ES2963221T3 - Anticuerpos anti-TNFalfa y fragmentos funcionales de los mismos - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas, capaces de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), a procesos para su producción y a sus usos terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-TNFalfa y fragmentos funcionales de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas, capaces de unirse al factor de necrosis tumoral alfa ("tumor necrosis factor alpha", TNFa), a procesos para su producción y a sus usos terapéuticos.
Antecedentes
El TNFa es una citocina proinflamatoria homotrimérica que es liberada por las células del sistema inmunitario e interactúa con ellas. También se ha demostrado que el TNFa se regula al alza en varias enfermedades humanas, incluidas enfermedades crónicas como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la esclerosis múltiple.
Se han propuesto anticuerpos contra el TNFa para la profilaxis y el tratamiento del choque endotóxico (Beutleret al.,Science, 234, 470-474, 1985). Bodmeret al.(Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) y Wherryet al.(Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) analizan el potencial terapéutico de los anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque séptico. El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque séptico también es analizado por Kirschenbaumet al.(Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). La artritis inducida por colágeno puede tratarse con eficacia con un anticuerpo monoclonal anti-TNFa (Williamset al.(PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn se analiza en Feldmanet al.(Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adoriniet al.(Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) y en Feldmanet al.(Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos contra el TNFa utilizados anteriormente en dichos tratamientos suelen ser anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 5919452.
En la técnica anterior se han descrito anticuerpos monoclonales contra el TNFa. Meageret al.(Hybridoma, 6, 305 311, 1987) describen anticuerpos monoclonales murinos contra el TNFa recombinante. Fendlyet al.(Hybridoma, 6, 359-370, 1987) describen la utilización de anticuerpos monoclonales murinos contra el TNFa recombinante para definir epítopos neutralizantes en el TNFa. Además, en la solicitud internacional de patente WO 92/11383 se divulgan anticuerpos recombinantes, incluidos anticuerpos injertados con CDR, específicos para el TNFa. Rankinet al.(British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) describen el uso de tales anticuerpos injertados con CDR en el tratamiento de la artritis reumatoide. La patente de EE. UU. n.° 5919452 divulga anticuerpos quiméricos anti-TNFa y su uso en el tratamiento de patologías asociadas con la presencia del TNFa. Otros anticuerpos anti-TNFa se describen en Stephenset al.(Immunology, 85, 668-674, 1995), documentos GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, US 8 673310, US 2014/0193400, EP 2 390 267 B1, US 8293235, US 8697074, WO 2009/155723 A 2yW O 2006/131013 A2.
Las moléculas de anticuerpos recombinantes anti-TNFa de la técnica anterior suelen tener una afinidad reducida por el TNFa en comparación con los anticuerpos de los que se derivan las regiones hipervariables o CDR. Todos los inhibidores del TNFa comercializados en la actualidad se administran por vía intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o más largos como inyecciones en embolada, lo que da lugar a concentraciones iniciales elevadas que van disminuyendo de forma constante hasta la siguiente inyección.
Los productos bioterapéuticos anti-TNFa aprobados en la actualidad incluyen (i) infliximab, un anticuerpo monoclonal quimérico IgG humano (Remicade®; Wiekowski M.et al.,"Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 01-01-2007, págs. 885-904); (ii) etanercept, una proteína de fusión dimérica TNFR2, con un Fc de IgG1 (Enbrel®); (iii) adalimumab, un anticuerpo monoclonal (mAb) totalmente humano (Humira®; Kupper H.et al.,"Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 01 01-2007, págs. 697-732); (iv) certolizumab, un fragmento Fab PEGilado (Cimzia®; Melmed G. Yet al.,"Certolizumab pegol", Nature Reviews, Drug Discovery, Nature Publishing Group, Reino Unido, vol. 7, n.° 8, 01-08-2008, págs. 641 642); (v) golimumab, un anticuerpo monoclonal IgGIK humano (Simponi®; Mazumdar S.et al.,"Golimumab", mAbs, Landes Bioscience, EE. UU., vol. 1, n.° 5, 01-09-2009, págs. 422-431). Sin embargo, se están desarrollando diversos productos biosimilares, y en Europa ya se ha aprobado un imitador del infliximab conocido como remsima.
El infliximab tiene una afinidad relativamente baja por el TNFa (K<d>> 0,2 nM; Weiret al.,2006, Therapy, 3: 535) y una potencia de neutralización limitada en un ensayo con L929. Además, el infliximab no presenta prácticamente ninguna reactividad cruzada con el TNFa de los monosCynomolgusoRhesus.Sin embargo, en el caso de los anticuerpos anti-TNFa, la reactividad cruzada con TNFa de monos es muy deseable, ya que esto permite realizar ensayos en animales con primates, que reflejan la situación en seres humanos en muchos aspectos.
El etanercept, aunque es una molécula bivalente, se une al TNFa en una proporción de un trímero por cada molécula de etanercept, lo que impide la formación de grandes complejos de antígeno-productos bioterapéuticos (Wallis, 2008, Lancet Infect. Dis., 8: 601). No inhibe la secreción de citocinas inducida por LPS en los monocitos (Kirchneret al., 2004,Cytokine, 28: 67).
La potencia del adalimumab es similar a la del infliximab. Otro inconveniente del adalimumab es su escasa estabilidad, por ejemplo, determinada en un ensayo de desplegamiento térmico. Se determinó que la temperatura de fusión (Tf) del adalimumab en dicho ensayo era de 67,5 °C. Sin embargo, cuanto menor es el valor de Tf de un anticuerpo, menor es su estabilidad general. Una Tf más baja hace que los anticuerpos sean menos adecuados para un uso farmacéutico, por ejemplo, para la administración oral.
La potencia del certolizumab es ligeramente superior a la del infliximab, pero sigue sin ser satisfactoria. El certolizumab no inhibe la proliferación de linfocitos T en una MLR (Voset al.,2011, Gastroenterology, 140: 221).
El documento EP2623515 A1 divulga anticuerpos anti-TNFa humanizados y fragmentos de unión al antígeno (Fab) de los mismos. Tal como se desprende claramente de los ejemplos divulgados, la potencia de los fragmentos Fab humanizados resultantes es comparable a la del infliximab en un ensayo de neutralización de L929 (véanse las tablas 2 y 5). El único anticuerpo IgG anti-TNFa sometido a pruebas de reactividad cruzada se une sólo débilmente al TNF-a de Rhesus (véase [0069]; figura 3). No se comprobó la reactividad cruzada con el TNFa de Cynomolgus. Además, la unión con el TNFp humano es débil (véase la figura 3). Por lo tanto, el documento EP2623515 A1 no divulga anticuerpos anti-TNFa o fragmentos funcionales de los mismos, que tengan una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 mayor que la del infliximab y que tengan reactividad cruzada con el TNFa de Rhesus y el TNFa de Cynomolgus.
El documento WO 2012/007880 A2 divulga una molécula de unión al antígeno de dominio único modificada ("single domain antigen binding molecule", SDAB) en forma de proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios de unión a un único antígeno que se unen a una o más dianas (por ejemplo, TNFa), un conector y una o más moléculas poliméricas. El único ejemplo específico dado se denomina SDAB-01 e incluye dos dominios de unión al antígeno, que se unen al TNFa, conectados con un conector flexible, y una cisteína C-terminal que soporta la PEGilación específica de sitio (véase la figura 3). El documento WO 2012/007880 A2 no compara la potencia de SDAB-01 con la de anticuerpos contra el TNFa conocidos, tales como infliximab, en un ensayo de neutralización basado en células L929, ni evalúa otros parámetros específicos de SDAB-01, tales como la eficacia para bloquear la interacción TNFa-TNFRI/II y la selectividad para unirse al TNFa frente al TNFp. En un ensayo en el que se compara el tratamiento con SDAB-01 e infliximab en un modelo de ratón transgénico para la poliartritis en que se sobreexpresa el TNFa humano (véase la página 54, ejemplo 8), ambos parecen tener una eficacia similar en la prevención de un mayor desarrollo de la artritis (por ejemplo, figuras 17 y 18). Sin embargo, la dosis dada en este ejemplo es engañosa, ya que el peso molecular del SDAB-01 es menos de la mitad que el de el infliximab. Así, el documento WO 2012/007880 A2 no divulga anticuerpos anti-TNFa que tengan una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 mayor que la del infliximab.
El documento WO 2015/144852 A1 investiga las propiedades de un scFv anti-TNF-a denominado "scFv1". Este scFv mostró una capacidad de neutralización del TNFa en un ensayo con células PK-15 comparable a la del infliximab (véase [0236]). Además, el scFv parece tener cierta reactividad cruzada con el TNF-a del macaco rhesus y del mono cynomolgus (véase el ejemplo 8). No se notifican datos de afinidad en el documento WO 2015/144852 A1. Sin embargo, el fragmento de anticuerpo monocatenario DLX105 (también conocido como ESBA 105), del que se sabe que sólo tiene una afinidad moderada (K<d>= 157 pM; véase Urechet al.,2010, Ann. Rheum. Dis., 69: 443), muestra una mejor unión al TNF-a que el scFv1 (véase la figura 1 del documento WO 2015/144852 A1). Por lo tanto, el documento WO 2015/144852 A1 no divulga anticuerpos anti-TNF-a que tengan alta afinidad por el TNFa humano (K<d>< 125 pM).
El documento WO 2015/065987 A1 describe anticuerpos anti-TNF-a, anticuerpos anti-IL-6 y anticuerpos biespecíficos que se unen a ambos antígenos. Determinados anticuerpos anti-TNFa mostraron cierta reactividad cruzada con el TNFa deCynomolgus(figura 17). Sin embargo, los anticuerpos anti-TNFa mostraron una potencia significativamente menor que la del infliximab en un ensayo de neutralización de L929 ([0152]; figura 5). Por lo tanto, el documento WO 2015/065987 A1 no divulga anticuerpos anti-TNF-a que tengan una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 mayor que la del infliximab.
Drugs in R&D, vol. 4, n.° 3, 2003, págs. 174-178 describe el anticuerpo humanizado "Humicade" (CDP 571; BAY 103356), un anticuerpo monoclonal anti-TNFa de alta afinidad. Sin embargo, la potencia de Humicade para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 parece ser limitada (véase, por ejemplo, el documento US 2003/0199679 A1 en [0189]). Por lo tanto, la referencia no divulga anticuerpos anti-TNF-a que tengan una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 superior a la del infliximab.
Saldanha J. W.et al.,"Molecular Engineering I: Humanization", Handbook of Therapeutic Antibodies, capítulo 6, 01 01-2007, WILEY-VCH, Weinheim, págs. 119-144 divulgan diferentes estrategias para la humanización de anticuerpos monoclonales, tales como el injerto de CDR, el resurgimiento/recubrimiento, la transferencia de SDR y la tecnología de desinmunización.
Existe la necesidad de moléculas de anticuerpos mejoradas para tratar enfermedades inflamatorias crónicas, tales como los trastornos inflamatorios intestinales. Las moléculas de anticuerpo deben tener al menos (i) una alta afinidad por el TNFa humano (es decir, una Kd < 125 pM), (ii) una alta potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929, (iii) una alta potencia para inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS, (iv) una afinidad sustancial por el TNFa deCynomolgusyRhesus(por ejemplo, una K<d>< 1 nM) y (v) una alta temperatura de fusión del dominio variable determinada en un experimento de desplegamiento térmico (por ejemplo, una Tf > 70°C).
Resumen de la invención
Los inventores de la presente solicitud descubrieron que determinados anticuerpos anti-TNFa y fragmentos funcionales de los mismos presentan una combinación de propiedades favorables, incluidas una alta afinidad por el TNFa humano (Kd < 125 pM), una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 mayor que la del infliximab, una potencia para inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS superior a la del adalimumab, y una afinidad sustancial (K<d>< 1 nM) por el TNFa de animales, tales como el mono CynomolgusfMacacafascicularis)y/o el macaco Rhesus(Macaca mulatta).Además, los anticuerpos y los fragmentos funcionales de los mismos eran específicos para el TNFa en el sentido de que no se unían significativamente al TNFp, y presentaban una estabilidad significativa, determinada en un ensayo de desplegamiento térmico del dominio variable.
La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse específicamente al factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende (i) un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14, y (ii) un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13, y en el que la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento para discriminar entre el TNFa humano y el TNFp humano.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Representación esquemática del proceso de humanización.
Figura 2: Cromatogramas SE-HPLC de preparaciones de scFv humanizado purificado de un scFv. El monómero de scFv eluye en unos tiempos de retención de entre 8,5 y 9,5 minutos, mientras que los componentes del tampón eluyen en >10 min. Todos los picos desde el volumen muerto de la columna hasta el monómero de scFv respectivo se integraron como agregados/oligómeros y se utilizaron para el cálculo del área de pico relativa.
Figura 3: Curvas de desplegamiento térmico a partir de mediciones DSF de dos construcciones de scFv. Para cada construcción se muestran mediciones por duplicado. Los valores de Tf resultantes se han determinado ajustando los datos a una ecuación de Boltzmann para obtener el punto medio de transición.
Figura 4: Evolución temporal del contenido de monómeros de las dos construcciones de scFv durante el almacenamiento. El contenido de monómeros determinado por SE-HPLC se ha representado gráficamente para las temperaturas de almacenamiento de 4, -20 y <-65 °C durante 4 semanas.
Figura 5: Superposición de cromatogramas SE-HPLC para dos moléculas de scFv. Para cada scFv se muestra la muestra (10 mg/ml) en d0 y tras su almacenamiento durante 4 semanas a 4 °C. Además, se muestra el cromatograma de la muestra tras 5 ciclos de congelación y descongelación. El panel insertado muestra una ampliación de aproximadamente 15 veces del eje de ordenadas para cada molécula con el fin de visualizar también cambios minúsculos en el contenido de oligómeros.
Figura 6: Evolución temporal del contenido de monómeros de los scFv humanizados durante el almacenamiento. El contenido de monómeros determinado por SE-HPLC se ha representado gráficamente para las muestras de 10 mg/ml a una temperatura de almacenamiento de 37 °C durante 4 semanas.
Figura 7: Potencia de neutralización del TNFa humano en el ensayo de L929 de dos scFv. Para cada experimento se muestran las curvas de dosis-respuesta de los scFv y del anticuerpo de referencia infliximab. Las concentraciones más altas de scFv e infliximab, así como los controles negativos, se fijaron en el 100 % y el 0 % del crecimiento.
Figura 8: Potencia de dos scFv para neutralizar el TNFa humano y de primate no humano en el ensayo de L929. Se muestran las curvas de dosis-respuesta para la neutralización del TNFa humano, de mono Cynomolgus y de mono Rhesus. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se fijaron en el 100 % y el 0 % del crecimiento.
Figura 9: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFRI. Se muestran las curvas de dosisrespuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se fijaron en el 0 % y el 100 % de la unión del TNFa al TNFRI.
Figura 10: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFRII. Se muestran las curvas de dosisrespuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se fijaron en el 0 % y el 100 % de la unión del TNFa al TNFRII.
Figura 11: Especificidad por la diana de un scFv. El potencial de inhibición de la interacción del TNFa biotinilado con el scFv por TNFa y TNFp se analizó mediante ELISA de competición. Se muestran los efectos dependientes de la dosis del TNFa y del TNFp.
La figura 12 representa la formación de complejos 16-22-H5-scFv:TNFa determinada por SE-HPLC (ejemplo 4).
La figura 13 representa la unión simultánea de dos moléculas de TNFa a 16-22-H5-scDb determinada por SPR (ejemplo 5).
La figura 14A muestra la formación de complejos 16-22-H5-IgG:TNFa (ejemplo 5).
La figura 14B representa la formación de complejos 16-22-H5-scDb:TNFa (ejemplo 5).
La figura 15 muestra la inhibición de la proliferación celular en una MLR tras el tratamiento CON anti-TNFa. *:p< 0,05; **:p< 0,01 en comparación con el control de IgG (ejemplo 6).
La figura 16 muestra la capacidad de los diferentes formatos de anticuerpos de 16-22-H5 y adalimumab para inhibir la secreción de IL-1p (figura 16A) y TNFa (figura 16B) inducida por LPS en monocitos de una manera dependiente de la dosis (ejemplo 7).
Descripción detallada
La presente invención se refiere a un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, capaz de unirse al TNFa humano, tal como se define en las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
En el contexto de la presente solicitud, el término "anticuerpo" se utiliza como sinónimo de "inmunoglobulina" (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), e incluye todos los anticuerpos conocidos de manera tradicional y sus fragmentos funcionales. En el contexto de la presente invención, un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento de unión al antígeno u otro derivado de un anticuerpo originario que mantiene fundamentalmente una o más de las propiedades de dicho anticuerpo originario mencionadas en los puntos (1) a (26) anteriores. Un "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento (por ejemplo, una región variable de una IgG) que conserva la región de unión al antígeno. Una "región de unión al antígeno" de un anticuerpo se suele encontrar en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2 y/o -3. Los "fragmentos de unión al antígeno" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fab. Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen scFv, dsFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y proteínas de fusión de Fc. El F(ab')2 o el Fab pueden diseñarse para minimizar o eliminar por completo las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente invención pueden formar parte de construcciones bi- o multifuncionales.
Los fragmentos funcionales preferidos en la presente invención son scFv y diacuerpos.
Un scFv es un fragmento Fv monocatenario en el que los dominios variable ligero ("V<l>") y variable pesado ("V<h>") están unidos por un puente peptídico.
Un diacuerpo es un dímero formado por dos fragmentos, cada uno con regiones variables unidas entre sí mediante un conector o similar (en lo sucesivo denominados fragmentos formadores de diacuerpos) y que suele contener dos V<l>y dos V<h>. Los fragmentos formadores de diacuerpos incluyen los que consisten en V<l>y V<h>, V<l>y V<l>, V<h>y V<h>, etc., preferentemente V<h>y V<l>. En los fragmentos formadores de diacuerpos, el conector que une las regiones variables no presenta limitaciones específicas, pero es preferible que sea lo suficientemente corto como para evitar la formación de enlaces no covalentes entre las regiones variables del mismo fragmento. La longitud de dicho conector puede determinarse según convenga por los expertos en la materia, pero suele ser de 2 a 14 aminoácidos, preferentemente de 3 a 9 aminoácidos, en especial de 4 a 6 aminoácidos. En este caso, el V<l>y el V<h>codificados en el mismo fragmento se unen a través de un conector lo suficientemente corto como para evitar la formación de enlaces no covalentes entre el V<l>y el V<h>en la misma cadena y para evitar la formación de fragmentos de región variable monocatenarios, de modo que puedan formarse dímeros con otro fragmento. Los dímeros pueden formarse mediante enlaces covalentes o no covalentes, o ambos, entre los fragmentos que forman el diacuerpo.
Además, los fragmentos formadores de diacuerpos pueden unirse mediante un conector o similar para formar diacuerpos monocatenarios (sc(Fv)2). Mediante la unión de fragmentos formadores de diacuerpos utilizando un conector largo de aproximadamente 15 a 20 aminoácidos, se pueden formar enlaces no covalentes entre los fragmentos formadores de diacuerpos existentes en la misma cadena para formar dímeros. Basándose en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también pueden prepararse anticuerpos polimerizados, como trímeros o tetrámeros, uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.
Preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une específicamente al TNFa. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo "reconoce específicamente" o "se une específicamente al" TNFa humano cuando el anticuerpo o fragmento funcional es capaz de discriminar entre el TNFa humano y una o más moléculas de referencia. Preferentemente, el valor de CI50 de unión a cada una de las moléculas de referencia es al menos 1000 veces mayor que el valor de CI50 de unión al TNFa, en concreto como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.4. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), la "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento funcional para discriminar entre el TNFa humano y una biomolécula no relacionada, según se determina, por ejemplo, de acuerdo con un procedimiento de ensayo de especificidad conocido en la técnica. Tales procedimientos comprenden las transferencias Western y los ensayos ELISA. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo ELISA convencional. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no una única biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares. En una realización, la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento para discriminar entre el TNFa humano y el TNFp humano.
El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14 y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13. El dominio V<l>comprende una región CDR1 (CDRL1), una región CDR2 (CDRL2), una región CDR3 (CDRL3) y regiones marco. El dominio V<h>comprende una región CDR1 (CDRH1), una región CDR2 (CDRH2), una región CDr 3 (CDRH3) y regiones marco.
El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión al antígeno. Una de las definiciones más utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E. A.et al.(1991), Sequences of proteins of immunological interest, publicación NIH, 91 3242). Tal como se utiliza en el presente documento, la definición de CDR de Kabat sólo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3, o L1, L2, L3), así como a CDR2 y CDr 3 del dominio variable de la cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3). Sin embargo, la CDR1 del dominio variable de la cadena pesada (CDR H1 o H1), tal como se utiliza en el presente documento, se define por los siguientes residuos (numeración de Kabat): Comienza con la posición 26 y termina antes de la posición 36.
La región CDR1 del dominio V<l>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:7.
La región CDR2 del dominio V<l>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:8.
La región CDR3 del dominio Vl consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:9.
La región CDR1 del dominio V<h>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:10.
La región CDR2 del dominio V<h>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:11.
La región CDR3 del dominio Vh consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:12.
El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13. Además, el anticuerpo o fragmento funcional comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14.
En una realización especialmente preferida, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13 y un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14. El dominio Vh y el dominio Vl están preferentemente unidos por un conector peptídico. El conector peptídico (en lo sucesivo denominado "conectorA") suele tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. El conectorA suele estar formado por residuos de Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. En realizaciones preferidas, el conector comprende múltiples repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:50), por ejemplo, de 2 a 6, o de 3 a 5, o 4 repeticiones consecutivas de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:50. Más preferentemente, el conectorA consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:49. El scFv puede tener la siguiente estructura (con el N-terminal a la izquierda y el C-terminal a la derecha):
VL-ConectorA-VH; o
VH-ConectorA-VL.
Más preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:15.
En otra realización especialmente preferida, el fragmento funcional es un diacuerpo que comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13 y un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14. El dominio V<h>y el dominio V<l>están unidos por un conector peptídico. El conector peptídico (en lo sucesivo denominado "conectorB") tiene preferentemente una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 5 aminoácidos. El conectorB suele comprender residuos de Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. Más preferentemente, el conectorB consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:50.
El diacuerpo es preferentemente un diacuerpo monoespecífico, es decir, está dirigido a un solo epítopo. El diacuerpo es preferentemente un homodímero. El diacuerpo puede ser un dímero de dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí de forma no covalente. Cada monómero puede ser una cadena polipeptídica con la estructura:
VL-ConectorB-VH; o
VH-ConectorB-VL.
Además, los fragmentos formadores de diacuerpos pueden unirse mediante un conectorA o similar para formar diacuerpos monocatenarios (sc(Fv)2). Mediante la unión de fragmentos formadores de diacuerpos utilizando un conector largo de aproximadamente 15 a 20 aminoácidos, se pueden formar enlaces no covalentes entre los fragmentos formadores de diacuerpos existentes en la misma cadena para formar dímeros. Entre los ejemplos de disposiciones de diacuerpos monocatenarios se incluyen los siguientes.
V<h>- conectorB - V<l>- conectorA - V<h>conectorB - V<l>
V<l>- conectorB - V<h>- conectorA - V<l>- conectorB - V<h>
Preferentemente, el diacuerpo de la invención tiene la siguiente estructura:
V<l>- conectorB - V<h>- conectorA - V<l>- conectorB - V<h>
Lo más preferible es que el diacuerpo consista en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:51.
Basándose en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también pueden prepararse anticuerpos polimerizados, tales como trímeros o tetrámeros, uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.
En otra realización concreta, el anticuerpo de la invención es una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina G (IgG). La subclase de IgG de la invención no presenta limitaciones concretas e incluye IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4. Preferentemente, la IgG de la invención es de la subclase 1, es decir, es una molécula de IgG-i. En una realización, cada cadena ligera de la molécula de IgG de la invención tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:52 y/o cada cadena pesada de la molécula de IgG de la invención tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:53. Una IgG específica de la invención consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en las que cada una de las dos cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:52, y cada una de las dos cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:53.
Afinidad
El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta afinidad por el TNFa humano. El término "K<d>" se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una determinada interacción anticuerpo-antígeno. Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa humano con una constante de disociación de equilibrio (K<d>) de menos de aproximadamente 2 * 10'10 M, preferentemente menos de 1,5 * 10'10 M, preferentemente menos de 1,25 * 10'10 M, más preferentemente menos de 1 * 10'10 M, más preferentemente menos de 7,5 * 10'11 M o incluso menos de 5 * 10'11 M, según se determina usando la tecnología de resonancia de plasmón de superficie ("surface plasmon resonance", SPR) en un instrumento BIACORE. En concreto, la determinación de la K<d>se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.1.
Reactividad cruzada con el TNFa de monos Cynomolgus o de macacos Rhesus
En realizaciones concretas, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene afinidad sustancial por el TNFa de animales, tales como monos Cynomolgus(Macaca fascicularis)y/o macacos Rhesus(Macaca mulatta).Esto es ventajoso, ya que los ensayos preclínicos de anticuerpos anti-TNFa humano, tales como los estudios de toxicidad, se realizan preferentemente con dichos animales. En consecuencia, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta preferentemente reactividad cruzada con el TNFa de animales, tales como monos Cynomolgus y/o macacos Rhesus. Las mediciones de afinidad se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.1.
En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta reactividad cruzada con el TNFa deMacaca fascicularis.El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene preferentemente una afinidad por el TNFa deMacaca fascicularisque es menos de 20 veces, especialmente menos de 10 veces, incluso más especialmente menos de 5 veces diferente a la del TNFa humano. Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa deMacaca fasciculariscon una constante de disociación de equilibrio (K<d>) en la que la proporción Rm. fascicularis de (i) la Kd de la unión al TNFa deMacaca fascicularisa (ii) la Kd de la unión al TNFa humano es inferior a 20.
KD(M .f ascicularis)
R M ,fascicu laris. =^( h u m a n ó )
La Rm. fascicularis es preferentemente inferior a 20, especialmente inferior a 10, aún más especialmente inferior a 5.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta reactividad cruzada con el TNFa deMacaca mulatta.El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene preferentemente una afinidad por el TNFa deMacaca mulattaque es menos de 20 veces, más especialmente menos de 10 veces diferente a la del TNFa humano. Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa deMacaca mulattacon una constante de disociación de equilibrio (K<d>), en la que la proporción R<m>. mulatta de (i) la K<d>de la unión al TNFa deMacaca mulattaa (ii) la K<d>de la unión al TNFa humano es inferior a 20.
Kd (M. mulatta)
RM .m ula tta'Kd(humano)
La R<m>. mulatta es preferentemente inferior a 20, especialmente inferior a 10.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta reactividad cruzada con el TNFa deMacaca fascicularisy con el TNFa deMacaca mulatta.El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene preferentemente una afinidad por el TNFa deMacaca fascicularisque es menos de 20 veces, especialmente menos de 10 veces, incluso más especialmente menos de 5 veces diferente a la del TNFa humano, y tiene preferentemente una afinidad por el TNFa deMacaca mulattaque es menos de 20 veces, más especialmente menos de 10 veces diferente a la del TNFa humano. La proporción R<m>. fascicularis del anticuerpo o fragmento funcional es preferentemente inferior a 20, especialmente inferior a 10, incluso más especialmente inferior a 5, y la proporción R<m>. mulatta del anticuerpo o fragmento funcional es preferentemente inferior a 20, especialmente inferior a 10.
Potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa de las células L929
El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa de las células L929. En una realización concreta, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa de células L929 mayor que la del anticuerpo conocido infliximab.
La potencia relativa al infliximab puede determinarse en un ensayo de L929 como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.2 de la presente solicitud. La potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente mayor que 2, más preferentemente mayor que 3, más preferentemente mayor que 5, más preferentemente mayor que 7,5 o incluso superior a 10, siendo la potencia relativa la proporción de (i) el valor de CI 50 del infliximab en un ensayo de L929 a (ii) el valor de CI50 del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo de L929, y en la que el CI50 indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para alcanzar el 50 % de inhibición máxima de la apoptosis inducida por TNFa de las células L929.
En otra realización, la potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente mayor que 2, más preferentemente mayor que 3, más preferentemente mayor que 5, más preferentemente mayor que 7,5 o incluso mayor que 10, siendo la potencia la proporción de (i) el valor de CI90 del infliximab en un ensayo de L929 a (ii) el valor de CI90 del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo de L929, y en la que el valor de CI90 indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para alcanzar el 90 % de inhibición máxima de la apoptosis inducida por TNFa de las células L929 .
Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS
Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS desde monocitos. La secreción de citocinas inducida por LpS desde monocitos puede determinarse como se describe en el ejemplo 7.
En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS desde monocitos CD14+. El valor de CI50 para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS es preferentemente inferior a 1 nM y/o inferior a 100 pg/ml. El valor de CI50 para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS, en una base molar y/o en una base de peso por volumen, es preferentemente inferior al del adalimumab.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS desde monocitos CD14+. El valor de CI50 para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS es preferentemente inferior a 1 nM y/o inferior a 150 pg/ml. El valor de CI50 para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS, en una base molar y/o en una base de peso por volumen, es preferentemente inferior al del adalimumab.
Inhibición de la proliferación celular
El anticuerpo o fragmento funcional de la invención suele ser capaz de inhibir la proliferación celular de células mononucleares de sangre periférica en una reacción de linfocitos mixtos. La inhibición de la proliferación celular puede determinarse como se describe en el ejemplo 6. El índice de estimulación del anticuerpo o fragmento funcional, por ejemplo, del scFv o diacuerpo de la invención, determinado según el ejemplo 6, es preferentemente inferior a 5, más preferentemente inferior a 4,5. En realizaciones concretas, el índice de estimulación del anticuerpo, por ejemplo, de la IgG de la invención, es inferior a 4 o incluso inferior a 3.
Inhibición de la interacción entre el TNFa y el receptor de TNF
Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNFa humano y el receptor I de TNF (TNFRI). La inhibición de la interacción entre el TNFa humano y el TNFRI puede determinarse con un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el ejemplo 2, sección 2.1.3.
La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre el TNFa humano y el TNFRI, en relación con la del infliximab (potencia relativa), según se determina con un ELISA de inhibición, es preferentemente al menos 2, en la que dicha potencia relativa es la proporción del valor de CI50 en ng/ml del infliximab al valor de CI50 en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNFa humano y el receptor II de TNF (TNFRII). La inhibición de la interacción entre el TNFa humano y el TNFRII puede determinarse con un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el ejemplo 2, sección 2.1.3.
La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre el TNFa humano y el TNFRII, en relación con la de infliximab (potencia relativa), según se determina con un ELISA de inhibición, es preferentemente al menos 2, más preferentemente al menos 3, en la que dicha potencia relativa es la proporción del valor de CI50 en ng/ml de infliximab al valor de CI50 en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
Estequiometría y reticulación
El anticuerpo o fragmento funcional de la invención suele ser capaz de unirse al TNFaTrímero humano con una estequiometría (anticuerpo:TNFaTrímero) de al menos 2. La estequiometría (anticuerpo:TNFaTrímero) es preferentemente superior a 2, o al menos 2,5, o al menos 3. En una realización, la estequiometría (anticuerpo:TNFaTrímero) es de aproximadamente 3. La estequiometría (anticuerpo:TNFaTrímero) puede determinarse como se describe en el ejemplo 4 a continuación.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de formar un complejo con el TNFa humano, en el que dicho complejo comprende al menos dos moléculas de TNFa y al menos tres moléculas de anticuerpo o del fragmento funcional. El fragmento funcional de acuerdo con esta realización comprende al menos dos sitios de unión separados para el TNFa tal como, por ejemplo, diacuerpos. La formación de complejos puede determinarse como se describe en el ejemplo 5 a continuación.
En una realización, el anticuerpo es una IgG y es capaz de formar un complejo de al menos 600 kDa con el TNFa. En otra realización, el fragmento funcional es un diacuerpo y es capaz de formar un complejo de al menos 300 kDa con el TNFa.
Selectividad de diana
En determinadas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento funcional de la invención tiene una alta selectividad de diana, es decir, puede discriminar entre el TNFa y el TNFp. Preferentemente, el valor de CI50 del TNFp es al menos 1000 veces mayor que el valor de CI50 del TNFa, determinado con un ELISA de competición como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.4. Más preferentemente, el valor de CI50 del TNPp es al menos 5000 veces, más preferentemente al menos 10000 veces mayor que el valor de CI50 del TNFa, determinado con un ELISA de competición como se describe en el ejemplo 2, sección 2.1.4.
Rendimiento de expresión y rendimiento de replegamiento
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o el diacuerpo, puede expresarse recombinantemente con alto rendimiento en microorganismos, tales como bacterias, o en otras células. Preferentemente, el rendimiento de expresión enE. coli,determinado como se describe en el ejemplo 2, es de al menos 0,25 g/l. Esto se aplica especialmente a los fragmentos funcionales, tales como scFv.
El rendimiento de replegamiento, determinado como se describe en el ejemplo 2, es de al menos 5 mg/l, más preferentemente de al menos 10 mg/l, más preferentemente de al menos 15 mg/l, y lo más preferentemente de al menos 20 mg/l. Esto se aplica especialmente a los fragmentos funcionales, tales como scFv.
Estabilidad
Generalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o diacuerpo, tiene una alta estabilidad. La estabilidad puede evaluarse mediante diferentes metodologías. La "temperatura de fusión", Tf, del dominio variable del anticuerpo o fragmento funcional de la invención, determinada por fluorimetría diferencial de barrido ("differential scanning fluorimetry", DSF) como se describe en el ejemplo 2, sección 2.2.4, es preferentemente de al menos 65 °C, más preferentemente de al menos 68 °C, más preferentemente de al menos 70 °C. La "temperatura de fusión del dominio variable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la temperatura de fusión de un scFv que consiste en la secuencia V<l>- ConectorA - V<h>, en la que la secuencia de aminoácidos del Conector A consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:49. Por ejemplo, la temperatura de fusión del dominio variable de una IgG se define como la temperatura de fusión de su correspondiente scFv, tal como se ha definido anteriormente.
La pérdida en el contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómeros > 95 %) después del almacenamiento durante cuatro semanas a 4 °C, determinada por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el ejemplo 2, sección 2.2.5, es preferentemente inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 3 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %. La pérdida en el contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómeros > 95 %) después del almacenamiento durante cuatro semanas a -20 °C, determinada mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el ejemplo 2, sección 2.2.5, es preferentemente inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 3 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %. La pérdida en el contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómeros > 95%) después del almacenamiento durante cuatro semanas a -65 °C, determinada mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el ejemplo 2, sección 2.2.5, es preferentemente inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 3 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %.
La pérdida de monómeros después de cinco ciclos consecutivos de congelación y descongelación, determinada como se describe en el ejemplo 2, es inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %, más preferentemente inferior al 0,2 %, por ejemplo el 0,1 % o el 0,0 %.
Anticuerpos y fragmentos funcionales
Algunas realizaciones concretas de la invención se refieren a fragmentos funcionales de los anticuerpos descritos en el presente documento. Los fragmentos funcionales incluyen el fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) o un diacuerpo. Más preferentemente, las secuencias que no son CDR del scFv o del diacuerpo son secuencias humanas.
Preferentemente, para minimizar el potencial de inmunogenicidad en seres humanos, el andamiaje aceptor elegido se compone de regiones marco derivadas de secuencias consenso humanas o secuencias de línea germinal humana. En concreto, las regiones marco I a III del dominio variable de cadena ligera consisten en secuencias consenso Vk1 humanas según SEQ ID NO: 56 a 58 y una región marco IV de una secuencia basada en la línea germinal A seleccionada entre SEQ ID NO:59 a 62. Dado que los residuos que no son de consenso humano o de línea germinal humana pueden provocar reacciones inmunitarias, el número de tales residuos en cada dominio variable (VH o VL) debe ser lo más bajo posible, preferentemente inferior a 7, más preferentemente inferior a 4, y lo más preferentemente 0.
Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon, incluido cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al procedimiento por el que se produce. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluido el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación por fagos, o una combinación de las mismas (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y).
En otras realizaciones, incluidas las realizaciones relacionadas con el usoin vivode los anticuerpos anti-TNFa en seres humanos, se pueden utilizar anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más preferentemente un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.
El término anticuerpo "quimérico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, que suelen seleccionarse de una plantilla de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science, 229(4719): 1202-1207; Oiet al.,1986, BioTechniques, 4:214-221; Gillieset al.,1985, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; patentes de EE. UU. n.os 5807715; 4816567 y 4816397.
Un experto en la materia dispone de diferentes metodologías recombinantes para hacer que un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) sea más similar al humano mediante la generación de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a la diana), que contengan secuencias mínimas derivadas de dicha inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo recombinante resultante comprenderá sustancialmente la totalidad o al menos uno, y generalmente dos dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, especialmente una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos injertados con CDR son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) de un anticuerpo generado originariamente en una especie no humana que se une al antígeno deseado, y regiones marco ("framework", FR) de una molécula de inmunoglobulina humana (documento EP239400; publicación PCT<w>O 91/09967; patente de EE. UU. n.° 5 225539; 5530 101 y 5585089). A menudo, en un proceso denominado "humanización", los residuos del marco en las regiones marco humanas se sustituirán también por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar la unión al antígeno. Estas sustituciones en el marco se identifican por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de las CDR y los residuos del marco para identificar los residuos del marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos del marco poco comunes en posiciones concretas. Véase, por ejemplo, Riechmannet al.,1988, Nature, 332:323-327, y Queenet al.,patentes de EE. UU. n.os: 5 530 101; 5585089; 5693761; 5693762 y 6 180370. Los anticuerpos pueden hacerse más humanos utilizando una diversidad de técnicas adicionales conocidas en la técnica, entre las que se incluyen, por ejemplo, el rebarnizado o el rechapado (documento EP592106; documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnickaet al.,1994, Prot. Eng., 7:805-814; Roguskaet al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973, y el reordenamiento de cadenas (patente de EE. UU. n.° 5565332). Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una plantilla de inmunoglobulina humana elegida.
En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados se preparan como se describe en Queenet al.,patente de EE. UU. n.os: 5530 101; 5585089; 5693761; 5693762 y 6180370. Se divulgan, pero no se reivindican, anticuerpos anti-TNFa que son anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti-TNFa completamente "humanos" pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tal como se utiliza en el presente documento, los "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bancos de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos pueden prepararse por diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluidos los procedimientos de presentación por fagos descritos anteriormente, utilizando bancos de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véanse las patentes de EE. UU. n.os 4444 887 y 4716 111 y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 y WO 91/10741. También se pueden producir anticuerpos humanos utilizando ratones transgénicos incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero sí pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patentes de EE. UU. n.os 5 413923; 5625 126; 5633425; 5569825; 5661 016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771y 5939598. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse mediante una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epítopo (Jesperset al.,1988, Biotechnology, 12:899-903). Se divulgan, pero no se reivindican, anticuerpos anti-TNFa que son anticuerpos primatizados. La expresión "anticuerpo primatizado" se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los procedimientos para producir anticuerpos primatizados son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5658570; 5681 722 y 5693780.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, los anticuerpos derivatizados se han modificado, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína (véase más adelante un análisis de los conjugados de anticuerpos), etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluidas la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
En otros aspectos, un anticuerpo anti-TNFa tiene uno o más aminoácidos insertados en una o más de sus regiones hipervariables, por ejemplo, como se describe en el documento US 2007/0280931.
Conjugados de anticuerpos
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son conjugados de anticuerpos que están modificados, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de tal manera que la unión covalente no interfiera con la unión al TNFa. En la técnica son muy conocidas las técnicas para conjugar restos efectores a anticuerpos (Hellstromet al.,Controlled Drag Delivery, 2a ed., en págs. 623-653 (Robinsonet al.,eds., 1987)); Thorpeet al.,l982, Immunol. Rev., 62: 119-158; y Dubowchiket al.,1999, Pharmacology and Therapeutics, 83:67-123).
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo se fusiona mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), opcionalmente en el N-terminal o el C-terminal, a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma; preferentemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento del mismo, está unido a la otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante del anticuerpo. Pueden utilizarse procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semividain vivo.Algunos ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a la albúmina o compuestos de unión a la albúmina tales como los descritos en el documento WO 2005/117984.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa pueden unirse a restos de poli(etilenglicol) (PEG). Por ejemplo, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, los restos de PEG pueden unirse a través de cualquier cadena lateral de aminoácidos o grupo funcional aminoácido terminal disponible situado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden estar presentes de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden introducirse en el fragmento mediante procedimientos de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5219996. Se pueden utilizar varios sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Preferentemente, los restos de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína situado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se utiliza un grupo tiol como punto de unión, pueden emplearse restos efectores activados de modo adecuado, por ejemplo, derivados selectivos de tiol, tales como maleimidas y derivados de cisteína.
En otro ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-TNFa es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, por ejemplo, según el procedimiento divulgado en el documento EP0948544. Véase también Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, Nueva York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54:531- 545.
Composiciones farmacéuticas y tratamiento
El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier manifestación o estadio clínico; el retraso del inicio o evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad.
Un "sujeto" o "paciente" al que se le administra un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo puede ser un mamífero, tal como un mamífero que no pertenece a los primates (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o ser humano). En determinados aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.
En el presente documento se describen composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNFa y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones se suelen suministrar como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede presentarse en cualquier forma adecuada (en función del procedimiento deseado de administración al paciente).
Los anticuerpos anti-TNFa y los fragmentos funcionales pueden administrarse a un paciente por diversas vías, tales como por vía oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica o local. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá del anticuerpo concreto, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del sujeto. Generalmente, un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo se administrará por vía intravenosa.
En una realización especialmente preferida, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se administra por vía oral. Si la administración se realiza por vía oral, el fragmento funcional es preferentemente un anticuerpo monocatenario (scFv), un diacuerpo o una IgG.
En realizaciones típicas, un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional está presente en una composición farmacéutica a una concentración suficiente para permitir la administración intravenosa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo o fragmento adecuada para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluye 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg o una concentración comprendida entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de 1 mg/kg a 10 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg o de 10 mg/kg a 18 mg/kg.
La dosis eficaz de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional puede oscilar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 750 mg/kg por administración única (por ejemplo, en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o para alcanzar una concentración sérica de 0,01 a 5000 pg/ml de concentración sérica por administración única (por ejemplo, en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o cualquier intervalo o valor eficaz dentro de la misma en función de la afección tratada, la vía de administración y la edad, peso y estado del sujeto. En determinadas realizaciones, cada dosis puede oscilar entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal o entre aproximadamente 3 mg y aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo puede formularse como una solución acuosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de farmacéuticas unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional por dosis. Dicha unidad puede contener de 0,5 mg a 5 g, por ejemplo, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg o cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de 10 mg a 1000 mg, de 20 mg a 50 mg, o de 30 mg a 300 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden adoptar una amplia variedad de formas en función, por ejemplo, de la afección a tratar o de la vía de administración.
La determinación de la dosis eficaz, el número total de dosis y la duración del tratamiento de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional del mismo está dentro de las capacidades de los expertos en la materia y puede determinarse utilizando un estudio convencional de aumento escalonado de la dosis.
Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TNFa y los fragmentos funcionales adecuados en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para su conservación como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo con el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes 0 estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables que suelen emplearse en la técnica (todos los cuales se denominan en el presente documento "vehículos"), es decir, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed., 1980). Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.
Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que oscilan entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM. Entre los agentes tamponantes adecuados se encuentran los ácidos orgánicos e inorgánicos y sus sales, tales como los tampones citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), los tampones succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico y tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico e hidróxido de sodio, etc.), tampones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico y gluconato de potasio, etc.), tampones oxalato (por ejemplo, mezcla de oxalato de sodio y ácido oxálico, mezcla de hidróxido de sodio y ácido oxálico, mezcla de oxalato de potasio y ácido oxálico, etc.), tampones lactato (mezcla de lactato de sodio y ácido láctico, mezcla de hidróxido de sodio y ácido láctico, mezcla de lactato de potasio y ácido láctico, etc.) y tampones acetato (mezcla de acetato de sodio y ácido acético, mezcla de hidróxido de sodio y ácido acético, etc.). Además, pueden utilizarse tampones fosfato, tampones histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.
Pueden añadirse conservantes para retrasar el crecimiento microbiano, en cantidades que oscilen entre el 0,2 % y el 1 % (p/v). Entre los conservantes adecuados se encuentran el fenol, el alcohol bencílico, el meta-cresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos, tales como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas, pueden añadirse isotonificantes, a veces conocidos como "estabilizantes", que incluyen alcoholes de azúcar polihidroxílicos, preferentemente alcoholes de azúcar trihidroxílicos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes polihidroxílicos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluidos los ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, amonototioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, polipéptidos de 10 residuos o menos); proteínas, tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa, sacarosa, y trisacáridos, tales como rafinosa; y polisacáridos, tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10000 partes en peso por parte en peso de la proteína activa.
Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger a la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a tensiones superficiales de cizallamiento sin provocar la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles Pluronic, monoéteres de sorbitán polioxietilenados (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
Otros excipientes diversos incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), inhibidores de proteasas y codisolventes.
La presente formulación también puede contener un segundo agente terapéutico además de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo. A continuación, se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.
La pauta posológica puede variar de una vez al mes a una vez al día en función de una serie de factores clínicos, incluidos el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-TNFa o al fragmento funcional. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo se administra a diario, dos veces por semana, tres veces por semana, cada dos días, cada 5 días, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de cada cuatro días a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.
La dosis de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional a administrar variará según el anticuerpo concreto, el sujeto, y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad, el estado físico del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico), y la vía de administración seleccionada; los expertos en la materia pueden determinar con facilidad la dosis apropiada.
Los expertos en la materia reconocerán que la cantidad óptima y el espaciado de las dosis individuales de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional del mismo se determinarán en función de la naturaleza y el alcance de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el lugar de administración, y la edad y el estado del sujeto concreto que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que se utilizarán. Esta dosis puede repetirse tantas veces como sea necesario. Si aparecen efectos secundarios, puede modificarse o reducirse la cantidad y/o la frecuencia de la dosis, de acuerdo con la práctica clínica habitual.
Trastornos a tratar
La invención se refiere a un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad humana relacionada con el TNFa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o un fragmento funcional como se define en el presente documento. La expresión "trastorno relacionado con el TNFa" o "enfermedad relacionada con el TNFa" se refiere a cualquier trastorno cuya aparición, progresión o persistencia de los síntomas o estados patológicos requiera la participación del TNFa. Algunos ejemplos de trastornos relacionados con el TNFa incluyen los estados de inflamación crónicos y/o autoinmunitarios en general, los trastornos inflamatorios inmunomediados en general, las enfermedades inflamatorias del SNC, las enfermedades inflamatorias que afectan a los ojos, las articulaciones, la piel, las mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o los pulmones, los estados de uveítis en general, la retinitis, la uveítis HLA-B27+, la enfermedad de Behget, el síndrome del ojo seco, el glaucoma, el síndrome de Sjogren, la diabetes mellitus (incluida la neuropatía diabética), la resistencia a la insulina, los estados de artritis en general, la artritis reumatoide, la artrosis, la artritis reactiva y el síndrome de Reiter, la artritis juvenil, la espondilitis anquilosante, la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain-Barré, la miastenia grave, la esclerosis lateral amiotrófica, la sarcoidosis, la glomerulonefritis, la enfermedad renal crónica, la cistitis, la psoriasis (incluida la artritis psoriásica), la hidradenitis supurativa, la paniculitis, el pioderma gangrenoso, el síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), el acné, el síndrome de Sweet, el pénfigo, la enfermedad de Crohn (incluidas las manifestaciones extraintestinales), la colitis ulcerosa, el asma bronquial, la neumonitis por hipersensibilidad, las alergias en general, la rinitis alérgica, la sinusitis alérgica, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar, la granulomatosis de Wegener, el síndrome de Kawasaki, la arteritis de células gigantes, la vasculitis de Churg-Strauss, la poliarteritis nodosa, las quemaduras, la enfermedad de injerto contra huésped, las reacciones de rechazo, los episodios de rechazo tras un trasplante de órganos o de médula ósea, los estados sistémicos y locales de la vasculitis en general, el lupus eritematoso sistémico y cutáneo, la polimiositis y la dermatomiositis, la esclerodermia, la preeclampsia, la pancreatitis aguda y crónica, la hepatitis vírica, la hepatitis alcohólica, la inflamación posquirúrgica, tal como la que se produce tras una intervención quirúrgica ocular (por ejemplo, cirugía de cataratas (sustitución del cristalino) o glaucoma), cirugía articular (incluida la cirugía artroscópica), cirugía de estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo, ACTP, aterectomía, colocación de endoprótesis vasculares), procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intraabdominales y ginecológicos, procedimientos endoscópicos urológicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial), o inflamación perioperatoria (prevención) en general, dermatitis bullosa, dermatitis neutrofílica, necrólisis epidérmica tóxica, dermatitis pustulosa, paludismo cerebral, síndrome urémico hemolítico, rechazo de aloinjertos, otitis media, mordedura de serpientes, eritema nodoso, síndromes mielodisplásicos, colangitis esclerosante primaria, espondiloarteropatía seronegativa, anemia hematolítica autoinmunitaria, granulamatosis orofacial, pioestomatitis vegetante, estomatitis aftosa, lengua geográfica, estoimatitis migratoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob y afecciones neurodegenerativas en general.
Osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis óseas, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de que estén causadas por efectos centrales o periféricos del TNFa y de que se clasifiquen como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas del dolor, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia postherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debidos a tumor metastásico, dismenorrea.
Entre los trastornos concretos a tratar se incluyen los estados de artritis en general, artritis reumatoide, artrosis, artritis reactiva, artritis juvenil; psoriasis, incluida artritis psoriásica; enfermedad inflamatoria intestinal, incluida la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, incluida proctitis, sigmoiditis, colitis del lado izquierdo y pancolitis, colitis indeterminada, colitis microscópica, incluida colitis colagenosa y linfocítica, colitis en la enfermedad del tejido conjuntivo, colitis por derivación, colitis en la enfermedad diverticular, colitis eosinofílica y reservoritis.
Más preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se utiliza para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal, en especial la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa o la colitis microscópica. La enfermedad de Crohn puede ser ileal, colónica, ileocolónica o enfermedad de Crohn superior aislada (gástrica, duodenal y/o yeyunal), incluido un comportamiento de enfermedad no estrechante/no penetrante, estrechante, penetrante y perianal, permitiendo cualquier combinación de ubicación y comportamiento de la enfermedad de cualquiera de las mencionadas. La colitis ulcerosa puede ser proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis panulcerosa y reservoritis.
Terapia combinada y otros aspectos
Preferentemente, el paciente tratado con un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo se trata también con otro medicamento convencional. Por ejemplo, un paciente que padezca una enfermedad inflamatoria intestinal, en especial si la enfermedad es de moderada a grave, suele tratarse también con mesalazina o derivados o profármacos de la misma, corticoesteroides, por ejemplo, budesonida o prednisolona (oral o i.v.), inmunosupresores, por ejemplo, azatioprina/6-mercaptopurina (6-MP) o metotrexato, ciclosporina o tacrolimus. Otros medicamentos que pueden ser coadministrados al paciente incluyen productos biológicos, tales como infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol u otros. Otros medicamentos que pueden ser coadministrados al paciente incluyen inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina/6-MP o metotrexato o ciclosporina oral) con el fin de mantener una remisión estable y más prolongada. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se define anteriormente para reducir la inflamación.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se define anteriormente para su uso en la reducción de la inflamación en un paciente que padece una enfermedad inflamatoria.
Otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento para tratar una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se define en el presente documento. La afección inflamatoria es preferentemente una de las afecciones descritas anteriormente.
Otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento de prevención de una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se define en el presente documento. La afección inflamatoria es preferentemente una de las afecciones descritas anteriormente.
Tabla 1. Resumen de las secuencias de aminoácidos
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos de conejo dirigidos contra el TNFa humano
1. Resultados
1.1 Inmunización
Se inmunizaron conejos con TNFa humano recombinante purificado (Peprotech, n.° de catálogo 300-01A). En el desarrollo de la inmunización, se evaluó cualitativamente la intensidad de la respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno determinando la dilución máxima (valoración) para el suero de cada conejo que seguía produciendo una unión detectable de los anticuerpos séricos policlonales al antígeno. Las valoraciones de anticuerpos séricos contra el TNFa humano recombinante inmovilizado se evaluaron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA, véase 2.2.1). Los tres conejos mostraron valoraciones muy elevadas, con una dilución del suero de 10 * 106 veces que seguía dando una señal positiva (al menos 3 veces superior a la señal obtenida con el suero de un animal no emparentado no expuesto que se utilizó como control de fondo) en el ELISA. Además, se evaluó la capacidad de diferentes sueros de conejo para inhibir la actividad biológica del TNFa mediante un ensayo basado en células L929 de ratón (véase el apartado 2.2.3). Los tres sueros inhibieron la apoptosis inducida por TNFa de los fibroblastos L929 de ratón. El conejo n.° 3 mostró la mayor actividad neutralizante, alcanzándose la inhibición del 50 % (CI50) con una dilución sérica de 1:155000. En comparación con el conejo n.° 3, el conejo n.° 2 y el conejo n.° 1 mostraron una actividad aproximadamente 3 y 21 veces menor, alcanzando el 50 % de inhibición con una dilución de suero de 1:55500 y 1:7210, respectivamente.
Se seleccionaron linfocitos aislados de bazos de los tres animales para los procedimientos posteriores de identificación de aciertos. Los animales se priorizaron en función de la potencia para inhibir la actividad biológica del TNFa en el ensayo de L929. Por lo tanto, el mayor número de aciertos que se cultivaron procedía del conejo n.° 3, y el menor número de aciertos procedía del conejo n.° 1.
1.2 Identificación de aciertos
1.2.1 Clasificación por aciertos
Antes del procedimiento de identificación de aciertos, se desarrolló un procedimiento de clasificación basado en la citometría de flujo que detecta específicamente y permite el aislamiento de linfocitos B de alta afinidad de unión al TNFa (véase 2.1).
Un total de 33 * 106 linfocitos (correspondientes al 1,5% del total de linfocitos aislados) procedentes de los tres conejos se caracterizaron en dos campañas de clasificación independientes. De las 33 * 106 células analizadas en total se aislaron 3452 linfocitos B que expresaban anticuerpos específicos del TNFa (IgG). El número de linfocitos clonados fue diferente para los tres conejos, ya que se aislaron más células de aquellos conejos cuyos sueros mostraron una fuerte inhibición del TNFa en el ensayo de L929. De los linfocitos B aislados, 792 clones procedían del conejo n.° 1, 1144 clones del conejo n.° 2 y 1408 clones del conejo n.° 3. Para 108 clones no se conoce el origen respectivo del conejo, porque procedían de una mezcla de linfocitos residuales de los 3 conejos para permitir una recuperación óptima de pequeñas cantidades de linfocitos de los viales.
1.2.2 Cribado de aciertos
Los resultados obtenidos durante la fase de cribado se basan en ensayos realizados con anticuerpos no purificados procedentes de sobrenadantes de cultivo de células secretoras de anticuerpos ("antibody secreting cells", ASC), ya que la escala del cultivo de alto rendimiento no permite la purificación de los anticuerpos de conejo individuales. Dichos sobrenadantes se utilizaron para clasificar un gran número de anticuerpos entre sí, pero no para proporcionar valores absolutos (por ejemplo, para la inhibición de la actividad biológica del TNFa), excepto para la afinidad de unión. Los sobrenadantes de las<a>S<c>se cribaron en un ELISA de alto rendimiento para determinar su unión al TNFa humano recombinante. Los sobrenadantes de unión al TNFa se caracterizaron además por su unión al TNFa del mono Cynomolgus mediante ELISA, cinética de unión y por su potencial para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano en el ensayo de L929. A excepción de la cinética de unión, los valores de los informes de los cribados de alto rendimiento deben interpretarse como respuestas "sí" o "no", que se basan en mediciones puntuales (no en la relación dosis-respuesta). Se analizó la afinidad por el TNFa de mono Cynomolgus y de ratón de los 102 clones seleccionados para la amplificación y la secuenciación de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.
1.2.2.1 Unión al TNFa humano
El objetivo del cribado primario es identificar clones de ASC que produzcan anticuerpos específicos para el TNFa humano. Para ello, se analizaron los sobrenadantes del cultivo celular de 3452 clones de ASC para detectar la presencia de anticuerpos contra el TNFa humano mediante ELISA (véase el apartado 2.2.1). El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNFa humano recombinante, aunque no ofrece información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. En este ensayo, los sobrenadantes de 894 clones de ASC produjeron una señal claramente superior al fondo. La tasa de aciertos en el cribado fue similar para el conejo n.° 1 y el n.° 2, con 153 aciertos de 792 (un 19,3 %) identificados en el conejo n.° 1 y 225 aciertos de 1144 identificados en el conejo n.° 2 (un 19,7 %). El conejo n.° 3 mostró un porcentaje de aciertos significativamente superior, del 34,4 %, lo que permitió identificar 484 aciertos de un total de 1408. Los 894 resultados identificados en este cribado primario se sometieron a la medición de la cinética de unión mediante SPR (cribado secundario).
1.2.2.2 Cinética de unión al TNFa
El objetivo del cribado secundario es obtener información cuantitativa sobre la calidad de la unión a la diana para cada acierto del cribado primario mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, véase 2.2.2). A diferencia del ELISA utilizado durante el cribado primario, este procedimiento evalúa la cinética de unión de la diana en función del tiempo. Esto permite determinar las constantes de afinidad (ka) y de disociación (kd) del anticuerpo con respecto a su diana. La proporción kd/ka proporciona la constante de disociación de equilibrio (Kd), que refleja la afinidad de un anticuerpo por su diana. De los 894 resultados identificados en el cribado primario, se pudo determinar la afinidad de unión al TNFa humano de 839 anticuerpos monoclonales de conejo. Para los 55 anticuerpos restantes no se pudo medir la afinidad porque la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de las ASC estaba por debajo del límite de detección del instrumento SPR en la configuración respectiva. Los 839 anticuerpos anti-TNFa que pudieron medirse mostraron constantes de disociación (Kd) que oscilaban entre menos de 1,36 * 10-13 M y 1,14 * 10-8 M. El 69 % de todos los anticuerpos analizados tenían una Kd inferior a 0,5 nM.
Las medianas de las Kd de 2,21 * 10-10 M y 2,09 * 10-10 M para los aciertos del cribado identificados de los conejos n.° 2 y n.° 3 fueron similares, mientras que el conejo n.° 1 mostró valores aproximadamente 2 veces superiores con una mediana de la Kd de 4,65 * 10-10M. Si se consideran únicamente los aciertos del cribado neutralizantes, las distribuciones de afinidad fueron similares para los tres animales, con valores más bajos para la mediana de la K<d>(medianas de la K<d>entre 1,4 * 10-10 M y 1,27 * 10-10 M). Se midieron afinidades por debajo de 0,041 nM, 0,029 nM y 0,026 nM para el 5 % de los aciertos del cribado para los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente. Para el 2 % de los sobrenadantes, las afinidades se situaron incluso en el intervalo picomolar bajo (por debajo de 6,2 pM, 7,9 pM y 11 pM). El excelente rendimiento de los anticuerpos de alta afinidad resultante del cribado secundario proporciona una amplia base para la selección de los anticuerpos más apropiados para la humanización y el reformateado.
1.2.2.3 Potencia
Para la evaluación de la potencia, se desarrolló un ensayo basado en células (ensayo de L929) (véase 2.2.3). De los 894 anticuerpos seleccionados, 506 (un 56,6 %), inhibieron la apoptosis inducida por TNFa en el ensayo de L929 en más de un 50 %. En consonancia con los resultados obtenidos durante el análisis de valoración, el mayor porcentaje de aciertos neutralizantes provino del conejo n.° 3, con una tasa de aciertos del 62,8 %, seguido del conejo n.° 2, con una tasa de aciertos del 56,4 %, y del conejo n.° 1, con la tasa de aciertos más baja, del 39,9 %. Las afinidades de estos anticuerpos neutralizantes oscilaron entre 1,36 * 10-13y 1,19 * 10-9 M.
1.2.2.4 Reactividad cruzada entre especies (mono Cynomolgus)
Los 894 aciertos positivos identificados en el cribado primario se analizaron para determinar la reactividad cruzada entre especies con el TNFa del mono Cynomolgus mediante ELISA (véase 2.2.1). El objetivo de este cribado adicional fue permitir la selección de clones de ASC que se sabe que presentan reacción cruzada con el TNFa del mono Cynomolgus. El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNFa recombinante del mono Cynomolgus, pero no da ninguna información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. Los sobrenadantes de 414 (un 46 %) clones de ASC produjeron una señal clara (densidad óptica [DO] > 1). El porcentaje de aciertos de reactividad cruzadas con el TNFa del mono Cynomolgus fue similar para el conejo n.° 1 y el conejo n° 3, con 81 aciertos de 153 (un 52,9 %) identificadas en el conejo n.° 1 y 236 aciertos de 484 identificados en el conejo n.° 3 (un 48,8 %). Con un 37,8 %, el conejo n.° 2 mostró un porcentaje ligeramente inferior de reacciones cruzadas, lo que dio lugar a la identificación de 82 aciertos de 225.
1.2.2.5 Selección de clones para RT-PCR
Como requisito previo para la confirmación de aciertos, el análisis de la secuencia genética y la posterior humanización de los anticuerpos de conejo, es necesario recuperar la información genética que codifica el dominio variable del anticuerpo de conejo. Esto se hizo mediante la transcripción inversa ("reverse transcription", RT) del ARN mensajero respectivo al ADN complementario (ADNc), seguida de la amplificación del ADN bicatenario mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La selección de los clones de ASC sometidos a RT-PCR se basó principalmente en la afinidad y la actividad neutralizante. Como criterio adicional se consideró la reactividad cruzada con el TNFa del mono Cynomolgus. En total, se seleccionaron 102 clones de ASC para la clonación de genes mediante RT-PCR. En primer lugar, se seleccionaron los 93 ASC mejor clasificados (en términos de afinidad) con una K<d>inferior a 80 pM, que inhibían la actividad biológica del TNFa en el ensayo de L929 en más de un 50 % y que mostraban una unión significativa al TNFa del mono Cynomolgus. Además, también se eligieron los 9 clones de a Sc mejor clasificados con una K<d>inferior a 20 pM que neutralizaban la actividad del TNFa en más del 50 %, pero que no se unían al TNFa del mono Cynomolgus. En total, se amplificaron y se secuenciaron con éxito 12, 13 y 66 clones de ASC de los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente.
1.2.2.6 Identificación de clones relacionados con las propiedades deseadas
Para caracterizar la diversidad genética del panel de clones de ASC aislados, se extrajeron las secuencias de las regiones determinantes complementarias (CDR) y se sometieron a una alineación de secuencias múltiples, permitiendo así el agrupamiento de secuencias en un árbol filogenético.
Mientras que este análisis, por un lado, permite la selección de un conjunto diverso de secuencias clonales para ser utilizadas en experimentos de humanización y reformateado, también identifica agrupamientos homólogos de secuencias clonales que parecían compartir un clon de linfocitos B originarios comunes en el conejo. La característica distintiva de estos agrupamientos de secuencias es la elevada homología de secuencia en las CDR y un patrón constante de propiedades farmacodinámicas. Ambas características se resumen para un agrupamiento de ocho clones en las tablas 2 y 3. A pesar de la conservación funcional de este agrupamiento de secuencias, la secuencia de consenso de la tabla 3 revela que se tolera una cierta variabilidad de las CDR, al tiempo que se obtiene el perfil farmacodinámico deseado.
Tabla 2: Propiedades farmacodinámicas de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de ASC.
Tabla 3: Se obtuvieron los siguientes datos de secuencia relativos a las CDR de los clones mencionados:
1.2.2.7 Reactividad cruzada con el TNFa de mono Cynomolgus (por SPR)
Debido al elevado número de aciertos de alta afinidad que neutralizaban con gran potencia el TNFa, se evaluó la reactividad cruzada entre especies de todos los anticuerpos monoclonales de conejo que se sometieron a RT-PCR con el fin de facilitar la selección de clones de ASC para la confirmación de aciertos. Las afinidades por el TNFa del mono Cynomolgus se determinaron mediante mediciones SPR de forma similar a la descrita anteriormente (véase también 2.2.2). Las afinidades de los 93 anticuerpos ensayados para el TNFa del mono Cynomolgus oscilaron entre 9,6 x 10-12 y 2,1 x 10-9 M. De los 93 anticuerpos de reactividad cruzada, 38 se unieron al TNFa humano y al del mono Cynomolgus con afinidad similar (menos de dos veces de diferencia en K<d>). Además, la diferencia de afinidad entre humano y Cynomolgus fue inferior a 20 veces para 79 de los 93 anticuerpos de reactividad cruzada e inferior a 10 veces para 62 de ellos, lo que los hace aceptables para el desarrollo preclínico en el mono Cynomolgus.
2. Procedimientos
2.1 Ensayo de clasificación
El procedimiento de clasificación basado en la citometría de flujo para el aislamiento de linfocitos B específicas de antígeno a partir de tejido linfático de conejo se realizó según lo descrito por Laloret al.(Eur. J. Immunol., 1992, 22:3001-2011)
2.2 Ensayos de cribado
2.2.1 ELISA de unión al TNFa (TNFa humano y de mono Cynomolgus)
Una placa ELISA de microvaloración de 96 pocillos se recubrió con TNFa humano recombinante (Peprotech, n.° de catálogo 300-01). La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNFa inmovilizado se detectó mediante un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con HRP (Jacksonlmmuno Research, n.° de catálogo 111-035-046). Se añadió sustrato TMB (3,3',5,5'- tetrametilbencidina, k Pl , n.° de catálogo 53-00-00) y la reacción de color se detuvo añadiendo H2SO4. Las placas se leyeron con un lector de placas de microvaloración (Infinity reader M200 Pro, Tecan) a una longitud de onda de 450 nm.
El rendimiento del ensayo durante las campañas de cribado se controló mediante un anticuerpo policlonal de conejo anti-TNFa de control positivo disponible en el mercado (AbD Serotec, n.° de catálogo 9295-0174). Para ello, se ensayó el anticuerpo de control positivo a 100 y 250 ng/ml por duplicado en cada placa de cribado. Se supervisó la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo en cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la proporción señal/fondo se situó entre 30 y 40 para el control positivo a 250 ng/ml y el coeficiente de variación (CV) del control positivo fue inferior al 10 %. Una señal con una densidad óptica de >100 % en relación con el control positivo de 250 ng/ml se consideró un acierto de cribado primario.
Para las determinaciones de la valoración sérica, se utilizó la misma configuración ELISA descrita anteriormente. Una dilución de suero se consideró positiva cuando la señal de unión del inmunosuero era al menos 3 veces superior en comparación con la señal de un animal no relacionado no expuesto.
Se determinó la reactividad cruzada entre especies con el mono Cynomolgus utilizando un ELISA similar al descrito anteriormente. Se recubrieron placas ELISA de microvaloración de 96 pocillos con TNFa recombinante de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° de catálogo 90018-CNAE). La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNFa de mono Cynomolgus inmovilizado se detectó mediante el anticuerpo secundario marcado con HRP, tal como se ha especificado anteriormente. El inmunosuero del conejo n.° 2 se utilizó como control positivo a una dilución de 1:80000 y 1:320000. Se supervisó la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo en cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la proporción señal/fondo se situó entre 20 y 30 para el control positivo a una dilución de 1:80000 y los CV del control positivo fueron inferiores al 10 %.
2.2.2 Cinética de unión al TNFa por SPR (humano y de mono Cynomolgus)
Las afinidades de unión de los anticuerpos por el TNFa humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un instrumento SPR MASS-1 (Sierra Sensors). El rendimiento del instrumento se calificó mediante soluciones de referencia patrón, así como mediante el análisis de una interacción antígeno-anticuerpo de referencia, tal como la interacción entre infliximab-TNFa.
Para el cribado por afinidad, un anticuerpo específico para la región Fc de las IgG de conejo (Bethyl Laboratories, n.° de catálogo A120-1 11A) se inmovilizó sobre un chip detector (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) mediante un procedimiento convencional de acoplamiento de aminas. Los anticuerpos monoclonales de conejo en los sobrenadantes de ASC fueron capturados por el anticuerpo anti-IgG de conejo. Tras la captura de los anticuerpos monoclonales, se inyectó TNFa humano (Peprotech, n.° de catálogo 300-01) se inyectó en las células de flujo durante 3 min a una concentración de 90 nM, y se dejó que se produjera la disociación de la proteína de la IgG capturada en el chip detector durante 5 min. Después de cada ciclo de inyección, las superficies se regeneraron con dos inyecciones de glicina-HCl 10 mM. Las constantes de disociación (kd) y de afinidad (ka) aparentes y la constante de disociación de equilibrio (K<d>) aparente se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión uno a uno de Langmuir y se controló la calidad de los ajustes basándose en la Chi2 relativa (Chi2 normalizada al nivel de unión máximo extrapolado del analito), que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Para la mayoría de los aciertos, el valor relativo de Chi2 era inferior al 15 %. Los resultados se consideraron válidos si las unidades de respuesta (UR) para la unión al ligando eran al menos el 2 % de las UR para la captura del anticuerpo. Se consideró que las muestras con UR para la unión del ligando con menos del 2 % de las UR para la captura del anticuerpo no mostraban unión específica del TNFa al anticuerpo capturado.
Se midió la reactividad cruzada entre especies al TNFa de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° de catálogo 90018-CNAE) utilizando la misma configuración de ensayo y concentraciones de TNFa y aplicando las mismas medidas de calidad. La Chi2 relativa fue inferior al 15 % para la mayoría de los sobrenadantes de ASC analizados.
2.2.3 Apoptosis inducida por TNFa en fibroblastos L929
Se evaluó la capacidad de las IgG de conejo procedentes de sobrenadantes de cultivos de ASC para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano recombinante utilizando fibroblastos L929 de ratón (ATCC/LGC Standards, n.° de catálogo CCL-1). Las células L929 se sensibilizaron a la apoptosis inducida por TNFa mediante la adición de actinomicina D 1 pg/ml. Las células se cultivaron en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos en presencia de sobrenadante del cultivo de ASC al 50 % y TNFa humano 100 pM (5,2 ng/ml) (Peprotech, n.° de catálogo 300-01) durante 24 h. En comparación con los anticuerpos purificados, deben utilizarse utilizar concentraciones más altas de TNFa en presencia de sobrenadantes de ASC para el cribado de aciertos. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Sigma Aldrich, n.° de catálogo 96992). Las deshidrogenasas celulares reducen el WST-8 a un producto de formazán naranja. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron mediante un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de infliximab necesaria para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa en un 50 % (CI50) a una concentración de 36,2 ng/ml. Por lo tanto, el límite inferior de detección estimado para este ensayo se sitúa entre 30 y 40 ng/ml. Este valor es sólo una estimación aproximada del límite de detección, ya que el potencial de bloqueo del TNFa no sólo depende de la concentración del anticuerpo monoclonal, sino también de la afinidad del anticuerpo por la diana. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo es suficiente para el cribado de sobrenadantes de ASC, ya que las concentraciones de IgG en la mayoría de los sobrenadantes de ASC están por encima de una concentración de 40 ng/ml. Se consideraron positivos los sobrenadantes que produjeron una neutralización del 50 % de la apoptosis inducida por TNFa.
Para asegurar un rendimiento robusto del ensayo durante las campañas de cribado, se ensayó el anticuerpo de control positivo infliximab a 115 ng/ml (0,8 nM) y a 58 ng/ml (0,4 nM) por duplicado en cada placa de cribado. Se controló el porcentaje de inhibición y la precisión de la respuesta para el control positivo en cada placa de cribado. Los criterios de aceptación para cada placa se establecieron como sigue: al menos un 60 % de inhibición con el anticuerpo de control positivo a una concentración de 115 ng/ml con un coeficiente de variación (CV) inferior al 20 %.
Ejemplo 2: Humanización y generación de scFv
1. Resultados
1.1 Confirmación de aciertosyselección de aciertos para la humanización
Se recuperaron 73 conjuntos únicos de dominios variables de cadena ligera y pesada de conejo originarios durante el cribado de aciertos y se analizaron mediante alineamiento de secuencias. Basándose en los resultados del ensayo de cribado y en la homología de secuencia de los clones individuales de IgG de conejo, se seleccionaron 30 candidatos para la confirmación de aciertos. Se prepararon 29 anticuerpos monoclonales y se seleccionaron los clones con mejor rendimiento en referencia a la afinidad y la potencia para la humanización y la generación de candidatos de partida. Los criterios para la selección de clones fueron i) la neutralización del TNFa humano en el ensayo de L929, ii) una alta afinidad por el TNFa humano, iii) la reactividad cruzada con el TNFa de los monos Cynomolgus y Rhesus, y iv) la diversidad de secuencias. Se seleccionó un clon (16-22-H05) para la humanización, uno de los IgG mejor clasificados por lo que se refiere a la potencia para neutralizar el TNFa humano en el ensayo de L929. Con respecto a la fuerza de unión, se desea la mejor afinidad posible, ya que es necesario anticipar una cierta pérdida de afinidad como resultado de la humanización y reformateado en el formato scFv.
Los datos para el clon de IgG n.° 16-22-H05 se resumen en la tabla 4.
Tabla 4: Propiedades de unión y actividad in vitro del anticuerpo monoclonal purificado (16-22-H05)
1.2 Generación y selección de fragmentos scFv humanizados
Las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se transfirieron por medios informáticos mediante injerto de bucle de CDR en una secuencia de andamiaje de dominio variable humana tal como se describe en el documento WO 2014/206561. Además, se generó una segunda construcción por clon de conejo, que transfería aminoácidos adicionales de la secuencia donante en posiciones con importancia estructural para los dominios de inmunoglobulina y la colocación de las CDR. Se sintetizó un gen artificial (con un uso de codones optimizado para la expresión bacteriana) que codifica el respectivo anticuerpo humanizado monocatenario Fv (scFv) (a partir de las correspondientes cadenas variables ligera y pesada). A continuación, se produjo el polipéptido y posteriormente se caracterizó utilizando ensayos similares a los descritos durante la confirmación de aciertos.
1.2.1 Humanización y fabricación de scFv humanizados (API)
La humanización del clon seleccionado comprendió la transferencia de las CDR de conejo a un marco aceptor de scFv del tipo Vk1/VH3 tal como se describe en el documento WO 2014/206561. En este proceso, que se muestra esquemáticamente en la figura 1, se identificó la secuencia de aminoácidos de las seis regiones CDR en la secuencia donante (mAb de conejo) y se injertó en la secuencia de andamiaje aceptor, dando lugar a las construcciones denominadas "injerto de CDR".
Además, se diseñó un segundo injerto, que incluía modificaciones de aminoácidos adicionales del donante de conejo en las posiciones L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 y H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (numeración AHo), que se ha notificado que influyen potencialmente en la colocación de las CDR y, por tanto, en la unión al antígeno (Borraset al.,JBC, 2010, 285:9054-9066). Esta construcción humanizada se denomina "injerto estructural (STR)". En caso de que la comparación de los datos de caracterización de estas dos construcciones iniciales revelara una ventaja significativa de la construcción STR, se diseñaron otras variantes que combinaban el VL injertada con CDR con el VH injertada con STR. Se ha demostrado que esta combinación suele ser suficiente para conservar la actividad del injerto STR (Borraset al.,2010, JBC, 285:9054-9066) y, por lo general, sería preferible, ya que un menor número de alteraciones no humanas en el andamiaje aceptor humano reduce el riesgo de deterioro de la estabilidad y también el potencial de inmunogenicidad.
Una vez completado el diseño por medios informáticos de la construcción descrita en la sección anterior, se sintetizaron los genes correspondientes y se construyeron los vectores de expresión bacteriana. La secuencia de las construcciones de expresión se confirmó a nivel del ADN y las construcciones se fabricaron según los protocolos genéricos de expresión y purificación.
La expresión heteróloga de las proteínas se realizó enE. colien forma de cuerpos de inclusión insolubles. El cultivo de expresión se inoculó con un cultivo inicial en crecimiento exponencial. El cultivo se realizó en matraces agitados en un agitador orbital utilizando medios ricos disponibles en el mercado. Las células se cultivaron hasta una DO600 definida de 2 y se indujeron mediante la expresión nocturna con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Al final de la fermentación, las células se recogieron por centrifugación y se homogeneizaron por sonicación. En este momento, se determinó el nivel de expresión de las diferentes construcciones mediante análisis SDS-PAGE del lisado celular. Los cuerpos de inclusión se aislaron del sedimento celular homogeneizado mediante un protocolo de centrifugación que incluía varias etapas de lavado para eliminar los restos celulares y otras impurezas de la célula hospedadora. Los cuerpos de inclusión purificados se solubilizaron en un tampón desnaturalizante (Tris 100 mM/HCl, pH 8,0, Gdn-HCl 6 M, EDTA 2 mM) y los scFv se volvieron a plegar mediante un protocolo de replegado escalable que generó cantidades de miligramos de scFv monoméricos plegados de forma nativa. Se empleó un protocolo normalizado para purificar los scFv, que incluía las siguientes etapas. El producto tras el replegamiento se capturó mediante una cromatografía de afinidad empleando agarosa Capto L (GE Healthcare) para obtener los scFv purificados. Los candidatos de partida que cumplían los criterios de afinidad y potencia en los ensayos iniciales se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño de refinamiento con una columna HiLoad Superdex75 (GE Healthcare). Tras el protocolo de purificación, las proteínas se formularon en una solución salina tamponada y se caracterizaron mediante los diversos procedimientos biofísicos, de interacción de proteínas y biológicos que se describen a continuación. La facilidad de producción de las diferentes construcciones se comparó determinando el rendimiento final de proteína purificada para el lote y normalizando este valor a 1 l de volumen de replegamiento.
1.2.2 Caracterización biofísica del scFv humanizado
La caracterización biofísica del scFv con respecto a la estabilidad y a la facilidad de producción se recopila en la tabla 5. La facilidad de producción y la estabilidad de la construcción scFv se caracterizó por los diferentes puntos de notificación, como se analiza en las secciones siguientes.
Se investigó el scFv en cuanto a determinados criterios, como se explica a continuación.
El criterio de facilidad de producción garantizará que la entidad de scFv seleccionada pueda expresarse, replegarse y purificarse en cantidades suficientes para apoyar el desarrollo posterior de la molécula de partida. Los criterios definidos fueron el rendimiento de expresión de scFv por litro de caldo de fermentación, evaluado mediante SDS-PAGE, y el rendimiento de purificación alcanzado en el proceso genérico a escala de laboratorio, evaluado mediante la medición de la cantidad de proteína purificada por espectrometría UV, calculada a partir de 1 litro de solución de replegamiento.
Los criterios de estabilidad tenían por objeto evaluar la propensión a la agregación durante el proceso de fabricación de las moléculas y su integridad estructural durante el almacenamiento y la manipulación posterior. El contenido de monómeros determinado por SE-HPLC permite evaluar la estabilidad coloidal de las moléculas durante el proceso de purificación (2.2.3). En un estudio de estabilidad posterior se comprobó el contenido de monómeros durante 4 semanas a 1 y 10 mg/ml y de almacenamiento a 4, -20 y <-65 °C. Además, se comprobó la estabilidad coloidal de las proteínas tras 5 ciclos de congelación y descongelación. Como otro parámetro indicador de la estabilidad, se determinó el punto medio del desplegamiento térmico mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF) (2.2.4) para proporcionar una lectura de la estabilidad conformacional de los candidatos de partida.
Tabla 5: Resumen de los datos de caracterización biofísicos de los scFv humanizados
1.2.2.1 Evaluación de la facilidad de producción
Las moléculas de scFv candidatas de partida se expresaron mediante fermentación en matraz agitado en modo discontinuo y se purificaron mediante un proceso genérico a escala de laboratorio para obtener las muestras de proteínas para su posterior caracterización. Durante este proceso se controlaron algunos parámetros clave de rendimiento para comparar las moléculas candidatas e identificar construcciones potencialmente difíciles de desarrollar.
La valoración de la expresión se determinó a nivel del lisado bruto deE. colitras la recolección de las células por centrifugación. Durante la recolección se prevé una pequeña pérdida de células, aunque se optó por despreciar este factor para el cálculo del rendimiento de expresión en favor de una estimación más conservadora de la productividad. Para la cuantificación del producto de scFv en el lisado, se eligió SDS-PAGE reductor teñido con Coomassie (2.2.1) debido a la alta especificidad del procedimiento que permite discriminar el producto de las proteínas de la célula hospedadora en la muestra.
Un segundo criterio para evaluar la facilidad de producción es el rendimiento de purificación de scFv calculado por litro de solución de replegamiento. Este parámetro aborda el posible cuello de botella en el proceso de fabricación previsto que incluye una etapa de replegamiento de proteínas. Dado que la eficacia del procedimiento de replegamiento ha demostrado ser limitante en procesos de fabricación comparables, se decidió comparar el rendimiento de las diferentes construcciones con respecto a la facilidad de producción normalizada a un volumen de replegamiento definido. Para calcular el rendimiento, se cuantificó la muestra final de proteínas de cada lote mediante absorbancia de UV (2.2.2) y se dividió por el volumen real de replegamiento de la purificación respectiva (tabla 6).
Tabla 6: Resumen de los datos de facilidad de producción de dos scFv humanizados. La valoración de la de expresión se determinó mediante SDS-PAGE cuantitativo en lisados de células al final de la producción. El rendimiento del lote se determinó mediante la medición de la absorbancia de UV de la agrupación de purificación final. El rendimiento de la purificación se calcula como el scFv purificado por litro de volumen de replegamiento.
1.2.2.2 Evaluación de la estabilidad
La evaluación de la estabilidad conformacional, la monodispersidad y la integridad estructural de las construcciones de scFv es un componente integral para la clasificación de las diferentes moléculas con respecto a la capacidad de ser desarrolladas. Un requisito previo para la comparación significativa de las diferentes construcciones es la preparación de moléculas purificadas de calidad similar. El criterio "pureza del monómero" determinado por SE-HPLC tiene por objeto garantizar una calidad compatible de las diferentes sustancias de ensayo. Además del análisis SE-HPLC, se realizó una SDS-PAGE para la determinación de la pureza e identidad de las proteínas, con el fin de confirmar la calidad comparable de las preparaciones analizadas.
Los resultados de SE-HPLC de los dos scFv revelan que todas las preparaciones pudieron purificarse hasta un contenido de monómeros de >99 % (figura 2).
El comportamiento de desplegamiento térmico de los candidatos de partida se ensayó mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF) para poder clasificar las moléculas con respecto a su estabilidad conformacional esperada. En la figura 3 se muestra un gráfico normalizado de los datos brutos de fluorescencia, que representa mediciones por duplicado de cada muestra. Se observó un comportamiento de desplegamiento cooperativo. Las dos moléculas 16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04 mostraron una Tf de 71,3 y 72,6 °C, respectivamente.
En una segunda rama de la evaluación de estabilidad, se controló la monodispersidad de las moléculas durante 4 semanas a diferentes temperaturas. Los resultados del estudio de estabilidad y el contenido de monómeros resultante se muestran en la figura 4. Ambas moléculas (16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04) parten de un contenido de monómeros superior al mínimo del 95 % de monómeros y pierden menos del 5 % de monómeros con respecto al valor de partida respectivo a una concentración de 10 mg/ml. En estado congelado a 20 °C y <-65 °C, las muestras sólo mostraron diferencias mínimas a lo largo del tiempo. En la condición más estricta (4°C), la molécula 16-22-H05-sc02 perdió tan sólo un 0,2 % de monómeros durante las 4 semanas. Además, se realizó un estudio de estabilidad al estrés a una temperatura de 37 °C y una concentración de scFv de 10 mg/ml durante un máximo de 4 semanas. En estas condiciones se espera una discriminación más estricta de la propensión a la agregación de las distintas construcciones. Los datos resultantes resumidos en la figura 6 revelaron una pérdida de monómeros del 15 % al cabo de 28 días. Ambos scFv demostraron una buena estabilidad de monómeros en condiciones de estrés. Los cromatogramas del estudio de estabilidad a 4 °C se presentan en la figura 5, en la que se presenta la muestra en el día 0 y después de 28 días a 4 °C. En esta superposición de cromatogramas también se muestran los resultados de la estabilidad a la congelación/descongelación. Para esta parte del estudio, las muestras se congelaron y descongelaron repetidamente durante un total de 5 ciclos. La cuantificación resultante del contenido de monómeros mediante SE-HPLC analítica no reveló ningún cambio en las dos muestras (tabla 5).
Se realizó un análisis SDS-PAGE para los dos scFv con el fin de generar datos de apoyo para la cuantificación por absorbancia de UV, confirmando la pureza de la preparación de la muestra y confiriendo así especificidad para la cuantificación del contenido. En otro aspecto de este análisis, los resultados de SDS-PAGE revelaron la ausencia de degradación de las proteínas durante el estudio de estabilidad (28 días a 4 °C y una concentración de 10 mg/ml en comparación con la muestra del día 0 almacenada a <-65 °C), que es una característica importante desde el punto de vista de la capacidad de su desarrollo.
Es importante señalar que los diferentes estudios realizados en el ámbito de esta evaluación abordan aspectos farmacodinámicos distintos de la estabilidad de las proteínas. La determinación de la temperatura de desplegamiento térmico de una proteína dará resultados complementarios a la medición de la monodispersidad por SE-HPLC tras el almacenamiento a temperatura elevada. Aunque ambos procedimientos están diseñados para ofrecer una estimación de la vida útil y la estabilidad potenciales del producto, los mecanismos abordados son profundamente diferentes. El punto medio de transición (Tf) evaluado mediante el desplegamiento térmico es una medida cualitativa de la estabilidad del dominio de proteína (no permite determinar termodinámicamente la AG). Los dominios de proteínas muy estables (Tf alto) tienen menos probabilidades de desplegarse espontáneamente a temperatura ambiente y, por tanto, son menos propensos a la agregación/precipitación irreversible impulsada por las interacciones de los dominios desplegados. La alta estabilidad del dominio indica un denso empaquetamiento de residuos de aminoácidos, que también se correlaciona con la resistencia a la escisión por proteasas. Por otra parte, la evaluación por SE-HPLC determina cuantitativamente el contenido de la fracción monomérica, así como de los oligómeros/agregados solubles. Estos oligómeros solubles suelen ser asociaciones reversibles y relativamente laxas impulsadas por interacciones electrostáticas o hidrófobas entre proteínas correctamente plegadas. Existe cierta correlación entre la Tf evaluada por el desplegamiento térmico y la propensión a la formación de oligómeros/agregados evaluada por SE-HPLC, especialmente en el caso de proteínas con una estabilidad "límite". Más allá de un determinado umbral de Tf de aproximadamente 60 °C, los dominios variables de los anticuerpos son, por lo general, lo suficientemente estables como para ser resistentes a la agregación/precipitación y a la degradación proteolítica debida al desplegamiento parcial del dominio a temperatura ambiente. Sin embargo, puede seguir produciéndose una oligomerización impulsada por las interacciones hidrofóbicas y/o electrostáticas de los residuos superficiales. Es importante destacar que en un estudio de estabilidad acelerada (estrés) a temperatura elevada (por ejemplo, 37 °C) pueden producirse simultáneamente los diversos mecanismos de formación y precipitación de oligómeros.
1.2.3 Caracterización de la uniónin vitroy la actividad de los scFv humanizados
A continuación, los scFv humanizados se caracterizaronin vitropor sus propiedades y potencias de unión a la diana. Se analizó la cinética de unión (ka, kd y KD) al TNFa humano y la potencia para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa en fibroblastos L929. Además, se determinó la potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en el mono Cynomolgus (Macaca fascicularis) y el mono Rhesus (Macaca mulatta), así como la potencia para inhibir la interacción entre el TNFa humano y TNFRI/TNFRII mediante ELISA y la selectividad de diana para la unión al TNFa frente al TNFp.
Para la comprensión de los resultados que se presentan a continuación, es importante señalar que tanto la transferencia de las CDR de conejo a un andamiaje de dominio variable humano como el cambio de formato de la IgG de tamaño completo al fragmento scFv pueden afectar a las propiedades farmacológicas. Por ejemplo, una cierta pérdida de afinidad suele ir asociada a la humanización. Además, debido al menor tamaño de los scFv en comparación con las IgG, se reduce en gran medida la capacidad de los scFv de interferir con los compañeros de interacción a través de impedimentos estéricos. Por último, pero no por ello menos importante, cabe señalar que, debido a su modo bivalente de unión al TNFa homotrimérico, la afinidad de la IgG originaria puede haberse notificado con un valor demasiado alto (artefacto de SPR). Por consiguiente, al comparar las afinidades entre la IgG bivalente de conejo originaria y la scFv monovalente humanizada, la "pérdida de afinidad" notificada puede estar sobreestimada.
1.2.3.1 Afinidad
La afinidad de los scFv humanizados por el TNFa humano se determinó mediante mediciones de SPR (véase también 2.1.1). La afinidad se determinó utilizando diluciones seriadas dobles de los scFv respectivos. Los scFv procedían de un anticuerpo monoclonal de conejo. Se generaron dos variantes de scFv , denominadas "CDR" (CDR) e "injerto estructural" (STR). Para evaluar la contribución relativa de las sustituciones en el marco en las cadenas ligera y pesada y reducir potencialmente el número de residuos de aminoácidos de conejo introducidos en el marco humano, se realizaron experimentos de reordenamiento de dominios. Por lo tanto, se generaron construcciones scFv que contenían una cadena ligera injertada con CDR y una cadena pesada con injerto estructural (CDR/STR) para el clon 16-22-H05.
Los scFv 16-22-H05-sc02 (STR) y 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) mejor clasificados se unieron con afinidades de 4,5 x 10'11 y 1,1 x10 '10M, respectivamente. 16-22-H05-sc04 sólo mostró una ligera reducción de la afinidad en comparación con su variante de "injerto estructural" (16-22-H04-sc02) (véase la tabla 7). Estos resultados sugieren que la afinidad de los scFv humanizados depende principalmente de los pocos aminoácidos de conejo introducidos en el marco de la cadena pesada humana.
1.2.3.2 Potencia
La capacidad de los scFv humanizados para neutralizar el TNFa humano se analizó utilizando el ensayo de L929 (véase también 2.1.2). Se analizó la potencia (CI50 y CI90) para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa con los scFv derivados de 16-22-H5 y se comparó con la potencia del anticuerpo de referencia infliximab para poder realizar una comparación directa de los valores de CI50 y CI90 de diferentes placas de ensayo. Los valores de CI50 y CI90 relativos se calcularon en unidades de masa (ng/ml) del infliximab y los scFv. El análisis de la potencia se realizó varias veces en días diferentes con distintos lotes de fragmentos de anticuerpos. La figura 7 muestra curvas dosis-respuesta representativas de un experimento para cada uno de los dos scFv. Los valores medios de las mediciones por duplicado se muestran en la tabla 7 (las desviaciones estándar se resumen en la leyenda de la tabla).
Los scFv humanizados inhibieron la apoptosis inducida por TNFa con valores de CI50 y CI90 inferiores a los de infliximab (véase la tabla 7). En consonancia con los resultados de la SPR, la variante de dominio reordenado 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) mostró igual potencia que el injerto estructural 16-22-H05-sc02 (STR). Los scFv 16-22-H05-sc04 y 16-22-H05-sc02 mostraron una excelente actividad neutralizante del TNFa, con valores de CI5014,6 y 13,1 veces superiores a los del infliximab, respectivamente. Los valores de CI90 de 16-22-H05-sc04 y 16-22-H05-sc02 fueron 13,1 y 12,6 veces mejores que los de infliximab, respectivamente. Tal como se observó con los anticuerpos monoclonales de conejo originarios, no hubo una correlación clara entre la afinidad y la potencia de los anticuerpos (la correlación no se muestra). Sin embargo, los scFv procedentes de 16-22-H05 que mostraron las afinidades más altas (16-22-H05-sc02 (STR) y 16-22-H05-sc04 (C<d>R/STR)) también mostraron la mayor potencia. Además, los resultados de los ensayos de neutralización sugieren que es necesario alcanzar un determinado umbral de afinidad para inhibir con eficacia la transducción de señales del TNFa. Por ejemplo, los scFv 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) y 17-20-G01-sc01 (CDR), que se unen todos al TNFa con afinidades superiores a 1 nM, muestran un escaso potencial para neutralizar el TNFa (no mostrado).
1.2.3.3 Reactividad cruzada entre especies (TNFa de mono Cynomolgus y Rhesus)
La reactividad cruzada entre especies para los scFv mejor clasificados se determinó mediante dos procedimientos: 1) potencia para neutralizar el TNFa de mono Cynomolgus y de mono Rhesus en el ensayo de L929 y 2) afinidad por el TNFa de mono Cynomolgus y de mono Rhesus mediante SPR. La potencia para neutralizar el TNFa de las diferentes especies se determinó mediante el ensayo de L929 de forma similar a la descrita anteriormente para el TNFa humano utilizando TNFa de mono Cynomolgus y de mono Rhesus, respectivamente (véase también 2.1.2). El TNFa de ambas especies mostró una potencia muy similar para inducir la apoptosis de L929 (datos no mostrados). Por lo tanto, se utilizaron las mismas concentraciones de TNFa humano y de mono para los ensayos de reactividad cruzada entre especies. Además, se determinó la cinética de unión (por SPR) al TNFa de mono Cynomolgus y de mono Rhesus utilizando un ensayo similar al del TNFa humano (véase también 2.1.1).
Todos los scFv derivados del clon 16-22-H05 mostraron reactividad cruzada con el TNFa de mono Cynomolgus y de mono Rhesus (véase la tabla 7). Las afinidades fueron similares, a saber, 2,0 * 10'10y 2,3 * 10'10 M para el mono Cynomolgus y para el mono Rhesus, respectivamente. La diferencia de afinidad entre el TNFa humano y el de mono era de aproximadamente 5 veces. Las potencias para neutralizar el TNFa de mono Cynomolgus, de mono Rhesus y humano se correlacionaron bien con las afinidades por los TNFa respectivos. Por consiguiente, los dos clones derivados de 16-22-H05 mostraron potencias entre 5 y 7 veces inferiores frente al TNFa de mono en comparación con el TNFa humano (véanse la tabla 7 y la figura 8). En resumen, los dos scFv mostraron reactividad cruzada entre especies con el TNFa de Cynomolgus y Rhesus.
1.2.3.4 Bloqueo de la interacción TNFa-TNFRI/II humano
Además del ensayo de L929, la potencia de cada scFv humanizado para inhibir la interacción entre TNFa humano y TNFRI/II se evaluó mediante ELISA (véase 2.1.3). De forma similar al ensayo de L929, los valores individuales de CI50 en cada placa se calibraron con respecto al CI50 de la molécula de referencia infliximab que se tomó a lo largo de cada placa y se calcularon los valores relativos de CI50 y CI90 en unidades de masa (ng/ml) del infliximab y los scFv.
Los ensayos de neutralización pueden distinguir potencias de anticuerpos bloqueadores de diana sólo si se unen a su diana con una constante de unión en equilibrio (KD) que sea superior a la concentración diana utilizada en el ensayo de potencia (KD > concentración diana). Para el ensayo de L929 se utilizó una concentración de TNFa de 5 pM, mientras que en los ELISA de inhibición de TNFRI/II se utilizó una concentración de TNFa de 960 pM. Por lo tanto, teóricamente, el ensayo de L929 puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 5 pM, mientras que el ELISA de inhibición sólo puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 960 pM. Dado que todos los scFv analizados mostraron unas KD inferiores a 960 pM, las potencias entre scFv con afinidades diferentes (pero mecanismo de acción similar) sólo pueden diferenciarse en el ensayo de L929.
16-22-H5-sc02 y 16-22-05-sc04 mostraron potencias de bloqueo de la interacción TNFa-TNFRI entre 2,8 y 3,5 veces superiores en comparación con el infliximab, mientras que la potencia en comparación con el infliximab en el ensayo de L929 fue significativamente superior (13,1 y 14,6 veces). Cuando se comparan los valores relativos de CI50 para la IgG originaria de conejo (véase la tabla 2) con los valores relativos de CI50 para los scFv humanizados (tabla 7), las potencias de los scFv son, por lo general, ligeramente superiores en comparación con la IgG originaria, aunque las afinidades en general están en el mismo intervalo para la IgG parental de conejo. Dado que las potencias de los anticuerpos y los scFv se compararon en unidades de masa, el número de valencias (sitios de unión al TNFa) en cada concentración es aproximadamente 2,9 veces mayor para los scFv monovalentes en comparación con los IgG más de cinco veces más pesados pero bivalentes. Con los scFv de unión de muy alta afinidad, esto produce un bloqueo más potente de la interacción de TNFa y TNFRI/II porque la falta de avidez ya no es crucial para la actividad. En cambio, con dominios monovalentes de baja afinidad se ha publicado lo contrario (Coppieterset al.,Arthritis & Rheumatism, 2006, 54:1856-1866). Por las razones mencionadas anteriormente, los resultados del ELISA de inhibición no se utilizaron para clasificar las potencias entre los diferentes anticuerpos, sino principalmente para comparar el potencial de los anticuerpos para bloquear la interacción con TNFRI frente a TNFRII. Los scFv investigados bloquearon la interacción entre ambos receptores TNFa con potencias comparables (tabla 9, figura 9 y figura 10).
1.2.3.5 Especificidad por la diana (selectividad de unión al TNFa frente al TNFp)
La especificidad de los dos scFv (16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04) por el TNFa frente al TNFp se confirmó mediante la evaluación del potencial relativo del TNFp en comparación con el TNFa para inhibir de forma semimáxima la unión del TNFa a cada scFv y se midió en un ELISA de competición (véase también 2.1.4). La calidad del TNFp humano recombinante fue analizada 1) en cuanto a la pureza mediante análisis SDS-page y HPLC, y 2) en cuanto a la actividad biológica en el ensayo de citotoxicidad de L929 de ratón por el fabricante de la proteína. Tal como se muestra en la figura 11, la interacción entre cada uno de los scFv con el TNFa biotinilado fue bloqueada por el TNFa no marcado con valores de CI50 que oscilaban entre 60 y 260 ng/ml, mientras que el TNFp no mostró ningún efecto significativo incluso a la concentración más alta de TNFp ensayada (1250 pg/ml). Así pues, todos los scFv analizados se unen específicamente al TNFa, pero no a su homólogo más cercano, el TNFp. El TNFp no mostró ninguna inhibición significativa de la unión del TNFa a los scFv en las concentraciones ensayadas. Por lo tanto, la concentración de TNFp necesaria para inhibir de forma semimáxima la unión del TNFa tiene que ser significativamente superior a la concentración más alta de TNFp utilizada en el ensayo (1250 pg/ml). Cuando se comparan las concentraciones de TNFa y TNFp necesarias para inhibir de forma semimáxima la unión del TNFa a los scFv, la selectividad para la unión al TNFa frente al TNFp es significativamente superior a aproximadamente 5000 a 20000 veces para todos los fragmentos ensayados (véase también la tabla 7). Por lo tanto, la unión en un sitio diana inespecífico de cualquiera de los scFv parece altamente improbable.
Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se resumen en las tablas 7 a 9.
Tabla 7. Propiedades de unión y actividadin vitrode scFv humanizados. CDR: "injerto de CDR", STR: "injerto estructural". El análisis de la potencia se realizó varias veces en días diferentes con distintos lotes de fragmentos de anticuerpos con las siguientes desviaciones estándar: 16-22-H05-sc02 (n=3): CI50 relativa = 13,1 ± 1,8 y CI90 relativa = 12,6 ± 3,5; 16-22-H05-sc04 (n=2): CI50 relativa = 14,6 ± 0,6 y CI90 relativa =13,1 ± 2,4.
Tabla 8. Características de los scFv humanizados de la presente invención.
Tabla 9. Potencia de los scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFR1 y TNFa-TNFR2.
2. Procedimientos
2.1 Ensayos de caracterización moléculas de partida
2.1.1 Cinética de unión y reactividad cruzada entre especies por SPR
Las afinidades de unión de los scFv por el TNFa humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un instrumento SPR MASS-1 (Sierra Sensors). El rendimiento del ensayo SPR se calificó mediante el análisis de la interacción antígeno y anticuerpo de referencia, tal como la interacción certolizumab-TNFa. El fragmento Fab pegilado certolizumab se seleccionó como referencia debido a su modo de unión monovalente similar al de los scFv. Utilizando la misma configuración de ensayo que para las mediciones de afinidad de los scFv, se determinó un valor de 9,94 * 10-11 M para la afinidad del certolizumab al TNFa. Este valor concuerda bien con los valores de K<d>publicados de 9,02 ± 1,43 * 10-11 M (BLA certolizumab; número BLA: 125160; fecha de presentación: 30 de abril de 2007).
Para las mediciones de afinidad de scFv, se inmovilizó TNFa humano (Peprotech, n.° de catálogo 300-01) sobre un chip detector (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors) mediante acoplamiento de aminas para alcanzar un nivel de inmovilización de 50 a 100 UR (los niveles de inmovilización alcanzados durante el análisis SPR se situaron entre 40 y 120 UR). En una primera etapa, se realizó un cribado de afinidad de los scFv utilizando una única concentración de scFv (90 nM). En una segunda etapa, para los scFv de mejor rendimiento, se midió la cinética de ciclo de inyección única ("Single Injection Cycle Kinetics", SiCK) a partir de un único ciclo de inyección inyectando simultáneamente seis muestras de analito a diferentes concentraciones en cada uno de los ocho canales paralelos del sistema MASS-1. Para los cribados de afinidad, se inyectaron scFv humanizados en las células de flujo a una concentración de 90 nM durante tres minutos y se controló la disociación durante 12 minutos. Para las posteriores determinaciones de afinidad, más precisas, se inyectaron en las células de flujo diluciones seriadas dobles de scFv que oscilaban entre 45 y 1,4 nM durante tres minutos y se dejó que se produjera la disociación de la proteína del TNFa inmovilizado en el chip detector durante 12 minutos. Las constantes de disociación (kd) y de asociación (ka) aparentes y la constante de disociación de equilibrio (K<d>) aparente se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión uno a uno de Langmuir y se controló la calidad de los ajustes basándose en Chi2, que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Cuanto menor sea el valor de Chi2 , más preciso será el ajuste al modelo de unión uno a uno de Langmuir. Para los cribados de afinidad, los resultados se consideraron válidos si la Chi2 era inferior a 10 para la concentración analizada. En los casos en los que se analizaron varias concentraciones de scFv, los resultados se consideraron válidos si la media de Chi2 en todas las concentraciones analizadas era inferior a 10. Se cumplieron los criterios de aceptación para todos los scFv ensayados.
Se midió la reactividad cruzada entre especies con TNFa (Peprotech, n.° de catálogo 315-01A) de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° de catálogo 90018-CNAE) y mono Rhesus (R&D Systems, n.° de catálogo 1070-RM-025/CF) utilizando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNFa humano. Para los monos Cynomolgus y Rhesus, se alcanzaron niveles de inmovilización de TNFa que oscilaban entre 50 y 180 UR y entre 90 y 250 UR, respectivamente. Los scFv se analizaron utilizando diluciones seriadas dobles con concentraciones que oscilaban entre 45 y 1,4 nM. Los valores promedio de Chi2 fueron inferiores a 10 para todos los scFv ensayados.
2.1.2 Apoptosis inducida por TNFa en fibroblastos L929 (neutralización de TNFa humano y de primate no humano por scFv)
Se evaluó la capacidad de los scFv para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano recombinante utilizando fibroblastos L929 de ratón (ATCC/LGC Standards, n.° de catálogo CCL-1). Se sensibilizaron células L929 a la apoptosis inducida por TNFa mediante la adición de actinomicina D 1 pg/ml. Se preincubaron diluciones seriadas triples de anticuerpo de referencia anti-TNFa o scFv (3000-0,05 ng/ml) y TNFa humano recombinante 5 pM (Peprotech, n.° de catálogo 300-01) a temperatura ambiente durante 1 hora. La concentración de TNFa utilizada (5 pM) induce la apoptosis submáxima de L929 (CE90). Tras la adición de las mezclas de agonista/inhibidor, las células se incubaron durante 24 horas. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Sigma Aldrich, n.° de catálogo 96992). La WST-8 es reducida por las deshidrogenasas celulares a un producto naranja de formazán. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron mediante un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de anticuerpo de referencia o scFv necesaria para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa en un 50 % y un 90 % (CI50 y CI90) (véase también la figura 7). Para que los valores de CI50 y CI90 fueran directamente comparables entre experimentos realizados en días diferentes o en placas de ensayo diferentes, los valores de CI50 y CI90 se calibraron con el anticuerpo de referencia infliximab. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas de dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV < 20 %).
Se midió la reactividad cruzada entre especies con TNFa de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° de catálogo 90018-CNAE) y mono Rhesus (R&D Systems, n.° de catálogo 1070-RM-025/CF) utilizando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNFa humano. De forma similar al homólogo humano, se utilizaron concentraciones de TNFa que inducen la apoptosis submáxima de L929 (CE90) para los ensayos de reactividad cruzada entre especies. El TNFa de ambas especies mostró una potencia muy similar a la del TNFa humano para inducir la apoptosis de fibroblastos L929 de ratón. Por consiguiente, se utilizó la misma concentración de TNFa (5 pM) para las otras especies analizadas. Durante los ensayos de reactividad cruzada entre especies, los CV de la mayoría de los puntos de medición duplicados fueron inferiores al 10 %.
2.1.3 ELISA de inhibición del TNFa
El efecto inhibidor de los scFv sobre la unión del ligando se evaluó mediante un ELISA, un procedimiento bioquímico que reproduce únicamente la interacción entre TNFa y TNFRI y TNFRII.
Para el primer ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRI fusionado a la región Fc de IgG humana (R&D Systems, n.° de catálogo 372-RI) se recubrió sobre un Maxisorp ELISA de 96 pocillos a una concentración de 0,5 pg/ml. Para el segundo ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRII fusionado a la región Fc de IgG humana (R&D Systems, n.° de catálogo 726-R2) se recubrió a una concentración de 2 pg/ml. Todas las etapas posteriores fueron idénticas para ambos ensayos. Para detectar la unión de TNFa a TNFRI y TNFRII, se biotiniló el TNFa antes de su uso. El TNFa humano biotinilado (960 pM, 50 ng/ml) se incubó en primer lugar con infliximab y scFv anti-TNFa humanizados diluidos en serie 3 veces (10000 ng/ml-0,2 ng/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de TNFa/fragmentos de anticuerpo se transfirieron a las placas inmovilizadas del receptor de TNF y se detectó la unión del TNFa no bloqueado al receptor de TNFa inmovilizado tras incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos con estreptavidina-HRP de unión a biotina (SDT Reagents, n.° de catálogo SP40C). La adición de sustrato de 3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) dio lugar a una lectura colorimétrica proporcional a la unión de TNFa a TNFRI y TNFRII. Antes de utilizarlo en el ELISA de competición, se confirmó la actividad biológica del TNFa biotinilado en el ensayo de L929. La CE50 del TNFa biotinilado fue similar a la CE50 del TNFa no marcado (datos no mostrados). De forma similar al ensayo de L929 descrito anteriormente, los datos se analizaron mediante un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de scFv necesaria para inhibir la interacción de TNFa y TNFR en un 50 % y un 90 % (CI50 y CI90). Para que los valores de CI50 y CI90 fueran directamente comparables entre experimentos realizados en días diferentes o en placas de ensayo diferentes, los valores de CI50 y CI90 se calibraron con el anticuerpo de referencia infliximab.
Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas de dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV < 25 %).
2.1.4 Especificidad por la diana
Para confirmar la especificidad de los scFvanti-TNFa, se evaluó la unión al miembro de la familia TNFp más homólogo. Se analizó el potencial de inhibición de la interacción del TNFa biotinilado con scFv por TNFp no marcado (Peprotech, n.° de catálogo 300-01B) y TNFa (Peprotech, n.° de catálogo 300-01) mediante ELISA de competición. Para ello, los scFv se recubrieron sobre una placa ELISA Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 1 pg/ml. Se detectó la unión de TNFa biotinilado (75 ng/ml) a los scFv recubiertos en presencia de TNFa sin marcar diluido en serie 5 veces (50 pg/ml-0,00013 pg/ml) o TNFp (1250 pg/ml-0,00013 pg/ml) utilizando estreptavidina-HRP de unión a biotina (SDT Reagents, n.° de catálogo SP40C) como se ha descrito anteriormente. Para la curva de dosis-respuesta con TNFa, se analizaron los datos mediante un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de TNFa no marcado necesaria para bloquear la interacción del TNFa biotinilado con el scFv recubierto en un 50 % (CI50). El TNFp no mostró inhibición significativa de la interacción entre TNFa biotinilado y scFv (véase también la figura 11). Para cuantificar el potencial relativo del TNFp en comparación con el TNFa para inhibir la unión del TNFa a cada scFv, se calculó la CI50 para inhibir la interacción por TNFp en relación con TNFa. Dado que no se observó una inhibición significativa al utilizar TNFp a una concentración aproximadamente 5000 a 20 000 veces superior a la CI50 de TNFa, se determinó que la selectividad de unión a TNFa frente a TNFp era significativamente superior a 5000 a 20000 veces. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas de dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV < 25 % para todas menos una de las concentraciones de TNFa/p analizadas). Todos los scFv cumplieron este criterio.
2.1 Analítica CMC
2.2.1SDS-PAGE reductora
La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es una técnica de análisis utilizada para la caracterización cualitativa y para controlar la pureza de las proteínas. Según la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) (USP Capítulo 1056), la electroforesis analítica en gel es un procedimiento apropiado y habitual para identificar y evaluar la homogeneidad de las proteínas en las sustancias farmacológicas.
El procedimiento se utiliza para cuantificar la cantidad de producto scFv a partir de lisados deE. colipara obtener el rendimiento de expresión tras la fermentación. Otra aplicación del procedimiento es verificar la identidad de las sustancias de ensayo basándose en su peso molecular con respecto a los valores teóricos. Con fines de apoyo, este procedimiento se utiliza para cuantificar la pureza de las muestras de ensayo con respecto a las impurezas relacionadas con el proceso (proteínas de la célula hospedadora) y las impurezas relacionadas con el producto (productos de degradación o aductos).
Los análisis de SDS-PAGE se realizaron con el sistema de gel prefabricado disponible en el mercado "Mini Protean" obtenido de Bio-Rad Laboratories Inc. Los scFv humanizados se analizaron en geles de resolución "Any kD" (n.° 456 9036). En ambos casos se utilizó el sistema tampón Tris/glicina recomendado por el fabricante. Para la detección de las bandas de proteínas se utilizó la tinción de Coomassie con la solución de tinción SimplyBlueTM (Life Technologies Corp., n.° LC6060) o la tinción de plata con el kit Pierce Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., n.° 24612). Para los procedimientos de tinción se siguieron los protocolos de los respectivos proveedores.
La documentación y el análisis de los geles de proteínas teñidos se realizaron con el sistema de documentación ChemiDoc XRS System (Bio-Rad Laboratories Inc., n.° 170-8265) y el software Image Lab, versión 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., n.° 170-9690).
Determinación de la valoración de muestras de lisado
La SDS-PAGE permite la detección específica de la proteína de interés en la mezcla de proteínas de la célula hospedadora. En cada gel se incluyó una serie de diluciones del patrón de referencia en el intervalo lineal del procedimiento (que se determinó de antemano). Se utilizó una regresión lineal de las intensidades de banda (medidas por densitometría) frente a las concentraciones nominales del patrón de referencia para calcular una curva patrón que, a su vez, se utilizó para extrapolar el contenido de scFv en la muestra.
Las muestras de lisado de concentraciones de producto desconocidas se cargaron en diferentes diluciones (al menos 1:10 en tampón de dilución) para tener al menos una concentración de scFv en el intervalo lineal del procedimiento. La cantidad de producto se calculó basándose en las intensidades de banda medidas del scFv y la concentración se determinó utilizando los factores de dilución de la preparación de la muestra. Los valores se promediaron para todas las muestras que se encontraban dentro del intervalo lineal de la curva patrón.
Como ensayo adicional de la idoneidad del procedimiento para la cuantificación de una muestra de lisado, se realizó una prueba de inhibición/mejora añadiendo a una muestra de lisado una cantidad conocida de patrón de referencia. El cálculo de la recuperación de la cantidad añadida con una dilución de la muestra de 1:10 en tampón de dilución dio como resultado un valor del 95,4 %, que se sitúa en el mismo nivel de precisión que el observado con el patrón de referencia en tampón de dilución. Así pues, no se observaron interferencias significativas de la matriz en los lisados celulares y el procedimiento se consideró adecuado para la cuantificación del contenido de scFv en lisados celulares.
Pureza y contenido de proteínas
Para demostrar la idoneidad del procedimiento para determinar el contenido y, por tanto, también la pureza de las muestras de ensayo, se determinó visualmente el límite inferior de detección ("lower limit of detection", LOD) para un scFv de referencia (identificando la banda de proteína) con una carga nominal de 0,02 |jg, y la evaluación del histograma de intensidad del carril respectivo muestra una proporción de señal-ruido a esta carga de aproximadamente 2. Además, se determinó el intervalo lineal para la cuantificación analizando densitométricamente las bandas principales.
El ajuste de los datos con una regresión lineal da como resultado un coeficiente de determinación (R2) de 0,9998, indicando así una buena calidad del ajuste. Además de la calidad global del ajuste, se determinó el error relativo de cada punto de datos individual para documentar la idoneidad del procedimiento en el intervalo elegido. Los errores relativos son inferiores al 10% para todos los puntos de datos, lo que indica una buena precisión de este procedimiento.
2.2.2 Absorbancia de UV a 280 nm
El procedimiento de absorbancia de UV a 280 nm es un ensayo de proteína total como se indica en el capítulo 1057 de la USP Las soluciones de proteínas absorben la luz UV a una longitud de onda de 280 nm debido a la presencia de aminoácidos aromáticos. La absorbancia de UV es una función del contenido de residuos de tirosina y triptófano en la proteína y es proporcional a la concentración de proteína. La absorbancia de una solución de proteínas desconocidas puede determinarse según el capítulo 851 de la USP sobre espectroscopia aplicando la ley de Beer: A = £*I*c, donde la absorbancia (A) es igual al producto de la absortividad molar (e), la longitud del camino de absorción y la concentración de la sustancia. La absortividad molar para el scFv se calculó con el software Vector NTI® (Life Technologies Corporation).
La medición de la absorbancia de UV se realizó con el lector Infinity M200 Pro equipado con placa Nanoquant (Tecan Group Ltd.). La absorbancia de las muestras de proteínas se midió a 280 nm y 310 nm, sirviendo esta última longitud de onda como señal de referencia que se restaba de la señal de 280 nm. Para tener en cuenta las posibles interferencias de la matriz de la muestra, se realizó una resta del blanco en cada medición. La señal de absorbancia final de una muestra de proteína obtenida se utilizó para calcular la concentración de proteína mediante la ley de Lambert-Beer.
Todas las mediciones se realizaron dentro del intervalo dado por las características técnicas de los instrumentos en el intervalo de medición de 0-4 DO, en el que el fabricante indica una reproducibilidad de <1 % y una uniformidad de <3 %.
2.2.3 SE-HPLC (cromatografía líquida de alta presión de exclusión por tamaño)
La SE-HPLC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida, tal como se describe en el capítulo 621 de la USP. Este procedimiento separa las moléculas en función de su tamaño y forma utilizando una fase estacionaria hidrófoba y una fase móvil acuosa. La separación de las moléculas se produce entre el volumen vacío (V0) y el volumen total de permeación (Vt) de una columna específica. Las mediciones por SE-HPLC se realizaron en un sistema HPLC Chromaster (Hitachi High-Technologies Corporation) equipado con inyección automática de muestras y un detector de UV ajustado a la longitud de onda de detección de 280 nm. El equipo se controla mediante el software EZChrom Elite (Agilent Technologies, versión 3.3.2 SP2), que también admite el análisis de los cromatogramas resultantes. Las muestras de proteínas se limpiaron por centrifugación y se mantuvieron a una temperatura de 6 °C en el automuestreador antes de la inyección. Para el análisis de las muestras de scFv, se empleó la columna Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., n.° F6989201) con una fase móvil salina tamponada normalizada (acetato de sodio 50 mM, pH 6,0, cloruro de sodio 250 mM) al caudal recomendado de 0,35 ml/min. La carga de muestra diana por inyección fue de 5 jg . Las muestras se detectaron mediante un detector de UV a una longitud de onda de 280 nm y los datos se registraron con un programa informático adecuado. Los cromatogramas resultantes se analizaron en el intervalo de V0 a Vt, excluyendo así los picos asociados a la matriz con un tiempo de elución >10 min.
Para asegurar la precisión intermedia del procedimiento, se midió de la forma habitual un patrón de referencia al principio y al final de cada secuencia de HPLC. El patrón de referencia utilizado para este ensayo de idoneidad del sistema fue un scFv que se había producido como un lote y se dividió en partes alícuotas para ser utilizado para cada punto temporal de medición.
2.2.4 DSF (fluorimetría diferencial de barrido)
El procedimiento DSF es un procedimiento no oficial para medir el desplegamiento de proteínas dependiente de la temperatura. Las mediciones de la temperatura de desplegamiento térmico mediante DSF se realizaron con una máquina qPCR MX3005P (Agilent Technologies) controlada con el paquete de software MX Pro (Agilent Technologies) y equipada con un filtro de excitación/emisión ajustado a 492/610 nm. Las reacciones se prepararon en placas PCR blancas Thermo fast 96 (Abgene; n.° AB-0600/W). Para la detección del desplegamiento de proteínas, se utilizó una solución madre disponibles en el mercado del colorante SYPRO naranja (Molecular Probes; n.° S6650) a una dilución final de 1:1000. Las muestras de proteínas se diluyeron para las mediciones de desplegamiento hasta una concentración final de 50 pg/ml en una solución salina tamponada normalizada. El desplegamiento térmico se llevó a cabo mediante un programa de temperatura que comenzaba a 25 °C y aumentaba hasta 96 °C en etapas de 1 °C con una duración de 30 segundos. Durante el programa de temperatura se registró la emisión de fluorescencia de cada muestra. Los datos brutos registrados se procesaron y evaluaron con un paquete de plantillas de Microsoft Excel (Niesen, Nature Protocols, 2007, vol. 2, n.° 9) y los datos de fluorescencia se ajustaron con una ecuación de Boltzmann utilizando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) para obtener el punto medio de transición (Tf).
Para producir mediciones fiables y robustas del punto medio de desplegamiento, se realizaron al menos mediciones por duplicado. Con respecto a la calidad de los datos, sólo se consideraron las mediciones con una bondad de ajuste (R2) >0,9900 y un intervalo de confianza del 95 % de la Tf inferior al 0,5 %.
Para una evaluación de la precisión intermedia, se incluyó un patrón de referencia (scFv caracterizado conocido) con cada medición para permitir la comparación del rendimiento del ensayo en diferentes días.
2.2.5 Estudio de estabilidad
Se diseñó un protocolo de estudio de estabilidad a corto plazo para evaluar la estabilidad de diferentes construcciones de scFv como indicador de la capacidad para poder desarrollar estas moléculas. Las construcciones de proteínas se concentraron en una formulación salina tamponada simple (véase más arriba) hasta alcanzar las concentraciones diana de 1 y 10 mg/ml. El contenido de monómeros se determinó mediante SE-HPLC para confirmar que la pureza superaba los criterios de éxito del >95 %. Posteriormente, las muestras de proteínas se almacenaron a <-65, -20, 4 y 37 °C durante 4 semanas y se analizaron partes alícuotas en distintos momentos. La lectura primaria es el análisis por SE-HPLC, que permite la cuantificación de oligómeros y agregados solubles de mayor peso molecular. Como medidas de apoyo, el contenido de proteínas se determinó por absorbancia de UV a 280 nm, lo que da una indicación de si durante el periodo de almacenamiento se perdieron cantidades sustanciales de proteínas por precipitación. Para el almacenamiento se utilizaron tubos con tapón de rosca (Sarstedt, n.° de catálogo 72.692.005) con cantidades de llenado de 30-1500 pg por parte alícuota. Además, la pureza se determinó mediante SDS-PAGE, que indica la estabilidad de la construcción con respecto a la degradación o la multimerización covalente.
Ejemplo 3: Generación de IgG y diacuerpos humanizados
La construcción de diacuerpo monocatenario se diseñó disponiendo los dominios variables en una configuración VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA. En estas construcciones, los dominios VLA y VHA y VLB y VHB forman conjuntamente el sitio de unión para TNFa. Se construyeron los conectores peptídicos L1-L3 que conectan los dominios variables a partir de repeticiones de glicina/serina. Los dos conectores cortos L1 y L3 están compuestos por una sola repetición G4S, mientras que el conector largo L2 está compuesto por la secuencia (G4S)4. Las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios variables humanizados (ejemplo 2; 1.2.1.) se sintetizaronde novoy se clonaron en un vector adaptado para la expresión enE. colique se basa en un esqueleto pET26b(+) (Novagen). La expresión y la purificación se realizó como se describe para los scFv en el ejemplo 2; 1.2.1.
La IgG humanizada se construyó clonando los dominios variables en un vector de expresión de mamífero adecuado para la expresión heteróloga transitoria que contenía una secuencia líder y los dominios constantes respectivos, por ejemplo, los vectores pFUSE-rlgG (Invivogen). La expresión transitoria de la IgG funcional se realizó mediante la cotransfección de vectores que codifican las cadenas pesada y ligera con el sistema FreeStyle™ MAX en células CHO S. Tras varios días de cultivo, se recuperó el sobrenadante de las células secretoras de anticuerpos para su purificación. Posteriormente, las IgG secretadas se purificaron por afinidad mediante Sepharose de proteína A (GE Healthcare). Las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE, absorbancia de UV a 280 nm y SE-HPLC.
Las afinidades de las moléculas de anticuerpo se determinaron utilizando un instrumento Biacore como se describe en el ejemplo 2 en 2.1.1).
Tabla 10
Las potencias de las moléculas de anticuerpo se determinaron en un ensayo de L929 (el procedimiento se describe en el ejemplo 2 en 2.1.2).
Tabla 11
Ejemplo 4: Determinación de la estequiometría de la unión al TNFa
La estequiometría de unión del 16-22-H5 al TNFa se determinó mediante SE-HPLC. Se incubaron 16-22-H5-scFv y TNFa en dos proporciones molares diferentes, a saber, en una proporción molar 1:1 y 4,5:1. Dado que el TNFa existe como trímero en solución, las proporciones molares indicadas se refieren al TNFatrímero. Así, en la proporción 4,5:1, el 16-22-H5-scFv está en exceso y debería ocupar todas las posiciones de unión al TNFatrímero, dando lugar a complejos de 1 TNFatrímero con 3 scFv. Sin embargo, en condiciones equimolares no hay suficiente scFv presente para saturar los 3 sitios teóricos de unión al TNFa. Por lo tanto, también se prevén variantes complejas con menos de 3 scFv unidos. Se incubaron TNFa y 16-22-H5-scFv durante 2 horas a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 min. Se analizaron 10 pl de cada muestra en SE-HPLC. El análisis SE-HPLC se realizó con tampón fosfato 50 mM, pH 6,5, NaCl 300 mM como eluyente a un caudal de 0,35 ml/min. Los picos de proteínas eluidas se detectaron a una longitud de onda de 280 nm. La columna se calibró previamente con el kit de calibración de filtración en gel de GE Healthcare (LMW, HMW) para la determinación de los pesos moleculares aparentes.
El panel inferior de la figura 12 muestra el perfil de elución con cantidades equimolares de scFv y TNFa que se superpone con los perfiles de TNFatrímero solo y scFv solo. Debido a la trimerización del TNFa en solución, teóricamente hay hasta tres sitios de unión equivalentes para el scFv presentes en cada trímero y, por lo tanto, las moléculas de scFv son limitantes. En estas condiciones se identificaron las tres especies complejas (3:1,2:1, 1:1). El panel superior de la figura 12 muestra el perfil de elución del complejo con cantidades en exceso de scFv. El excedente de scFv no unido eluyó en el tiempo de retención previsto. El pico de TNFa se consumió cuantitativamente para la formación de complejos y desapareció por completo. El pico de este complejo se desplazó hacia tiempos de retención más bajos, y se correlacionó bien con el tiempo de retención del pico de mayor peso molecular de la configuración equimolar. Por esta razón, se concluyó que todos los sitios de unión disponibles en el TNFa estaban ocupados por scFv y, por lo tanto, la estequiometría de unión es 3:1 (scFv:TNFa) si el scFv está disponible en exceso.
Además de estas observaciones cualitativas, también se calculó la estequiometría de unión aparente basándose en el Pm aparente del complejo 16-22-H5-scFv:TNFa determinado por SE-HPLC. Basándose en el tiempo de retención, se calculó que el Pm aparente era de 139,7 kDa. Según la siguiente ecuación (1), se calculó que la estequiometría de unión aparente era de 3,3. Esto se correlaciona bien con el número teórico de tres sitios de unión equivalentes disponibles para scFv en el TNFatrímero y con las observaciones anteriores en las que se determinó una estequiometría de unión 3:1.
Ecuación (1):estequiometría de unión (scFv: TNFa = Pm (ap-.del c o m p le io ) -P m (teór.del TNFa)
Pm (teór.del scFv)-
Ejemplo 5: Formación de complejos TNFa:anticuerpo (reticulación del TNFa)
La capacidad del 16-22-H5-scDb de unirse simultáneamente a dos moléculas de TNFa se ensayó en un instrumento Biacore T200 en tampón HEPES que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM y Tween al 0,05 %. El TNFa biotinilado (Aero Biosystems) se capturó mediante un oligo de ADNmc biotinilado utilizando el kit Biotin CAPture (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyectaron 0,25 jg/m l de TNFa biotinilado con un caudal de 10 |jl/min durante 3 min para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 300 UR (unidades de resonancia). Los anticuerpos 16-22-H5-scDb y 16-22-H5-scFv, como control, se inyectaron sobre la superficie inmovilizada de TNFa durante 2 min con un caudal de 30 jl/m in a una concentración de 90 nM. Tras la asociación de los fragmentos de anticuerpos, se inyectó TNFa (Peprotech) durante 5 min con un caudal de 30 jl/m in a 90 nM. Las concentraciones de anticuerpo y TNFa se seleccionaron cerca de la saturación de la unión. La medición se realizó a 25 °C. La figura 13 ilustra que el 16-22-H5-scDb bivalente es capaz de unirse a dos moléculas de TNFa simultáneamente mientras que, como era de esperar, el 16-22-H5-scFv monovalente se une sólo a una molécula de TNFa.
Además, se evaluó la formación de complejos TNFa-anticuerpo en diferentes proporciones de TNFa y formatos de anticuerpo 16-22-H5 usando SE-HPLC. Se incubaron 16-22-H5-IgG (150 kDa) y 16-22-H5-scDb (52 kDa) con TNFa (52 kDa) en diferentes proporciones molares (1:3, 1:1, 3:1) con respecto a los sitios de unión. Así, IgG y scDb tienen 2 sitios de unión y TNFa tiene 3 sitios de unión. Las mezclas de anticuerpo-TNFa se incubaron durante al menos 30 min a 37 °C, se enfriaron durante 10 min a temperatura ambiente y se almacenaron durante la noche a 2-8 °C. Se inyectaron de 5 a 10 ul de mezcla de proteínas con una concentración aproximada de 1 mg/ml en una columna TOSHO TSKgel UP-SW3000. El análisis se realizó con tampón fosfato 150 mM, pH 6,8, NaCl 100 mM como eluyente a un caudal de 0,3 ml/min. Los picos de proteínas eluidas se detectaron a una longitud de onda de 214 nm. La columna se calibró previamente con la mezcla patrón de proteínas BEH450 SEC (Waters) para la determinación de los pesos moleculares aproximados de los complejos. La figura 14A muestra la formación de complejos 16-22-H5-IgG:TNFa. Los complejos que son >600 kDa indican la formación de complejos formados por >2 moléculas de TNFa y >3 moléculas de IgG. La figura 14B muestra la formación de complejos 16-22-H5-scDb:TNFa. Los complejos que son >300 kDa indican la formación de complejos formados por >2 moléculas de TNFa y >3 moléculas de scDb.
Ejemplo 6: Inhibición de la proliferación celular
Se ensayó la capacidad de diferentes formatos de anticuerpos de 16-22-H5 y adalimumab para inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica ("peripheral blood mononuclear cells", PBMC) en una reacción linfocítica mixta ("mixed lymphocyte reaction", MLR). Se cultivaron PBMC de 2 donantes sanos (RPMI1640) en proporción 1:1 en placas de 96 pocillos durante 48 h a 37 °C/5 % de CO2. Tras la activación, las células se trataron con anticuerpos anti-TNFa o anticuerpo de control IgG (todos a una concentración final de 10 jg/m l) por sextuplicado durante 5 d más a 37 °C/5 % de CO2. Veinticuatro h antes del final de la incubación, se añadió BrdU (20 ul/pocillo) a cada pocillo y se determinó la proliferación midiendo la captación de BrdU mediante un ELISA de proliferación celular disponible en el mercado (Roche Diagnostics). El índice de estimulación se determinó calculando la proporción de captación de BrdU entre las células tratadas con anticuerpos y las tratadas con mitomicina C (25 ng/ml). La tabla 12 y la figura 15 ilustran que todos los formatos de anticuerpos ensayados de 16-22-H5 inhibieron significativamente la proliferación de linfocitos T de forma comparable al adalimumab.
Tabla 12
Ejemplo 7: Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS
Se sembraron monocitos CD14+ en RPMI1640 en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 16 h a 37 °C/5 % de CO2 en un incubador humidificado. A continuación, las células se trataron con anticuerpos anti-TNFa o anticuerpo de control IgG por duplicado durante 1 h utilizando concentraciones finales de anticuerpo que oscilaban entre 2 y 2000 ng/ml. Los monocitos se lavaron 3 veces con medio de cultivo celular y posteriormente se incubaron con LPS (100 ng/ml) durante 4 h a 37 °C/5%de CO2. Las concentraciones de IL-1p y TNFa en los sobrenadantes de los cultivos celulares se determinaron utilizando kits de ELISA disponibles en el mercado (R&D Systems). Los resultados se muestran en las tablas 13 y 14 y en las figuras 16A y B. La CI50 se determinó utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. En cuanto a la secreción de IL-1p, los valores de CI50 para 16-22-H5-lgG, 16-22-H5-scDb, 16-22 H5-scFv y adalimumab se resumen en la tabla 13 a continuación.
Tabla 13. Secreción de IL-1 p
En cuanto a la secreción de TNFa, los valores de CI50 determinados para 16-22-H5-lgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv se resumen en la tabla 14.
Tabla 14. Secreción de TNFa
Tabla 15. Secuencias consenso Vk1 (reordenadas)
Tabla 16: Secuencias del marco basadas en VA de la línea germinal
Claims (13)
1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse específicamente al factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional comprende (i) un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:14, y (ii) un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:13, y en el que la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento para discriminar entre el TNFa humano y el TNFp humano.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es una inmunoglobulina G (IgG).
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que la subclase de la IgG es IgGi.
4. El anticuerpo de la reivindicación 2 o 3, en el que cada cadena ligera de la IgG tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:52.
5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.
7. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o el vector o plásmido de la reivindicación 6.
8. Un procedimiento de preparación del anticuerpo o fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 7 en un medio en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional, y recuperar el anticuerpo o fragmento funcional de las células o del medio.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y opcionalmente un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. El anticuerpo o fragmento funcional como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio.
11. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según la reivindicación 10, en el que dicho trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.
12. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según la reivindicación 11, en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es la enfermedad inflamatoria intestinal.
13. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según la reivindicación 11 o 12, en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.
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