više aminokiselina insertovanih u jedan ili više od njegovih hipervarijabilnih regiona, na primer kao što je opisano u US 2007/0280931.

Konjugati antitela

[0083] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitela su konjugati antitela koja su modifikovana, npr., kovalentnim vezivanjem bilo koje vrste molekula za antitelo, tako da kovalentno vezivanje ne interferira sa vezivanjem za TNFα. Postupci za konjugovanje efektorskih ostataka sa antitelima su dobro poznati u oblasti tehnike (Videti, npr., Hellstrom et al., Controlled Drag Delivery, 2nd Ed., at pp.

623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.62: 119-58 i Dubowchik et al., 1999, Pharmacology i Therapeutics 83:67-123).

[0084] U jednom primeru, antitelo ili njegov fragment je kombinovan pomoću kovalentne veze (npr., peptidne veze), na po potrebi N-kraju ili C-kraju, sa aminokiselinskom sekvencom drugog proteina (ili njegovim delom; poželjno dela proteina od najmanje 10, 20 ili 50 aminokiselina). Poželjno antitelo, ili njegov fragment, je spojen sa drugim proteinom na N-kraju konstantnog domena proteina. Postupci rekombinantne DNK mogu da budu korišćeni da bi se dobile kakve kombinacije, na primer kao što je opisano u WO 86/01533 i EP0392745. U drugom primeru efektorski molekul može da poveća poluživot in vivo. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, albumin, proteine za vezivanje albumina ili jedinjenja za vezivanje albumina kao što su ona koja su opisana u WO 2005/117984.

[0085] U nekim izvođenjima, anti-TNFα antitela mogu da budu vezana za poli(etilenglikol) (PEG) ostatke. Na primer, ukoliko je antitelo fragment antitela, PEG ostaci mogu da budu vezani preko bilo koji dostupan bočni aminokiselinski lanac ili funkcionalnu grupu terminalne aminokiseline koja je locirana u fragmentu antitela, na primer bilo koja slobodna amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupa. Takve aminokiseline mogu da se nalaze prirodno u fragmentu antitela ili mogu da budu modifikovane u fragment upotrebom postupaka rekombinantne DNK. Videti na primer U.S. Patent Br.

5,219,996. Brojna mesta mogu da budu korišćena za vezivanje dva ili više PEG molekula. Poželjno PEG ostaci su kovalentno vezani preko tiolne grupe sa najmanje jednim cisteinskim ostatkom lociranim u fragmentu antitela. Gde je tiolna grupa korišćena kao tačka vezivanja, na odgovarajući način aktivirani efektorski ostaci, na primer tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i derivati cisteina, mogu da budu korišćeni.

[0086] U drugom primeru, konjugat anti-TNFα antitela je modifikovani Fab’ fragment koji je PEGilovan, tj., za njega je kovalentno vezan PEG (poli(etilenglikol)), npr., prema postupku prikazanom u EP0948544. Videti takođe Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997);

1

i Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); i Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545.

Farmaceutske kompozicije i lečenje

[0087] Lečenje bolesti obuhvata lečenje pacijenata kojima je već dijagnostikovano da imaju bilo koji oblik bolesti u bilo kom kliničkom stadijumu ili ispoljavanju; odlaganje početka ili evolucija ili narušavanje ili pogoršanje simptoma ili znakova bolesti; i/ili prevencije i/ili smanjenja težine simptoma bolesti.

[0088] "Subjekt" ili "pacijent" kome se daje anti-TNFα antitelo ili njegov funkcionalni fragment može da bude sisar, kao što je ne-primat (npr., krava, svinja, konj, mačka, pas, pacov, itd.) ili primat (npr., majmun ili čovek). U određenim aspektima, čovek je pedijatrijski pacijent. U drugim aspektima, čovek je adultni pacijent.

[0089] Kompozicije koje se sastoje iz anti-TNFα antitela i, po potrebi jednog ili više dodatnih terapeutskih sredstava, kao što su druga terapetuska sredstva opisana u tekstu ispod, koja su ovde prikazana. Kompozicije se obično isporučuju kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova kompozicija može da bude u bilo kom poželjnom obliku (u zavisnosti od željenog načina davanja pacijentu).

[0090] Anti-TNFα antitela i funkcionalni fragmenti mogu da se daju pacijentu različitim načinima davanja kao što je oralno, transdermalno, subkutanozno, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, intratekalno, topikalno ili lokalno. Najpoželjniji način za davanje u bilo kom slučaju će zavisiti od posebnog antitela, subjekta, i prirode i težine bolesti i fizičkog stanja subjekta. Obično, anti-TNFα antitelo ili njegov funkcionalni fragment će se davati intravenozno.

[0091] U posebno poželjnom izvođenju, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je davan oralno. Ukoliko se davanje sprovodi preko oralnog načina davanja funkcionalni fragment je poželjno jednolančano antitelo (scFv), diatelo ili IgG.

[0092] U uobičajenim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili funkcionalni fragment se nalazi u farmaceutskoj kompoziciji u koncentraciji dovoljnoj da omogući intravenozno davanje na 0.5 mg/kg telesne težine do 20 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, koncentracija antitela ili fragmenta pogodnog za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama i postupcima uključuje 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, ili koncentraciju opsega između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti, npr., 1 mg/kg do 10 mg/kg, 5 mg/kg do 15 mg/kg, ili 10 mg/kg do 18 mg/kg.

[0093] Efikasna doza anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta može da bude opsega od oko 0.001 do oko 750 mg/kg po jednom (npr., bolus doza) davanju, višestruka davanja ili kontinuirano davanje, ili da bi se postigla koncentracija u serumu od oko 0.01-5000 μg/ml koncentracije u serumu po jednom (npr., bolus) davanju,višestrukim davanjima ili kontinuiranom davanju, ili bilo koji efikasan opseg ili vrednost time zavisi od stanja koje se leči, načina davanja i starosti, težine i stanja subjekta. U određenim izvođenjima, svaka doza može da bude opsega od oko 0.5 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne težine ili od oko 3 mg do oko 30 mg po kilogramu telesne težine. Antitelo može da bude formulisano kao vodeni rastvor.

[0094] Farmaceutske kompozicije mogu pogodno da budu predstavljene u jediničnim dozim oblicima koji se sastoje iz prethodno određene količine anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta po dozi. Takva jedinica može da sadrži 0.5 mg do 5 g, na primer, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100

1

mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, ili bilo koji opseg između bilo koje dve od gore navedenih vrednosti, na primer 10 mg do 1000 mg, 20 mg do 50 mg, ili 30 mg do 300 mg. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu da se široko razlikuju u oblicima u zavisnosti od, npr., stanja koje se leči ili načina davanja.

[0095] Određivanje efikasne doze, ukupnog broja doza, i dužine lečenja sa an anti-TNFα antitelom ili njegovim funkcionalnim fragmentom je dobro obuhvaćena sposobnostima stručnjacima iz oblasti tehnike, i može da se odredi upotrebom standardnog ispitivanja povećanja doze.

[0096] Terapeutske formulacije anti-TNFα antitela i funkcionalni fragmenti koji su pogodni u ovde opisanim postupcima mogu da se dobiju za skladištenje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa po potrebi farmaceutski-prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima koji su uobičajeno korišćeni u oblasti tehike (od kojih su ovde svi naznačeni sa "nosači"), tj., sredstva za puferovanje, sredstva za stabilizaciju, konzervansi, izotonifikatori, ne-jonski deterdženti, antioksidansi, i dodatni različiti aditivi. Videti, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th izdanje (Osol, ed. 1980). Takvi aditivi moraju da budu netoksični u odnosu na recipijente u korišćenim dozama i koncentracijama.

[0097] Sredstva za puferovanje pomažu da se pH održi u opsegu koji je približan fiziološkim uslovima. Mogu da se nalaze u koncentraciji opsega od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna sredstva za puferovanje uključuju oba i organske i neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr., smeša mononatrijum citrata-dinatrijum citrata, smeša limunske kiseline trinatrijum citrata, smeša limunske kiseline-mononatrijum citrata, itd.), pufera sukcinata (npr., smeša sukcinske kiselinemononatrijum sukcinata, smeša sukcinske kiseline-natrijum hidroksida, smeša sukcinske kiseline -dinatrijum sukcinata, itd.), tartratnih pufera (npr., smeša vinske kiseline-natrijum tartarata, smeša vinske kiseline-kalijum tartarata, smeša vinske kiseline-natrijum hidroksida, itd.), fumaratni puferi (npr., smeša fumarne kiseline-mononatrijum fumarata, smeša fumarne kiseline-dinatrijum fumarata, smeša mononatrijum fumarata-dinatrijum fumarata, itd.), glukonatni puferi (npr., smeša glukonske kiseline-natrijum glukonata, smeša glukonske kiseline-natrijum hidroksida, smeša glukonske kiselinekalijum glukonata, etc.), oksalatni pufer (npr., smeša oksalne kiseline-natrijum oksalata, smeša oksalne kiseline-natrijum hidroksida, smeša oksalne kiseline-kalijum oksalata, itd.), laktatni puferi (npr., smeša mlečne kiseline-natrijum laktata, smeša mlečne kiseline-natrijum hidroksida, smeša mlečne kiselinekalijum laktata, itd.) i acetatni puferi (npr., smeša sirćetne kiseline-natrijum acetata, smeša sirćetne kiseline-natrijum hidroksida, itd.). Dodatno, fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli kao što je Tris mogu da budu korišćeni.

[0098] Konzervansi mogu da budu dodati da bi se odložio rast mikroba, i mogu da se dodaju u količinama koje su opsega od 0.2%- 1% (mas/v). Pogodni konzervansi uključuju fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetolbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halogenide (npr., hloride, bromide, i jodide), heksametonijum hloride, i alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, i 3-pentanol. Izotonifikatori su nekada poznati pod imenom "stabilizatori" mogu da se dodaju da bi se osigurala izotoničnost tečnih kompozicija i uključuju polivodonične šećerne alkohole, poželjno trivodonične ili više šećere alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa koji mogu da variraju u funkciji od sredstva za povećanje mase do aditiva koji solubilizuje terapeutsko sredstvo ili pomaže da se spreči denaturacija ili vezivanje za zid posude. Uobičajeni stabilizatori mogu da budu polivodonični šećerni alkoholi (numerisani gore u tekstu); aminokiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol i slično, uključujući ciklitole kao što je inozitol; polietilen

1

glikol; polimeri aminokiselina; sredstva za redukciju koja sadrže sumpor, kao što je urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; polipeptidi niske molekulske težine (npr., peptidi od 10 ostataka ili manje); proteini kao štoje humani albumin iz seruma, albumin govečeta iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što su polivinilpirrolidon monosaharidi, kao što je ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što je laktoza, maltoza, saharoza i trisaaridi kao što je rafinoza; i polisagharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu da budu prisutni u opsegu od 0.1 do 10,000 masa po delu mase aktivnog proteina.

[0099] Ne-jonska površinska sredstva ili deterdženti (takođe poznat pod imenom "sredstva za vlaženje") mogu da budu dodati da bi se omogućilo solubilizovanje terapeutskog agensa kao i da bi se zaštitio terapeutski protein od slepljivanja indukovanog mešanjem, koje takođe omogućava da formulacija bude izložena smicanju površine pod naponom bez uzrokovanja denaturacije proteina. Pogodna ne-jonska površinska sredstva uključuju polisorbate (20, 80, etc.), polioksamere (184, 188 etc.), Pluronske poliole, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Ne-jonska površinska sredstva mogu da se nalaze u opsegu od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, ili u opsegu od oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.

[0100] Dodatni različiti ekscipijensi uključuju sredstva za zgrušnjavanje (npr., skrob), helirajuća sredstva (npr., EDTA), antioksidanse (npr., askorbinska kiselina, metionin, vitamin E), inhibitore proteaze i ko-rastvarače.

[0101] Ovde navedena formulacija može takođe da sadrži drugo terapeutsko sredstvo pored anti-TNFα antitela ili njegov funkcionalni fragment. Primeri drugih pogodnih terapeutskih sredstava su obezbeđeni ispod.

[0102] Dozni raspored može da se razlikuje od jednom mesečno do dnevnog u zavisnosti od broja kliničkih faktora, uključujući tip bolesti, težinu bolesti, i osetljivost pacijenta na anti-TNFα antitelo ili funkcionalni fragment. U specifičnim izvođenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov funkcionalni fragment je davan dnevno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, svakog drugog dana, svakih 5 dana, svakih 10 dana, svake dve nedelje, svakih tri nedelja, svakih četiri nedelja ili jednom mesečno, ili u bilo kom opsegu između bilo koje dve od gore navednih vrednosti, na primer od svakih četiri dana do svakog meseca, od svakih 10 dana do svake dve nedelje, ili od dva do tri puta nedeljno, itd.

[0103] Doza anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta koja je namenjena davanju će se razlikovati u zavisnosti od određenog antitela, subjekta, i prirode i težine bolesti, fizičkog stanja subjekta, terapeutskog režima (npr., da li je korišćeno drugo terapeutsko sredstvo), i izabranog načina davanja; odgovarajuća doza može brzo da bude određena od strane stručnjaka iz oblasti tehnike.

[0104] Od strane stručnjaka iz oblasti tehnike će biti prepoznato da će optimalna količina i razmak individualnih doza anti-TNFα antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta biti određena prirodom i obimom stanja koje se leči, oblikom, načinom i mestom davanja, i godinama i stanjem određenog subjekta koji se leči, i lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti. Ova doza se može ponavljati onoliko često koliko je potrebno. Ukoliko se neželjeni efekti razviju količina i/ili učestalost doze može da bude promenjena ili smanjena, prema normalnoj kliničkoj praksi.

Poremećaji koje treba lečiti

[0105] Pronalazak se odnosi na postupak lečenja ili prevencije humane bolesti povezane sa TNFα kod subjekta, koji se sastoji iz davanja subjektu antitela ili funkcionalnog fragmenta kao što je ovde definisano. Termin "poremećaj povezan sa TNFα" ili "bolest povezana sa TNFα" se odnosi na bilo koji poremećaj, početak, napredovanje ili trajanje simptoma ili stanja bolesti koje zahteva učestvovanje

2

TNFα. Primer poremećaja povezanih sa TNFα uključuju generalno hronična i/ili autoimunska stanja inflamacije, generalno imunski posredovane inflamatorne poremećaje, inflamatornu bolest CNS-a, inflamatorne bolesti koje pogađaju oko, zglob, kožu, mukozne membrane, centralni nervni sistem, gastrointestinalni trakt, urinarni trakt ili pluća, uopštena stanja uveitisa, retinitis, HLA-B27+ uveitis, Behčetova bolest, sindrom suvog oka, glaukom, Sjogrenov sindrom, dijabetes melitus (uključujući dijabetsku neuropatiju), insulinsku rezistenciju, uopšteno stanja artritisa, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis i Reiterov sindrom, juvenilni artritis, ankilozirajući spondilitis, multiple skleroza, Žilijan-Bar sindrom, mijastenija gravis, amiotrofna lateralna skleroza, sarkoidoza, glomerulonefritis, hronična bolest bubrega, cistitis, psorijaza (uključujući psorijazni artritis), hidradenitis suppurativa, panikulitis, pioderma gangrenozum, SAPHO sindorm (sinovitis, akne, pustuloza, hiperstoza i osteitis), akne, Sweet-ov sindrom, pemfigus, Kronova bolest (uključujući ekstraintestinalna ispoljavanja), ulcerativni kolitis, bronhijalna astma, pneumonitis izazvan preosetljivošću, alergije opšteg tipa, alergijski rinitis, alergijski sinuzitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), plućna fibroza, Wegener-ova granulomatoza, Kawasaki-jev sindrom, arteritis džinovskih ćelija, Čarg-Štrausov vaskulitis, poliarteritis nodoza, opekotine, bolest graft protiv domaćina, reakcije grafta protiv domaćina, reakcije odbacivanja koje prate transplantaciju organa ili koštane srži, generalna sistemska i lokalna stanja vaskulitisa, sistemski i kutanozni eritematozni lupus, polimiozitis i dermatomiozitis, sklerodermija, pre-eklampsija, akutni i hronični pankreatitis, virusni hepatitis, alkoholni hepatitis, posthirurška inflamacija kao što je posle operacije oka (npr. katarakta (zamena očnog sočiva) ili operacija glaukoma), operacija zgloba (uključujući artroskopsku operaciju), operacija na strukturama povezanim sa zglobom (npr. ligamentima), oralna i/ili dentalna operacija, minimalne invazivne kardiovaskularne procedure (npr. PTCA, aterektomija, ugrađivanje stenta), laparoskopske i/ili endoskopske intra-abdominalne i ginekološke procedure, endoskopske urološke procedure (npr. operacija prostate, ureteroskopija, cistoskopija, intersticijalni cistitis), ili perioperativna inflamacija (prevencija) uopšteno, bulozni dermatitis, neutrofilni dermatitis, toksična epidermalna nekroliza, pustularni dermatitis, cerebralna malarija, hemolitički uremijski sindrom, odbacivanje alografta, zapaljenje srednjeg uha, ujed zmije, eritema nodozum, mijelodisplastični sindromi, primarni sklerozirajući holangitis, seronegativna spondilarteropatija, autoimunska hematolitička anemija, orofacijalna granulamatoza, inflamatorni stomatitis (pyostomatitis vegetans), aftozni stomatitis, geografski jezik, migratorni stoimatitis, Alzhajmerova bolest, Parkinsonova boles, Huntingtonova bolest, Belova paraliza, Creutzfeld-Jakob-ova bolest i uopšteno neuro-degenerativna stanja.

[0106] Osteoliza povezana sa kancerom, inflamacija povezana sa kancerom, bol povezan sa kancerom, kaheksija povezana sa kancerom, metastaze na kostima, akutni i hronični oblici bola, bez obzira na to da li su uzrokovani sa centralnim ili perifernim efektima TNFα i da li se klasifikuju kao inflamatorni, nociceptvni ili neuropatski oblici bola, išijas, bol u donjem delu leđa, sindrom karpalnog tunela, sindrom kompleksnog regionalnog bola (CRPS), giht, postherpetična neuralgija, fibromijalgija, stanja lokalnog bola, sindromi hroničnog bola uzrokovani metastazom, dismenoreja.

[0107] Posebni poremećaji koje treba lečiti uključuju generalna stanja artritisa, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis, juvenilni artritis; psorijaza uključujući psorijazni artritis; inflamatornu bolest creva, uključujući Kronovu bolest, ulcerativni kolitis uključujući proktitis, sigmoiditis, kolitis leve strane, ekstenzivni kolitis i pankolitis, neodređeni kolitis, mikroskopski kolitis uključujući kolagenozni i limfocitni kolitis, kolitis u bolesti vezivnog tkiva, diverzijski kolitis, kolitis u divertikularnoj bolesti, eozinofilni kolitis i puhitis.

[0108] Poželjnije, antitelo ili funkcionalni fragment iz pronalaska je korišćen za lečenje inflamatorne bolesti creva, posebno Kronove bolesti, ulcerativnog kolitis ili mikroskopski kolitis. Kronova bolest može da bude bolest ileuma, debelog creva, ileodebelog creva ili izolovana gornja Kronova bolest (želudca, duodenuma i/ili jejuma) uključujući ponašanje bez-konstrikcije/ne-prodirujuće, sa konstrikcijom, prodiranjem i perianalna bolest, omogućavajući bilo koju kombinaciju lokalizacije i ponašanja bolesti prema bilo kom od prethodno pomenutih. Ulcerativni kolitis može da bude ulcerativni proktitis, proktosigmoiditis, kolitis leve strane, panulcerativni kolitis i puhitis.

Kombinovana terapija i drugi aspekti

[0109] Poželjno, pacijent koji se leči sa anti-TNFa antitelom ili njegovim funkcionalnim fragmentom je takođe tretiran sa drugim pogodnim lekom. Na primer, pacijent koji pati od inflamatorne bolesti creva, posebno ukoliko ima umerenu do ozbiljnu bolest je obično tretiran sa mesalazinom ili njegovim derivatima ili prolekovima, kortikosteroidima, npr. budesonidom ili prednizolonom (oralno ili i.v.), imunosupresantima, npr. azatioprin/6-merkaptopurin (6-MP) ili metotreksatom, ciklosporinom ili takrolimusom. Drugi lekovi koji mogu istovremeno da se daju pacijentu uključuju biološka sredstva kao što su infliksimab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol ili druge. Drugi lekovi koji se mogu istovremeno davati pacijentu uključuju imunosupresante (npr. azatioprin/6-MP ili metotreksat ili oralni ciklosporin) da bi se održala stabilna i duža remisija. Još drugi aspekt pronalaska je upotreba anti-TNFa antitela ili funkcionalnog fragmenta kao što je ovde definisano gore u tekstu za redukovanje inflamacije.

[0110] Još drugi aspekt iz pronalaska je anti-TNFα antitelo ili funkcionalni fragmenti kao što je ovde definisano gore u tekstu za upotrebu u redukovanju inflamacije kod pacijenta koji pati od inflamatornog stanja.

[0111] Dalji aspekt kao što je ovde opisano je postupak za lečenje inflamatornog stanja, koji se sastoji iz davanja pacijentu kome je potrebno efikasne količine anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta kao što je ovde definisano gore u tekstu. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od stanja koje se opisuje gore u tekstu.

[0112] Dalji aspekt kao što je ovde opisano je postupak za prevenciju inflamatornog stanja, koji se sastoji iz davanja pacijentu kome je potrebno efikasne količine anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta kao što je ovde definisano gore u tekstu. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od ovde opisanih stanja.

Tabela 1. Pregled aminokiselinskih sekvenci

(nastavak)

2 (nastavak)

Primeri

Primer 1: Dobijanje zečjih antitela usmerenih protiv humanog TNFα

1. Rezultati

1.1 Imunizacija

[0113] Zečevi su imunizovani sa prečišćenim rekombinantnim humanim TNFα (Peprotech, kat. br.300-01A). Tokom trajanja imunizacije, jačina humoralnog imunog odgovora protiv antigena je kvantitativno procenjena određivanjem maksimalnog razblaženja (titra) za serum iz svakog zeca koji još uvek proizvodi detektabilno vezivanje poliklonalnih antitela iz seruma za antigen. Titri serumskog antitela protiv immobilizovanog rekombinantnog humanog TNFα su ispitani korišćenjem enzimom-povezanog imunosorbentnog testa (ELISA, videti 2.2.1). Sva tri zečeva su pokazala veoma visoke titre sa 10 x 10<6>-puta razblaženjem seruma koji i dalje rezultuje u pozitivnom signalu (najmanje 3-puta većim od signala dobijenog sa serumum iz naivne nesrodne životinje koja je korišćena kao pozadinska kontrola) u ELISA. Dodatno, sposobnost različitog zečjeg seruma da inhibira biološku aktivnost TNFα je ispitana korišćenjem mišjeg testa zasnovanog na L929 ćelijama (videti 2.2.3). Sva tri seruma su inhibirala TNFαindukovanu apoptozu mišjih L929 fibroblasta. Zec #3 je pokazao najjaču neutrališuću aktivnost sa 50% inhibicijom (IC50) koja je dostignuta na razblaženju serumu 1:155’000. U poređenju sa zecom #3, zecom #2 i zecom #1 pokazalo je približno 3 i 21-puta nižu aktivnost, koja dostiže 50% inhibiciju na razblaženju seruma redom 1:55’500 i 1:7’210.

[0114] Limfociti izolovani iz slezina iz sve tri životinje su izabrani za naknadne postupke „hit“ identifikacije. Životinje su prioritizovane na osnovu potencije da se inhibira biološka aktivnost TNFα u L929 testu. Prema tome, najveći broj pogodaka koji su bili kultivisani je bio poreklom iz zeca #3, i najniži broj pogodaka je bio poreklom iz zeca #1.

1.2 „Hit“ Identifikacija

1.2.1 „Hit“ Sortiranje

[0115] Pre postupka „hit“ identifikacije, razvijen je postupak sortiranja koji je zasnovan na protočnoj citometriji koji specifično detektuje i omogućava izolaciju visokoafinitetnih TNFα vezujućih B-ćelija (videti 2.1).

[0116] Ukupno 33 x 10<6>limfocita (koji odgovaraju 1.5% ukupno izolovanih limfocita) koji su dobijeni iz sva tri zeca su karakterisani u dve nezavisne kampanje sortiranja. Od 33 x 10<6>ćelija analiziranih u ukupno 3452 B ćelije koje eksprimiraju TNFα-specifična antitela (IgG) su izolovana. Brojevi kloniranih limfocita su različiti za sva tri zeca, kao što je više ćelija izolovano iz ovih zečeva čiji su serumi pokazivali jaku inhibiciju TNFα u L929 testu. Od izolovanih B-ćelija, 792 klonova je dobijeno od zeca #1, 1144 klonova iz zeca #2 i 1408 klonova iz zeca #3. Za 108 klonova odgovarajuće zečje poreklo nije poznato, zbog toga što su oni dobijeni iz smeše preostalih limfocita iz sva tri 3 zeca da bi se omogućilo optimalno dobijanje male količine limfocita iz posuda.

1.2.2 „Hit“ Skrining

[0117] Rezultati koji su dobijeni tokom faze skrininga su zasnovani na testovima koji su izvedeni sa neprečišćenim antitelima iz supernatanta kultura ćelija koje sekretuju antitela (ASC), kao što skala visokopropusne kulture ne omogućava prečišćavanje individualnih zečjih antitela. Takvi supernatanti su korišćeni za rangiranje velikog broja antitela jedan u odnosu na drugi, međutim ne da bi se obezbedile apsolutne vrednosti (npr. za inhibiciju biološke aktivnosti TNFα), izuzev za afinitet vezivanja. ASC supernatanti su ispitani i visokopropusna ELISA za vezivanje sa rekombinantnim humanim TNFα. TNFα-vezujući supernatanti su dalje karakterisani za vezivanje sa TNFα poreklom od cinomolgus majmuna sa ELISA, kinetikama vezivanja i za njihov potencijal da neutralizuju biološku aktivnost humanog TNFα u L929 testu. Sa izuzetkom kinetika vezivanja, prijavljene vrednost visokopropusnog skrininga trebaju da se interpretiraju sa "da" ili "ne" odgovorima, koji su zasnovani sa merenjima u jednoj tački (odgovor bez doze). Afinitet prema TNFα cinomolgus majmuna i miša je analiziran za sva 102 klonova koji su izabrani za umnožavanje i sekvenciranje varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela.

1.2.2.1 Vezivanje za humani TNFα

[0118] Cilj primarnog skrininga je da se identifikuju ASC klonovi koji proizvode antitela specifična za humani TNFα. Za ovu svrhu, supernatanti ćelijske kulture 3452 ASC klonova su analizirani za prisustvo antitela prema humanom TNFα pomoću ELISA (videti 2.2.1). ELISA postupak koristi procenjuje "količine" antitela podtipa IgG vezanog za rekombinantni humani TNFa, međutim ne dajući informacije o afinitetu ili koncentraciji antitela. U ovom testu, supernatanti iz 894 ASC klonova proizveli su signal koji je jasno iznad pozadinskog. „Hit rate“ u skriningu je bila slična onoj za zeca #1 i zeca #2 sa 153 pogodaka od 792 (19.3%) identifikovanih iz zeca #1 i 225 pogodaka od 1144 identifikovanih iz zeca #2 (19.7%). Zec #3 je pokazao značajno veću stopu pogodaka od 34.4% dovodeći do identifikacije 484 pogodaka od 1408. Svih 894 pogodaka koji su identifikovani u ovom primarnom skriningu, su izloženi merenjima kinetika vezivanja sa SPR (sekundarni skrining).

1.2.2.2 Kinetike vezivanja TNFa

[0119] Cilj sekundarnog skrininga je da se dobije kvantitativna informacija o kvalitetu ciljnog vezivanja za svaki pogodak iz primarnog vezivanja korišćenjem površinske plazmon rezonancije (SPR, videti 2.2.2). U suprotnosti sa ELISA koja je korišćena tokom primarnog skrininga, ovaj postupak ispituje kinetike ciljanog vezivanja kao funkcije vremena. Ovo omogućava određivanje brzine konstanti za asocijaciju (ka) i disocijaciju (kd) antitela sa njegove mete. Odnos kd/kaobezbeđuje ravnotežnu konstantu disocijacije (KD), koja odražava afinitet antitela prema njegovoj meti. Od 894 pogodaka koji su identifikovani u primarnom skriningu, afiniteti vezivanja za humani TNFα bi mogli da budu određeni

2

za 839 monoklonskih zečjih antitela. Za preostalih 55 antitela afinitet nije mogao da bude izmeren zbog toga što je koncentracija antitela u ASC supernatantu bila ispod granice detekcije SPR instrumenta u odgovarajućoj postavci. 839 anti-TNFα antitela koja su mogla da se izmere su pokazala konstante disocijacije (KD) opsega od ispod 1.36 x 10<-13>M do 1.14 x 10<-8>M. 69% od svih analiziranih antitela je imalo KDispod 0.5 nM.

[0120] Srednje vrednosti KD2.21 x 10<-10>M i 2.09 x 10<-10>M za pogotke skrininga identifikovane od zečeva #2 i #3 su bile slične dok je zec #1 pokazao oko 2-puta veće vrednosti sa srednjom vrednosti KDod 4.65 x 10<-10>M. Uzimajući u obzir samo pogotke neutralizujućeg skrininga, distribucije afiniteta su bile slične za sve tri životinje sa nižim vrednostima za srednju vrednost KD(srednje vrednosti KDizmeđu 1.4 x 10<-10>M i 1.27 x 10<-10>M). Afiniteti ispod 0.041 nM, 0.029 nM i 0.026 nM su izmereni za 5% pogodaka skrininga za zečeve #1, #2 i #3, redom. Za 2% supernatanta, afiniteti su bili čak u nižem pikomolarnom opsegu (ispod 6.2 pM, 7.9 pM i 11 pM). Odličan prinos visoko-afinitetnih antitela koja su dobijena od sekundarnog skrininga obezbeđuje široku osnovu za odabir antitela koja naviše odgovaraju za humanizaciju i ponovno formatiranje.

1.2.2.3 Potencija

[0121] Za procenu potencije, test zasnovan na ćelijama (L929 test) je razvijen (videti 2.2.3).506 od 894 izabranih antitela (56.6%), su inhibirala TNFa-indukovanu apoptozu u L929 testu za više od 50%. U skladu sa rezultatima dobijenim tokom analize titra, najveći procenat neutralizujućih pogodaka je dobijen od zeca #3 sa stopom pogotka od 62.8%, zatim zec #2 sa stopom pogotka od 56.4% i zec #1 sa najnižom stopom pogotka 39.9%. Afiniteti ovih neutralizujućih antitela bili su opsega između 1.36 x 10<-13>do 1.19 x 10<-9>M.

1.2.2.4 Ukrštena reaktivnost vrsta (cinomolgus majmun)

[0122] Svih 894 pogodaka identifikovanih u primarnom skriningu, su analizirani za ukrštenu reaktivnost vrsta prema TNFα cinomolgus majmuna pomoću ELISA (videti 2.2.1). Cilj ovog dodatnog skrininga je bio da se omogući odabir ASC klonova za koje je poznato da ukršteno reaguju sa TNFα poreklom iz cinomolgus majmuna. ELISA postupak koristi "kvantitet" antitela podipa IgG vezanog za rekombinantni TNFα cinomolgus majmuna, međutim ne daje informaciju o afinitetu ili koncentraciji antitela. Supernatanti iz 414 (46%) klonova ASC su proizveli jasan signal (optička gustina (OD) ≥ 1). Procenat pogodaka ukrštene reaktivnosti sa TNFα cinomolgus majmuna je bio sličan za zeca #1 i zeca #3 sa 81 pogodaka od 153 (52.9%) identifikovanih od zeca #1 i 236 pogodaka od 484 identifikovanih od zeca #3 (48.8%). Sa 37.8%, zec #2 je pokazao blago niži procenat pogodaka ukrštene reaktivnosti dovodeći do identifikacije 82 pogodaka od 225.

1.2.2.5 Selekcija klonova za RT-PCR

[0123] Kao preduslov za potvrdu pogotka, analiza genske sekvence i naknadna humanizacija zečjih antitela, genetička informacija koja kodira varijabilni domen zečjeg antitela treba da se dobije. Ovo je urađeno reverznom transkripcijom (RT) odgovarajuće informacione RNK u komplementarnu DNK (cDNK), zatim umnožavanjem dvolančane DNK reakcijom polimeraze lanaca (PCR). Selekcija ASC klonova koji su podvrgnuti RT-PCR je primarno zasnovana na afinitetu i neutrališućoj aktivnosti. Kao dodati kriterijum razmatrana je ukrštena reaktivnost sa TNFα cinomolgus majmuna. Ukupno 102 ASC klonova su izabrani za kloniranje gena sa RT-PCR. Prvo, 93 najbolje rangiranih ASC (u terminima afiniteta) sa KDispod 80 pM, koji su inhibirali biološku aktivnost TNFα u L929 testu za više od 50% i koji su pokazali značajno vezivanje za TNFα cinomolgus majmuna su izabrani. Dodatno, svih 9 najbolje rangiranih ASC klonova sa KDispod 20 pM koji su neutralizovali aktivnost TNFα za više od 50% ali se

2

nisu vezali za TNFα cinomolgus majmuna su osim toga takođe izabrani. Ukupno, 12, 13 i 66 ASC klonova je uspešno umnoženo i sekvencirano iz zečeva redom #1, #2 i #3.

1.2.2.6 Identifikacija povezanih klonova sa željenim svojstvima

[0124] Da bi se karakterisao genetički diverzitet panela izolovanih ASC klonova sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR-e) su ekstrahovane i izložene su multiplom poravnanju sekvenci time omogućujući grupisanje sekvenci u filogenetskom drvetu. Dok ova analiza sa jedne strane omogućava selekciju različitog seta klonalnih sekvenci da se izvedu prema humanizaciji i eksperimentima ponovnog formatiranja takođe identifikuje homologne grupe klastera klonalnih sekvenci koje izgleda imaju zajednički parentalni B-ćelijski klon kod zeca. Oznaka ovih klastera sekvenci su visoka homologija sekvenci u CDR-a i nepromenjiv obrazac farmakodinamičkih svojstava. Obe ove karakteristike su sažeto prikazane za kluster od osam klonova u Tabelama 2 i 3. Pored funkcionalne konzervacije ovog klustera sekvenci konsenzusna sekvenca u Tabeli 3 otkriva da se može tolerisati određeni stepen varijabilnosti u CDR-a, sve dok dovodi do željenog farmakodinamičkog profila.

Tabela 3: Podaci sekvence koji slede u odnosu na CDR-e su dobijeni za gore navedene klonove:

2

2

1.2.2.7 Ukrštena reaktivnost sa TNFα cinomolgus majmuna (sa SPR)

[0125] Zbog velikog broja visokoafinitetnih pogodaka koji potentno neutralizuju TNFα, ukrštena reaktivnost vrsta je ispitana za sva monoklonska zečja antitela koja su izložena RT-PCR da bi se olakšala selekcija ASC klonova za „Hit“ potvrdu. Afiniteti prema TNFα cinomolgus majmuna su određeni sa SPR merenjima slično kao što je opisano gore u tekstu (videti takođe 2.2.2). Afiniteti 93 ispitana antitela za TNFa cinomolgus majmuna bila su opsega od 9.6 x 10<-12>do 2.1 x 10<-9>M.38 od 93 antitela sa ukrštenom reaktivnosti prema vezuju humani i TNFα cinomolgus majmuna sa sličnim afinitetom (manje od dvostruke razlike u KD). Osim toga, razlika u afinitetu između humanog i cinomolgusa je bila manja od 20-puta za 79 od 93 antitela sa ukrštenom reaktivnosti i manja od 10-puta za 62 od navedenih, što ih čini prihvatljivim za preklinički razvoj kod cinomolgus majmuna.

2. Postupci

2.1 Test sortiranja

[0126] Postupak sortiranja zasnovan na protočnoj citometriji za izolaciju antigen-specifičnih B-ćelija iz zečjeg limfnog tkiva je izveden kao što je prikazano u Lalor et al (Eur J Immunol.1992;22.3001-2011)

2.2 Skrining testovi

2.2.1 TNFα vezujuća ELISA (humani i TNFα cinomolgus majmuna)

[0127] Rekombinantni humani TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01) je obložen na mikrotitarsku ELISA ploču sa 96 bunarića. Vezivanje zečijih antitela u supernatantima ASC kulture sa imobilizovanim TNFα je detektovan sa sekundarnim HRP-obeleženim anti-zečjim IgG (Jacksonlmmuno Research, Cat. No.

111-035-046). TMB supstrat (3,3’,5,5’- tetrametilbenzidin, KPL, Cat. No. 53-00-00) je dodat i bojena reakcija je zaustavljena sa dodavanjem H2SO4. Ploče su čitane korišćenjem mikrotitarskog čitača ploča (Infinity čitač M200 Pro, Tecan) na talasnoj dužini od 450 nm. Izvođenje testa tokom kampanja skrininga je praćeno sa komercijalno dostupnom pozitivnom kontrolom anti-TNFα zečjim poliklonalnim antitelom (AbD Serotec, Cat. No.9295-0174). Za ovu svrhu antitelo poitivne kontrole je ispitano na 100 i 250 ng/ml u duplikatu na svakoj skrining ploči. Robustnost i preciznost odgovora pozitivne kontrole je praćen za svaku ploču. Na konačnim uslovima testa, odnos signal-pozadina je bio između 30 do 40 za pozitivnu kontrolu 250 ng/ml i koeficijent varijacije (CV) pozitivne kontrole su bili ispod 10%. Signal optičke gustine od ≥100% u odnosu na 250 ng/ml pozitivne kontrole je smatran primarnim pogotkom skrininga.

[0128] Za određivanje titra seruma, korišćena je ista ELISA postavka kao što je opisano gore u tekstu. Razblaženje seruma je smatrano pozitivnim kada je signal vezivanja imunog seruma bio najmanje 3-puta veći u poređenju sa signalom naivne nesrodne životinje.

[0129] Ukrštena reaktivnost vrsta prema cinomolgus majmunu je određena upotrebom slične ELISA kao što je opisano gore u tekstu. Rekombinanti TNFα cinomolgus majmuna (Sino Biological, Cat. No.

90018-CNAE) je obložen na mikrotitarske ELISA ploče sa 96 bunarića. Vezivanje zečjih antitela u

2

supernatantima ASC kulture prema imobilizovanim TNFa cinomolgus majmuna je detektovan sa HRP-obeleženim sekundarnim antitelom kao što je navedeno gore u tekstu. Imunski serum iz zeca #2 je korišćen kao pozitivna kontrola u razblaženju od 1:80’000 i 1:320’000. Robustnost i preciznost odgovora pozitivne kontrole je praćen za svaku ploču. Na konačnim uslovima testa, odnos signalpozadina je bio između 20 do 30 za pozitivnu kontrolu na razblaženju od 1:80’000 i CV-i pozitivne kontrole su bili ispod 10%.

2.2.2 Kinetike vezivanja za TNFα sa SPR (humani i cinomolgus majmun)

[0130] Afiniteti vezivanja antitela prema humanom TNFα su izmereni sa površinskom plazmon rezonancijom (SPR) korišćenjem MASS-1 SPR instrumenta (Sierra Sensors). Performansa na instrumentu je kvalifikovana sredstvima standardnim referentnim rastvorima kao i sa analizom referentne interakcije antitelo-antigen kao što je interakcija infliksimab-TNFα. Za skrining afiniteta, antitelo specifično za Fc region zečjih IgG-a (Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A) je imobilizovano na senzorskom čipu (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) upotrebom standardnog postupka za kuplovanje amina. Zečja monoklonska antitela u ASC supernatantima su uhvaćena sa imobilizovanim anti-zečjim IgG antitelom. Nakon hvatanja monoklonskih antitela, humani TNFα (Peprotech, Cat. No.300-01) je ubrizgan u protočne ćelije tokom 3 min u koncentraciji od 90 nM, i disocijacija proteina sa uhvaćenog IgG na senzorskom čipu je omogućena u trajanju od 5 min. Nakon svakog ciklusa injekcije, površine su regenerisane sa dve injekcije 10 mM Glicin-HCl. Očigledne konstante brzine disocijacije (kd) i asocijacije (ka) i očigledna ravnotežna konstanta disocijacije (KD) su izračunate sa MASS-1 softverom za analizu (Analyzer, Sierra Sensors) korišćenjem „one-toone“ Langmuir modela vezivanja i kvalitet uklapanja je praćen na osnovu relativnog Chi<2>(Chi<2>normalizovan sa ekstrapoliranim maksimalnim nivoom vezivanja analite), koji je mera za kvalitet uklapanja krive. Za većinu od „Hits“ relativna Chi<2>vrednost bila je ispod 15%. Rezultati su smatrani validnim ukoliko su jednice odgovora (RU) za vezivanje liganda bile najmanje 2% od RUs za hvatanje antitela. Uzorci sa RU za vezivanje liganda sa manje od 2% RUs za antitelo koje hvata su smatrani da ne pokazuju specifično vezivanje TNFα sa antitelom za hvatanje.

[0131] Ukrštena reaktivnost vrsta TNFα cinomolgus majmuna (Sino Biological, Cat. No.90018-CNAE) je izmerena korišćenjem iste postavke testa i koncentracije TNFα i primenom istih mera kvaliteta. Relativna Chi<2>je bila ispod 15% za većinu od analiziranih supernatanata ASC.

2.2.3 TNFα-indukovana apoptoza u L929 fibroblastima

[0132] Sposobnost zečijih IgG-a iz supernatanata ASC kulture da bi se neutralizovala biološka aktivnost rekombinantnog humanog TNFα je ispitana korišćenjem mišjih L929 fibroblasta (ATCC/LGC Standardi, Cat. No. CCL-1). L929 ćelije su senzibilisane prema TNFα-indukovanoj apoptozi dodavanjem 1 µg/ml aktinomicina D. Ćelije su kultivisane u mikrotitarskim pločama sa 96-bunarića sa ravnim dnom u prisustvu 50% supernatanta ASC kulture i 100 pM (5.2 ng/ml) humanog TNFα (Peprotech, Cat. No.300-01) tokom 24 h. U poređenju sa puferovanim antitelima, veće koncentracije TNFα moraju da budu korišćene u prisustvu ASC supernatanata za „hit skrining“. Preživljavanje ćelija je određeno sa kolorimetrijskim testom upotrebom WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumova so) reagens ćelijske proliferacije (Sigma Aldrich, Cat. No. 96992). WST-8 je redukovan ćelijskim dehidrogenazama do narandžastog proizvoda formazana. Količina proizvedenog formazana je direktno proporcionalan broju živih ćelija. Podaci su analizirani korišćenjem uklapanja logističke krive sa četiri parametra korišćenjem Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), i koncentracije infliksimaba potrebne da bi se neutralizovala TNFαindukovana apoptoza za 50% (IC50) je izračunata za koncentraciju od 36.2 ng/ml. Prema tome, procenjena niža granica detekcije za ovaj test je između 30 do 40 ng/ml. Ova vrednost je samo gruba procena za detekciju granice, s obzirom da potencijal a blokiranje TNFα ne zavisi samo od koncentracije monoklonskog antitela već takođe od afiniteta antitela prema meti. Međutim, senzitivnost testa je dovoljna za skrining ASC supernatanta s obzirom da koncentracije IgG u većini supernatanata ASC su iznad koncentracije 40 ng/ml. Supernatanti koji dovode do 50% neutralizacije TNFα-indukovane apoptoze su smatrani pozitivnim.

[0133] Da bi se osiguralo robustno izvođenje testa tokom kampanja skrininga antitelo pozitivne kontrole infliksimab je ispitano na 115 ng/ml (0.8 nM) i na 58 ng/ml (0.4 nM) u duplikatima na svakoj skrining ploči. Procenat inhibicije i preciznost odgovora za pozitivnu kontrolu je praćena za svaku skrining ploču. Kriterijum prihvatanja za svaku ploču su postavljeni prema sledećim: najmanje 60% inhibicije sa antitelom pozitivne kontrole na koncentraciji od 115 ng/ml sa koeficijentom varijacije (CV) ispod 20%.

Primer 2: Humanizacija i dobijanje scFv

1. Rezultati

1.1 Hit potvrda & odabir Hit-a za humanizaciju

[0134] 73 jedinstvena seta parentalnih zečjih varijabilnih domena lakog i teškog lanca su dobijeni tokom hit skrininga i analizirano je sa poravnanjem sekvenci. Na osnovu rezultata testa skrininga i homologije sekvence individualnih zečjih klonova IgG, 30 je izabrano za hit potvrdu.29 monoklonskih antitela je napravljeno i klonovi koji su se najbolje pokazali u terminima afiniteta i potencije su izabrani za humanizaciju i dobijanje vodećeg kandidata. Kriterijumi za selekciju klonova su bili i) neutralizacija humanog TNFα u L929 testu, ii) visok afinitet prema humanom TNFα, iii) ukrštena reaktivnost sa TNFα cinomologus i rezus majmuna, i iv) diverzitet sekvence. Jedan klon (16-22-H05) je izabran za humanizaciju – jedan od najbolje rangiranih IgG-a u terminima potencije da bi se neutralizovao humani TNFα u L929 testu. U odnosu na jačinu vezivanja, poželjan je najbolji mogući afinitet s obzirom da određni gubitak u afinitetu treba razumeti kao rezultat imunizacije i ponovnog formatiranja u scFv format.

[0135] Podaci za IgG klon No.16-22-H05 su prikazani u Tabeli 4.

1

1.2 Dobijanje i selekcija humanizovanih scFv fragmenata

[0136] Sekvence koje kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDR) su prenete u silico CDR-„loop grafting“ na skelu sekvence humanog varijabilnog domena kao što je opisano u WO 2014/206561. Dodatno, drugi konstrukt je dobijen po zečjem klonu, koji je preneo dodatne aminokiseline iz donorske sekvence na položajima od strukturalnog značaja za imunoglobulinske domene i pozicioniranje CDR. Veštački gen (sa optimizovanom upotrebom kodona za bakterijsku ekpresiju) koji kodira odgovarajuće humanizovano jednolančano antitelo Fv (scFv) je sintetisan (iz odgovarajućih varijabilnih lakih i teških lanaca). Zatim je proizveden polipeptid i nakon toga je karakterisan upotrebom sličnih testova kao što je opisano tokom „hit confirmation“.

1.2.1 Humanizacija i dobijanje humanizovanih scFv (APIs)

[0137] Humanizacija izabranog klona se sastoji iz transfera zečijih CDR-a akceptorski scFv okvir čitanja Vκ1/VH3 tipa kao što je opisano u WO 2014/206561. U ovom postupku, koji je šematski predstavljen na Slici 1, aminokiselinska sekvenca šest regiona CDR je identifikovano na donorskoj sekvenci (zečje mAt) i graftovano je na skeli akceptorske sekvence, pri čemu se dobijaju konstrukti koji su poznati pod imenom "CDR graft".

[0138] Pored toga, dizajniran je drugi graft, koji je uključio dodatne aminokiselinske modifikacije iz zečjeg donora na položajima L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 i H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (AHo numerisanje), koje su opisane da potencijalno utiču na pozicioniranje CDR i prema tome na vezivanje antigena (Borras et al. JBC. 2010; 285:9054-9066). Ovi humanizovani konstrukti su poznati pod imenom "strukturalni (STR) graft". U slučaju poređenja podaci karakterizacije za ova dva početna konstrukta su otkrila značajnu prednost da su dodatne varijante STR konstrukta bile dizajnirane da kombinuju CDR graftovan VL sa STR graftovanim VH. Pokazano je da je ova kombinacija često bila dovoljna da se zadrži aktivnost STR grafta (Borras et al., 2010, JBC, 285:9054-9066) i generalno bi bila poželjna sa manje ne-humanih izmena u humanoj akceptroskoj skeli da bi se smanjio rizik za narušavanje stabilnosti i takođe potencijala za imunogenost. Jednom kada je završen in-silico dizajn konstrukta koji se opisuje u prethodnom odeljku odgovarajući geni su sintetisani i konstruisani su bakterijski ekspresioni vektori. Sekvenca ekspresionih konstrukata je potvrđena na nivou DNK i konstrukti su dobijeni u skladu sa generičkom ekspresijom i protokolima za prečišćavanje.

[0139] Heterologna ekspresija proteina je sprovedena u E.coli kao nerastvorljivim inkluzionim telima. Ekresiona kultura je inokulisana sa polaznom kulturom u eksponencijalnom rastu. Kultivacija je sprovedena u posudama koje se mešaju u orbitalnoj mešalici korišćenjem komercijalno dostupnog bogatog medijuma. Ćelije su gajene do definisane OD600od 2 i indukovane su ekspresijom preko noći sa 1 mM Izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG). Na kraju fermentacije ćelije su sakupljene centrifugom i homogenizovane su izlaganjem ultrazvučnim talasima. U ovom trenutku nivo ekspresije različitih konstrukata je određen sa SDS-PAGE analizom ćelijskog lizata. Inkluziona tela su bila izolovana iz homogenizovanog ćelijskog peleta sa protokolom centrifugiranja koji je uključio nekoliko koraka pranja da bi se uklonio ćelijski debris i druge nečistoće ćelije domaćina. Prečišćena inkluziona tela su solubilizovana u denaturišućem puferu (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) i scFvs su ponovo savijeni sa merljivim protokolom za ponovno savijanje kojim su se dobile količine u miligramima prirodno savijenog, monomernog scFv. Standardizovan protokol je korišćen za prečišćavanje scFvs, koji je obuhvatao sledeće korake. Proizvod nakon ponovnog savijanja je uhvaćen sa afinitetnom hromatografijom korišćenjem Capto L agaroze (GE Healthcare) da bi se dobili prečišćeni scFvs. Vodeći kandidati koji su u početnom ispitivanju ispunili kriterijum afiniteta i potencije dalje su prečišćeni sa „polishing“ hromatografijom za isključivanje veličina korišćenjem HiLoad Superdex75 kolone (GE Healthcare). Nakon protokola prečišćavanja proteini su formulisani u puferovanom rastvoru soli i karakterisani su sa različitim biofizičkim, postupcima interakcije proteina i biološkim postupcima, što je opisano kao što sledi. Učinkovitost različitih konstrukata je poređena određivanjem konačnog prinosa prečišćenog proteina za količinu i normalizovanje ove vrednosti sa zapreminom 1 L za ponovno savijanje.

1.2.2 Biofizička karakterizacija humanizovanog scFv

[0140] Biofizička karakterizacija scFv u odnosu na stabilnost i produktivnost sastavljena je u Tabeli 5. Produktivnost i stabilnost scFv konstrukta je karakterisana sa različitim tačkama izveštavanja o ćemu će biti reči u narednim odeljcima.

[0141] scFv je ispiran prema određenom kriterijumu, kako je objašnjeno u nastavku. Kriterijum produktivnosti će osigurati da izabrani entitet scFv može da bude eksprimiran, ponovo savijen i prečišćen u dovoljnim količinama da podrži kasniji razvoj vodećeg molekula. Definisani kriterijumi su bili prinos ekspresije of scFv po litru fermentacionog bujona, kao što je ispitano sa SDS-PAGE, i prinos prečišćavanja postignut u generičkom laboratorijskom postupku, kao što je procenjeno merenjem količine prečišćenog proteina UV spektrometrijom, izračunato na 1 litar rastvora za ponovno savijanje. Kriterijumi stabilnosti su namenjeni da bi se procenila sklonost ka agregaciji tokom postupka dobijanja molekula i njhovog strukturnog integriteta tokom skladištenja i daljeg održavanja. Sadržaj monomera koji je određen sa SE-HPLC dozvoljava procenu koloidne stabilnosti molekula tokom postupka prečišćavanja (2.2.3). U narednoj studiji stabilnosti sadržaj monomera je ispitan tokom trajanja od 4 nedelje 1 i 10 mg/mL i skladištenja na 4, -20 i < -65°C. Dodatno, koloidna stabilnost proteina je ispitana posle 5 ciklusa zamrzavanja i otapanja. Kao dodatni parametar koji ukazuje na stabilnost, srednja tačka toplotnog razdvajanja je određena sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF) (2.2.4) da se obezbedi očitavanje za konformacionu stabilnost vodećih kandidata.

Tabela 5: Pregled podataka biofizičke karakterizacije za humanizovane scFv

1.2.2.1 Ispitivanje producibilnosti

[0142] Glavni kandidati scFv molekula su eksprimirani sa posudom za fermentaciju uz mešanje u serijskom modu i prečišćeni su generičkim procesom na lab-skali da bi se dobili uzorci proteina za dalju karakterizaciju. Tokom ovog postupka neki ključni parametri performansi su praćeni da bi se uporedili molekuli kandidati i da bi se identifikovale potencijalne teškoće za razvijanje konstrukata. Ekspresioni titar je određen na nivou sirovog lizata E.coli nakon sakupljanja ćelija centrifugiranjem. Tokom sakupljanja očekivan je mali gubitak ćelija, međutim, odabrano je da se ovaj faktor zanemari za izračunavanje prinosa ekspresije u korist konzervativnije procene producibilnosti. Za kvantifikaciju scFv proizvoda u lizatu komasi obojena redukujuća SDS-PAGE (2.2.1) je izabrana zbog visoke specifičnosti postupka koji dozvoljava razlikovanje proizvoda od proteina ćelije domaćina u uzorku. Drugi kriterijum za ispitivanje producibilnosti je prinos prečišćavanja scFv izračunat po litru rastvora za ponovno savijanje. Ovaj parametar se bavi potencijalnim uskim grlom u predviđenom proizvodnom procesu koji uključuje korak ponovnog savijanja proteina. S obzirom da se efikasnost postupka savijanja proteina

4

pokazala kao ograničavajuća u uporedivim proizvodnim postupcima odlučeno je da se uporede performanse različitih konstrukata u odnosu na producibilnost normalizovanu sa definisanom zapreminom za ponovno savijanje. Za izračunavanje prinosa konačan uzorak proteina iz svake grupe je kvantifikovan sa UV absorbancijom (2.2.2) i podeljen je sa stvarnom zapreminom za ponovno savijanje odgovarajućeg prečišćavanja (Tabela 6).

Tabela 6: Pregled podataka producibilnosti za dva humanizovana scFvs. Ekspresioni titar je određen sa kvantitativnim SDS-PAGE na lizatima u krajnjim tačkama proizvodnje ćelija. Grupni prinos je određen sa merenjima UV absorbancije konačne grupe za prečišćavanje. Prinos prečišćavanja je izračunat kao prečišćeni scFv po litru zapremine za ponovno savijanje.

1.2.2.2 Procena stabilnosti

[0143] Procena konformacione stabilnosti, monodisperznosti i strukturalnog integriteta scFv konstrukata je integralna komponenta za rangiranje različitih molekula u odnosu na razvijenost. Preduslov za poređenje od značaja različitih konstrukata je priprema prečišćenih molekula sličnog kvaliteta. Kriterijum "čistoća monomera" određen sa SE-HPLC je namenjen da osigura kompatibilan kvalitet različitih supstanci koje se ispituju. Pored SE-HPLC analize, SDS-PAGE za određivanje čistiće proteina i identiteta je izveden da bi se potvrdio uporediv kvalitet preparata koji se ispituju. SE-HPLC rezultati dva scFvs su otkrili da bi svi preparati mogli da budu prečišćeni do sadržaja monomera od ≥ 99% (Slika 2).

[0144] Ponašanje toplotnog razdvajanja glavnih kandidata je ispitano sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF) da bi se omogućilo rangiranje molekula u odnosu na njihovu očekivanu konformacionu stabilnost. Normalizovani grafikon neobrađenih podataka fluorescencije je prikazan na Slici 3, koja prikazuje duplikate merenja svakog uzorka. Uočeno je kooperativno ponašanje razdvajanja. Dva molekula 16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04 su pokazala Tmod 71.3 i 72.6°C redom. U drugom delu procene stabilnosti the monodisperznost molekula je praćena tokom trajanja od 4 nedelje na različitim temperaturama. Rezultati za ispitivanje stabilnosti i dobijeni sadržaji monomera su prikazani na Slici 4. Oba molekula (16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04) počinju na sadržaju monomera koji prelazi preko minimuma 95% monomera i gubi se manje od 5% monomera u odnosu na odgovarajuću početnu vrednost na koncentraciji od 10 mg/ml. U zamrznutom stadijumu na -20°C i <-65°C uzorci su pokazali samo minimalne razlike tokom vremena. Na najstrožim uslovima (4°C) gubitak molekula 16-22-H05-sc02 onoliko malo koliko je 0.2% monomera tokom 4 nedelje. Pored toga ispitivanje stabilnosti pod uslovima stresa sprovedeno je na temperaturi od 37°C i koncentraciji scFv od 10 mg/ml u trajanju od 4 nedelje. Pod ovim uslovom očekivano je strože razlikovanje sklonosti ka nakupljanju različitih proizvoda. Dobijeni podaci koji su prikazani na Slici 6 otkrili su gubitak u monomeru od 15% nakon 28 dana. Oba scFv su pokazala dobru stabilnost monomera pri uslovima stresa. Hromatogrami studije stabilnosti na 4°C su obezbeđeni na Slici 5, gde je prikazan uzorak u danu 0 i posle 28 dana na 4°C. U ovom hromatogramu je takođe prikazano preklapanje koje nastaje od stabilnosti pri zamrzavanju / otapanju. Za ovaj deo ispitivanja uzorci su sa ponavljanjem zamrzavani i otopljeni za ukupno 5 ciklusa. Dobijena kvantifikacija sadržaja monomera sa analitičkom SE-HPLC nije otkrila bilo koje promene u dva uzorka (Tabela 5). SDS-PAGE analiza je sprovedena za dva scFvs za generisanje dodatnih podataka za kvantifikovanje sa UV apsorbancijom, potvrđujući čistoću preparata uzorka i time dodeljuje specifičnost za kvantifikaciju sadržaja. U drugom aspektu ove analize SDS-PAGE rezultati su otkrili odsustvo degradiranja proteina tokom ispitivanja stabilnosti (28 dana na 4°C i koncentracije 10 mg/ml u poređenju sa uzorkom od dana 0 skladištenom na <-65°C), što je važna karakteristika iz perspektive razvijenosti.

[0145] Važno je primetiti da su izvedena različita ispitivanja u okviru ove procene koja se bave različitim mehaničkim aspektima proteinske stabilnosti. Određivanje temperature toplotnog odvijanja proteina će dati komplementarne rezultate merenju monodisperznosti sa SE-HPLC nakon skladištenja na povišenoj temperaturi. Dok su oba postupka dizajnirana da daju procenu potencijalnog roka trajanja proizvoda i stabilnosti naznačeni mehanizmi su značajno različiti. Srednja tačka prelaza (Tm) koja je ispitana sa termalnim razdvajanjem je kvalitativna mera za stabilnost proteinskog domena (ne omogućava termodinamičko određivanje ΔG). Manje je verovatno da se visoko stabilni proteinski domeni (visoka Tm) spontano razdvoje na ambijentalnoj temperaturi i samim tim su manje skloni ireverzibilnom nakupljanju/precipitaciji koje je vođeno interakcijama sa nesavijenim domenima. Visoka stabilnost domena ukazuje na gusto pakovanje aminokiselinskih ostataka, koje je takođe u korelaciji sa rezistencijom prema proteaznom cepanju. SE-HPLC procena sa druge strane kvantitativno određuje sadržaj frakcije monomera kao i rastvorljivih oligomera/agregata. Takvi rastvorljivi oligomeri su često reverzibilni i relativno slabe veze su vođene elektrostatičkim ili hidrofobnim interakcijama između ispravno savijenih proteina. Postoji određeni stepen korelacije između Tmkao što je procenjeno sa termalnim razdvajanjem i sklonosti ka obrazovanju oligomera/agregata kao što je ispitano sa SE-HPLC posebno za proteine sa "graničnom linijom" stabilnosti. Iznad određenog praga Tmod približno 60°C varijabilnih domena antitela su generalno dovoljno stabilni da budu rezistentni prema nakupljanju/precipitaciji i proteolitičkoj degradaciji zbog parcijalnog razdvajanja proteina na ambijentalnoj temperturi. Oligomerizacija vođena sa hidrofobnim i/ili elektrostatičkim interakcijama površinskih ostataka može, međutim, ipak da se dogodi. Važno, u ubrzanom (stresnom) ispitivanju stabilnosti na povišenoj temperaturi (npr. 37°C) različiti mehanizmi za obrazovanje oligomera i precipitacija mogu istovremeno da se dogode.

1.2.3 Karakterizacija in vitro vezivanja i aktivnosti humanizovanih scFv-a

[0146] U nastavku humanizedi scFv-i su karakterisani in vitro za njihova svojstva ciljnog vezivanja i potencije. Analizirane su kinetike vezivanja (ka, kdi KD) prema humanom TNFα i potencija da se neutralizuje TNFα-indukovana apoptoza L929 fibroblasta. Dodatno, potencija da se inhibira cinomolgus majmun (Macaca fascicularis) i rezus majmun (Macaca mulatta) TNFα indukovana apoptoza kao i potencija da se inhibira interakcija između humanog TNFα i TNFRI/TNFRII sa ELISA i određena je ciljana selektivnost za vezivanje sa TNFα u odnosu na TNFβ.

[0147] Za razumevanje rezultata u tekstu ispod važno je primetiti da oba, transfer zečjih CDR-a na skelu humanog varijabilnog domena kao i promena u formatu od pune velićine IgG do scFv fragmenta može imati uticaja na farmakološka svojstva. Na primer, određeni gubitak u afinitetu je obično u vezi sa humanizacijom. Dalje, zbog manje veličine scFv u poređenju sa IgG sposobnost scFv da interferira sa interakcijom partnera preko sternih smetnji je u velikoj meri smanjena. Zadnje, ali ne najmanje važno primećeno je da zbog njegovog bivalentnog načina vezivanja sa homo-trimernim TNFα, afinitet parentalnog IgG može da bude prijavljen kao previše visok (SPR artefakt). Prema tome, kada se uporede afiniteti između parentalnog bivalentnog zečjeg IgG i humanizovanog monovalentnog scFv, prijavljeni "gubitak u afinitetu" može da bude precenjen.

1.2.3.1 Afinitet

[0148] Afinitet humanizovanih scFvs prema humanom TNFa je određen sa SPR merenjima (videti takođe 2.1.1). Afinitet je određen upotrebom 2-strukih serijskih razblaženja odgovarajućih scFvs. scFvs su dobijeni od zečjeg monoklonskog antitela. Dobijene su dve varijante scFv, poznate pod imenom "CDR" (CDR) i "strukturalni graft" (STR). Da bi se ispitao relativni doprinos supstitucija u okvirima čitanja u lakom i teškom lancu i moguće da se smanji broj ostataka zečjih aminokiselina koje su ugrađene u humani okvir čitanja, izvedeni su eksperimenti mešanja domena. Prema tome, scFv konstruktu koji sadrže laki lanac sa graftovanim CDR i strukturalni graftovani teški lanac (CDR/STR) dobijeni su za klon 16-22-H05.

[0149] scFvs 16-22-H05-sc02 (STR) i 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) koji su rangirani u vrhu vezuju se redom sa afinitetima 4.5 x 10-11i 1.1 x 10<-10>M.16-22-H05-sc04 je pokazao samo malo smanjenje afiniteta kada se uporedi sa njegovom varijantom "strukturalnog grafta" (16-22-H04-sc02) (videti Tabela 7). Ovi rezultati ukazuju da afinitet humanizovanih scFv uglavnom zavisi od nekoliko zečjih aminokiselna koje su uvedene u humani okvir čitanja teškog lanca.

1.2.3.2 Potentnost

[0150] Sposobnost humanizovanih scFv da neutralizuju humani TNFa je analizirana korišćenjem L929 testa (videti takođe 2.1.2). Potentnost (IC50i IC90) da neutralizuju TNFa indukovanu apoptozu je analizirana za 16-22-H5 dobijenim scFvs i upoređena je sa potencijom referentnog antitela infliksimaba da se uporede vrednosti IC50i IC90sa različitim pločama testa. Relativne IC50i IC90vrednosti su izračunate u masenim jedinicama (ng/ml) infliksimaba i scFvs. Analize potentnosti su izvedene nekoliko puta u različitim danima sa različitim serijama fragmenata antitela. Slika 7 prikazuje reprezentativne krive doze odgovora iz jednog eksperimenta za svaki od dva scFv-a. Srednje vrednosti merenja replikata su prikazane u Tabeli 7 (standardne devijacije su prikazane u legendi tabele).

[0151] Humanizovani scFvs su inhibirali TNFα indukovanu apoptozu sa nižim IC50i IC90vrednostima u odnosu na infliksimab (videti Tabelu 7). U skladu sa SPR rezultatima, varijanta sa promenjenim domenom 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) ispoljila je jednaku potenciju kada je upoređena sa sktrukturalnim graftom 16-22-H05-sc02 (STR). scFvs 16-22-H05-sc04 i 16-22-H05-sc02 su pokazali odlične TNFα-neutralizujuće aktivnosti, sa vrednostima IC50od redom 14.6- i 13.1-puta boljim u odnosu na infliksimab. IC90vrednosti od 16-22-H05-sc04 i 16-22-H05-sc02 su redom bile 13.1- i 12.6-puta bolje u odnosu na vrednosti za infliksimab. Kao što je uočeno za parentalna zečja monoklonska antitela nije bilo jasne korelacije između afiniteta i potencije antitela (korelacija nije prikazana). Osim toga, scFv koji je izveden iz 16-22-H05 je pokazao najveće afinitete (16-22-H05-sc02 (STR) i 16-22-H05-sc04 (CDR/STR)) takođe je pokazao najveću potenciju. Dodatno, rezultati iz testova neutralizacije ukazuju na to da određeni afinitet praga treba da bude postignut za efikasnu inhibiciju signalizacije preko TNFα. Na primer, scFv-i 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) i 17-20-G01-sc01 (CDR), koji se svi vezuju za TNFa sa afinitetima iznad 1 nM, pokazuju slab potencijal za neutralizovanje TNFa (nije prikazano).

1.2.3.3 Ukrštena reaktivnost vrsta (TNFα Cynomolgus i Rhesus majmuna)

[0152] Ukrštena reaktivnost vrsta za rangiranje scFvs u vrhu je određena korišćenjem dva postupka: 1) potencija da se neutralizuje TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna u L929 testu i 2) afinitet prema TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna sa SPR. Potencija za neutralizovanje TNFα iz različitih vrsta je određena sa L929 testom slično kao što je opisano gore u tekstu za humani TNFα korišćenjem TNFα redom iz cinomolgus majmuna i rezus majmuna (videti takođe 2.1.2). TNFα iz obe vrste je pokazao veoma sličnu potenciju za indukovanje apoptoze L929 (podaci nisu prikazani). Prema tome, iste koncentracije humanog i TNFα majmuna su korišćene za ispitivanje ukrštene reaktivnosti vrsta. Dodatno, kinetike vezivanja (sa SPR) za TNFα iz cinomolgus majmuna i rezus majmuna su određene korišćenjem sličnog testa kao za humani TNFα (videti takođe 2.1.1).

[0153] Svi scFvs koji su dobijen iz klona 16-22-H05 pokazao je ukrštenu reaktivnost sa TNFα iz cinomolgus majmuna i rezus majmuna (videti Tabelu 7). Afiniteti su bili slični, odnosno 2.0 x 10<-10>i 2.3 x 10<-10>M redom za cinomolgus majmuna i rezus majmuna. Razlika u afinitetu između humanog i TNFα majmuna bila je oko 5-puta. Potencije za neutralizovanje TNFα redom iz cinomolgus majmuna, rezus majmuna i čoveka bile su u dobroj korelaciji sa afinitetima prema respektivnim TNFα. Shodno tome, dva klona izvedena iz 16-22-H05 pokazala su između 5- do 7-puta niže potentnosti prema TNFα majmuna u poređenju sa humanim TNFα (videti Tabelu 7 i Sliku 8). Da rezimiramo, dva scFv-a pokazala su ukrštene reaktivnosti vrsta TNFα iz cinomolgus majmuna i rezus majmuna.

1.2.3.4 Blokiranje interakcije humanog TNFα-TNFRI/II

[0154] Pored L929 testa, potentnost svakog humanizovanog scFv da inhibira interakciju između humanog TNFα i TNFRI/II je ispitana sa ELISA (videti 2.1.3). Slično sa L929 testom, individualne IC50vrednosti na svakoj ploči su kalibrisane protiv IC50referentnog molekula infliksimaba koji je uzet na svakoj ploči i relativne IC50i IC90vrednosti su izračunate u masenim jedinicama (ng/ml) Infliksimaba i scFvs.

[0155] Testovi neutralizacije mogu da razlikuju potentnosti ciljnih blokirajućih antitela samo ukoliko se oni vezuju za metu sa ravnotežnom konstantom vezivanja (KD) koja je veća od ciljane koncentracije koja je korišćena u testu potentnosti (KD> ciljne koncentracije). Za L929 test koncentracija TNFα od 5 pM je korišćena dok u TNFRI/II ELISA testovima inhibicije korišćena je koncentracija TNFα od 960 pM. Prema tome, teorijski, test L929 može da bude između scFvs sa KD> 5 pM, dok ELISA test inhibicije može da napravi razlike u potentnosti između scFvs sa KD> 960 pM. S obzirom da svaki od analiziranih scFvs pokazuje KDispod 960 pM, potentnosti između scFv sa različitim afinitetima (ali sličan mehanizam delovanja) može se razlikovati samo u testu L929.

[0156] 16-22-H5-sc02 i 16-22-05-sc04 su pokazali potentnosti za blokiranje interakcije TNFα-TNFRI između 2.8 i 3.5-puta veću u poređenju sa infliksimabom dok je potentnost u poređenju sa infliksimabom u L929 testu bila značajno veća (13.1 i 14.6-puda). Kada se uporedi sa relativnim IC50 vrednostima za parentalni zečji IgG (videti Tabelu 2) sa relativnom IC50vrednostima za humanizovana scFv (Tabela 7) potentnosti scFv su malo veće u poređenju sa parentalnim IgG iako su generalno afiniteti u istom opsegu za parentalno zečje IgG. S obzirom da su potentnosti antitela i scFvs upoređene u masenim jedinicama, broj valencija (mesta vezivanja TNFa) na svakoj koncentraciji je oko 2.9-puta veća za monovalentni scFvs u poređenju sa više od pet-puta težim ali bivalentnim IgG. Sa veoma visokim-afinitetom vezivanja scFvs, ovo dovodi do potentnijeg vezivanja interakcije TNFα i TNFRI/II zbog toga što nedostatak aviditeta više nije kritičan za afinitet. Suprotno tome, sa nisko afinitetnim monovalentnim domenima objavljeno je suprotno (Coppieters et al. Arthritis & Rheumatism, 2006; 54:1856-1866). Iz gore pomenutih razloga, rezultati za ELISA inhibiciju nisu korišćeni za rangiranje potentnosti između različitih antitela već primarno za poređenje potencijala antitela da blokiraju interakciju sa TNFRI u odnosu na TNFRII. Ispitani scFv-i blokirali su interakciju između oba TNFα receptora sa uporedivim potencijama (Tabela 9, Slika 9 i Slika 10).

1.2.3.5 Ciljana specifičnost (Selektivnost za vezivanje TNFα u odnosu na TNFβ)

[0157] Specifičnost dva scFvs (16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04) za TNFα u odnosu na TNFβ je potvrđena sa procenom relativnog potencijala TNFβ u poređenju sa TNFα da napola-maksimalno inhibira vezivanje TNFα sa svakim scFv i izmereno je u kompetitivnom ELISA (videti takođe 2.1.4). Kvalitet rekombinantnog humanog TNFβ bio je analiziran za 1) čistoću sa SDS-page i HPLC analizom, i 2) biološku aktivnost u mišjem testu citotoksičnosti L929, od strane proizvođača proteina. Kao što je prikazano na Slici 11, interakcija između svakog od scFvs sa biotinilovanim TNFα je blokirana sa neobeleženim TNFα sa IC50vrednostima opsega od 60 do 260 ng/ml, dok TNFβ nije pokazao bilo kakav značajan efekat čak i na najvećoj ispitanoj koncentraciji TNFβ (1250 µg/ml). Prema tome, svaki od analiziranih scFvs specifično se vezao za TNFα ali ne za njegov najbliži homolog, TNFβ. TNFβ nije pokazao bilo kakvu značajnu inhibiciju vezivanja TNFα sa scFvs na ispitanim koncentracijama. Prema tome, koncentracija TNFβ koja je potrebna da upola-maksimalno inhibira vezivanje TNFα mora da bude značajno veća u odnosu na najveću koncentraciju TNFβ koja je korišćena u testu (1250 µg/ml). Kada se uporede koncentracije TNFa i TNFβ potrebne da upola-maksimalno inhibiraju vezivanje TNFα sa scFvs, selektivnost za vezivanje sa TNFα u odnosu na TNFβ je značajno veća u odnosu na približno 5000 do 20’000 puta za svaki od ispitanih fragmenata (videti takođe Tabelu 7). Prema tome, malo je verovatno da se pojavi vezivanje koje nije specifično za metu bilo kog od scFvs.

[0158] Rezultati gore opisanih eksperimenata su prikazani u tabelama 7 do 9.

2. Postupci

2.1 Glavni testovi karakterizacije

2.1.1 Kinetike vezivanja i ukrštena reaktivnost vrsta sa SPR

[0159] Afiniteti vezivanja scFvs prema humanom TNFa su mereni sa površinskom plazmon rezonancijom (SPR) korišćenjem MASS-1 SPR instrumenta (Sierra Sensors). Izvođenje SPR testa je kvantifikovano analizom interakcije antitela antigena kao što je interakcija certolizumab-TNFα. Pegilovani Fab-fragment certolizumaba je izabran kao referentni zbog njegovog načina monovalentnog vezivanja sličnog onom za scFvs. Korišćenjem iste postavke testa kao za merenja afiniteta scFvs, vrednost koja iznosi 9.94 x 10-11M je određena za afinitet certolizumaba prema TNFa. Ova vrednost se dobro slaže sa objavljenim KDvrednostima 9.02 ± 1.43 x 10<-11>M (BLA certolizumab; BLA broj: 125160; datum podnošenja: April 30, 2007).

[0160] Za merenja afiniteta scFvs humanog TNFa (Peprotech, Cat. No. 300-01) je imobilizovan na senzorskom čipu (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors) kuplovanjem amina da se dostigne nivo imobilizacije 50 do 100 RUs (nivoi imobilizacije postignuti tokom analize SPR su bili između 40 do 120 RUs). U prvom koraku, skrining afiniteta scFvs je izveden korišenjem samo jedne koncentracije scFv (90 nM). U drugom koraku, za najbolje izvođenje scFvs, kinetike ciklusa jednog ubrizgavanja (SiCK) su merene sa jednog ciklusa ubrigavanja istovremenim ubrizgavanjem uzoraka šest analita u različitim koncentracijama u svaki od osam paralelnih kanala u MASS-1 sistemu. Za skrininge afiniteta, humanizovani scFvs su ubrizgani u ćelije u protoku u koncentraciji od 90 nM u trajanju od tri minuta i disocijacija je praćena tokom 12 minuta. Za sledeća preciznija određivanja afiniteta, dvostruka serijska razblaženja scFv opsega od 45 do 1.4 nM su ubrizgavana u ćelije u protoku u trajanju od tri minuta i disocijacija proteina sa TNFa imobilizovanog na senzorskom čipu je omogućena da traje 12 minuta. Očigledne konstante brzine disocijacije (kd) i asocijacije (ka) i očigledna ravnotežna konstanta disocijacije (KD) su izračunate sa MASS-1 softverom za analizu (Analyzer, Sierra Sensors) upotrebom 2

jedan-na-jedan Langmuir modela vezivanja i kvalitet uklapanja je praćen na osnovu Chi , što je mera za kvalitet uklapanja krive. Što je manja vrednost za Chi<2>preciznije je uklapanje sa jedan-na-jedan Langmuir modelom vezivanja. A skrininge afiniteta, rezultati su smatrani validnim ukoliko je Chi<2>bila ispod 10 za koncentraciju koja je analizirana. U slučajevima gde je analizirano nekoliko scFv koncentracija, rezultati su smatrani validnim ukoliko je srednja vrednost Chi<2>u odnosu na sve ispitane koncentracije bila ispod 10. Kriterijumi za prihvatanje su ispunjeni za sve ispitane scFvs.

[0161] Ukrštena reaktivnost vrsta sa cinomolgus majmunom (Sino Biological, Cat. No.90018-CNAE) i rezus majmunom (R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFa (Peprotech, Cat. No. 315-01A) je izmerena korišćenjem iste postavke testa i primenom istih kvalitativni mera kao što je opisano gore u tekstu za humani TNFa. Za cinomolgus i rezus majmune postignuti su nivoi imobilizacije TNFa opsega redom od 50 do 180 RUs i od 90 do 250 RUs. scFvs su analizirani korišćenjem dvostrukih serijski razblaženja sa koncentracijama opsega od 45 do 1.4 nM. Srednje vrednosti Chi<2>su bile ispod 10 za svaki od ispitanih scFvs.

2.1.2 TNFa-indukovana apoptoza kod L929 fibroblasta (neutralizacija humanog, ne-humanog primata i TNFa sa scFvs)

[0162] Sposobnost scFvs da neutralizuje biološku aktivnost rekombinantnog humanog TNFa je ispitana korišćenjem mišjih L929 fibroblasta (ATCC/LGC Standardi, kat. ro. CCL-1). L929 ćelije su senzibilisane sa TNFa-indukovanom apoptozom dodavanjem 1 µg/ml aktinomicina D. Trostruka serijska razblaženja anti-TNFa referentnog antitela ili scFvs (3000-0.05 ng/ml) i 5 pM rekombinantnog humanog TNFa (Peprotech, Cat. No. 300-01) prethodno su inkubirane na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata. Korišćena koncentracija TNFa (5 pM) imdukuje submaksimalnu apoptozu L929 (EC90). Nakon dodavanja smeše agonista/inhibitora ćelije su inkubirane u trajanju od 24 sa. Preživljavanje ćelija je određeno kolorimetrijkim testom korišenjem WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumove soli) reagensa ćelijske proliferacije (Sigma Aldrich, Cat. No.96992). WST-8 je redukovan sa ćelijskim dehidrogenazama do narandžastog proizvoda formazana. Količina proizvedenog formazana direktno je proporcionalna broju živih ćelija. Podaci su analizirani korišenjem uklapanja logističke krive sa četiri parametra upotrebom Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), i izračunata je koncentracija referentnog antitela ili scFvs potrebna da se neutralizuje TNFa-indukovana apoptoza za 50% i 90% (IC50i IC90) (videti takođe Sliku 7). Da bi se vrednosti IC50i IC90direktno uporedile između eksperimenata koji su izvedeni u različitim danima ili na različitim pločama testa, vrednosti IC50i IC90su kalibrisane u odnosu na referentno antitelo infliksimab. Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, krive doze-odgovora su analizirane u duplikatu. Standardne devijacije i CVs su izračunate za svaku tačku merenja (CV < 20%). Ukrštena reaktivnost vrsta sa cinomolgus majmunom (Sino Biological, Cat. No.90018-CNAE) i rezus majmunom (R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFa je izmerena korišćenjem iste postavke testa i primenom istih mera kvaliteta kao što je gore u tekstu opisano za TNFa. Slično sa humanim parnjakom, koncentracije TNFa koje indukuju submaksimalnu apoptozu L929 (EC90) su korišćene za ispitivanje ukrštene reaktivnosti vrsta. TNFa iz obe vrste je pokazao veoma sličnu potenciju prema humanom TNFa da indukuje apopozu L929 mišjeg fibroblasta. Shodno tome, ista koncentracija TNFa (5 pM) je korišćena za obe ispitane vrste. Tokom ispitivanja CV-a ukrštene reaktivnosti vrsta većina tačaka merenja duplikata je bila ispod 10%.

2.1.3 ELISA inhibicije TNFa

[0163] Inhibitorni efekat scFvs na vezivanje liganda je ispitan korišćenjem ELISA, biohemijskog postupka koji isključivo reprodukuje interakciju između TNFa i TNFRI i TNFRII.

[0164] Za prvi ELISA test inhibicije, vanćelijski domen TNFRI spojen sa Fc regionom humanog IgG (R&D Systems, Cat. No. 372-RI) je obložen na ploču sa 96-bunarića Maxisorp ELISA u koncentraciji od 0.5 µg/ml. Za drugi ELISA test inhibicije, vanćelijski domen TNFRII spojen sa Fc regionom humanog IgG (R&D Systems, Cat. No. 726- R2) je obložen u koncentraciji od 2 µg/ml. Svi koraci koji slede su bili identični za oba testa. Da bi se detektovalo vezivanje TNFa sa TNFRI i TNFRII, TNFa je biotinilovan pre upotrebe. Biotinilovani humani TNFa (960 pM, 50 ng/ml) je prvo inkubiran sa 3-strukim serijski razblaženim humanizovanim anti-TNFa scFvs i infliksimabom (10’000 ng/ml-0.2 ng/ml) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Smeše fragmenta TNFa/antitelo su prenete na ploče sa imobilizovanim receptorom za TNF i vezivanje neblokiranog TNFa sa imobilizovanim receptorom za TNFa je detektovano posle inkubacije na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 minuta sa biotin-vezanim streptavidin-HRP (SDT Reagents, Cat. No. SP40C). Dodavanje supstrata 3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) je dovelo do kolorimetrijskog očitavanja koje je bilo proporcionalno vezivanju TNFa sa TNFRI i TNFRII. Pre upotrebe u kompetitivnoj ELISA, biološka aktivnost biotinilovanog TNFa je potvrđena u L929 testu. EC50biotinilovanog TNFa je bila slična sa EC50neobeleženog TNFa (podaci nisu prikazani). Slično sa L929 testom koji je gore opisan, podaci su analizirani korišenjem uklapanja logističke krive sa četiri parametra korišćenjem Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), i izračunata je koncentracija scFvs koja je neophodna za inibiranje interakcije TNFa i TNFR za 50% i 90% (IC50i IC90).Da bi se vrednosti IC50i IC90direktno uporedile između eksperimenata koji su izvedeni u različitim danima ili na različitim pločama za ispitivanje, IC50i IC90vrednosti su kalibrisane u odnosu na referentno antitelo infliksimab.

[0165] Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, krive doze odgovora su analizirane u duplikatu. Standardne devijacije i CVs su izračunate za svaku tačku merenja (CV < 25%).

2.1.4 Ciljana specifičost

[0166] Da bi se potvrdila specifičnost anti-TNFa scFvs, ispitano je vezivanje sa najviše homolognim članom familije TNFβ. Potencijal za inhibiranje interakcije bioinilovanog TNFa sa scFvs sa neobeleženim TNFβ (Peprotech, Cat. No.300-01B) i TNFa (Peprotech, Cat. No.300-01) je analiziran sa kompetitivnim ELISA testom. Za ovu svrhu, scFvs su obloženi na Maxisorp ELISA ploču sa 96-bunarića u koncentraciji od 1 µg/ml. Vezivanje biotinilovanog TNFa (75 ng/ml) sa obloženim scFvs u prisustvu 5-strukog serijski razblaženog neobeleženog TNFa (50 µg/ml - 0.00013 µg/ml) ili TNFβ (1250 µg/ml - 0.00013 µg/ml) je detektovano koriščenjem biotin-vezanog streptavidin-HRP (SDT Reagensi, kat. br. SP40C) kao što je opisano gore u tekstu. Za krivu doza odgovor podaci TNFa su analizirani korišćenjem uklapanja logističe

4

krive sa četiri parametra korišenjem Softmax sofvera za analizu podataka (Molecular Devices), i i izračunata je koncentracija neobeleženog TNFa koja je neopodna za blokiranje interakcije biotinilovanog TNFa sa obloženim scFv za 50% (IC50). TNFβ nije pokazao bilo kakvu značajnu inhibiciju interakcije između biotinilovanog TNFa i scFvs (videti takođe Slika 11). Da bi se kvantifikovao relativni potencijal TNFβ u poređenju sa TNFa da inhibira vezivanje TNFa svakim scFv IC50da inhibira interakciju sa TNFβ u odnosu na TNFa je izračunata. S obzirom da nije uočena značajna inhibicija kada se koristi TNFβ na približno 5’000 do 20’000-puta većom koncentracijom u odnosu na IC50TNFa, selektivnost za vezivanje sa TNFa u odnosu na TNFβ je određena da bude značajno veća od 5’000 do 20’000-puta. Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, krive doze-odgovora su analizirane u duplikatu. Standardne devijacije i CVs su izračunate za svaku tačku merenja (CV < 25% za svaku osim jedne od ispitanih koncentracija TNFα/β). Svaki scFv je ispunio ovaj kriterijum.

2.2 CMC Analize

2.2.1 Redukujuća SDS-PAGE

[0167] Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu koji sadrži natrijum dodecil sulfat (SDS-PAGE) je tehnika analize koja se koristi za kvalitativnu karakterizaciju i za kontrolu čistoće proteina. U skladu sa Farmakopejom Sjedinjenih država (USP) (USP odeljak 1056) analitička gel elektroforeza je odgovarajući i rutinski postupak za identifikovanje i procenu homogenosti proteina u supstancama leka.

[0168] Postupak je korišćen za kvantifikovanje scFv proizvoda iz lizata E.coli da se dobije prinos ekpresije nakon fermetacije. Druga prijava postupka je da se verifikuje identitet supstanci koje se ispituju na osnovu njihove molekularne težine u odnosu na teorijske vrednosti. Za svrhe podrške ovaj postupak je korišćen za kvantifikovanje čistoće uzoraka koji se ispituju u odnosu na nečištoće koje su povezane sa postupkom (proteini ćelije domaćina) i nečistoće povezane sa proizvodom (proizvodi degradiranja ili adukti).

[0169] Analize SDS-PAGE su izvedene sa komercijalno dostupnim precast gel sistemom "Mini Protean" dobijenim od Bio-Rad Laboratories Inc. Humanizovani scFvs su analizirani na "Any kD" gelovima za razdvajanje (#456-9036). U oba slučaja korišćen je Tris/Glicin sistem pufera koji je preporučio proizvođač. Za detekciju proteinskih traka ili komasi bojenje sa SimplyBlueTM rastvorom za bojenje (Life Technologies Corp., #LC6060) ili bojenje srebrom sa Pierce Silver kitom za bojenje (Thermo Fisher Scientific Inc., #24612) je korišćeno. Za postupke bojenja praćeni su protokoli odgovarajućeg dobavljača. Dokumentacija i analiza bojenih proteinskih gelova je izvedena sa sistemom dokumentacije ChemiDoc XRS System (Bio-Rad Laboratories Inc., #170-8265) i softverom Image Lab, Verzija 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., # 170-9690).

Određivanje titra uzoraka lizata

[0170] SDS-PAGE omogućava specifičnu detekciju proteina od interesa u smeši proteina ćelija domaćina. Referentne serije standardnog razblaženja u linearnom opsegu postupka (koje su određene unapred) su uključene na svakom gelu. Linearna regresija intenziteta traka (mereno denzitometrijom) u odnosu na nominalne koncentracije referentnog standarda su korišćene za izračunavanje standardne krive, koja je korišćena sa druge strane, za ekstrapolaciju scFv sadržaja u uzorku.

[0171] Uzorci lizata nepoznatih koncentracija proizvoda su naneti u različitim razblaženjima (najmanje 1:10 u puferu za razblaživanje) da se dobije najmanje jedna koncentracija scFv u linearnom opsegu postupka. Količina proizvoda je izračunata na osnovu izmerenih intenziteta traka scFv i koncentracija je određena korišćenjem faktora razblaženja preparata uzorka. Vrednosti su usrednjene za sve uzorke koji se nalaze unutar linearnog opsega standarnde krive.

[0172] Kao dodatni test pogodnosti postupka za kvantifikovanje uzorka lizata izveden je test inhibicije / pojačanja unošenjem uzorka lizata sa poznatom količinom referentnog standarda. Izračunavanje dobijanja uzorka u razblaženju uzorka 1:10 u puferu za rastvaranje dovelo je do vrednosti 95.4% koja je na istom nivou precizna kao što je uočeno sa referentnim standardnom u puferu za rastvaranje. Prema tome, nije uočena značajna interferencija matriksa u ćelijskim lizatima i postupak je smatran pogodnim za kvantifikovanje sadržaja scFv u ćelijskim lizatima.

Čistoća proteina i sadržaj

[0173] Da bi se pokazala pogodnost postupka za određivanje sadržaja i samim tim čistoće uzoraka koji se ispituju, niža granica detekcije (LOD) za referentni scFv je određena vizuelno (identifikovanjem proteinske trake) na nominalnoj količini od 0.02 µg, procena intenziteta histograma odgovarajuće trake pokazuje odnos signala-prema buci na ovom nanošenju od 2. Dodatno, linearni opseg za kvantifikovanje je određen analizom glavnih traka denzitometrijski.

2

[0174] Uklapanje podataka sa linearnom regresijom, dovodi do određivanja koeficijenta (R ) od 0.9998, prema tome indikuje dobar kvalitet uklapanja. Pored sveukupnog kvaliteta uklapanja utvrđeno je da relativna greška svake individualne tačke podatka dokumentuje pogodnost postupka u izabranom opsegu. Relativne greške su bile ispod 10% za sve tačke podataka što ukazuje na dobru tačnost ovog postupka.

2.2.2 UV Absorbancija na 280 nm

[0175] Postupak UV absorbancije na 280 nm je test kojim se ispituje ukupni protein kao što je navedeno u USP odeljku 1057. Proteinski rastvori apsorbuju UV svetlost na talasnoj dužini 280 nm zbog prisustva aromatičnih aminokiselina. UV apsorbancija je funkcija sadržaja ostataka tirozina i triptofana u proteinu i proporcinalna je koncentraciji proteina. Apsorbanca rastvora nepoznatog proteina može da bude određena u skladu sa USP odeljkom 851 na spektroskopu primenom Beer-ovog zakona: A= ε*l*c, gde je apsorbanca (A) jednaka proizvodu molarne apsorpcije (ε), dužini puta apsorpcije i koncentraciji supstance. Molarna apsorptivnost za scFv je izračunata sa softverom Vector NTI® (Life Technologies Corporation).

[0176] Merenje UV absorbancije je izvedeno sa Infinity čitačem M200 Pro opremljenim a Nanoquant pločom (Tecan Group Ltd.). Apsorbancije uzroka proteina su izmerene na 280 nm i 310 nm, gde posledenja talasna dužina služi kao referentni signal koji je oduzet od 280 nm signala. Da bi se uzela u obzir potencijalna interferencija matriksa uzorka sa blankom oduzimanje je sprovedeno za svako merenje. Finalni signal apsorbancije dobijenog proteinskog uzorka je korišće za izračunavanje koncentracije proteina korišćenjem Lambert-Beer-ovog zakona. Sva merenja su sprovedena u opsegu datom od strane specifikacija instrumenata u mernom opsegu 0-4 OD, gde je reproducibilnost < 1% i uniformnost < 3% naznačena od strane proizvođača.

2.2.3 SE-HPLC (Tečna hromatografija visokog pritiska za isključivanje veličina)

[0177] SE-HPLC je tehnika razdvajanja koja je zasnovana na čvrstoj stacionarnoj fazi i tečnoj mobilnoj fazi kao što je naznačeno sa USP odeljkom 621. Ovaj molekul razdvaja molekule na osnovu njihove veličine i oblika korišćenjem hidrofobne stacionarne faze i vodene mobilne faze. Razdvajanje molekula sa dešava između prazne zapremine (Vo) i ukupne zapremine koja prolazi (VT) specifične kolone.

4

Merenja sa SE-HPLC su izvedena na Chromaster HPLC sistemu (Hitachi High-Technologies Corporation) opremljenim sa automaskim ubacivanjem uzorka i UV detektorom podešenim za detekciju talasne dužine od 280 nm. Oprema je kontrolisana sa softerom EZChrom Elite (Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2) koji takođe podržava analizu dobijenih hromatograma. Uzorci proteina izbistreni centrifugom i držani su na temperaturi od 6°C u autosampler-u pre ubrizgavanja. Za analizu scFv uzoraka kolona Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., #F6989201) je korišćena sa standardizovanom mobilnom fazom puferovanom sa slanim rastvorom (50 µM Natrijum acetat pH 6.0, 250 mM natrijum hlorid) na preporučenoj brzini protoka 0.35 mL/min. Nanošenje ciljnog uzorka po injekciji je 5 µg. Uzorci su detektovani sa UV na talasnoj težinu 280 nm i podaci su zabeleženi odgovarajućim softverskim paketom. Dobijeni hromatogrami su analizirani u opsegu V0do VTpri čemu se isključuju signali povezani sa matriksom sa >10 min vremena elucije.

[0178] Da bi se osigurala srednja preciznost postupka, referentni standard je rutinski izmeren na početku i na kraju svake HPLC sekvence. Referentni standard koji je korišćen za ovaj sistem ispitivanja podobnosti bio je scFv koji je proizveden u seriji i bio je alikvotiran za upotrebu za svaku vremensku tačku merenja.

2.2.4 DSF (Differencijalna skenirajuća fluorimetrija)

[0179] Postupak DSF je ne-farmakopejski postupak za merenje razdvajanje proteina koje zavisi od toplote. Merenja temperature termalnog razdvajanja sa DSF su izvedena sa MX3005P qPCR mašinom (Agilent Technologies) kontrolisanom sa MX Pro softverskim paketom (Agilent Technologies) i opremljenim sa filterom za ekscitaciju/emisiju podešenim na 492/610 nm. Reakcije su postavljene u Thermo fast 96 belim PCR pločama (Abgene; #AB-0600/W). Za detekciju razdvajanja proteina komercijalno dostupni rastvor štoka boje SYPRO oranž (Molecular Probes; # S6650) je korišćen u finalnom razblaženju 1:1’000. Uzorci proteina su razbaženi za merenja razdvajanja do finalne koncentracije od 50 µg/mL u standardizovanom puferovanom rastvoru soli. Termalno razdvajanje je izvedeno sa programom temperature počev od 25°C sa rampom do 96°C u 1°C koraka sa trajanjem 30 sekundi. Tokom temperaturnog programa zabeležena je emisija fluorescenije svakog uzorka. Snimljeni neobrađeni podatak je obrađen i ocenjen je sa paketom Microsoft Excel matrica (Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2 No.9) i neobrađeni podaci fluorescencije su uklopljeni sa Boltzmanovom jednačinom korišćenjem programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) da se dobije srednja tačka prelaza (Tm).

[0180] Da bi se proizvela pouzdana i robustna merenja srednje tačke razdvajanja izvedeni su najmanje duplikati merenja. U odnosu na kvalitet podataka razmotrena su samo merenja sa „goodness of fit“ (R2) >0.9900 i 95% intervalom poverenja Tmmanjim od 0.5%.

[0181] Za procenu srednje preciznosti referentni standard (poznati karakterisani scFv) je uključen sa svakim merenjem da se omogući poređenje testa performansi u različlitim danima..

2.2.5 Ispitivanje stabilnosti

[0182] Da bi se ispitala stabilnost različitih scFv konstrukata kao očitavanja razvijenosti ovih molekula dizajniran je prtokol ispitivanja kratkotrajne stabilnosti. Proteinski konstrukti su konstruisani u jednoj formulaciji puferovanog rastvora soli (videti gore u tekstu) da bi se ciljale koncentracije 1 i 10 mg/mL. Sadržaj monomera je određen sa SE- HPLC da se potvrdi da čistoća premašuje kriterijum njegove uspešnosti > 95%. Nakon toga su proteinski uzorci skladišteni na <-65, -20, 4 i 37°C tokom trajanja od 4 nedelje i alikvote su analizirane u različitim vremenskim tačkama. Primarno očitavanje je analiza sa SE-HPLC, koja omogućava kvantifikaciju rastvorljivih oligomera visoke molekulske težine i agregata.

4

Kao pomoćna merenja sadržaj proteina je određen sa UV absorbancom na 280 nm, što daje naznaku da li su tokom perioda skladištenja suštinske količine proteina izgubljene taloženjem. Za skladištenje su korišćene cevi sa navojnim zatvaračem (Sarstedt, Cat. No.72.692.005) sa količinama za punjenje 30-1500 µg po alikvotu. Dodatna čistoća je određena sa SDS-PAGE koja ukazuje stabilnost konstrukta u odnosu na degradiranje ili kovalentnu multimerizaciju.

Primer 3: Dobijanje humanizovanog diatela i IgG

[0183] Konstrukt jednolačanog diatela je dizajniran uređenjem varijabilnih domena u VLA-L1-VHB-L2-VLB- L3-VHA konfiguraciji. U ovim konstruktima VLA i VHA i VLB i VHB domeni zajedno obrazuju mesto vezivanja za TNFa. Preptidni linkeri L1-L3 koji spajaju varijabilne domene su konstruisani sa ponovcima glicina/serina. Dva kratka linkera L1 i L3 se sastoje iz jednog G4S ponovka, pri čemu se duži linker L2 sastoji iz sekvence (G4S)4. Nukleotidne sekvence koje kodiraju humanizovane varijabilne domene (Primer 2; 1.2.1.) su de novo sintetisane i klonirane u adaptirani vektor za ekspresiju u E.coli koji je zasnovan na pET26b(+) okosnici (Novagen). Ekspresija i prečiščavanje su izvedeni kao što je opisano za scFvs u Primeru 2; 1.2.1.

[0184] Humanizovani IgG je konstruiran kloniranjem varijabilni domena u pogodni sisarski ekspresioni vektor za prolaznu heterolognu ekspresiju koja sadrži vodeću sekvencu i odgovarajuće konstantne domene npr. pFUSE-rlgG vektore (Invivogen). Prolazna ekspresija funkcionalnog IgG je izvedena sa kotransfekcijom vektora koji kodiraju teške i lake lance sa FreestyleTM MAX sistemom u CHO S ćelijama. Nakon kultivacije od nekoliko dana dobijen je supernatant ćelija koje sekretuju antitela za prečišavanje. Nakon toga. sekretovani IgG-i su afinitetno prečišćeni sa Protein A sefarozom (GE Healthcare). Frakcije elucije su analizirane sa SDS-PAGE, UV absorbancijom na 280 nm i SE-HPLC.

[0185] Afiniteti molekula antitela su određivani upotrebom Biacore instrumenta kao što je opisano u Primeru 2 pod 2.1.1).

[0186] Potencije molekula antitela su određene u L929 testu (postupak je opisan u Primeru 2 pod 2.1.2).

4

Primer 4: Određivanje stehiometrije vezivanja TNFa

[0187] Stehiometrija vezivanja 16-22-H5 sa TNFa je određena korišćenjem SE-HPLC. 16-22-H5-scFv i TNFα su inkubirani u dva raličita molarna odnosa, odnosno u molarnom odnosu 1:1 i 4.5:1. S obzirom da se TNFa nalazi kao trimer u rastvoru naznačeni molarni odnosi se odnose na TNFαtrimer. Prema tome, u odnosu 4.5:116-22-H5-scFv je u višku i treba da zauzme sve pozicije vezivanja TNFαtrimer pri čemu nastaju kompleksi 1 TNFαtrimersa 3 scFv. Međutim, pod ekvimolarnim uslovima nema dovoljno prisutnog scFv da zasiti sva 3 teoretska mesta vezivanja TNFa. Prema tome, takođe varijante kompleksa sa manje od 3 vezana scFv su očekivane. TNFa i 16-22-H5-scFv su inkubirani u trajanju od 2 sata na RT da bi se omogućilo obrazovanje kompleksa. Uzorci su nakon toga centrifugirani na 4°C tokom 10 min.

10 µL od svakog uzorka je analizirano na SE-HPLC. Analiza SE-HPLC je izvedena sa 50 mM fosfatnim puferom pH 6.5, 300 mM NaCl kao eluentom na brzini protoka od 0.35 mL/min. Eluirani proteinski signali su detektovani na talasnoj dužini 280 nm. Kolona je unapred kalibrisana korišćenjem Gel filtration Calibration kita od GE Healthcare (LMW, HMW) za određivanje vidljivih molekulskih težina.

[0188] Donji panel na Slici 12 prikazuje profil elucije sa ekvimolarnim količinama scFv i TNFa koji se preklapa sa profilima samog TNFαtrimeri samog scFv. Zbog trimerizacije TNFa u rastvoru teorijski postoje do tri ekvivalentna mesta vezivanja za scFv koji se nalazi na svakom trimeru i prema tome molekuli scFv su ograničavajući. Pod ovim uslovima identifikovane su sve tri vrste kompleksa (3:1, 2:1, 1:1). Gornji panel na slici 12 prikazuje elucioni profil kompleksa sa viškom količina scFv. Višak nevezanog scFv je eluiran u očekivanom retencionom vremenu. Signal TNFa je kvantitativno potrošen za obrazovanje kompleksa i potpunosti je nestao. Signal ovog kompleksa se pomerio prema nižim retencionim vremenima, i nalazio se u dobroj korelaciji sa retencionim vremenom signala sa najvećim molekulskim težinama ekvimolarne postavke. Iz ovog razloga zaključeno je da su sva dostupna mesta vezivanja na TNFa zauzeta sa scFv i prema tome, stehiometrija vezivanja je 3:1 (scFv:TNFa) ukoliko je scFv dostupan u višku.

[0189] Pored ovih kvalitativnih zapažanja, očigledna stehiometrija vezivanja je takođe izračunata na osnovu vidljive MW 16-22-H5-scFv:TNFα kompleksa kao što je određeno sa SE-HPLC. Na osnovu retencionog vremena, izračunata očigledna MW je bila 139.7 kDa. Prema jednačini (1) u tekstu ispod očigledna stehiometrija vezivanja je izračunata da bude 3.3. Ovo s Kompleks app dobroj korelaciji sa teorijskim brojem tri ekvivalentna dostupna mesta vezivanja za scFv na TNFαtrimeri gore prikazana zapažanja gde je određena 3:1 stehiometrija vezivanja.

Jednačina (1): stehiometrija vezivanja (sFc:TNFα)

MW (kompleks app): 139.7 kDa

MW (TNFa theo): 52.2 kDa

MW (scFv theo): 26.5 kDa

Primer 5: Obrazovanje kompleksa TNFα:antitelo (ukršteno vezivanje TNFα)

[0190] Sposobnost 16-22-H5-scDb da veže istovremeno dva TNFa molekula je ispitana na Biacore T200 instrumentu u HEPES puferu koji sadrži 10 mM HEPES, 150 mM NaCl i 0.05% Tween. Biotinilovani TNFa (Acro Biosystems) je uhvaćen pomoću biotinilovane ssDNK oligo korišćenjem Biotin CAPture kita (GE Healthcare) prema uputstvima proizvođača. 0.25 µg/mL biotinilovanog TNFa je ubrizgano pri brzini

4

protoka 10 µL/min tokom 3 min da bi se dostigao nivo hvatanja od približno 200 do 300 RUs (jedinica rezonance). Antitela 16-22-H5-scDb i 16-22- H5-scFv, kao kontrola, su ubrizgana preko TNFa imobilizovanog na površini tokom 2 min na brzini protoka od 30 µL/min na koncentraciji od 90 nM. Nakon vezivanja fragmenata antitela, TNFa (Peprotech) je ubrizgan tokom 5 min sa brzinom protoka od 30 µL/min na 90 nM. Antitelo i koncentracije TNFa su izabrane blizu saturaciji vezivanja. Merenje je spovedeno na 25°C. Slika 13 ilustruje da je bivalentni 16-22-H5-scDb sposoban da veže dva molekula TNFa istovremeno dok, kao što je očekivano, monovalentni 16-22-H5-scFv se vezuje samo za jedan molekul TNFa.

[0191] Dalje, obrazovanje kompleksa TNFα-antitela je procenjeno u različitim odnosima TNFa i formata 16-22-H5 antitela korišćenjem SE-HPLC.16-22-H5-IgG (150 kDa) i 16-22-H5-scDb (52 kDa) su inkubirani sa TNFa (52 kDa) u različitim molarnim odnosima (1:3, 1:1, 3:1) u pogledu mesta vezivanja. Prema tome, IgG i scDb imaju 2 i TNFa ima 3 mesta vezivanja. Smeše antitelo-TNFa su inkubirane najmanje 30 min na 37°C, ohlađene do 10 min na RT i skladištene preko noći na 2 - 8°C. Pet do 10 uL smeše proteina u koncentraciji od približ. 1 mg/mL su ubrizgani na TOSHO TSKgel UP-SW3000 kolonu. Analiza je izvedena sa 150 mM fosfatnim puferom pH 6.8, 100 mM NaCl kao eluentom na brzini protoka 0.3 mL/min. Eluirani signali proteina su detektovani na talasnoj dužini 214 nm. Kolona je kalibrisana korišćenjem BEH450 SEC standardnog mixa proteina (Waters) unapred za određivanje približnih molekulskih težina kompleksa. Slika 14A pokazuje obrazovanje kompleksa 16-22-H5-IgG:TNFα. Kompleksi koji su ≥ 600 kDa ukazuju da se obrazovanje kompleksa sastoji iz ≥ 2 TNFa i ≥ 3 IgG molekula. Slika 14B pokazuje obrazovanje kompleksa 16-22-H5-scDb:TNFα. Kompleksi koji su ≥ 300 kDa ukazuju da se obrazovanje kompleksa sastoji od ≥ 2 TNFa i ≥ 3 scDb molekula.

Primer 6: Inhibicija proliferacije ćelija

[0192] Kapacitet različitih formata antitela 16-22-H5 i adalimumaba da inhibiraju proliferaciju mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) je ispitan u reakciji pomešanih limfocita (MLR). PBMC iz 2 zdrava donora su kultivisani (RPMI1640) u odnosu 1:1 u pločama sa 96-bunarića tokom 48 h na 37°C/5 % CO2. Nakon aktivacije, ćelije su tretirane sa anti-TNFa antitelima ili IgG kontrolnim antitelom (svaki na finalnoj koncentraciji 10 (µg/mL) u sekstuplikatima dodatnih 5 d na 37°C/5 % CO2.24 h pre kraja inkubacije BrdU (20 µL/bunariću) je dodat u svaki bunarić i proliferacija je određena sa merenjem preuzimanja BrdU korišćenjem komercijalno dostupne ELISA za ćelijsku proliferaciju (Roche Diagnostics). Indeks stimulacije je određen izračunavanjem odnosa preuzimanja BrdU između ćelija tretiranih antitelom i ćelija tretiranih mitomicinom C (25 ng/mL). Tabela 12 i Slika 15 ilustruju da svu formati ispitanih antitela 16-22-H5 značajno inhibiraju proliferaciju T-ćelija u poređenju sa adalimumabom.

Tabela 12

4

Primer 7: Inhibicija LPS-indukovane sekrecije citokina

[0193] CD14<+>monociti u RPMI1640 su zasejani na ploče sa 96-bunarića i inkubirani su u trajanju od 16 h na 37°C/5 % CO2u vlažnom inkubatoru. Zatim su ćelije tretirane sa anti-TNFa antitelima ili IgG kontrolnim antitelom u duplikatima tokom 1 h korišćenjem finalnih koncentracija antitela opsega od 2 do 2000 ng/mL. Monociti su oprani 3 puta sa medijumom ćelijske kulture i nakon toga su inkubirani sa LPS (100 ng/mL) tokom 4 h na 37°C/5% CO2. Koncentracije IL-1β i TNFa u supernatantima ćelijskih kultura su određivani korišćenjem komercijalno dostupnih ELISA kitova (R&D Systems). Rezultati su prikazani u Tabelama 13 i 14 i Slikama 16A i B. IC50je određivan korišćenjem uklapanja logističke krive sa četiri parametra. U vezi sekrecije IL-1β i IC50vrednosti za 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv i adalimumaba dat je pregled u Tabeli 13 ispod.

Tabela 13. Sekrecija IL-1β

[0194] U vezi sekrecije TNFα, određene IC50vrednosti za 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv su predstavljene u Tabeli 14.

Tabela 14. Sekrecija<TNF α>

Tabela 15. konsenzusne sekvence V 1 rearanžirane

Tabela 16: Sekvence okvira čitanja IV zasnovane na germinativnoj V λ

1

2

4

�

2

4

1

�

4

�

2

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji je sposooban da se veže za humani faktor nekroze tumora alfa (TNFα), pri čemu se pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment sastoji iz (i) VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:14, i (ii) VHdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena SEQ ID NO:13.

2. Funkcionalni fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji je jednolančani varijabilni fragment (scFv).

3. Funkcionalni fragment prema zahtevu 2, pri čemu pomenuti scFv ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:15.

4. Antitelo prema zahtevu 1, koje je imunoglobulin G (IgG).

5. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva.

6. Vektor ili plazmid koji se sastoji iz nukleinske kiseline prema zahtevu 5.

7. Ćelija koja se sastoji iz nukleinske kiseline prema zahtevu 5 ili vektor ili plazmid prema zahtevu 6.

8. Postupak za dobijanje antitela ili funkcionalnog fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji obuhvata kultivisanje ćelije prema zahtevu 7 u medijumu pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili funkcionalni, i dobijanje antitela ili funkcionalnog fragmenta iz ćelija ili iz medijuma.

9. Farmaceutska komozicija koja se sastoji iz antitela ili funkcionalnog fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4, i po potrebi farmaceutski prihvatljivog nosača i/ili ekscipijenta.

10. Antitelo ili funkcionalni fragment kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja.

11. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu je pomenuti inflamatorni poremećaj inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta.

12. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je inflamatorna bolest creva.

13. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema zahtevu 11 ili 12, pri čemu pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis.

4