CN109071650B

CN109071650B - 抗TNFα抗体及其功能片段

Info

Publication number: CN109071650B
Application number: CN201780015298.5A
Authority: CN
Inventors: 迪·冈德; 塞巴斯蒂安·迈尔; 艾丝特·玛利亚·富勒
Original assignee: Tillotts Pharma AG
Current assignee: Tillotts Pharma AG
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: WO2017158092A1; CN109071650A; PL3430043T3; EP3430043B1; DK3430043T5; FI3430043T3; HRP20231464T1; CY1123784T1; TWI784945B; JOP20210085A1; MA43717B1; EP3219726B1; PH12018501907A1; US11459383B2; TW202311288A; JP2022130407A; PL3219726T3; KR102470235B1; JP2019512268A; HRP20210123T1

Abstract

本发明涉及能够与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的抗体分子及其功能片段，涉及它们的制备方法并且涉及它们的治疗用途。

Description

抗TNFα抗体及其功能片段

技术领域

背景技术

TNFα是一种同三聚体促炎细胞因子，由免疫系统细胞释放并与之相互作用。还已经证实的是，TNFα在许多人类疾病中表现出上调，包括慢性疾病，例如类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和多发性硬化症。

已提出用于预防和治疗内毒素性休克的针对TNFα的抗体(Beutler等，Science，234，470-474，1985)。Bodmer等人(Critical Care Medicine，21，S441-S446，1993)和Wherry等人(Critical Care Medicine，21，S436-S440，1993)讨论了抗TNFα抗体治疗脓毒症休克的治疗潜力。Kirschenbaum等人也讨论了抗TNFα抗体在治疗脓毒症休克中的用途(Critical Care Medicine，26，1625-1626，1998)。使用抗TNFα单克隆抗体能够有效地治疗胶原诱导的关节炎(Williams等(PNAS-USA，89，9784-9788，1992))。

在Feldman等人(Transplantation Proceedings，30，4126-4127，1998)、Adorini等人(Trends in Immunology Today，18，209-211，1997)和在Feldman等人(Advances inImmunology，64，283-350，1997)中讨论了抗TNFα抗体在治疗类风湿性关节炎和克罗恩病中的用途。先前在这种治疗中使用的TNFα抗体通常是嵌合抗体，例如美国专利号5,919,452中所述的那些。

在现有技术中已经描述了针对TNFα的单克隆抗体。Meager等人(Hybridoma，6，305-311，1987)描述了针对重组TNFα的鼠单克隆抗体。Fendly等人(Hybridoma，6，359-370，1987)描述了针对重组TNFα的鼠单克隆抗体在界定TNFα上中和表位中的用途。此外，在国际专利申请WO 92/11383中，公开了特异性针对TNFα的重组抗体，包括CDR移植抗体。Rankin等人(British J.Rheumatology，34，334-342，1995)描述了这种CDR移植抗体在治疗类风湿性关节炎中的用途。美国专利号5,919,452公开了抗TNFα嵌合抗体和它们在治疗与TNFα有关的病理中的用途。进一步的抗TNFα抗体公开于Stephens等人(Immunology，85，668-674，1995)、GB-A-2 246 570、GB-A-2 297 145、US 8,673,310、US 2014/0193400、EP 2 390 267B1、US 8,293,235、US 8,697,074、WO 2009/155723 A2和WO 2006/131013 A2中。

与高变区或CDR的来源抗体相比，现有技术的重组抗TNFα抗体分子通常对TNFα具有降低的亲和力。所有目前市售的TNFα抑制剂以每周或更长的间隔作通过静脉或皮下推注施用，导致高起始浓度，其直至下一次注射前稳定下降。

目前已批准的抗TNFα生物疗法包括(i)英夫利昔单抗，嵌合IgG抗人单克隆抗体(

Wiekowski M等：″Infliximab(Remicade)″，Handbook of TherapeuticAntibodies，WILEY-VCH；Weinheim，2007-01-01，p.885-904)；(ii)依那西普，具有IgG1 Fc的TNFR2二聚体融合蛋白

(iii)阿达木单抗，全人单克隆抗体(mAb)(

Kupper H等：″Adalimumab(Humira)″，Handbook of Therapeutic Antibodies，WILEY-VCH；Weinheim，2007-01-01，p.697-732)；(iv)赛妥珠单抗，聚乙二醇化Fab片段(

Melmed G Y等：″Certolizumab pegol″，Nature Reviews.Drug Discovery，NaturePublishing Group，GB，Vol.7，No.8，2008-08-01，p.641-642)；(v)戈利木单抗，人IgG1K单克隆抗体(

Mazumdar S et al：″Golimumab″，mAbs，Landes Bioscience，US，Vol.1，No.5，2009-09-01，p.422-431)。然而，各种生物仿制药正在开发中，并且在欧洲已经批准了称为Remsima的英夫利昔单抗的模拟物。

英夫利昔单抗对TNFα具有相对低的亲和力(KD＞0.2nM；Weir等，2006，Therapy 3：535)并且在L929测定中具有有限的中和效力。此外，英夫利昔单抗显示与来自食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkeys)的TNFα基本上没有交叉反应性。然而，对于抗TNFα抗体，高度期望与来自猴子的TNFα的交叉反应性，因为这考虑到用灵长类动物进行动物试验，在许多方面反映了在人类中的情况。

依那西普虽然是二价分子，但是以每个依那西普分子一个三聚体的比例结合TNFα，排除了大抗原-生物治疗复合物的形成(Wallis，2008，Lancet Infect Dis，8：601)。它不抑制单核细胞中LPS诱导的细胞因子分泌(Kirchner等，2004，Cytokine，28：67)。

阿达木单抗的效力类似于英夫利昔单抗的效力。阿达木单抗的另一缺点是其稳定性差，例如在热解折叠测试中测定的。在这样的测试中阿达木单抗的解链温度(T_m)被测定为67.5℃。但是，抗体的T_m值越低，其一般稳定性越低。较低的T_m使得抗体不太适用于药物用途，例如用于口腔给药。

赛妥珠单抗的效力略高于英夫利昔单抗，但仍不令人满意。赛妥珠单抗在MLR中不抑制T细胞增殖(Vos等，2011，Gastroenterology，140：221)。

EP2623515 A1公开了人源化抗TNFα抗体及其抗原结合片段(Fab)。从所公开的实施例中可以清楚地看出，所得人源化Fab片段的效力与L929中和测定中的英夫利昔单抗的效力相当(参见表2和5)。测试交叉反应性的唯一抗TNFαIgG抗体仅与恒河猴TNFα弱结合(参见[0069]；图3)。未测试与食蟹猴TNFα的交叉反应性。而且，与人TNFβ有弱结合(见图3)。因此，EP2623515A1没有公开这样的抗TNFα抗体或其功能片段，其具有大于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力，并且其与恒河猴TNFα和食蟹猴TNFα交叉反应。

WO2012/007880A2公开了融合蛋白形式的经修饰的单域抗原结合分子(SDAB)，其包含结合一个或多个结合于一个或多个靶的单抗原结合域(例如TNFα)、接头和一个或多个聚合物分子。给出的唯一具体实例称为SDAB-01，其包括与TNFα结合且用柔性接头连接的两个抗原结合域，以及支持位点特异性PEG化的C末端半胱氨酸(参见图3)。WO2012/007880A2未能在基于L929细胞的中和测定中比较SDAB-01与已知TNFα抗体如英夫利昔单抗的效力，或评估其他SDAB-01特异性参数如阻断TNFα-TNFRI/II相互作用的有效性以及相比于TNFβ对TNFα的结合选择性。在用于过量表达人TNFα的多关节炎的转基因小鼠模型中用SDAB-01和英夫利昔单抗治疗的测定比较中(见第54页，实施例8)，两者似乎在预防关节炎的进一步发展方面同样有效(例如图17和18)。然而，该实施例中给出的剂量是误导性的，因为SDAB-01的分子量小于英夫利昔单抗的分子量的一半。因此，WO2012/007880A2没有公开抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力大于英夫利昔单抗的抗TNFα抗体。

WO 2015/144852 A1研究了命名为“scFv1”的抗TNF-αscFv的性质。该scFv显示出PK-15细胞测定中的TNFα中和能力，其与英夫利昔单抗相当(参见[0236])。此外，scFv似乎与恒河猴和食蟹猴的TNF-α有一些交叉反应性(参见实施例8)。在WO 2015/144852 A1中没有报道亲和力数据。然而，已知单链抗体片段DLX105(也称为ESBA105)仅具有中等亲和力(K_D＝157pM；参见Urech等2010 Ann Rheum Dis 69：443)，显示出比scFv1更好的与TNF-α的结合(参见WO2015/144852A1的图1)。因此，WO 2015/144852 A1未公开对人TNFα具有高亲和力的抗TNF-α抗体(K_D＜125pM)。

WO 2015/065987 A1描述了抗TNF-α抗体、抗IL-6抗体和结合两种抗原的双特异性抗体。某些抗TNFα抗体显示出与来自食蟹猴的TNFα的一些交叉反应性(图17)。然而，抗TNFα抗体在L929中和测定中显示出比英夫利昔单抗显著更低的效力(图5)。因此，WO 2015/065987 A1没有公开具有大于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力的抗TNFα抗体。

Drugs in R&D，Vol.4 No.3，2003，pages 174-178描述了人源化抗体“Humicade”(CDP 571；BAY 103356)，一种具有高亲和力的单克隆抗TNFα抗体。然而，Humicade抑制L929细胞中TNFα诱导的细胞凋亡的效力似乎是有限的(参见，例如，US 2003/0199679 A1，[0189])。因此，该参考文献没有公开具有大于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力的抗TNFα抗体。

Saldanha J W等：″Molecular Engineering I：Humanization″，Handbook ofTherapeutic Antibodies，Chapter 6，2007-01-01，WILEY-VCH，Weinheim，p.119-144公开了用于人源化单克隆抗体的不同策略，包括CDR移植、重塑/镶饰、SDR转移和去免疫技术。

需要改进的抗体分子来治疗慢性炎性疾病，例如炎性肠病。抗体分子应该至少具有(i)对人TNFα的高亲和力(即K_D＜125pM)，(ii)抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的高效力，(iii)抑制LPS-诱导细胞因子分泌的高效力，(iv)与食蟹猴和恒河猴的TNFα显著的亲和力(例如K_D＜1nM)，和(v)在热解折叠实验中测定的可变结构域的高解链温度(例如T_m＞70℃)。

发明内容

本申请的发明人发现某些抗TNFα抗体及其功能片段表现出有利性质的组合，包括对人TNFα的高亲和力(K_D＜125pM)，大于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力，大于阿达木单抗的抑制LPS诱导的细胞因子分泌的效力，对动物如食蟹猴(Macacafascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα具有显著的亲和力(K_D＜1nM)。另外，抗体及其功能片段对TNFα具有特异性，因为它们不显著结合TNFβ，并且表现出显著的稳定性，如在可变结构域的热解折叠测定中所确定的。

本发明提供抗体分子及其功能片段。

因此，本发明涉及在以下项目(1)至(48)中所定义的主题：

(1)能够结合人肿瘤坏死因子α(TNFα)的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含(i)V_L结构域，其包含具有根据SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR3区，和(ii)V_H结构域，其包含具有根据SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR3区。

(2)项目(1)所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含(i)V_L结构域，其包含具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR1区、具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR2区和具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的CDR3区，和(ii)V_H结构域，其包含具有SEQ IDNO：10所示氨基酸序列的CDR1区、具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR2区和具有SEQID NO：12所示氨基酸序列的CDR3区。

(3)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含具有SEQID NO：13所示氨基酸序列的V_H结构域。

(4)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含具有选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：54的氨基酸序列、优选具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的V_L结构域。

(5)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或其功能片段特异性结合人TNFα。

(6)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或其功能片段不显著结合人TNFβ。

(7)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或其功能片段

(i)以小于125pM的解离常数(K_D)结合人TNFα；

(ii)与恒河猴的TNFα和与食蟹猴的TNFα交叉反应；

(iii)如通过L929测定法测定的，具有比英夫利昔单抗更强的效力；

(iv)能够以至少2的化学计量比(抗体∶TNFα_三聚体)结合人TNFα_三聚体。

(8)前述任一项所述的抗体或功能片段，其以小于100pM、优选小于50pM的K_D结合人TNFα。

(9)前述任一项所述的抗体或功能片段，其以小于1nM的K_D结合来自恒河猴的TNFα。

(10)前述任一项所述的抗体或功能片段，其以小于1nM的K_D结合来自食蟹猴的TNFα。

(11)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中在L929测定中测定的抗体或功能片段抑制TNFα诱导的细胞凋亡相对于英夫利昔单抗的效力(相对效力)大于5，并且其中所述相对效力是在L929测定中以ng/mL为单位的英夫利昔单抗IC₅₀值与在L929测定中以ng/mL为单位的scFv形式抗体的IC₅₀值之比。

(12)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中通过差示扫描荧光测定法测定的scFv形式的抗体的可变区的解链温度为至少65℃。

(13)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中通过差示扫描荧光测定法测定的scFv形式的抗体的可变区的解链温度为至少68℃。

(14)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中通过差示扫描荧光测定法测定的解链温度为至少70℃。

(15)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中在连续五次冻融循环后，单体含量的损失小于0.2％。

(16)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中在4℃下储存四周后，单体含量的损失小于1％。

(17)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中如在抑制ELISA中测定的，抗体或功能片段阻断人TNFα和TNF受体I(TNFRI)之间相互作用相对于英夫利昔单抗的效力(相对效力)至少为2，并且其中所述相对效力是英夫利昔单抗以ng/mL为单位的IC₅₀值与scFv形式的抗体以ng/mL为单位的IC₅₀值之比。

(18)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中如在抑制ELISA中测定的，抗体或功能片段阻断人TNFα和TNF受体II(TNFRII)之间相互作用相对于英夫利昔单抗(相对效力)至少为2，并且其中所述相对效力是英夫利昔单抗以ng/mL为单位的IC₅₀值与scFv形式的抗体以ng/mL为单位的IC₅₀值之比。

(19)前述任一项所述的抗体或功能片段，其能够在混合的淋巴细胞反应中抑制外周血单核细胞的细胞增殖。

(20)前述任一项所述的抗体或功能片段，其能够抑制LPS诱导的白介素-1β从CD14⁺单核细胞的分泌。

(21)项目(20)所述的抗体或功能片段，其中抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC₅₀值小于1nM。

(22)项目(21)所述的抗体或功能片段，其中基于摩尔的所述抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC₅₀值小于阿达木单抗的IC₅₀值。

(23)前述任一项所述的抗体或功能片段，其能够抑制LPS诱导的TNFα从CD14⁺单核细胞的分泌。

(24)项目(23)所述的抗体或功能片段，其中抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC₅₀值小于1nM。

(25)项目(24)所述的抗体或功能片段，其中基于摩尔的所述抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC₅₀值小于阿达木单抗的IC₅₀值。

(26)前述任一项所述的抗体，其为免疫球蛋白G(IgG)。

(27)项目(1)至(25)中任一项所述的功能片段，其为单链可变片段(scFv)。

(28)项目(27)所述的功能片段，其中所述scFv包含或由选自SEQ ID NO：15和SEQID NO：55的氨基酸序列、优选SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成。

(29)项目(1)至(25)中任一项所述的功能片段，其为双抗体。

(30)项目(29)所述的功能片段，其中所述双抗体包含或由SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列组成。

(31)结合与包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的V_H结构域和具有SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列的V_L结构域的抗体基本上相同的人TNFα上的表位的抗体或其功能片段，特别是其中所述抗体或功能片段表现出在本文上述项目(1)至(30)中所述的一种或多种特征。

(32)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中(i)与具有SEQ ID NO：56至58(参见表15)的各自人Vκ1共有序列不同的所述抗体或功能片段的轻链可变结构域框架区I至III的氨基酸的数量和(ii)与选自SEQ ID NO：59至62(参见表16)的最相似的人λ基于种系的序列不同的所述抗体或功能片段的轻链可变结构域框架区IV的氨基酸的数量之和小于7，优选小于4。

(33)前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段的轻链可变结构域的框架区I至III分别由具有SEQ ID NO：56至58的人Vκ1共有序列组成，并且框架区IV由选自SEQ ID NO：59至62的λ基于种系的序列组成。

(34)编码前述任一项所述的抗体或功能片段的核酸。

(35)包含项目(34)所述的核酸的载体或质粒。

(36)包含项目(35)所述的核酸或项目(34)所述的载体或质粒的细胞。

(37)制备项目(1)至(33)中任一项所述的抗体或功能片段的方法，包括在允许编码抗体或功能片段的核酸表达的条件下在培养基中培养项目(36)所述的细胞，并从细胞或从培养基中回收抗体或功能片段。

(38)药物组合物，包含项目(1)至(33)中任一项所述的抗体或功能片段和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

(39)项目(1)至(33)中任一项所定义的抗体或功能片段，其用于治疗炎性病症或TNFα相关病症的方法。

(40)根据项目(39)使用的抗体或功能片段，其中所述炎性病症选自下文的“待治疗病症”节中所列出的疾病和病症的列表。

(41)根据项目(39)使用的抗体或功能片段，其中所述炎性病症是胃肠道的炎性病症。

(42)根据项目(41)使用的抗体或功能片段，其中所述胃肠道的炎性病症是炎性肠病。

(43)根据项目(41)或(42)使用的抗体或功能片段，其中所述胃肠道的炎性病症是克罗恩病。

(44)根据项目(43)使用的抗体或功能片段，其中所述克罗恩病选自回肠，结肠，回肠结肠和/或孤立的上克罗恩病(胃，十二指肠和/或空肠)，包括非狭窄/非穿透，狭窄，穿透和肛周疾病行为，允许任何上述的局部和疾病行为的任何组合。

(45)根据项目(41)或(42)使用的抗体或功能片段，其中所述胃肠道的炎性病症是溃疡性结肠炎。

(46)根据项目(45)使用的抗体或功能片段，其中所述溃疡性结肠炎选自溃疡性直肠炎，直肠乙状结肠炎，左侧结肠炎，泛溃疡性结肠炎和脓包皮炎。

(47)根据项目(41)或(42)使用的抗体或功能片段，其中所述胃肠道的炎性病症是显微镜下结肠炎。

(48)根据项目(39)至(47)中任一项使用的抗体或功能片段，其中所述方法包括将抗体或功能片段口服施用于受试者。

附图简要说明

图1：人源化过程的示意图。

图2：scFv的纯化的人源化的scFv制剂的SE-HPLC色谱图。scFv单体在8.5至9.5分钟的保留时间洗脱，而缓冲剂组分在＞10min洗脱。从柱的死体积至各自scFv单体的所有的峰整合为聚集体/寡聚体并用于计算相对峰面积。

图3：来自两种scFv构建体的DSF测量的热解折叠曲线。对于每种构建体，显示一式两份的测量。通过将数据拟合到玻尔兹曼方程以获得转变的中点来确定Tm结果值。

图4：两种scFv构建体在储存期间的单体含量的时间过程。由SE-HPLC测定的单体含量已经针对储存温度4、-20和＜-65℃持续4周进行绘制。

图5：两种scFv分子的SE-HPLC色谱图的叠加。对于每种scFv，显示了第0天和在4℃储存4周后的样品(10mg/ml)。此外，显示了5个冻融循环后样品的色谱图。插入的小图显示每种分子大约15倍放大的Y轴以可视化以及显示寡聚体含量的微小变化。

图6：人源化的scFv在储存期间的单体含量的时间过程。由SE-HPLC测定的单体含量已经针对储存温度37℃持续4周的10mg/mL样品进行绘制。

图7：在两种scFv的L929测定中中和人TNFα的效力。对于每个实验，显示了scFv和参考抗体英夫利昔单抗的剂量-反应曲线。最高的scFv和英夫利昔单抗浓度以及阴性对照设定为100％和0％的生长。

图8：两种scFv在L929测定中中和非人灵长类动物和人TNFα的效力。显示了中和人、食蟹猴和恒河猴TNFα的剂量-反应曲线。最高的scFv浓度和阴性对照设定为100％和0％的生长。

图9：两种scFv阻断TNFα-TNFRI相互作用的效力。显示了剂量-反应曲线。最高的scFv浓度和阴性对照设定为0％和100％的TNFα结合TNFRI。

图10：两种scFv阻断TNFα-TNFRII相互作用的效力。显示了剂量-反应曲线。最高的scFv浓度和阴性对照设定为0％和100％的TNFα结合TNFRII。

图11：scFv的靶特异性。通过竞争ELISA分析通过TNFα和TNFβ抑制生物素化的TNFα与scFv相互作用的可能性。显示了TNFα和TNFβ的剂量依赖性作用。

图12描述了通过SE-HPLC测定的16-22-H5-scFv∶TNFα复合物的形成(实施例4)。

图13描述了通过SPR测定的两种TNFα分子与16-22-H5-scDb的同时结合(实施例5)。

图14A描述了16-22-H5-IgG∶TNFα复合物的形成(实施例5)。

图14B描述了16-22-H5-scDb∶TNFα复合物的形成(实施例5)。

图15描述了抗TNFα处理后MLR中细胞增殖的抑制。*：p＜0.05；**：与IgG对照相比p＜0.01(实施例6)。

图16显示16-22-H5和阿达木单抗的不同抗体形式以剂量依赖性方式抑制单核细胞中LPS诱导的IL-1β(图16A)和TNFα(图16B)分泌的能力(实施例7)。

具体实施方式

本发明涉及能够结合人TNFα的抗体或其功能片段。

在本申请的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，其定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或任何亚类)的蛋白质，并且包括所有常规已知的抗体及其功能片段。在本发明的上下文中，抗体/免疫球蛋白的“功能片段”被定义为亲本抗体的抗原结合片段或其他衍生物，其基本上保持本文上述项目(1)至(30)中提及的这种亲本抗体的一种或多种性质。抗体/免疫球蛋白的“抗原结合片段”定义为保留抗原结合区的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，即CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区。本发明的“抗原结合片段”包括F(ab′)₂片段和Fab片段的结构域。本发明的“功能片段”包括scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体和Fc融合蛋白。可以工程化F(ab′)2或Fab以最小化或完全去除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用。本发明的抗体或功能片段可以是双功能或多功能构建体的一部分。

本发明中优选的功能片段是scFv和双抗体。

scFv是单链Fv片段，其中轻链可变结构域(“V_L”)和重链可变结构域(“V_H”)通过肽桥连接。

双抗体是由两个片段组成的二聚体，每个片段具有通过接头等连接在一起的可变区(下文称为双抗体形成片段)，并且通常含有两个V_L和两个V_H。双抗体形成片段包括由V_L和V_H、V_L和V_L、V_H和V_H等组成的那些、优选V_H和V_L。在双抗体形成片段中，连接可变区的接头并不特别限定，但优选足够短以在同一片段中避免可变区之间的非共价键。这样的接头的长度可以由本领域技术人员确定，但通常为2-14个氨基酸，优选3-9个氨基酸，特别是4-6个氨基酸。在该情况下，同一片段上所编码V_L和V_H经接头连接，所述接头足够短以在同一链上避免V_L和V_H之间的非共价键并避免单链可变区片段的形成使得可以形成与其他片段的二聚体。二聚体可以通过共价键或非共价键或两者兼有在双抗体形成片段之间形成。

此外，双抗体形成片段可以通过接头等连接以形成单链双抗体(sc(Fv)₂)。通过使用约15-20个氨基酸的长接头连接双抗体形成片段，可以在存在于同一链上的双抗体形成片段之间形成非共价键以形成二聚体。基于与制备双抗体相同的原理，也可以通过连接三个或更多个双抗体形成片段来制备聚合抗体如三聚体或四聚体。

优选地，本发明的抗体或功能片段特异性结合TNFα。如本文所用的，当抗体或功能片段能够区分人TNFα和一种或多种参考分子时，抗体或其功能片段“特异性识别”或“特异性结合”人TNFα。优选地，结合每种参考分子的IC₅₀值比结合TNFα的IC₅₀值大至少1,000倍，特别是如实施例2第2.1.4节中所述。在其最一般的形式中(并且当没有提到确定的参考文献时)，“特异性结合”是指抗体或功能片段区分人TNFα和不相关的生物分子的能力，例如，根据本领域已知的特异性测定方法所测定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹和ELISA测试。例如，可以进行标准ELISA测定。通常，通过不使用单一参考生物分子，而是使用一组约三至五个不相关的生物分子，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等，来进行结合特异性的测定。在一个实施方案中，特异性结合是指抗体或片段区分人TNFα和人TNFβ的能力。

本发明的抗体或本发明的功能片段包含V_L结构域和V_H结构域。V_L结构域包含CDR1区(CDRL1)、CDR2区(CDRL2)、CDR3区(CDRL3)和框架区。V_H结构域包含CDR1区(CDRH1)、CDR2区(CDRH2)、CDR3区(CDRH3)和框架区。

术语“CDR”是指主要赋予抗原结合的抗体的可变结构域内六个超可变区之一。六个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication 91-3242提供。如本文所用，CDR的Kabat的定义仅适用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。然而，如本文所用，重链可变结构域的CDR1(CDR H1或H1)由以下残基定义(Kabat编号)：它从第26位开始并在第36位之前结束。

V_L结构域的CDR1区由根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_L结构域的CDR1区由选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成。最优选地，VL结构域的CDR1区由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成。

V_L结构域的CDR2区由根据SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_L结构域的CDR2区由选自SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。最优选地，V_L结构域的CDR2区由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成。

V_L结构域的CDR3区由根据SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_L结构域的CDR3区由选自SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成。最优选地，VL结构域的CDR3区由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR1区由根据SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR1区由选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成。最优选地，V_H结构域的CDR1区由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR2区由根据SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR2区由选自SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成。最优选地，V_H结构域的CDR2区由SEQID NO：11所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR3区由根据SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR3区由选自SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的氨基酸序列组成。最优选地，V_H结构域的CDR3区由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)V_L结构域，其包含具有根据SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR3区，和(ii)V_H结构域，其包含具有根据SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQID NO：6所示氨基酸序列的氨基酸序列的CDR3区。

在具体的实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)V_L结构域，其包含具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR1区、具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR2区和具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的CDR3区，和(ii)V_H结构域，其包含具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CDR1区、具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的CDR2区和具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的CDR3区。

在更优选的实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的V_H结构域。在另一更优选的实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的V_L结构域。最优选地，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的V_H结构域，和(ii)具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的V_L结构域。

在特别优选的实施方案中，功能片段是单链抗体(scFv)，其包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的V_H结构域和具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的V_L结构域。V_H结构域和V_L结构域优选通过肽接头连接。肽接头(下文中称为“接头A”)通常具有约10至约30个氨基酸的长度，更优选约15至约25个氨基酸的长度。接头A通常包含Gly和Ser残基，但其他氨基酸也是可能的。在优选的实施方案中，接头包含多个重复的序列GGGGS(SEQ ID NO：50)，例如2至6、或3至5、或4个连续重复的SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。最优选地，接头A由SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列组成。scFv可具有以下结构(N末端为左，C末端为右)：

V_L-接头A-V_H；或

V_H-接头A-V_L。

更优选地，功能片段是单链抗体(scFv)，其由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列组成。最优选地，功能片段是单链抗体(scFv)，其由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成。

在另一特别优选的实施方案中，功能片段是双抗体，其包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的V_H结构域和具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的V_L结构域。V_H结构域和V_L结构域通过肽接头连接。肽接头(下文中称为“接头B”)优选具有约2至约10个氨基酸的长度，更优选约5个氨基酸的长度。接头B通常包含Gly和Ser残基，但其他氨基酸也是可能的。最优选地，接头B由SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列组成。

双抗体优选为单特异性双抗体，即它仅针对一个表位。双抗体优选为同源二聚体。双抗体可以是两条多肽链的二聚体，它们彼此非共价结合。每个单体可以是具有以下结构的多肽链：

V_L-接头B-V_H；或

V_H-接头B-V_L。

此外，双抗体形成片段可以通过接头A等连接以形成单链双抗体(sc(Fv)₂)。通过使用约15-20个氨基酸的长接头连接双抗体形成片段，可以在存在于同一链上的双抗体形成片段之间形成非共价键以形成二聚体。单链双抗体的排列的实例包括以下排列。

V_H-接头B-V_L-接头A-V_H接头B-V_L

V_L-接头B-V_H-接头A-V_L-接头B-V_H

优选地，本发明的双抗体具有以下结构：

V_L-接头B-V_H-接头A-V_L-接头B-V_H

最优选地，双抗体由SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列组成。

基于与制备双抗体相同的原理，也可以通过连接三个或更多个双抗体形成片段来制备聚合抗体如三聚体或四聚体。

在另一具体的实施方案中，本发明的抗体是免疫球蛋白，优选免疫球蛋白G(IgG)。本发明的IgG的亚类不受限制并且包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，本发明的IgG具有亚类1，即它是IgG₁分子。在一个实施方案中，本发明的IgG分子的每条轻链具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，和/或本发明的IgG分子的每条重链具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列。本发明的特异性IgG由两条轻链和两条重链组成，其中两条轻链中的每一条具有SEQID NO：52所示的氨基酸序列，并且两条重链中的每一条具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列。

亲和力

本发明的抗体或功能片段对人TNFα具有高亲和力。术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常本发明的抗体或功能片段以小于约2x10^-10M、优选小于1.5x10^-10M、优选小于1.25x10^-10M、更优选小于1x10^-10M，最优选小于7.5x10^-11M或甚至小于5x10-¹¹M的解离平衡常数(K_D)结合人TNFα，如在BIACORE仪器中使用表面等离子体共振(SPR)技术测定的。特别地，如实施例2第2.1.1节所述进行K_D的测定。

与来自食蟹猴(Cynomolgus monkeys)或恒河猴(Rhesus macaques)的TNFα的交叉反应性

在具体的实施方案中，本发明的抗体或功能片段对来自动物例如食蟹猴(Macacafascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα具有显著的亲和力。这是有利的，因为优选用这些动物进行抗人TNFα抗体的临床前试验，例如毒性研究。因此，本发明的抗体或功能片段优选与来自动物如食蟹猴和/或恒河猴的TNFα交叉反应。如实施例2第2.1.1节中所述进行的亲和力测定。

在一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自食蟹猴(Macacafascicularis)的TNFα交叉反应。本发明的抗体或功能片段优选对食蟹猴(Macacafascicularis)TNFα具有是对人TNFα的亲和力的二十分之一、特别是十分之一、甚至更特别是五分之一的亲和力。通常，本发明的抗体或功能片段以解离平衡常数(K_D)与来自食蟹猴(Macaca fascicularis)的TNFα结合，其中(i)结合来自食蟹猴(Macaca fascicularis)的TNFα的K_D与(ii)结合人TNFα的K_D的比R_食蟹猴小于20。

R_M食蟹猴优选小于20，特别是小于10，甚至更特别是小于5。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα交叉反应。本发明的抗体或功能片段优选对恒河猴(Macaca mulatta)TNFα具有是对人TNFα的亲和力的二十分之一、更特别是十分之一的亲和力。通常，本发明的抗体或功能片段以解离平衡常数(K_D)与来自恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα结合，其中(i)结合来自恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα的K_D与(ii)结合人TNFα的KD的比R_恒河猴小于20。

R恒河猴优选小于20，特别是小于10。

在又一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自食蟹猴(Macacafascicularis)的TNFα并且与来自恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα交叉反应。本发明的抗体或功能片段优选针对食蟹猴TNFα的亲和力是对人TNFα的亲和力的二十分之一、特别是十分之一、甚至更特别是五分之一，并且它优选针对恒河猴TNFα的亲和力是对人TNFα的亲和力的二十分之一、更特别是十分之一的亲和力。抗体或抗体片段的R_食蟹猴比值优选小于20，特别是小于10，甚至更特别是小于5，并且抗体或抗体片段的R_恒河猴比值优选小于20，特别是小于10。

抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力

本发明的抗体或功能片段具有抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的高效力。在具体实施方案中，本发明的抗体或功能片段具有抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力大于已知抗体英夫利昔单抗。

如本申请的实施例2第2.1.2节中所述，可以在L929测定中测定相对于英夫利昔单抗的效力。本发明的抗体或功能片段的相对效力大于1.5，优选大于2，更优选大于3，更优选大于5，更优选大于7.5，或甚至大于10，其中相对效力是(i)L929测定中英夫利昔单抗的IC₅₀值与(ii)L929测定中本发明的抗体或功能片段的IC₅₀值的比，并且其中IC₅₀表示达到对TNFα诱导的L929细胞凋亡最大抑制的50％时所必需的各分子的浓度(ng/mL)。

在另一实施方案中，本发明的抗体或功能片段的相对效力大于1.5，优选大于2，更优选大于3，更优选大于5，更优选大于7.5，或甚至大于10，其中相对效力是(i)L929测定中英夫利昔单抗的IC₉₀值与(ii)L929测定中本发明的抗体或功能片段的IC₉₀值的比，并且其中IC₉₀值表示达到对TNFα诱导的L929细胞凋亡最大抑制的90％时所必需的各分子的浓度(ng/mL)。

抑制LPS诱导的细胞因子分泌

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制LPS诱导的细胞因子从单核细胞的分泌。可以如实施例7所述测定LPS诱导的细胞因子从单核细胞的分泌。

在一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够抑制LPS诱导的白介素-1β从CD14+单核细胞的分泌。抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC₅₀值优选小于1nM和/或小于100pg/mL。基于摩尔和/或基于每体积重量，抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC₅₀值优选低于阿达木单抗的IC₅₀值。

在另一实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够抑制LPS诱导的TNFα从CD14+单核细胞的分泌。抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC₅₀值优选小于1nM和/或小于150pg/mL。基于摩尔和/或基于每体积重量，抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC₅₀值优选低于阿达木单抗的IC₅₀值。

抑制细胞增殖

本发明的抗体或功能片段通常能够在混合的淋巴细胞反应中抑制外周血单核细胞的细胞增殖。可以通过实施例6所述的测定细胞增殖的抑制。根据实施例6测定的，本发明的抗体或功能片段的刺激指数例如scFv或双抗体的刺激指数优选小于5，更优选小于4.5。在具体实施方案中，本发明的抗体的刺激指数例如IgG的刺激指数小于4或甚至小于3。

抑制TNFα与TNF受体之间的相互作用

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制人TNFα和TNF受体I(TNFRI)之间的相互作用。如下文实施例2第2.1.3节所述，人TNFα和TNFRI之间相互作用的抑制可以在抑制ELISA中测定。

如在抑制ELISA中测定的，本发明的抗体或功能片段阻断人TNFα和TNFRI之间相互作用相对于英夫利昔单抗阻断人TNFα和TNFRI之间相互作用的效力(相对效力)至少为2，并且其中所述相对效力是英夫利昔单抗以ng/mL为单位的IC₅₀值与抗体或其功能片段以ng/mL为单位的IC50值之比。

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制人TNFα和TNF受体II(TNFRII)之间的相互作用。如下文实施例2第2.1.3节所述，人TNFα和TNFRII之间相互作用的抑制可以在抑制ELISA中测定。

如在抑制ELISA中测定的，本发明的抗体或功能片段阻断人TNFα和TNFRII之间相互作用相对于英夫利昔单抗阻断人TNFα和TNFRII之间相互作用的效力(相对效力)优选至少为2，更优选至少3，并且其中所述相对效力是英夫利昔单抗以ng/mL为单位的IC₅₀值与抗体或其功能片段以ng/mL形式的IC₅₀值之比。

化学计量和交联

本发明的抗体或功能片段通常能够以至少2的化学计量比(抗体∶TNFα三聚体)结合人TNFα三聚体。化学计量比(抗体∶TNFα三聚体)优选大于2，或至少2.5，或至少3。在一个实施方案中，化学计量比(抗体∶TNFα三聚体)约为3。可以通过下文实施例4所述测定化学计量比(抗体∶TNFα三聚体)。

在另一实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够与人TNFα形成复合物，其中所述复合物包含TNFα的至少两个分子和抗体或功能片段的至少三个分子。根据该实施方案的功能片段包含针对TNFα的至少两个分开的结合位点例如双抗体。可以通过下文实施例5所述测定复合物的形成。

在一个实施方案中，抗体是IgG并且能够与TNFα形成至少600kDa的复合物。在另一个实施方案中，功能片段是双抗体并且能够与TNFα形成至少300kDa的复合物。

靶选择性

在某些实施方案中，本发明的抗体或功能片段具有高靶选择性，即它可以区分TNFα和TNFβ。优选地，如在实施例2第2.1.4节中所述的竞争ELISA中测定的，TNFβ的IC₅₀值是TNFα的IC₅₀值的至少1,000倍。更优选地，如在实施例2第2.1.4节中所述的竞争ELISA中测定的，TNFβ的IC₅₀值是TNFα的IC₅₀值的至少5,000倍、最优选至少10,000倍。

表达产率和重折叠产率

在其他实施方案中，本发明的抗体或功能片段(优选scFv或双抗体)可以在微生物如细菌或其他细胞中以高产率重组表达。优选地，如实施例2中所述测定的大肠杆菌中的表达产率为至少0.25g/L。这特别适用于诸如scFv的功能片段。

如实施例2中所述测定的重折叠产率为至少5mg/L，更优选至少10mg/L，更优选至少15mg/L，最优选至少20mg/L。这特别适用于诸如scFv的功能片段。

稳定性

通常，本发明的抗体或功能片段(优选scFv或双抗体)具有高稳定性。可以通过不同的方法学评估稳定性。如通过实施例2第2.2.4节所述的差示扫描荧光测定法(DSF)测定的，本发明的抗体或功能片段的可变结构域的“解链温度”优选至少65℃，更优选至少68℃，最优选至少70℃。如本文所用，“可变结构域的解链温度”是指由序列V_L-接头A-V_H组成的scFv的解链温度，其中接头A的氨基酸序列由SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列组成。例如，IgG可变结构域的解链温度定义为如上定义的其相应scFv的解链温度。

在4℃下储存4周后，通过如实施例2第2.2.5节中所述的分析型体积排阻色谱法测定，单体含量(浓度为10g/L；初始单体含量＞95％)的损失优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。在-20℃下储存4周后，通过如实施例2第2.2.5节中所述的分析型体积排阻色谱法测定，单体含量(浓度为10g/L；初始单体含量＞95％)的损失优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。在-65℃下储存4周后，通过如实施例2第2.2.5节中所述的分析型体积排阻色谱法测定，单体含量(浓度为10g/L；初始单体含量＞95％)的损失优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。

如实施例2中所述测定的五次连续冻融循环后的单体损失小于5％，更优选小于1％，更优选小于0.5％，最优选小于0.2％，例如，0.1％或0.0％。

抗体和功能片段

本发明的具体实施方案涉及本文所述抗体的功能片段。功能片段包括但不限于F(ab′)₂片段、Fab片段、scFv、双抗体、三抗体和四抗体。优选地，功能片段是单链抗体(scFv)或双抗体。更优选地，scFv或双抗体的非CDR序列是人序列。

优选地，为了使在人中免疫原性的可能性最小化，所选择的受体支架由源自人共有序列或人种系序列的框架区组成。特别地，可变轻链结构域的框架区I至III由根据SEQID NO：56至58的人Vκ1共有序列组成并且基于λ种系的序列的框架区IV选自SEQ ID NO：59至62。由于非人类共有残基或人种系残基可能引起免疫反应，每个可变结构域(VH或VL)中此类残基的数量应尽可能低，优选低于7，更优选低于4，最优选0。

优选地，抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是产生它的方法。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，所述技术包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。(Harlow and Lane，″Antibodies，ALaboratory Manual″CSH Press 1988，Cold Spring Harbor N.Y.)。

在其他实施方案、包括涉及在人体内使用抗TNFα抗体的实施方案中，可以使用嵌合、灵长类源化、人源化或人抗体。在优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体，更优选地，单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。

如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有源自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，1985，Science 229(4719)：1202-7；Oi等，1986，BioTechniques 4：214-221；Gillies等.，1985，J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。

本领域普通技术人员可获得不同的重组方法，通过产生免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或其他靶结合子序列)，使非人(例如鼠)抗体更像人的，其含有源自这种非人免疫球蛋白的最小序列。通常，所得重组抗体将包含基本上全部至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列、特别是人免疫球蛋白共有序列的FR区。CDR移植抗体是具有一个或多个源于最初由非人物种产生的抗体且结合所需的抗原的互补决定区(CDR)，和来自人免疫球蛋白分子的框架(FR)区的抗体分子(EP239400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)。通常，在称为“人源化”的过程中，人框架区中的框架残基将另外被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴定对抗原结合和序列对比重要的框架残基，以鉴定特定位置的异常框架残基。参见例如Riechmann等，1988，Nature 332：323-7和Queen等，美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370(各自通过引用整体并入本文)。使用本领域已知的各种其他技术可以使抗体更接近人抗体，包括例如，镶饰或重塑(EP592106；EP519596；Padlan，1991，MoI.Immunol，28：489-498；Studnicka等，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973)和链替换(美国专利号5,565,332)，均通过引用整体并入本文。CDR移植或人源化的抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的一部分。

在一些实施方案中，如Queen等，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370中所述制备人源化抗体(各自通过引用整体并入本文)。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是人抗体。完全“人”抗TNFα抗体可能是人类患者治疗的理想选择。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种不表达内源免疫球蛋白的人免疫球蛋白转基因动物中分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示的方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111和PCT公开号WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO 91/10741，各自通过引用整体并入本文。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能够表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如PCT公开号WO98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598，其通过引用整体并入本文。可以使用称为“引导选择”的技术产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，1988，Biotechnology 12：899-903)。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是灵长类源化抗体。术语“灵长类源化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类源化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570；5,681,722和5,693,780，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是衍生化抗体。例如但不限于，已经被修饰的衍生化抗体，例如通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/封闭基团衍生化，蛋白水解切割，与细胞配体或其他蛋白质的连接(参见下文关于抗体缀合物的讨论)等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定的化学切割，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。

在其他方面，抗TNFα抗体具有一个或多个插入其一个或多个超变区的氨基酸，例如US 2007/0280931中所述的。

抗体缀合物

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是抗体缀合物，其被修饰例如通过任何类型的分子与抗体的共价连接，使得共价连接不干扰与TNFα的结合。将效应部分与抗体偶联的技术是本领域众所周知的(参见例如Hellstrom等，Controlled Drag Delivery，2nd Ed.，atpp.623-53(Robinson等，eds.，1987))；Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62：119-58和Dubowchik等，1999，Pharmacology and Therapeutics 83：67-123)。

在一个实例中，抗体或其片段经共价键(例如肽键)在任选的N末端或C末端融合至另一蛋白质的氨基酸序列(或其部分；优选该蛋白质的至少10、20或50个氨基酸的部分)。优选地，抗体或其片段在抗体的恒定结构域的N末端连接至其他蛋白质。例如在WO 86/01533和EP0392745中所述的，可以使用重组DNA方法来产生这样的融合。在另一实例中，效应分子能够增加体内半衰期。这类合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如WO 2005/117984中描述的那些。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体可以连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。例如，如果抗体是抗体片段，则PEG部分可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基连接。这些氨基酸可以天然存在于抗体片段中，或者可以使用重组DNA方法工程化到片段中。参见例如美国专利号5,219,996。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。优选地，PEG部分通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基团共价连接。当硫醇基团用作连接点时，可以使用适当活化的效应部分，例如硫醇选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。

在另一实例中，例如，根据EP0948544中公开的方法，抗TNFα抗体缀合物是经修饰的Fab′片段，其被PEG化，即具有共价连接于其上的PEG(聚(乙二醇))。还参见Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and Biomedical Applications，(J.MiltonHarris(ed.)，Plenum Press，New York，1992)；Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications，(J.Milton Harris and S.Zalipsky，eds.，AmericanChemical Society，Washington D.C，1997)；和Bioconjugation Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，(M.Aslam and A.Dent，eds.，GrovePublishers，New York，1998)；和Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews 54：531-545。

药物组合物与治疗

疾病的治疗包括在任何临床阶段或表现中治疗已经诊断为患有任何形式疾病的患者；延迟疾病的症状或体征的发作或进展或加重或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重程度。

施用抗TNFα抗体或其功能片段的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(如猴或人)。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。

本文描述了包含抗TNFα抗体和任选的一种或多种另外的治疗剂(例如下文描述的第二治疗剂)的组合物。该组合物通常作为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。

抗TNFα抗体和功能片段可以通过多种途径施用于患者，例如口服，透皮，皮下，鼻内，静脉内，肌内，鞘内，局部外敷或局部给药。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用抗TNFα抗体或其功能片段。

在特别优选的实施方案中，口服施用本发明的抗体或功能片段。如果通过口服途径施用，则功能片段优选为单链抗体(scFv)、双抗体或IgG。

在典型的实施方案中，抗TNFα抗体或功能片段以足以允许以0.5mg/kg体重至20mg/kg体重静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，适合用于本文所述的组合物和方法的抗体或片段的浓度包括但不限于0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，2.5mg/kg，3mg/kg，4mg/kg，5mg/kg，6mg/kg，7mg/kg，8mg/kg，9mg/kg，10mg/kg，11mg/kg，12mg/kg，13mg/kg，14mg/kg，15mg/kg，16mg/kg，17mg/kg，18mg/kg，19mg/kg，20mg/kg，或前述任意值之间的范围浓度，例如1mg/kg至10mg/kg，5mg/kg至15mg/kg，或10mg/kg至18mg/kg。

取决于所治疗的病症、施用途径和受试者的年龄、体重和状况，抗TNFα抗体或功能片段的有效剂量可以为约0.001至约750mg/kg每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用，或实现每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/ml的血清浓度，或其中的任何有效范围或值。在某些实施方案中，每剂量可以为约0.5mg至约50mg/千克体重或约3mg至约30mg/千克体重。抗体可以配制为水溶液。

药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的抗TNFα抗体或功能片段的单位剂量形式存在。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于，1mg，10mg，20mg，30mg，40mg，50mg，100mg，200mg，300mg，400mg，500mg，750mg，1000mg，或任何两个前述值之间的任何范围，例如10mg至1000mg，20mg至50mg，或30mg至300mg。药学上可接受的载体可以采取多种形式，这取决于例如待治疗的病症或施用途径。

抗TNFα抗体或其功能片段的有效剂量、总剂量和治疗时间的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。

通过将具有所需纯度的抗体与通常在本领域使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂和其他各种添加剂混合，可以制备适合于本文所述方法的抗TNFα抗体和功能片段的治疗制剂，储存为冻干制剂或水溶液。参见Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition(Osol，ed.1980)。在所用的剂量和浓度下，这些添加剂必须对接受者无毒。

缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(如富马酸-富马酸单钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(如葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物，葡萄糖酸钠氢氧化物混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和醋酸盐缓冲剂(如醋酸-醋酸钠混合物，醋酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。\

可以添加防腐剂以延缓微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的范围的量添加。合适的防腐剂包括苯酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如氯化物，溴化物和碘化物)，氯化六甲基铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂可增溶治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁上。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括诸如肌醇的环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，硫代乙醇酸钠，硫代甘油，α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白等蛋白质；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖，如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖，如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1至10,000重量的范围存在。

可加入非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白免受搅动诱导的聚集，这也使得制剂暴露于剪切表面受到应力而不会导致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，聚氧乙烯醚(184、188等)，Pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(

等)。非离子表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围存在，或者以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。

其他各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)，蛋白酶抑制剂和共溶剂。

除抗TNFα抗体或其功能片段外，本文的制剂还可含有第二种治疗剂。以下提供合适的第二治疗剂的实例。

给药方案可以从每月一次到每天一次，取决于许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度和患者对抗TNFα抗体或功能片段的敏感性。在具体的实施方案中，每天，每周两次，每周三次，隔天，每隔5天，每10天，每两周，每三周，每四周或一个月一次或任何两个前述值之间的任何范围，例如从每四天到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等施用抗TNFα抗体或其功能片段。

待施用的抗TNFα抗体或功能片段的剂量将根据特定抗体，受试者，疾病的性质和严重程度，受试者的身体状况，治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和选择的施用途径而变化；本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。

本领域技术人员将认识到，抗TNFα抗体或其功能片段的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度，施用形式、途径和部位，特定受试者的年龄和状况，以及医生最终确定要使用的适当剂量决定。该剂量可以适当地重复进行。如果产生副作用，则可以根据正常的临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。

待治疗的病症

本发明涉及治疗或预防受试者中人TNFα相关疾病的方法，包括向受试者施用本文定义的抗体或功能片段。术语“TNFα相关病症”或“TNFα相关疾病”是指任何病症，其症状或疾病状态的发作、进展或持续需要TNFα的参与。示例性TNFα相关病症包括但不限于一般的炎症的慢性和/或自身免疫状态，一般的免疫介导的炎性病症，炎性CNS病，影响眼睛、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、泌尿道或肺的炎性疾病，一般葡萄膜炎状态，视网膜炎，HLA-B27+葡萄膜炎，白塞病，干眼症，青光眼，干燥综合征，糖尿病(包括糖尿病性神经病)，胰岛素抵抗，一般的关节炎状态，类风湿性关节炎，骨关节炎，反应性关节炎和赖特综合征，青少年关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化症，吉兰-巴雷综合征，重症肌无力，肌萎缩侧索硬化症，结节病，肾小球肾炎，慢性肾病，膀胱炎，银屑病(包括银屑病关节炎)，化脓性汗腺炎，脂膜炎，坏疽性脓皮病，SAPHO综合征(滑膜炎，痤疮，脓疱病，骨质增生和骨炎)，痤疮，斯威特氏综合征，天疱疮，克罗恩病(包括肠外表现)，溃疡性结肠炎，哮喘支气管炎，过敏性肺炎，一般过敏，过敏性鼻炎，过敏性鼻窦炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，肺纤维化，韦格纳肉芽肿病，川崎综合征，巨细胞动脉炎，变应性肉芽肿性血管炎，结节性多动脉炎，烧伤，移植物抗宿主病，宿主与移植物反应，器官或骨髓移植后排斥反应，一般的全身和局部血管炎状态，全身和皮肤红斑狼疮，多发性肌炎和皮肌炎，硬皮病，先兆子痫，急性和慢性胰腺炎，病毒性肝炎，酒精性肝炎，术后炎症，如眼科手术后(如白内障(眼球晶状体置换术)或青光眼手术)，关节手术(包括关节镜手术)，关节相关结构手术(如韧带)，口腔和/或牙科手术，微创心血管手术(例如PTCA，粥样斑块切除术，支架置入)，腹腔镜和/或内窥镜腹腔内和妇科手术，内窥镜泌尿外科手术(例如前列腺手术，输尿管镜检查，膀胱镜检查，间质性膀胱炎)，或一般的围手术期炎症(预防)，大疱性皮炎，中性粒细胞性皮炎，中毒性表皮坏死松解症，脓疱性皮炎，脑疟疾，溶血性尿毒症综合征，同种异体移植排斥反应，中耳炎，蛇咬伤，结节性红斑，骨髓增生异常综合征，原发性硬化性胆管炎，血清阴性脊柱热病，自身免疫性溶血性贫血，口面部肉芽肿病，增殖性脓性口炎，阿弗他口炎，地图样舌，迁移性口炎，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，贝尔氏麻痹，克罗伊茨费尔特-雅各布病和一般的神经退行性病况。

癌症相关性骨溶解，癌症相关炎症，癌症相关疼痛，癌症相关恶病质，骨转移，急性和慢性疼痛形式，无论这些是由TNFα的中枢或外周作用引起的，以及它们是否被归类为炎症，伤害性或神经性疼痛形式，坐骨神经痛，腰痛，腕管综合征，复杂区域疼痛综合征(CRPS)，痛风，带状疱疹后神经痛，纤维肌痛，局部疼痛状态，转移性肿瘤引起的慢性疼痛综合征，痛经。

待治疗的具体病症包括一般的关节炎状态，类风湿性关节炎，骨关节炎，反应性关节炎，青少年关节炎；银屑病包括银屑病关节炎；炎性肠病，包括克罗恩病，溃疡性结肠炎包括直肠炎，乙状结肠炎，左侧结肠炎，广泛性结肠炎和泛结肠炎，未确定的结肠炎，显微镜结肠炎包括胶原性和淋巴细胞性结肠炎，结缔组织病结肠炎，转移性结肠炎，憩室病结肠炎，嗜酸细胞性结肠炎和结肠袋炎(pouchitis)。

最优选地，本发明的抗体或功能片段用于治疗炎性肠病，特别是克罗恩病、溃疡性结肠炎或显微镜结肠炎。克罗恩病可以是回肠，结肠，回肠结肠或孤立的上克罗恩病(胃，十二指肠和/或空肠)包括非狭窄/非穿透，狭窄，穿透和肛周疾病行为，允许任何上面提到的局部和疾病行为的任何组合。溃疡性结肠炎可以是溃疡性直肠炎，直肠乙状结肠炎，左侧结肠炎，泛溃疡性结肠炎和结肠袋炎。

联合疗法及其他方面

优选地，用抗TNFα抗体或其功能片段治疗的患者也用另一种常规药物治疗。例如，患有炎性肠病的患者，特别是如果患有中度至重度疾病的患者通常也用美沙拉嗪或其衍生物或前药，皮质类固醇，例如布地奈德或泼尼松龙(口服或静脉注射)，免疫抑制剂，例如硫唑嘌呤/6-巯基嘌呤(6-MP)或氨甲蝶呤，环孢菌素或他克莫司治疗。可以共同施用于患者的其他药物包括生物制剂，例如英夫利昔单抗，阿达木单抗，依那西普，赛妥珠单抗等。可以共同施用于患者的其他药物包括免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤/6-MP或氨甲蝶呤或口服环孢菌素)，以维持稳定和更长的缓解。本发明的又一方面是如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段用于减轻炎症的用途。

本发明的又一方面是如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段，其用于减轻患有炎性病况的患者的炎症。

本发明的另一方面是治疗炎性病况的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段。炎性病况优选是上述病况之一。

本发明的另一方面是预防炎性病况的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段。炎性病况优选是上述病况之一。

表1.氨基酸序列的概述

实施例

实施例1：产生针对人TNFα的兔子抗体

1.结果

1.1 免疫

用纯化的重组人TNFα(Peprotech，目录号300-01A)免疫兔子。在免疫过程中，通过测定仍然产生多克隆血清抗体与抗原的可检测结合的每只兔子血清的最大稀释度(效价)来定性评估针对抗原的体液免疫应答的强度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA，参见2.2.1)评估针对固定的重组人TNFα的血清抗体效价。所有三只兔子都显示出非常高的效价，其中血清稀释10×10⁶倍，仍然产生ELISA的阳性信号(是用来自用作背景对照的未经实验的无关动物的血清获得的信号至少3倍)。此外，使用基于小鼠L929细胞的测定评估了不同兔血清抑制TNFα的生物活性的能力(参见2.2.3)。所有三种血清均抑制TNFα诱导的小鼠L929成纤维细胞的凋亡。兔子#3显示出最强的中和活性，在1∶155000的血清稀释度下达到50％抑制(IC₅₀)。与兔子#3相比，兔子#2和兔子#1显示出约三分之一和二十一分之一的活性，分别在1∶55500和1∶7210的血清稀释度下达到50％抑制。

选择从所有三只动物的脾中分离的淋巴细胞用于随后的命中鉴定程序。基于L929测定中抑制TNFα的生物活性的效力对动物进行优先排序。因此，培养的最高命中数源自兔子#3，而最低命中数源自兔子#1。

1.2 命中鉴定

1.2.1 命中分选

在命中鉴定程序之前，开发了基于流式细胞术的分选程序，其特异性检测并允许分离高亲和力的TNFα结合B细胞(参见2.1)。

在两个独立的分选活动中表征源自所有三只兔子的总共33×10⁶个淋巴细胞(相当于分离的总淋巴细胞的1.5％)。在总共分析的33×10⁶个细胞中，分离出3452个表达TNFα特异性抗体(IgG)的B细胞。克隆的淋巴细胞数量对于三只兔子是不同的，因为从L929测定中血清显示出强烈抑制TNFα的兔子中分离出更多细胞。在分离的B细胞中，792个克隆源自兔子#1，1144个克隆源自兔子#2和1408个克隆源自兔子#3。对于108个克隆，各自的兔子来源是未知的，因为它们源自所有3只兔子的残留淋巴细胞的混合物，以允许从小瓶中最佳地回收少量淋巴细胞。

1.2.2 命中筛选

在筛选阶段期间获得的结果基于使用来自抗体分泌细胞(ASC)培养上清未纯化抗体进行的测定，因为高通量培养的规模不允许纯化个体兔子抗体。这些上清用于对大量相对于彼此的抗体进行排序，但除了结合亲和力不提供绝对值(例如TNFα的生物活性的抑制)。在高通量ELISA中筛选ASC上清以结合重组人TNFα。通过ELISA、结合动力学以及它们在L929测定中中和人TNFα的生物活性的潜力，进一步表征TNFα结合上清与食蟹猴TNFα的结合。除结合动力学外，高通量筛选的报告值应解释为“是”或“否”的答案，这些答案基于单点测量(无剂量响应)。针对选择用于扩增和测序抗体重链和轻链可变结构域的所有102个克隆，分析对食蟹猴和小鼠TNFα的亲和力。

1.2.2.1 结合人TNFα

初步筛选的目的是鉴定产生对人TNFα特异性抗体的ASC克隆。为此目的，通过ELISA分析3452个ASC克隆的细胞培养上清中人TNFα抗体的存在(参见2.2.1)。使用的ELISA方法评估与重组人TNFα结合的IgG亚型的抗体的“量”，但是没有给出关于抗体的亲和力或浓度的信息。在该测定中，来自894个ASC克隆的上清产生明显高于背景的信号。对于兔子#1和兔子#2，筛选的命中率相似，其中从兔子#1中鉴定的792个中有153个命中(19.3％)，从兔子#2中鉴定的1144个中有225个命中(19.7％)。兔子#3显示出显著更高的命中率34.4％，得到1408个中有484个命中的鉴定。在该初步筛选中鉴定的所有894个命中通过SPR进行结合动力学测量(二次筛选)。

1.2.2.2 TNFα结合动力学

二次筛选的目的是通过表面等离子体共振(SPR，参见2.2.2)获得关于来自初步筛选的每个命中的靶结合质量的定量信息。与初步筛选期间使用的ELISA相反，该方法评估随时间变化的靶结合动力学。这允许测定抗体与其靶标的结合(k_a)和解离(k_d)的速率常数。比率k_d/k_a提供平衡解离常数(K_D)，其反映抗体对其靶标的亲和力。在初步筛选中鉴定的894个命中中，可以测定839个单克隆兔抗体对人TNFα的结合亲和力。对于剩余的55个抗体，不能测量亲和力，因为ASC上清中的抗体浓度低于相应设置中SPR仪器的检测限。可以测量的839个抗TNFα抗体显示解离常数(K_D)在1.36×10^-13M至1.14×10^-8M范围内。所分析的所有抗体中69％的K_D低于0.5nM。

从兔子#2和#3鉴定的筛选命中的2.21×10^-10M和2.09×10^-10M的中值K_D是类似的，而兔子#1显示至少2倍的值，为4.65×10^-10M的中值K_D。当仅考虑中和筛选命中时，所有三只动物的亲和力分布相似，具有较低的中值K_D值(中值K_D在1.4×10^-10M和1.27×10^-10M之间)。对于兔子#1、#2和#3的5％筛选命中，分别测得低于0.041nM、0.029nM和0.026nM的亲和力。对于2％的上清，亲和力甚至在低皮摩尔范围中(低于6.2pM、7.9pM和11pM)。由二次筛选产生的高亲和力抗体的优异产率为选择最适合人源化和重新格式化的抗体提供了充分的基础。

1.2.2.3 效力

为了评估效力，已经开发了基于细胞的测定(L929测定)(参见2.2.3)。在894个选择的抗体中有506个(56.6％)，在L929测定中抑制TNFα诱导的细胞凋亡超过50％。与效价分析中获得的结果一致，中和命中的最高百分比源自兔子#3，命中率为62.8％，其次是兔子#2，命中率为56.4％，命中率最低是兔子#1，命中率为39.9％。这些中和抗体的亲和力范围为1.36×10^-13至1.19×10^-9M。

1.2.2.4 物种交叉反应(食蟹猴)

通过ELISA分析在初步筛选中鉴定的所有894个命中与食蟹猴TNFα的物种交叉反应性(参见2.2.1)。该额外筛选的目的是允许选择已知与食蟹猴TNFα交叉反应的ASC克隆。使用的ELISA方法评估与重组食蟹猴TNFα结合的IgG亚型的抗体的“量”，但是没有给出关于抗体的亲和力或浓度的信息。来自414个(46％)ASC克隆的上清产生明显的信号(光密度(OD)≥1)。对于兔子#1和兔子#3，对食蟹猴TNFα的交叉反应命中百分比相似，其中从兔子#1中鉴定的153个中有81个命中(52.9％)，从兔子#3中鉴定的484个中有236个命中(48.8％)。兔子#2显示出稍微较低的交叉反应命中百分比，其为37.8％，得到225个中有82个命中的鉴定。

1.2.2.5 选择克隆用于RT-PCR

作为命中确认、基因序列分析和随后兔抗体人源化的先决条件，需要检索编码兔抗体可变区的遗传信息。这是通过将各信使RNA逆转录(RT)到互补DNA(cDNA)中，然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA来完成的。进行RT-PCR的ASC克隆的选择主要基于亲和力和中和活性。作为额外的标准，考虑了与食蟹猴TNFα的交叉反应性。通过RT-PCR总共选择102个ASC克隆用于基因克隆。首先，选择具有低于80pM的K_D的93个最佳排序的ASC(就亲和力而言)，其抑制L929测定中TNFα的生物活性超过50％并且显示出与食蟹猴TNFα的显著结合。此外，还选择KD低于20pM的所有9个最佳排序的ASC克隆，其中和TNFα活性超过50％，但不与食蟹猴TNFα结合。从兔子#1、#2和#3中总共分别有12、13和66个ASC克隆成功扩增并测序。

1.2.2.6 具有所需属性的相关克隆的鉴定

为了表征分离的ASC克隆组的遗传多样性，提取互补决定区(CDR)的序列并进行多序列比对，从而允许在系统发生树中进行序列聚类。

虽然这种分析一方面允许选择不同组的克隆序列以进行人源化和重新格式化实验，但它也鉴定了在兔子中疑似共享共同亲本B细胞克隆的同源克隆序列簇。这些序列簇的标志是CDR中的高序列同源性和药效学特性的一致模式。对于表2和表3中的八个克隆的簇，可总结出这两个特征。尽管该序列簇具有功能保守性，但表3中的共有序列揭示了CDR的某些可变性是耐受的，同时仍产生所需的药效学特征。

表2：ASC上清中单克隆抗体的药效学特性。

表3：针对上述克隆获得以下关于CDR的序列数据：

*标为“X”的氨基酸具有如所附序列表中所定义的含义。

1.2.2.7 对食蟹猴TNFα的交叉反应性(通过SPR)

由于有效中和TNFα的大量高亲和力命中，对所有进行RT-PCR的单克隆兔抗体评估物种交叉反应性，以便于选择ASC克隆用于命中确认。通过类似于如上所述的SPR测量来测定对食蟹猴TNFα的亲和力(也参见2.2.2)。食蟹猴TNFα的93个测试抗体的亲和力范围为9.6×10^-12至2.1×10^-9M。93个交叉反应性抗体中有38个以相似的亲和力结合人和食蟹猴TNFα(KD差异小于2倍)。此外，对于93个交叉反应抗体中的79个，人和食蟹猴之间的亲和力差异小于20倍，对于其中62个小于10倍，这使得它们对于在食蟹猴中的临床前开发是可接受的。

2.方法

2.1 分选测定

如Lalor等人(Eur J Immunol.1992；22.3001-2011)所概括的，基于流式细胞术的分选方法用于从兔淋巴组织中分离抗原特异性B细胞。

2.2 筛选测定

2.2.1 TNFα结合ELISA(人和食蟹猴TNFα)

将重组人TNFα(Peprotech，目录号300-01)包被在96孔微量滴定ELISA板上。通过HRP标记的抗兔IgG(JacksonImmuno Research，目录号111-035-046)二抗检测ASC培养上清中的兔抗体与固定的TNFα的结合。加入TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，KPL，目录号53-00-00)并通过加入H₂SO₄终止显色反应。使用微量滴定板酶标仪(Infinity reader M200Pro，Tecan)在450nm的波长下读板。

通过市售的阳性对照抗TNFα兔多克隆抗体(AbD Serotec，目录号9295-0174)监测筛选活动期间的测定性能。为此目的，在每个筛选平板上以100和250ng/ml一式两份测试阳性对照抗体。监测每个平板的阳性对照的响应的稳健性和精确性。在最终测定条件下，对于250ng/ml的阳性对照，信号-背景比在30至40之间，阳性对照的变异系数(CV)低于10％。相对于250ng/ml阳性对照，光密度≥100％的信号被认为是初步筛选命中。

对于血清效价测定，使用如上所述相同的ELISA设置。当与未经实验的无关动物的信号相比，免疫血清的结合信号至少3倍时，血清稀释被认为是阳性的。

使用如上所述的类似ELISA测定对食蟹猴的物种交叉反应性。将重组食蟹猴TNFα(Sino Biological，目录号90018-CNAE)包被在96孔微量滴定ELISA板上。如上所述，通过HRP标记的二抗检测ASC培养上清中的兔抗体与固定的食蟹猴TNFα的结合。来自兔子#2的免疫血清用作阳性对照，稀释度为1∶80000和1∶320000。监测每个平板的阳性对照的响应的稳健性和精确性。在最终测定条件下，对于稀释度1∶80000的阳性对照，信号-背景比在20至30之间，阳性对照CV低于10％。

2.2.2 通过SPR测定与TNFα的结合动力学(人和食蟹猴)

使用MASS-1 SPR仪器(Sierra Sensors)通过表面等离振子共振(SPR)测量抗体对人TNFα的结合亲和力。通过标准参考溶液以及参考抗体-抗原相互作用(例如英夫利昔单抗-TNFα相互作用)的分析来鉴定仪器的性能。

对于亲和力筛选，使用标准胺偶联程序将对兔IgG的Fc区特异性的抗体(BethylLaboratories，目录号A120-111A)固定在传感器芯片(SPR-2 Affinity Sensor，HighCapacity Amine，Sierra Sensors)上。在ASC上清中的兔单克隆抗体被固定化的抗兔IgG抗体捕获。捕获单克隆抗体后，将人TNFα(Peprotech，目录号300-01)以90nM的浓度注射到流动池3分钟，并允许该蛋白质从在传感器芯片上捕获的IgG的解离继续进行5分钟。每次注射循环后，用10mM甘氨酸-HCl的两次注射再生表面。使用一对一朗缪尔结合的模型的MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)计算表观解离(K_d)和结合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于相对卡方(Chi²)监测拟合的质量(Chi²归一化至分析物的外推最大结合水平)，其是对曲线拟合质量的考量。对于绝大多数命中，相对Chi²值低于15％。如果配体结合的响应单位(RU)是抗体捕获的RU的至少2％，则结果视为有效。具有小于2％的抗体捕获的RU的配体结合的RU的样品被认为显示TNFα与捕获的抗体没有特异性结合。

使用相同的测定设置和TNFα浓度并应用相同的质量量度来测量与食蟹猴TNFα(Sino Biological，目录号90018-CNAE)的物种交叉反应性。对于分析的大多数ASC上清，相对Chi²低于15％。

2.2.3 L929成纤维细胞中TNFα诱导的凋亡

使用小鼠L929成纤维细胞(ATCC/LGC规格，目录号CCL-1)评估来自ASC培养上清的兔IgG中和重组人TNFα的生物活性的能力。通过加入1μg/ml放线菌素D使L929细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。在50％ASC培养上清和100pM(5.2ng/ml)人TNFα(Peprotech，目录号300-01)存在下，将细胞在96孔平底微量滴定板中培养24小时。与纯化的抗体相比，在ASC上清存在下必须使用更高浓度的TNFα用于命中筛选。使用WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓，一钠盐)细胞增殖试剂(SigmaAldrich，Cat.No.96992)通过比色测定法测定细胞的存活率。WST-8被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜产物。产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。通过Softmax数据分析软件(Molecular Devices)使用四参数对数曲线拟合分析数据，并且中和TNFα诱导的凋亡50％所需的英夫利昔单抗浓度(IC₅₀)被计算为36.2ng/ml的浓度。因此，该测定的估计检测下限为30至40ng/ml。该值仅是检测限的粗略估计，因为阻断TNFα的可能性不仅取决于单克隆抗体的浓度，还取决于抗体对靶标的亲和力。然而，该测定的灵敏度足以筛选ASC上清液，因为大多数ASC上清中的IgG浓度高于40ng/ml的浓度。导致50％中和TNFα诱导的细胞凋亡的上清被认为是阳性的。

为了确保筛选活动期间稳定的测定性能，在每个筛选板上以115ng/ml(0.8nM)和58ng/ml(0.4nM)一式两份测试阳性对照抗体英夫利昔单抗。监测每个筛选板的阳性对照的抑制百分比和响应精确度。每个平板的验收标准设定如下：用浓度为115ng/ml的阳性对照抗体抑制至少60％，变异系数(CV)低于20％。

实施例2：scFv的人源化和产生

1.结果

1.1 命中确认&选择命中用于人源化

在命中筛选期间检索了73组独特的亲本兔轻链和重链可变结构域，并通过序列比对进行分析。基于筛选测定结果和各个兔IgG克隆的序列同源性，选择30个候选物用于命中确认。制备了29个单克隆抗体，并且在亲和力和效力方面选择性能最佳的克隆用于人源化和先导候选物的产生。选择克隆的标准是i)在L929测定中中和人TNFα，ii)对人TNFα的高亲和力，iii)与食蟹猴和恒河猴TNFα的交叉反应性，和iv)序列多样性。已选择一个克隆(16-22-H05)用于人源化——就L929测定中中和人TNFα的效力而言，其是排序最佳IgG之一。关于结合强度，期望尽可能好的亲和力，因为由于人源化和重新格式化为scFv形式，需要预期一定的亲和力损失。

IgG克隆号16-22-H05的数据概括在表4中。

表4：纯化的单克隆抗体(16-22-H05)的体外结合和活性特性

^*：IC₅₀，英夫利昔单抗/IC₅₀，检测样品

1.2 人源化scFv片段的产生和选择

如WO 2014/206561中所述，在计算机中通过CDR-环移植将编码互补决定区(CDR)的序列转移到人可变结构域支架序列上。此外，每个兔克隆产生第二个构建体，其在与免疫球蛋白结构域和CDR定位具有结构相关性的位置从供体序列转移另外的氨基酸。合成编码相应的人源化单链抗体Fv(scFv)的人工基因(具有用于细菌表达的优化密码子使用)(来自相应的可变轻链和重链)。然后产生多肽，随后使用命中确认期间描述的类似测定表征。

1.2.1 人源化和人源化scFv(API)的制备

如WO 2014/206561中所述，所选克隆的人源化包括将兔CDR转移到Vκ1/VH3型的scFv受体框架上。在该过程中，其示意性地显示在图1中，在供体序列(兔mAb)上鉴定六个CDR区的氨基酸序列并移植到受体支架序列中，产生称为“CDR移植物”的构建体。

此外，设计了第二个移植物，其中包括来自兔供体的位置L15，L22，L48，L57，L74，L87，L88，L90，L92，L95，L97，L99和H24，H25，H56，H82，H84，H89，H108(AHo编号)的额外氨基酸修饰，其已被描述为可能影响CDR定位并因此影响抗原结合(Borras等JBC.2010；285：9054-9066)。这些人源化的构建体称为“结构(STR)移植物”。在比较这两种初始构建体的表征数据显示STR构建体的显著优点的情况下，设计了将CDR移植的VL与STR移植的VH组合的另外的变体。已经证明这种组合通常足以保留STR移植物的活性(Borras等，2010，JBC，285：9054-9066)并且通常优选，因为人受体支架中更少的非人类改变会降低稳定性受损的风险以及免疫原性的可能性。

一旦完成前一部分中描述的计算机模拟构建体设计，则合成相应的基因并构建细菌表达载体。在DNA水平上确认表达构建体的序列，并根据通用表达和纯化方案制备构建体。

蛋白质的异源表达在大肠杆菌中作为不溶性包涵体进行。用指数生长的起始培养物接种表达培养物。使用市售的富培养基(rich media)在定轨摇床的摇瓶中进行培养。使细胞生长至规定的OD₆₀₀为2，并通过用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)过夜表达诱导。在发酵结束时，通过离心收获细胞并通过超声处理均质化。此时，通过细胞裂解物的SDS-PAGE分析确定不同构建体的表达水平。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，所述离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解于变性缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，6M Gdn-HCl，2mM EDTA)中，并通过可扩展的重折叠方案重折叠scFv，其产生毫克量的天然折叠的单体scFv。采用标准化方案纯化scFv，其包括以下步骤。通过使用Capto L琼脂糖(GE Healthcare)的亲和层析捕获重折叠后的产物，得到纯化的scFv。通过使用HiLoad Superdex75柱(GE Healthcare)的修正的尺寸排阻色谱法进一步纯化在初始测试中满足亲和力和效力标准的前导候选物。如下所述，在纯化方案之后，将蛋白质配制在缓冲盐水溶液中，并通过各种生物物理、蛋白质相互作用和生物学方法表征。通过测定批次的纯化蛋白质的最终产量并将该值标准化为1L重折叠体积来比较不同构建体的生产力。

1.2.2 人源化scFv的生物物理表征

scFv在稳定性和生产力方面的生物物理特征列于表5中。如后续章节中所讨论的，scFv构建体的生产力和稳定性由不同的报告点表征。

如下所述，对scFv进行了某些标准的调查。

生产力标准应确保所选择的scFv实体能够以足够的量表达、重折叠和纯化，以支持后来的先导分子的开发。定义的标准是通过SDS-PAGE评估的每升发酵液中scFv的表达产率，以及通过UV光谱法测量纯化蛋白质的量、计算回到1升的重折叠溶液评估的通用实验室规模过程实现的纯化产率。

稳定性标准旨在评估分子制造过程中的聚集倾向及其在储存和进一步处理过程中的结构完整性。通过SE-HPLC测定的单体含量允许在纯化过程中评估分子的胶体稳定性(2.2.3)。在随后的稳定性研究中，单体含量以1和10mg/mL并在4℃、-20℃和＜-65℃下储存4周的持续时间内进行测试。此外，在5次冻融循环后测试蛋白质的胶体稳定性。作为额外的稳定性指示参数，通过差示扫描荧光测定法(DSF)确定热解折叠的中点(2.2.4)，以提供先导候选物的构象稳定性的读数。

表5：人源化scFv的生物物理特征数据概要。

1.2.2.1 生产力评估

通过摇瓶发酵以分批模式表达先导候选scFv分子，并通过通用实验室规模过程纯化以产生蛋白质样品用于进一步表征。在此过程中，监测一些关键性能参数以比较候选分子并鉴定可能难以开发的构建体。

通过离心收获细胞后，在粗大肠杆菌裂解物的水平上测定表达效价。在收获期间，预计会有少量细胞损失，但是，为了计算表达产量而选择忽略该因子，有利于更保守地估计生产力。为了定量裂解物中的scFv产物，选择考马斯染色的还原SDS-PAGE(2.2.1)，因为该方法的高特异性允许将产物与样品中的宿主细胞蛋白区分开。

评估生产力的第二个标准是每升重折叠溶液计算的scFv的纯化产率。该参数解决了包括蛋白质重折叠步骤的预期制造过程中的潜在瓶颈。由于重新折叠程序的效率已被证明在可比较的制造过程中是有限的，因此已经决定将不同构建体的性能与相对于限定的重折叠体积标准化的生产力进行比较。为了计算产率，通过UV吸光度定量来自每批的最终蛋白质样品(2.2.2)，并除以相应纯化的实际重折叠体积(表6)。

表6：两个人源化scFv的生产力数据概要。通过对生产终止细胞(end-of-production cell)的裂解物进行定量SDS-PAGE测定表达效价。通过最终纯化库的UV吸光度测量确定批量产率。纯化产率计算为每升重折叠体积的纯化scFv。

1.2.2.2 稳定性评估

对scFv构建体的构象稳定性、单分散性和结构完整性的评估是不同分子在可开发性方面的排序的不可或缺的组成部分。有意义地比较不同构建体的先决条件是制备具有相似质量的纯化分子。通过SE-HPLC测定的标准“单体纯度”旨在确保不同测试物质的相容质量。除了SE-HPLC分析之外，进行用于测定蛋白质纯度和特性的SDS-PAGE以证实测试制剂的可比质量。

两个scFv的SE-HPLC结果显示所有制剂可以纯化至单体含量≥99％(图2)。

通过差示扫描荧光测定法(DSF)测试先导候选物的热解折叠行为，以允许分子相对于其预期的构象稳定性进行排序。荧光原始数据的标准化图显示在图3中，其描绘了每个样品的重复测量。观察到合作的(cooperative)解折叠行为。两个分子16-22-H05-sc02和16-22-H05-sc04分别显示71.3℃和72.6℃的T_m。

在第二组稳定性评估中，在不同温度下在4周的持续时间内监测分子的单分散性。稳定性研究的结果和所得单体含量示于图4中。两个分子(16-22-H05-sc02和16-22-H05-sc04)开始于单体含量超过最小95％单体，并且在10mg/ml浓度下相对于各自起始值，损失少于5％的单体。在-20℃和＜-65℃的冷冻状态，随着时间样品仅显示最小的差异。在最严格的条件(4℃)下，分子16-22-H05-sc02在4周期间损失少至0.2％的单体。此外，在37℃的温度和10mg/ml的scFv浓度下进行应力(stress)稳定性研究长达4周。在该条件下，预期会更严格地区分不同构建体的聚集倾向。图6中总结的结果数据显示28天后单体损失为15％。两个scFv在应力条件下都表现出良好的单体稳定性。图5中提供了4℃下稳定性研究的色谱图，其中显示了4℃的第0天的样品和28天后的样品。在该色谱图中，还显示了冻/融稳定性的结果。对于该部分研究，将样品反复冻融，共5个循环。通过分析型SE-HPLC对所得单体含量的定量未显示两个样品的任何变化(表5)。

对两个scFv进行SDS-PAGE分析以产生用于通过UV吸光度定量的支持数据，证实样品制备物的纯度，从而赋予含量定量的特异性。在该分析的另一方面，SDS-PAGE结果显示在稳定性研究期间没有蛋白质降解(在4℃下28天，浓度为10mg/ml，与在＜-65℃下储存的第0天的样品相比)，从可开发性的角度来看，这是一个重要的特征。

值得注意的是，在本评估范围内进行的不同研究涉及蛋白质稳定性的不同机制方面。确定蛋白质的热解折叠温度将得到在升高的温度下储存时通过SE-HPLC测量单分散性的互补结果。虽然两种方法都旨在估计潜在的产品保质期和稳定性，但所解决的机制却截然不同。通过热解折叠评估的转变中点(T_m)是蛋白质结构域稳定性的定性测量(不允许热力学测定ΔG)。高度稳定的蛋白质结构域(高T_m)在环境温度下不太可能自发地解折叠，因此不太倾向于由解折叠的结构域相互作用驱动的不可逆聚集/沉淀。高结构域稳定性表明氨基酸残基的密集包装，这也与蛋白酶切割的抗性相关。另一方面，SE-HPLC评估定量确定单体级分以及可溶性低聚物/聚集体的含量。这种可溶性寡聚体通常是可逆的并且由正确折叠的蛋白质之间的静电或疏水相互作用驱动的相对松散的缔合。通过热解折叠评估的T_m与通过SE-HPLC评估的寡聚体/聚集体形成的倾向之间存在一些相关性，特别是对于具有“边界线”稳定性的蛋白质。超过约60℃的特定阈值Tm抗体可变结构域通常足够稳定以抵抗由于在环境温度下部分结构域解折叠的聚集/沉淀和蛋白水解降解。然而，仍然会发生由表面残基的疏水和/或静电相互作用驱动的寡聚反应。重要的是，在升高的温度(例如37℃)下的加速(应力)稳定性研究中，寡聚体形成和沉淀的各种机制可同时发生。

1.2.3 人源化scFv的体外结合和活性的表征

在下文中，人源化scFv体外表征其靶结合特性和效力。分析了与人TNFα的结合动力学(k_a、k_d和K_D)和中和TNFα诱导的L929成纤维细胞凋亡的效力。另外，测定了抑制食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)TNFα诱导细胞凋亡的效力以及通过ELISA抑制人TNFα和TNFRI/TNFRII之间相互作用的效力和相对于TNFβ与TNFα结合的靶选择性。

为了理解下面的结果，重要的是要注意，兔CDR转移到人可变结构域支架以及从全尺寸IgG到scFv片段的形式变化都可能影响药理学性质。例如，一定程度的亲和力损失通常与人源化有关。此外，由于与IgG相比scFv尺寸较小，scFv通过空间位阻干扰相互作用配偶体的能力大大降低。最后但并非最不重要的是应注意，由于其与同源三聚体TNFα的二价结合模式，可能已经报道了亲本IgG的亲和力太高(SPR假象)。因此，当比较亲本二价兔IgG和人源化单价scFv之间的亲和力时，报道的“亲和力损失”可能被高估。

1.2.3.1 亲和力

通过SPR测量确定人源化scFv对人TNFα的亲和力(也参见2.1.1)。使用相应scFv的2倍系列稀释液测定亲和力。scFv源自兔单克隆抗体。产生两个scFv变体，命名为“CDR”(CDR)和“结构移植物”(STR)。为了评估在轻链和重链中框架取代的相对贡献并可能减少人框架中引入的兔氨基酸残基的数量，进行了结构域混编(domain shuffling)实验。因此，为克隆16-22-H05产生含有CDR移植轻链和结构移植重链(CDR/STR)的scFv构建体。

排序最高的scFv 16-22-H05-sc02(STR)和16-22-H05-sc04(CDR/STR)分别以4.5×10_-11和1.1×10_-10M的亲和力结合。与其“结构移植物”变体(16-22-H04-sc02)相比，16-22-H05-sc04仅显示出亲和力的轻微降低(参见表7)。这些结果表明人源化scFv的亲和力主要取决于引入人重链框架中的少数兔氨基酸。

1.2.3.2 效力

使用L929测定分析人源化scFv中和人TNFα的能力(也参见2.1.2)。分析16-22-H5衍生的scFv的中和TNFα诱导的细胞凋亡的效力(IC50和IC90)，并与参考抗体英夫利昔单抗的效力比较，以允许直接比较来自不同测定板的IC₅₀和IC₉₀值。计算英夫利昔单抗和scFv的质量单位(ng/ml)的相对IC50和IC90值。使用不同批次的抗体片段在不同天进行数次效力分析。图7显示了来自两个scFv中的每一个的一个实验的代表性剂量-反应曲线。重复测量的平均值显示在表7中(标准偏差总结在表的图例中)。

与英夫利昔单抗相比，人源化scFv抑制TNFα诱导的细胞凋亡的IC50和IC90值更低(参见表7)。与SPR结果一致，与结构移植物16-22-H05-sc02(STR)相比，结构域混编的变体16-22-H05-sc04(CDR/STR)表现出相等的效力。scFv16-22-H05-sc04和16-22-H05-sc02显示出优异的TNFα中和活性，IC₅₀值分别是英夫利昔单抗的14.6倍和13.1倍。16-22-H05-sc04和16-22-H05-sc02的IC90值分别是英夫利昔单抗的13.1倍和12.6倍。如对亲本兔单克隆抗体所观察到的，抗体的亲和力和效力之间没有明确的相关性(相关性未显示)。然而，源自显示最高亲和力的16-22-H05的scFv(16-22-H05-sc02(STR)和16-22-H05-sc04(CDR/STR))也显示出最高效力。另外，来自中和测定的结果表明需要达到某种阈值亲和力以有效抑制TNFα信号传导。例如，scFv 16-14-D08-sc01(CDR)、16-15-C09-sc01(CDR)、16-24-H07-sc01(CDR)和17-20-G01-sc01(CDR)，所有对TNFα结合具有高于1nM亲和力，显示出中和TNFα的潜力较差(未显示)。

1.2.3.3 物种交叉反应性(食蟹猴和恒河猴TNFα)

排序最高的scFv的物种交叉反应性由两种方法确定：1)在L929测定中中和食蟹猴和恒河猴TNFα的效力和2)通过SPR对食蟹猴和恒河猴TNFα的亲和力。中和来自不同物种的TNFα的效力通过L929测定法测定，类似于上文分别使用食蟹猴和恒河猴TNFα对人TNFα的描述(也参见2.1.2)。来自两个物种的TNFα显示出非常相似的诱导L929凋亡的效力(数据未显示)。因此，相同浓度的人和猴TNFα用于物种交叉反应性测试。另外，使用与人TNFα类似的测定法测定(通过SPR)与食蟹猴和恒河猴TNFα的结合动力学(也参见2.1.1)。

来自克隆16-22-H05的所有scFv显示出与食蟹猴和恒河猴TNFα的交叉反应性(参见表7)。亲和力相似，即食蟹猴和恒河猴分别为2.0×10^-10和2.3×10^-10M。人和猴TNFα之间的亲和力差异约为5倍。中和食蟹猴、恒河猴和人TNFα的效力与对各自TNFα的亲和力相关。因此，与人TNFα相比，衍生自16-22-H05的两个克隆显示出是对猴TNFα的效力的五分之一至七分之一(参见表7和图8)。总之，两个scFv显示出与食蟹猴和恒河猴TNFα的物种交叉反应性。

1.2.3.4 阻断人TNFα-TNFRI/II相互作用

除L929测定外，还通过ELISA评估每个人源化scFv抑制人TNFα和TNFRI/II之间相互作用的效力(见2.1.3)。与L929测定相似，每个平板上的个体IC₅₀值针对每个平板上获取的参考分子英夫利昔单抗的IC₅₀进行校准，并且以英夫利昔单抗和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC₅₀和IC₉₀值。

中和测定只有在以高于效力测定中使用的靶浓度的平衡结合常数(K_D)(K_D＞靶浓度)与它们的靶结合时才能区分靶标阻断抗体的效力，。对于L929测定，使用5μM的TNFα浓度，而在TNFRI/II抑制中，使用960pM的TNFα浓度。因此，理论上，L929测定可以区分具有KD＞5pM的scFv之间的效力，而抑制ELISA只能区分具有K_D＞960pM的scFv之间的效力。由于所有分析的scFv显示K_D低于960pM，因此具有不同亲和力(但具有相似作用机制)的scFv之间的效力可以仅在L929测定中区分。

与英夫利昔单抗相比，16-22-H5-sc02和16-22-05-sc04显示阻断TNFα-TNFRI相互作用的效力在2.8和3.5倍之间，而在L929测定中与英夫利昔单抗相比的效力显著更高(13.1和14.6倍)。当比较亲本兔IgG的相对IC₅₀值(参见表2)与人源化scFv的相对IC₅₀值(表7)时，scFv的效力通常略高于亲本IgG，尽管亲和力通常在亲本兔IgG的相同范围。由于抗体和scFv的效力以质量单位进行比较，因此单价scFv的每个浓度的效价(TNFα结合位点)的数量是超过5倍重的但是二价的IgG的约2.9倍。使用非常高亲和力的结合scFv，这导致更有效地阻断TNEα和TNFRI/II的相互作用，因为缺乏亲合力对于活性不再是关键的。相反，对于低亲和力的单价结构域，已经发表了相反的观点((Coppieters等Arthritis&Rheumatism，2006；54：1856-1866).由于上述原因，来自抑制ELISA的结果不用于不同抗体之间效力的排序，但主要用于比较抗体阻断TNFRI相对于TNFRII的相互作用的可能性。研究的scFv阻断了具有相当效力的两个TNFα受体之间的相互作用(表9，图9和图10)。

1.2.3.5 靶特异性(结合TNFα相对于TNFβ的选择性)

两个scFv(16-22-H05-sc02和16-22-H05-sc04)对TNFα相对于TNFβ的特异性通过评估TNFβ与TNFα相对于半数最大程度抑制TNFα与每种scFv的结合的相对潜能来确认并在竞争ELISA中测量(参见2.1.4)。蛋白质制造商已经通过1)SDS-page和HPLC分析纯度，以及2)在小鼠L929细胞毒性测定中的生物活性分析了重组人TNFβ的质量。如图11所示，每个scFv与生物素化的TNFα之间的相互作用被未标记的TNFα阻断，IC₅₀值范围为60至260ng/ml，而TNFβ即使在测试的最高浓度的TNFβ(1250μg/ml)下也没有显示任何显著效果。因此，所分析的所有scFv都与TNFα特异性结合，但不与其最接近的同源物TNFβ结合。在测试浓度下，TNFβ未显示出scFv与TNFα结合的任何显著抑制。因此，半数最大限度地抑制TNFα结合所需的TNFβ浓度必须显著高于测定中使用的TNFβ的最高浓度(1250μg/ml)。当比较半数最大限度地抑制TNFα与scFv结合所需的TNFα和TNFβ浓度时，对于所有测试的片段，结合TNFα的选择性显著为TNβF的约5000至20,000倍(也参见表7)。因此，任何scFv的脱靶结合似乎不太可能。

上述实验的结果总结在表7至9中。

2.方法

2.1 先导表征测定

2.1.1 通过SPR测定的结合动力学和物种交叉反应性

使用MASS-1 SPR仪器(Sierra Sensors)通过表面等离振子共振(SPR)测量scFv对人TNFα的结合亲和力。通过分析参考抗体抗原相互作用例如赛妥珠单抗-TNFα相互作用来鉴定SPR测定的性能。选择聚乙二醇化Fab片段赛妥珠单抗作为参考，因为其单价结合模式类似于scFv。使用与scFv的亲和力测量相同的测定设置，确定赛妥珠单抗对TNFα的亲和力的值为9.94x10_-11M。该值与公布的K_D值9.02±1.43x10^-11M非常一致(BLA赛妥珠单抗；BLA编号：125160；提交日期：2007年4月30日)。

对于scFv的亲和力测量，通过胺偶联将人TNFα(Peprotech，目录号300-01)固定在传感器芯片(SPR-2 Affinity Sensor，Amine，Sierra Sensors)上以达到50至100RU的固定水平(在SPR分析期间实现的固定水平在40至120RU之间)。在第一步，仅使用一个scFv浓度(90nM)进行scFv亲和力筛选。在第二步，为了最佳表现的scFv，从通过同时将不同浓度的六个分析物样品注射到MASS-1系统的八个平行通道的单个注射循环测得单个注射循环动力学(SiCK)。对于亲和力筛选，将人源化scFv以90nM的浓度注入流动池中3分钟，并监测解离12分钟。对于后续更精确的亲和力测定，将scFv的两倍连续稀释液(45至1.4nM)注射到流动池中3分钟，并使蛋白质与固定在传感器芯片上的TNFα的解离进行12分钟。使用一对一朗缪尔结合的模型的MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)计算表观解离(K_d)和结合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于卡方(Chi2)监测拟合的质量，Chi²是用于曲线拟合的质量的量度。Chi²的值越小，一对一朗缪尔结合的模型的拟合越准确。对于亲和力筛选，如果所分析的浓度的Chi²低于10，则认为结果有效。在分析几个scFv浓度的情况下，如果测试的所有浓度的平均Chi²低于10，则认为结果有效。所有测试的scFv均符合验收标准。

使用相同的测定装置并应用与上述人TNFα相同的质量测量来测量对食蟹猴(SinoBiological，目录号90018-CNAE)和恒河猴(R&D Systems，目录号1070-RM-025/CF)TNFα(Peprotech，目录号315-01A)的物种交叉反应性。对于食蟹猴和恒河猴，TNFα固定水平分别为50至180RU和90至250RU。使用浓度范围为45-1.4nM的两倍系列稀释液分析scFv。对于所有测试的scFv，平均Chi²值低于10。

2.1.2 TNFα诱导的L929成纤维细胞凋亡(通过scFv中和人、非人灵长类动物和TNFα)

使用小鼠L929成纤维细胞(ATCC/LGC规格，目录号CCL-1)评估scFv中和重组人TNFα的生物活性的能力。通过加入1μg/ml放线菌素D使L929细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。抗TNFα参照抗体或scFv(3000-0.05ng/ml)和5pM重组人TNFα三倍连续稀释(Peprotech，目录号300-01)在室温下预孵育1小时。使用的TNFα浓度(5pM)诱导次最大L929细胞凋亡(EC₉₀)。加入激动剂/抑制剂混合物后，将细胞培养24小时。使用WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓，一钠盐)细胞增殖试剂(SigmaAldrich，Cat.No.96992)通过比色测定法测定细胞的存活率。WST-8被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜产物。产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)，使用四参数对数曲线拟合分析数据，并且计算中和TNFα诱导的凋亡50％和90％所需的参考抗体或scFv浓度(IC₅₀和IC₉₀)(也参见图7)。为了使IC₅₀和IC₉₀值在不同天或不同测定板上进行的实验之间直接可比，针对参考抗体英夫利昔单抗校准IC₅₀和IC₉₀值。为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(CV＜20％)。

使用相同的测定装置并应用与上述人TNFα相同的质量测量来测量对食蟹猴(SinoBiological，目录号90018-CNAE)和恒河猴(R&D Systems，目录号1070-RM-025/CF)TNFα的物种交叉反应性。与人对应物相似，诱导次最大L929凋亡的TNFα浓度(EC90)用于物种交叉反应性测试。来自两个物种的TNFα显示出与人TNFα非常相似的诱导L929小鼠成纤维细胞凋亡的效力。因此，相同浓度的TNFα(5pM)用于测试的其他物种。在物种交叉反应性测试期间，大多数一式两份测量点的CV低于10％。

2.1.3 TNFα抑制ELISA

使用ELISA评估scFv对配体结合的抑制作用(仅仅再现TNFα与TNFRI和TNFRII之间的相互作用的生化方法)。

对于第一抑制ELISA，将融合至人IgG Fc区的TNFRI的细胞外结构域(R&DSystems，目录号372-RI)以0.5μg/ml的浓度包被在96孔Maxisorp ELISA上。对于第二抑制ELISA，将融合至人IgG Fc区的TNFRII的细胞外结构域(R&D Systems，目录号726-R2)以2μg/ml的浓度包被。两种测定的所有后续步骤均相同。为了检测TNFα与TNFRI和TNFRII的结合，在使用前将TNFα生物素化。首先将生物素化的人TNFα(960pM，50ng/ml)与3倍系列稀释的人源化抗TNFαscFv和英夫利昔单抗(10000ng/ml-0.2ng/ml)在室温下孵育1小时。将TNFα/抗体片段混合物转移到TNF受体固定的平板上，用生物素结合链霉抗生物素蛋白-HRP(SDT Reagents，目录号SP40C)在室温下孵育20分钟后检测未封闭的TNFα与固定的TNFα受体的结合。加入3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物得到比色读数，其与TNFα与TNFRI和TNFRII的结合成比例。在竞争ELISA中使用之前，在L929测定中证实了生物素化的TNFα的生物活性。生物素化的TNFα的EC₅₀与未标记的TNFα的EC₅₀相似(数据未显示)。与上述L929测定类似，使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)使用四参数对数曲线拟合分析数据，并且计算50％和90％抑制TNFα和TNFR相互作用所需的scFv浓度(IC₅₀和IC₉₀)。为了使IC₅₀和IC₉₀值在不同天或不同测定板上进行的实验之间直接可比，针对参考抗体英夫利昔单抗校准IC₅₀和IC₉₀值。

为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(CV＜25％)。

2.1.4 靶特异性

为了确认抗TNFα scFv的特异性，评估了与最同源的家族成员TNFβ的结合。通过竞争ELISA分析通过未标记的TNFβ(Peprotech，目录号300-01B)和TNFα(Peprotech，目录号300-01)抑制生物素化的TNFα与scFv相互作用的可能性。为此目的，将scFv以1μg/ml的浓度包被在96孔Maxisorp ELISA板上。使用如上所述的生物素结合链霉抗生物素蛋白-HRP(SDT试剂，目录号SP40C)在5倍连续稀释的未标记的TNFα(50μg/ml-0.00013μg/ml)或TNFβ(1250μg/ml-0.00013μg/ml)存在下，检测生物素化的TNFα(75ng/ml)与包被的scFv结合。对于TNFα的剂量-反应曲线，使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)使用四参数对数曲线拟合分析数据，并且计算50％阻断生物素化的TNFα和包被的scFv相互作用所需的未标记TNFα的浓度(IC₅₀)。TNFβ未显示生物素化的TNFα和scFv之间相互作用的任何显著抑制(也参见图11)。为了定量TNFβ与TNFα相比抑制TNFα与每种scFv结合的相对潜力，计算抑制TNFβ相对于TNFα相互作用的IC₅₀。由于使用TNFβ的浓度是TNFα的IC₅₀的约5000至20000倍时没有观察到明显的抑制，因此确定结合TNFα的选择性显著为TNFβ的5000至20000倍。为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(对于除了所测试的TNF/浓度中的一个之外的所有测量值，CV＜25％)。所有scFv都符合这一标准。

2.1 CMC分析(analytics)

2.2.1 还原SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种用于定性表征和控制蛋白质纯度的分析技术。根据美国药典(USP)(USP第1056章)，分析凝胶电泳是鉴定和评估药物中蛋白质同质性的合适且常规的方法。

该方法用于定量来自大肠杆菌裂解物的scFv产物的量，以得到发酵后的表达产率。该方法的另一个应用是基于它们的分子量相对于理论值来验证测试物质的特性。为了支持目的，该方法用于定量测试样品相对于过程相关杂质(宿主细胞蛋白质)和产物相关杂质(降解产物或加合物)的纯度。

用购自Bio-Rad Laboratories Inc.的市售预制凝胶系统“Mini Protean”进行SDS-PAGE分析。在“Any kD”解析凝胶(#456-9036)上分析人源化scFv。在两种情况下，使用制造商推荐的Tris/甘氨酸缓冲系统。为了检测蛋白质条带，使用SimplyBlueTM染色溶液(Life Technologies Corp.，#LC6060)进行考马斯染色或使用Pierce Silver Stain Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.，#24612)进行银染。对于染色程序，遵循相应供应商的方案。

使用文档系统ChemiDoc XRS System(Bio-Rad Laboratories Inc.，#170-8265)和软件Image Lab，版本4.0.1(Bio-Rad Laboratories Inc.，#170-9690)进行染色的蛋白质凝胶的记录和分析。

裂解物样品的效价测定

SDS-PAGE允许特异性检测宿主细胞蛋白质混合物中的目的蛋白质。在每个凝胶上包括该方法的线性范围(其预先确定)的参考标准稀释系列。使用条带强度的线性回归(通过光密度测定法测量)与参考标准的标称浓度来计算标准曲线，该标准曲线又用于外推样品中的scFv含量。

将未知产物浓度的裂解物样品以不同稀释度(在稀释缓冲液中至少1∶10)上样，以在该方法的线性范围内具有至少一个scFv浓度。基于测量的scFv的条带强度计算产物量，并使用样品制剂的稀释因子确定浓度。对在标准曲线的线性范围内的所有样品的值进行平均。

作为该方法用于定量裂解物样品的适合性的另外测试，通过用已知量的参考标准掺入裂解物样品来进行抑制/增强测试。在稀释缓冲液中以1∶10的样品稀释度计算加标回收率得到95.4％的值，其与用稀释缓冲液中的参考标准品观察到的精确度相同。因此，未观察到细胞裂解物中显著的基质干扰，并且该方法被认为适合于细胞裂解物中scFv含量的定量。

蛋白质纯度和含量

为了显示该方法确定含量的适合性以及由此测试样品的纯度，参考scFv的检测下限(LOD)在0.02μg的标称上样下目测确定(通过鉴定蛋白质条带)，对相应泳道的强度直方图的评估显示在该上样的信噪比约为2。此外，通过密度分析主要条带确定定量的线性范围。

将数据线性回归拟合得到0.9998的测定系数(R2)，从而表明拟合的质量良好。除了拟合的总体质量之外，还确定每个单独数据点的相对误差以记录该方法在所选范围内的适合性。所有数据点的相对误差均低于10％，表明该方法具有良好的准确性。

2.2.2 280nm的UV吸光度

该方法在280nm的UV吸光度是USP第1057章中概述的总蛋白质测定。由于芳香族氨基酸的存在，蛋白质溶液吸收280nm波长的紫外光。UV吸光度随着蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量而变化，并且与蛋白质浓度成比例。未知蛋白质溶液的吸光度可以根据USP第851章关于光谱学通过应用比尔定律来确定：A＝ε*l*c，其中吸光度(A)等于摩尔吸光系数(ε)、吸收路径长度和物质浓度的乘积。用软件Vector

(Life TechnologiesCorporation)计算scFv的摩尔吸光系数。

使用配备有Nanoquant板(Tecan Group Ltd.)的Infinity读数器M200 Pro进行UV吸光度的测量。在280nm和310nm测量蛋白质样品的吸光度，其中后一波长用作从280nm信号中减去的参考信号。为了解释样品基质的潜在干扰，对每次测量进行空白减法。使用朗伯-比尔定律，将获得的蛋白质样品的最终吸光度信号用于计算蛋白质浓度。

所有测量均在仪器规格给出的范围内进行，测量范围为0-4 OD，其中再现性＜1％，均匀度＜3％由制造商规定。

2.2.3 SE-HPLC(体积排阻高压液相色谱)

如USP第621章所述，SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V0)和总渗透体积(VT)之间。在配备有自动样品注射和设定为280nm检测波长的UV检测器的Chromaster HPLC系统(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行SE-HPLC测量。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图的分析。通过离心澄清蛋白质样品，并在注射前在自动取样器中保持在6℃的温度。对于scFv样品的分析，用标准缓冲盐水流动相(50mM乙酸钠pH 6.0，250mM氯化钠)以推荐的流速0.35毫升/分钟使用Shodex KW402.5-4F柱(ShowaDenko Inc.，#F6989201)。每次注射的靶样品上样为5μg。通过UV检测器在280nm的波长下检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V0至VT的范围内分析所得的色谱图，从而排除洗脱时间＞10分钟的基质相关峰。

为了确保方法的期间精确度，在每个HPLC序列的开始和结束时常规测量参考标准。用于该系统适合性测试的参考标准是scFv，其已作为批次生产并等分以用于每个测量时间点。

2.2.4 DSF(差示扫描荧光法)

方法DSF是测量温度依赖性蛋白质解折叠的非药典方法。使用MX300软件包(Agilent Technologies)控制并配备设定为492/610nm的激发/发射滤光器的MX3005PqPCR机器(Agilent Technologies)进行通过DSF进行的热解折叠温度的测量。将反应设置在Thermo fast 96白色PCR板(Abgene；#AB-0600/W)中。为了检测蛋白质解折叠，使用市售的染料SYPRO orange(Molecular Probes；#S6650)的储备溶液，最终稀释度为1∶1000。在标准化的缓冲盐水溶液中将蛋白质样品稀释至终浓度为50μg/mL用于解折叠测量。热解折叠通过温度程序进行，温度程序从25℃开始，以1℃逐步升温至96℃，持续时间为30秒。在温度程序期间，记录每个样品的荧光发射。使用Microsoft Excel模板包(Niesen，NatureProtocols 2007，Vol.2 No.9)处理和评估记录的原始数据，并使用GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.)程序使用Boltzmann方程拟合荧光数据获得转变的中点(T_m)。

为了产生解折叠的中点的可靠且稳健的测量，进行了至少一式两份的测量。关于数据质量，仅考虑具有拟合优度(R²)＞0.9900和小于0.5％的Tm的95％置信区间的测量。

为了评估期间精确度，每次测量都包括参考标准(已知特征为scFv)，以便比较不同日期的测定性能。

2.2.5 稳定性研究

为了评估不同scFv构建体的稳定性作为这些分子可开发性的读数，设计了短期稳定性研究方案。将蛋白质构建体在简单的缓冲盐水制剂(参见上文)中浓缩至1和10mg/mL的靶浓度。通过SE-HPLC测定单体含量以确认纯度超过＞95％的成功标准。随后将蛋白质样品在＜-65℃、-20℃、4℃和37℃下储存4周，并在不同时间点分析等分试样。主要读数是通过SE-HPLC分析，其允许定量可溶性较高分子量的寡聚物和聚集体。作为支持性测量，蛋白质含量通过280nm的UV吸光度确定，其表明在储存期间是否通过沉淀损失了大量蛋白质。对于储存，使用螺旋盖管(Sarstedt，目录号72.692.005)，每个等分试样的填充量为30-1500μg。另外，通过SDS-PAGE测定纯度，其表明构建体在降解或共价多聚化方面的稳定性。

实施例3：产生人源化双抗体和IgG

通过以VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA构型排列可变结构域来设计单链双抗体构建体。在这些构建体中，VLA和VHA以及VLB和VHB结构域共同形成TNFα的结合位点。连接可变结构域的肽接头L1-L3由甘氨酸/丝氨酸重复构建。两个短接头L1和L3由单个G4S重复组成，而长接头L2由序列(G4S)4组成。编码人源化可变结构域的核苷酸序列(实施例2；1.2.1.)从头合成并克隆到适合的大肠杆菌表达载体中，该载体基于pET26b(+)主链(Novagen)。如对实施例2；1.2.1中的scFv所述进行表达和纯化。

通过将可变结构域克隆到合适的哺乳动物表达载体中来构建人源化IgG，所述表达载体用于瞬时异源表达，其含有前导序列和相应的恒定结构域，例如，pFUSE-rIgG载体(Invivogen)。通过在CHO S细胞中用FreeStyle^TM MAX系统共转染编码重链和轻链的载体来进行功能性IgG的瞬时表达。培养数天后，回收抗体分泌细胞的上清用于纯化。随后，通过蛋白A琼脂糖凝胶(GE Healthcare)亲和纯化分泌的IgG。通过SDS-PAGE、280nm的UV吸光度和SE-HPLC分析洗脱级分。

使用如实施例2中2.1.1)所述的Biacore仪器测定抗体分子的亲和力。

表10

在L929测定(该方法如实施例2中2.1.2所述)中测定抗体分子的效力。

表11

实施例4：TNFα结合的化学计量比学测定

使用SE-HPLC测定16-22-H5与TNFα的结合化学计量比。将16-22-H5-scFv和TNFα以两种不同的摩尔比孵育，即以1∶1和4.5∶1的摩尔比孵育。由于TNFα作为溶液中的三聚体存在，因此所示的摩尔比是指TNFα三聚体。因此，在4.5∶1的比例下，16-22-H5-scFv过量并且应占据所有TNFα三聚体结合位置，得到1个TNFα三聚体与3个scFv的复合物。然而，在等摩尔条件下，没有足够的scFv存在以使所有3个理论TNFα结合位点饱和。因此，预期还有小于3个scFv结合的复杂变体。将TNFα和16-22-H5-scFv在室温下孵育2小时以允许复合物形成。然后将样品在4℃下离心10分钟。在SE-HPLC上分析10μL的每种样品。用50mM磷酸盐缓冲液、pH6.5、300mM NaCl作为洗脱液以0.35mL/min的流速进行SE-HPLC分析。在280nm的波长下检测到洗脱的蛋白质峰。使用来自GE Healthcare(LMW，HMW)的凝胶过滤校准试剂盒预先校准柱以测定表观分子量。

图12的下图显示了具有等摩尔量的scFv和TNFα的洗脱曲线，其与单独的TNFα三聚体和单独的scFv的曲线重叠。由于溶液中TNFα的三聚化，理论上每个三聚体上存在的scFv最多有三个等同的结合位点，因此scFv分子是有限的。在这些条件下，鉴定了所有三种复合物质(3∶1、2∶1、1∶1)。图12的上图显示了具有过量scFv的复合物的洗脱曲线。过剩的未结合的scFv在预期的保留时间洗脱。TNFα峰被定量消耗用于复合物形成并完全消失。该复合物的峰向较低的保留时间移动，并且与具有等摩尔设置的最大分子量的峰的保留时间良好相关。由于这个原因，可以得出结论，TNFα上的所有可用结合位点都被scFv占据，因此，如果scFv过量，则结合化学计量比为3∶1(scFv∶TNFα)。

除了这些定性观察之外，还通过SE-HPLC测定的16-22-H5-scFv∶TNFα复合物的表观MW计算表观结合化学计量比。基于保留时间，表观MW计算为139.7kDa。根据下面的等式(1)，表观结合化学计量比计算为3.3。这与TNFα三聚体上可用于scFv的三个等同结合位点的理论数量和上面观察到的3∶1结合化学计量比的理论数量很好地相关。

等式(1)：

MW(复合物表观分子量)：139.7kDa

MW(TNFα理论分子量)：52.2kDa

MW(scFv理论分子量)：26.5kDa

实施例5：TNFα：抗体复合物的形成(TNFα的交联)

在含有10mM HEPES、150mM NaCl和0.05％Tween的HEPES缓冲液中在Biacore T200仪器上测试16-22-H5-scDb同时结合两个TNFα分子的能力。根据制造商的说明，使用生物素CAPture试剂盒(GE Healthcare)通过生物素化的ssDNA寡核苷酸捕获生物素化的TNFα(Acro Biosystems)。以10μL/min的流速注射0.25μg/mL的生物素化的TNFα，持续3分钟，以达到约200至300RU(共振单位)的捕获水平。将作为对照的抗体16-22-H5-scDb和16-22-H5-scFv以30μL/min的流速以90nM的浓度注射到TNFα固定的表面上2分钟。在抗体片段结合后，以30μL/min的流速注射90nM的TNFα(Peprotech)5分钟。选择抗体和TNFα浓度接近结合饱和度。在25℃下进行测量。如所预期的，图13说明二价16-22-H5-scDb能够同时结合两个TNFα分子，而单价16-22-H5-scFv仅结合一种TNFα分子。

此外，使用SE-HPLC以不同比例的TNFα和16-22-H5抗体形式评估TNFα-抗体复合物的形成。将16-22-H5-IgG(150kDa)和16-22-H5-scDb(52kDa)与相对于结合位点的不同摩尔比(1∶3、1∶1、3∶1)的TNFα(52kDa)一起孵育。因此，IgG和scDb具有2个结合位点，而TNFα具有3个结合位点。将抗体-TNFα混合物在37℃孵育至少30分钟，在室温下冷却10分钟并在2-8℃下储存过夜。将5至10uL的浓度约1mg/mL的蛋白质混合物注射到TOSHO TSKge1UP-SW3000柱上。用150mM磷酸盐缓冲液、pH 6.8、100mM NaCl作为洗脱液以0.3mL/min的流速进行分析。在214nm的波长下检测到洗脱的蛋白质峰。使用BEH450SEC蛋白质标准混合物(Waters)预先校准柱以测定复合物的近似分子量。图14A显示了16-22-H5-IgG∶TNFα复合物的形成。≥600kDa的复合物表明由≥2个TNFα和≥3个IgG分子组成的复合物的形成。图14B显示了16-22-H5-scDb∶TNFα复合物的形成。≥300kDa的复合物表明由≥2个TNFα和≥3个scDb分子组成的复合物的形成。

实施例6：抑制细胞增殖

在混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了16-22-H5和阿达木单抗的不同抗体形式抑制外周血单核细胞(PBMC)增殖的能力。将来自2个健康供体的PBMC以1∶1的比例在96孔板中在37℃/5％CO₂下培养(RPMI1640)48小时。活化后，用抗TNFα抗体或IgG对照抗体(均以10μg/mL的终浓度)处理细胞，在37℃/5％CO₂下再处理5天。在孵育结束前24小时，向每个孔中加入BrdU(20uL/孔)，并通过使用市售细胞增殖ELISA(Roche Diagnostics)测量BrdU摄取来测定增殖。通过计算抗体处理的细胞和丝裂霉素C(25ng/mL)处理的细胞之间BrdU摄取的比来确定刺激指数。表12和图15说明16-22-H5的所有测试抗体形式显著抑制与阿达木单抗相当的T细胞增殖。

表12

*p＜0.05；**p＜0.01

实施例7：抑制LPS诱导的细胞因子分泌

将RPMI1640中的CD14+单核细胞接种于96孔板并在湿润的培养箱中在37℃/5％CO2中培养16h。然后用抗TNFα抗体或IgG对照抗体使用2至2000ng/mL的最终抗体浓度一式两份处理细胞1小时。用细胞培养基洗涤单核细胞3次，随后用LPS(100ng/mL)在37℃/5％CO2下孵育4小时。使用市售的ELISA试剂盒(R&D Systems)测定细胞培养上清中的IL-1β和TNFα浓度。结果显示在表13和14以及图16A和B中。使用四参数对数曲线拟合确定IC₅₀。关于IL-1β的分泌，16-22-H5-IgG、16-22-H5-scDb、16-22-H5-scFv和阿达木单抗的IC₅₀值总结于下表13中。

表13.IL-1β的分泌

关于TNFα的分泌，测定的16-22-H5-IgG、16-22-H5-scDb、16-22-H5-scFv的IC50值总结于表14中。

表14.TNFα的分泌

表15.Vκ1共有序列(重排)

表16：Vλ基于种系的框架IV序列

Claims

1.一种能够结合人肿瘤坏死因子α(TNFα)的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含：(i)V_L结构域，其包含由SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列组成的CDR1区、由SEQ IDNO:8中所示氨基酸序列组成的CDR2区和由SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列组成的CDR3区；和(ii)V_H结构域，其包含由SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列组成的CDR1区、由SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列组成的CDR2区和由SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列组成的CDR3区。

2.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段

(i)以小于125pM的解离常数结合人TNFα；

(ii)与恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα以及与食蟹猴(Macaca fascicularis)的TNFα交叉反应；

(iii)通过L929测定法测定，具有比英夫利昔单抗更强的抑制TNFα诱导细胞凋亡的效力；

(iv)包含具有通过差示扫描荧光测定法测定的至少70℃的解链温度的可变结构域；和/或

(v)能够以至少2的抗体与TNFα_三聚体的化学计量比结合人TNFα_三聚体。

3.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其以小于50pM的K_D结合人TNFα。

4.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含具有SEQ IDNO:13中所示的氨基酸序列的V_H结构域。

5.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含具有选自SEQID NO:14或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的V_L结构域。

6.根据权利要求1所述的功能片段，其为单链可变片段(scFv)。

7.根据权利要求6所述的功能片段，其中所述scFv具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的抗体，其为免疫球蛋白G(IgG)。

9.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段的轻链可变结构域的(i)框架区I中与SEQ ID NO:56所示的人Vκ1共有序列不同的氨基酸的数量，(ii)框架区II中与SEQ ID NO:57所示的人Vκ1共有序列不同的氨基酸的数量，(iii)框架区III中与SEQ ID NO:58所示的人Vκ1共有序列不同的氨基酸的数量，和(iv)框架区IV中与选自SEQID NO:59至62的最相似的人λ基于种系的序列不同的氨基酸的数量之和小于7。

10.根据权利要求1所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段的所述轻链可变结构域的框架区I由SEQ ID NO:56所示的人Vκ1共有序列组成，框架区II由SEQ ID NO:57所示的人Vκ1共有序列组成，框架区III由SEQ ID NO:58所示的人Vκ1共有序列组成，并且框架区IV由选自SEQ ID NO:59至62任一所示的λ基于种系的序列组成。

11.一种编码根据权利要求1所述的抗体或功能片段的核酸。

12.一种包含根据权利要求11所述的核酸的载体。

13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体为质粒。

14.一种包含根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12或13所述的载体的细胞。

15.一种制备根据权利要求1所述的抗体或功能片段的方法，包括：在允许表达编码所述抗体或功能片段的所述核酸的条件下在培养基中培养根据权利要求14所述的细胞，并从所述细胞或从所述培养基中回收所述抗体或功能片段。

16.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的抗体或功能片段和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

17.根据权利要求1所述的抗体或功能片段用于制备治疗炎性病症的药物的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其中所述炎性病症是胃肠道的炎性病症。

19.根据权利要求18所述的应用，其中所述胃肠道的炎性病症是炎性肠病。

20.根据权利要求18或19所述的应用，其中所述胃肠道的炎性病症是克罗恩病或溃疡性结肠炎。