JP6708544B2 - 新規抗体フレームワーク - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は有利な特性を有する新規抗体フレームワークに関する。
本発明は有利な特性を有する新規抗体フレームワークに関する。
発明の背景
本発明は、高い安定性及び少ない凝集傾向のような有利な特性を有する、Ｖκ由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及びＶλ由来のフレームワーク領域ＩＶを含む、新規なキメラヒト抗体軽鎖フレームワークに関する。
本発明は、高い安定性及び少ない凝集傾向のような有利な特性を有する、Ｖκ由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及びＶλ由来のフレームワーク領域ＩＶを含む、新規なキメラヒト抗体軽鎖フレームワークに関する。
最初のモノクローナル抗体の開発から過去４０年で（“ｍＡｂｓ”； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ． ２５６ （１９７５） ４９５−７）、抗体は研究、診断及び治療目的のための生体分子のますます重要な種類となっている。はじめに、抗体は対応する目的の抗原で免疫動物からもっぱら得られた。非ヒト由来の抗体は、研究及び診断に用いることができるが、治療手段においては、人体は非ヒト抗体を異物として認識し、非ヒト抗体薬物に対して免疫応答を生じ得、それはほとんど効果的でないか効果的でない。したがって、遺伝子組み換え方法は、非ヒト抗体にほとんど免疫原生を与えないように設定されてきた。
非ヒトｍＡｂをほとんど免疫原性のない治療に変換する最初の試みは、動物（例えばげっ歯類）の可変ドメイン及びヒト定常領域からなるキメラ抗体の作成を伴った（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２， （１９８４） ６４３ − ６４６）。さらなるアプローチは ヒト可変ドメイン足場にＣＤＲを導入することによって（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３２１ （１９８６） ５２２ − ５２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２ （１９８８） ３２３−７）、又は、可変ドメインを変換する（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）こと（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ （１９９４） ９６９−９７３）によるげっ歯類ｍＡｂのヒト化を目的とした。
ＣＤＲループ移植（ＣＤＲ ｌｏｏｐ ｇｒａｆｔｉｎｇ）によるヒト化のため、ヒト受容体フレームワークは、ドナーフレームワークに対する相同性（例えばＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９ （１９９６） ８９５−９０４； ＷＯ／２００８／１４４７５７ （ウサギに関する））、又は、好ましい安定性プロフィール（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４ （２００４） １８４−１９９）に基づいて選択される。後者の概念は普遍的可変ドメインフレームワークでのウサギ抗体ヒト化のために利用されている。
いずれかの選択された方法によっても得られるｍＡｂ又は機能的フラグメントはドナーｍＡｂの所望の薬力学的特性を理想的に保持し、同時に、薬物様生物物理学的特性及び最少の免疫原性を示す。ｍＡｂ又はその機能的フラグメントの生物物理学的特性に関して、凝集の傾向は、主に以下の三つの理由により、治療的分子の開発可能性に関する主要な関心事であった。
第一に、タンパク質凝集は宿主内における、抗薬物抗体の形成及び、最終的には薬物中和抗体をもたらす、免疫応答を誘発するためのより高い可能性を一般的に示す（Ｊｏｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７ （２０１２） ２５２６６-２５２７９）。
第二に、凝集はそれらの除去のための高い労力に因り、製造収量に影響する（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ８ （２００６）， Ａｒｔｉｃｌｅ ６６）。
第三に、オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果が観察されることがある。オリゴマー形成に対する関心は、標的及びコンストラクト当たりただ一つの結合価を有する二重特異性（又は多重特異性）抗体型を含む、一価の結合が好ましい適用についてより一層明らかである。なぜならば、それらの場合におけるオリゴマー形成は、潜在的にオフターゲット効果をもたらす多価結合性を有するタンパク質凝集を生じるためである。そのような非特異的活性の例には、二重特異性抗体型の一本（鎖）ＣＤ３ε結合ドメインを有するコンストラクトの使用がある。そのような型は、例えば、がん抗原に対しては二つの結合ドメインの一つによって結合し、細胞障害性Ｔ細胞を救援するＣＤ３ε結合ドメインに対しては二つの結合ドメインの二つ目に結合し得る。一価のＣＤ３ε結合部分の架橋結合はＣＤ３εを介するシグナル伝達を誘導するために必要とされるので、Ｔ細胞は、標的細胞の表面に結合された複数の二重特異性コンストラクトによって結合されたときに、刺激されるにすぎないであろう、そして、そのため、架橋結合分子の性質を取り入れることは、もっぱらがん細胞に向けられる特定のＴ細胞応答を生じる。これに対して、そのようなコンストラクトのオリゴマーは架橋結合二重特異性抗体の性質を示し、それによって細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、がん細胞に結合しなかった場合であっても、それによって、Ｔ細胞の系統的な活性化をもたらす。そのようなＴ細胞の非特異的かつ系統的な活性化は、有害作用につながるサイトカインレベルの上昇を生じ得た。
さらに、クローニング、発現及び精製方法が標準化され得るので、信頼性があり、かつ、一般に適用可能なアクセプターフレームワークは、非ヒト抗体をヒト化する頑強な方法を可能にするために有益である。
非ヒトｍＡｂのヒト化についての上述の基準を満たすために、公表された方法論は、非ヒトの相補性決定領域の移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）のための受容体足場としての、ヒトコンセンサス可変ドメインフレームワーク配列の使用を提唱する。タンパク質中のそれぞれのアミノ酸位置について、タンパク質安定性に寄与する残基は進化の過程で生殖系配列のプールで豊富であるという推定に基づいて、得られるヒト化可変ドメインがそれぞれの可変ドメインファミリーのヒト生殖系列コンセンサス配列に近くなればなるほど、期待される安定性が高くなることは、共通の理解である。Ｓｔｅｉｐｅ（Ｓｔｅｉｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９４ ２４０ （１９９４） １８８−９２）によって記載され、Ｗｏｒｎ（Ｗｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０５ （２００１） ９８９−１０１０）により概説されているこの概念は、広く一般に受け入れられ、幅広い用途を見出す。非限定的な例は、（ａ）非ヒト抗体のヒト化のためのコンセンサス配列可変ドメインの使用（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ （１９９２） ４２８５−４２８９）；（ｂ）安定的な標的結合抗体のインビトロスクリーニングのためのＣＤＲライブラリを作成するためのコンセンサス配列可変ドメインの使用（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６ （２０００） ５７−−８６）；そして、（ｃ）非コンセンサス残基をコンセンサス残基に交換することによる、抗体可変ドメインの安定性を改善するための知識に基づいた方法（Ｓｔｅｉｐｅ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）、である。
加えて、種々の可変ドメインファミリーの安定性は、もっとも安定した可変重（鎖）ドメインであるＶＨ３について記載されている。重要なことに、可変軽鎖ドメインの場合にはＶλファミリーよりもむしろＶκファミリーが好ましい（Ｅｗｅｒｔ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）。特に、ＶＨ３及びＶκ１のヒトコンセンサス配列は、有利な生物物理学的特性を有し（Ｅｗｅｒｔ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）、非ヒト原料の抗体のヒト化に特に適している（Ｃａｒｔｅｒでの使用， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）と記述されてきた。
これに即して、ヒトＶκ１−ＶＨ３コンセンサスフレームワークｈｕ−４Ｄ５がげっ歯類及びうさぎ抗体のヒト化に用いられてきたという、いくつかの刊行物がある（Ｒａｄｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （２０００） １３６６８-１３６７６； ＷＯ／２００５／０１６９５０； ＷＯ ２００８／００４８３４）。あるいは、ｈｕ−４Ｄ５と同じファミリーに属する天然配列はウサギ起源由来の安定なヒト化一本鎖（ｓｃＦｖ）フラグメントを生成するために用いられてきた（ＵＳ ８，２９３，２３５； Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８５ （２０１０） ９０５４-９０６６）。
重要なことに、可変ドメインが定常ドメイン１に隣接し、かつ、定常ドメイン１に接している、完全長抗体の文脈で、自然選択が安定的な可変ドメインを常に進化させたことは注目すべきである。それゆえに、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントの文脈では、ある非コンセンサス残基は、単離された可変ドメインに対しより良い安定性を十分に与え得る。この仮説の裏付けとして、安定性に寄与する非コンセンサス突然変異が米国特許出願ＵＳ ２００９／００７４７８０に記載されている。
さらに、抗体安定性は、生産、精製、保存性及び、結果として、抗体治療のための製品価格にとって非常に重要である。それらの要素の１以上の軽微な改善でさえ、抗体薬物の研究開発が商業的に実現可能となるかという問題について、高度に関連し得る。
従って、非ヒト抗体からのヒト化抗体薬物の獲得に関する問題に取り組む多くの試みがなされてきたという事実にも関わらず、高い安定性及び少ない凝集傾向のような、有利な特性であって、できる限り免疫原性の配列を作成するリスクを減らすために、天然配列と比べた際に、ヒト抗体フレームワークができるかぎり少ない突然変異を含み、理想的には含まないとの特性を有する、新規ヒト抗体フレームワークを開発するための、大きな、未だ対処されていない要求が未だ残っている。そのような安定的なヒトフレームワークは、例えばループ移植によって、又は、単に親抗体と安定フレームワークとの間の安定性に寄与する構成要素を交換することにより、完全ヒト抗体又はそのフラグメントを安定化するために用いることもできる。
本発明により与えられるその問題の解決、すなわち、高い安定性及び少ない凝集傾向のような有利な特性を有する、Ｖκ由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及びＶλ由来のフレームワーク領域ＩＶを含む、新規なキメラヒト抗体軽鎖フレームワークは、これまで、先行技術により達成又は示唆されていない。
本発明は、高い安定性、少ない凝集傾向及び最少の免疫原性のような有利な特性を有する、Ｖκ由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及びＶλ由来のフレームワーク領域ＩＶを含む、新規なキメラヒト抗体軽鎖フレームワークに関する。
従って、第１の態様において、本発明は（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶを含む、抗体ＶＬドメインであって、該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系配列；
から選択され、
ｂ又はｃの場合に、フレームワーク領域ＩＶが配列ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）を有することを条件とし、
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない、
抗体ＶＬドメインに関する。
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系配列；
から選択され、
ｂ又はｃの場合に、フレームワーク領域ＩＶが配列ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）を有することを条件とし、
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない、
抗体ＶＬドメインに関する。
第２の態様において、本発明は、本発明に係る抗体ＶＬドメインを含む、単離された抗体又はその機能的フラグメントに関する。
第３の態様において、本発明は、本発明の単離された抗体又はその機能的フラグメント、並びに、必要に応じて薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
第４の態様において、本発明は、本発明のいずれか一つの抗体ＶＬドメイン、又は、本発明の単離された抗体もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列もしくは核酸配列の集合物、及び／又は本発明の第９の態様に係る方法によって得られる、核酸配列もしくは核酸配列（複数）に関する。
第５の態様において、本発明は、本発明の核酸配列又は核酸配列の集合物を含む、ベクター又はベクターの集合物に関する。
第６の態様において、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合物、又は本発明のベクターもしくはベクターの集合物を含む、宿主細胞、特に、発現宿主細胞に関する。
第７の態様において、本発明は、本発明のいずれか一つの抗体ＶＬドメイン、又は本発明の単離された抗体もしくはその機能的フラグメントの製造方法であって、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合物、又は本発明のベクターもしくはベクターの集合物、又は本発明の宿主細胞、特に、発現宿主細胞を発現するステップを含む、方法に関する。
第８の態様において、本発明は、ヒト化ウサギ抗体の作製方法であって、以下のステップ：
ａ）目的の抗原によるウサギの免疫化；
ｂ）少なくとも一つの目的の抗体の単離；及び
ｃ）本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列に対する、前記少なくとも一つの目的の抗体のＶＬ ＣＤＲ領域のクローニング、
を含む、方法に関する。
ａ）目的の抗原によるウサギの免疫化；
ｂ）少なくとも一つの目的の抗体の単離；及び
ｃ）本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列に対する、前記少なくとも一つの目的の抗体のＶＬ ＣＤＲ領域のクローニング、
を含む、方法に関する。
第９の態様において、本発明は、本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列、又は、本発明に係る単離された抗体もしくはその機能的フラグメントをコードする１以上の核酸配列の作製方法であって、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶをコードする、１以上の核酸配列を組み合わせることを含み、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列；
から選択され、
特に、上記作製方法は、以下の方法：
ｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に、組換えベクターにおいて、Ｖκフレームワーク領域をフレームワーク領域ＩＶによって置換し、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉ．１以上のステップにおいて、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を含む核酸構造物、特に組換えベクターに、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；並びに（ｉｉ）ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする１以上の核酸配列を挿入し、ここで、
前記フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列において、フレームワーク領域ＩＶを産生するために、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を突然変異させ、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；あるいは
ｉｖ．１以上のステップにおいて、ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ、ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＩＶを含む、軽鎖ドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に組換えベクターにおいて、目的の抗体由来の対応するＣＤＲドメイン（複数）をコードする核酸配列（複数）によって前記ＣＤＲドメインをコードする１以上の核酸配列を置換すること、ここで、
前記フレームワーク領域は、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択される、
のうちの一つが用いられる、方法に関する。
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列；
から選択され、
特に、上記作製方法は、以下の方法：
ｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に、組換えベクターにおいて、Ｖκフレームワーク領域をフレームワーク領域ＩＶによって置換し、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉ．１以上のステップにおいて、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を含む核酸構造物、特に組換えベクターに、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；並びに（ｉｉ）ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする１以上の核酸配列を挿入し、ここで、
前記フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列において、フレームワーク領域ＩＶを産生するために、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を突然変異させ、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；あるいは
ｉｖ．１以上のステップにおいて、ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ、ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＩＶを含む、軽鎖ドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に組換えベクターにおいて、目的の抗体由来の対応するＣＤＲドメイン（複数）をコードする核酸配列（複数）によって前記ＣＤＲドメインをコードする１以上の核酸配列を置換すること、ここで、
前記フレームワーク領域は、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択される、
のうちの一つが用いられる、方法に関する。
発明の詳細な説明
非ヒト抗体のヒト化／安定化、又は、ヒト抗体の安定化のための、ヒトフレームワークを作成するための従前の手法と比較した、本発明の特性は、本発明が、改善されたタンパク質安定性及び少ない凝集傾向を有する、κ−λキメラ可変軽（鎖）ドメインをもたらす、λ連結セグメント（フレームワーク領域ＩＶ）によるκ可変軽（鎖）ドメイン中のκ連結セグメントの置換に関する、という事実である。それは、タンパク質安定性をさらに向上するため及び凝集傾向をさらに少なくするために、位置ＡＨｏ１０１におけるκコンセンサス残基（フレームワーク領域ＩＩＩ）の突然変異、及び、κ−λキメラ可変軽（鎖）ドメイン中のλ連結セグメントのパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）を支持するためのλコンセンサス残基による置換にさらに関する。
非ヒト抗体のヒト化／安定化、又は、ヒト抗体の安定化のための、ヒトフレームワークを作成するための従前の手法と比較した、本発明の特性は、本発明が、改善されたタンパク質安定性及び少ない凝集傾向を有する、κ−λキメラ可変軽（鎖）ドメインをもたらす、λ連結セグメント（フレームワーク領域ＩＶ）によるκ可変軽（鎖）ドメイン中のκ連結セグメントの置換に関する、という事実である。それは、タンパク質安定性をさらに向上するため及び凝集傾向をさらに少なくするために、位置ＡＨｏ１０１におけるκコンセンサス残基（フレームワーク領域ＩＩＩ）の突然変異、及び、κ−λキメラ可変軽（鎖）ドメイン中のλ連結セグメントのパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）を支持するためのλコンセンサス残基による置換にさらに関する。
従って、第１の態様において、本発明は（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶ、を含む抗体ＶＬドメインであって、該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系配列；
から選択され、
ｂ又はｃの場合に、フレームワーク領域ＩＶが配列ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）を有することを条件とし、
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない、
抗体ＶＬドメインに関する。
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系配列；
から選択され、
ｂ又はｃの場合に、フレームワーク領域ＩＶが配列ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）を有することを条件とし、
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない、
抗体ＶＬドメインに関する。
本発明の文脈において、クローン３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔは、Ｂｏｒｒａｓら（ｌｏｃ． ｃｉｔ．）のクローンリストを言う。これらクローンは、ＶＬドメインＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の変異体であって、それらは、表５に示すように、ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）のＶＬフレームワーク領域とは、ＶＬフレームワーク領域におけるある一定の位置において異なる。
特定の実施態様においては、前記フレームワーク領域ＩＶはＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）ではない。
本発明の文脈において、用語「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＢ、ＩｇＡ及びＩｇＤ（又はそれらのいずれかのサブクラス）に属するタンパク質として定義される、「イムノグロブリン」（Ｉｇ）の同義語として用いられ、すべての慣習的に知られている抗体及びその機能的フラグメントを含む。抗体／イムノグロブリンの「機能的フラグメント」は、抗原結合領域を保持する、抗体／イムノグロブリンの断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、抗体の１以上の超可変領域（複数）、すなわち、ＣＤＲ−１、−２及び／又は−３領域に一般的にみられるが、可変「フレームワーク」領域は、例えばＣＤＲに対する足場を提供することによって、抗原結合における重要な役割を果たすこともできる。
本発明の文脈においては、別段明確に言及しない限りは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎにより提唱されたナンバリングシステムが用いられ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９ （２００１） ６５７−６７０）、さらに、以下の残基：ＣＤＲ−Ｌ１：Ｌ２４−Ｌ４２；ＣＤＲ−Ｌ２：Ｌ５８−Ｌ７２；ＣＤＲ−Ｌ３：Ｌ１０７−Ｌ１３８；ＣＤＲ−Ｈ１：Ｈ２７−Ｈ４２；ＣＤＲ−Ｈ２：Ｈ５７−Ｈ７６；ＣＤＲ−Ｈ３：Ｈ１０９−Ｈ１３８はＣＤＲ領域として定義される。好ましくは、「抗原結合領域」は少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４から１４９及び可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５から１４９を含み、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３から１４９及びＶＨのアミノ酸残基４から１４６を含み、ＶＬ及びＶＨ鎖（図２に従いナンバリングする、ＶＬのアミノ酸位置１から１４９及びＶＨのアミノ酸位置１から１４９）が特に好ましい。フレームワーク及びＣＤＲ領域は図２に示される。本発明の使用に好ましいイムノグロブリンのクラスはＩｇＧである。本発明の「機能的フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖのドメインを含む。Ｆ（ａｂ’）２ 又はＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にする又は完全に除去するように設計され得る。本発明の抗体及びその機能的フラグメントは、段落［００５５］から［００５８］おいてさらに述べるように、二官能性又は多官能性コンストラクトの一部であってよい。
本発明の文脈において、用語「Ｖκ」及び「Ｖλ」は、配列の同一性及び相同性により分類される抗体軽鎖配列のファミリーを言う。例えば、ＢＬＯＳＵＭ等の相同性検索マトリックスを用いることによる配列の相同性の測定方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ． ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｊ． Ｇ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ （１９９２） １０９１５−１０９１９）、及び、相同性による配列の分類方法は、当業者に周知である。ＶκとＶλのいずれについても、異なるサブファミリーを同定することができる（例えば、Ｖκ１からＶκ４ のＶκ及びＶλ１からＶλ３のＶλを分類する、Ｋｎａｐｐｉｋ、ｌｏｃ． ｃｉｔ．を参照）。
本発明の文脈において、用語「クローンのリスト：．．．にみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列」は、（ｉ）前記リストに含まれるすべての配列において所定の位置に存在するアミノ酸残基（Ｂｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．参照）、又は、（ｉｉ）Ｂｏｒｒａｓにより最適化されてきた位置について（Ｂｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）、前記配列の多様化された位置の一つに存在するアミノ酸残基のうちいずれか一つ（Ｂｏｒｒａｓによる、位置１５、２２、４０、４９、５８、６９、７０、７２、７４、７７、７９及び８１（Ｂｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）であって、ＡＨｏ位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９に相当する）、のいずれかを用いることにより作成され得る配列を言う。
本発明の一の実施態様において、フレームワーク領域ＩＩＩにおける位置ＡＨｏ１０１（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎのナンバリングシステムによる位置１０１）のアミノ酸残基は、ヒトＶλコンセンサス配列の該位置に存在するアミノ酸残基であり、特に、前記アミノ酸残基はフェニルアラニンとは異なり、より特には、前記アミノ酸残基はグルタミン酸である。
本発明の一の実施態様において、前記Ｖκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３及びＶκ４、特にＶκ１から選択される、Ｖκドメインサブファミリーに属する。
本発明の文脈において、Ｖκドメインサブファミリーは、配列番号２３から２６に示されるコンセンサス配列によって表される。所定の抗体可変軽鎖ドメインは、段落［００３９］に記載の方法を用いた際に、前記Ｖκドメインサブファミリーと最も高度な配列の相同性を示す場合、Ｖκドメインサブファミリーに属しているとみなされる。
特定の実施態様において、Ｖκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、（ａ）最も近いヒト生殖配列、又は（ｂ）配列番号２３から２６を有するコンセンサス配列の一つ、特に配列番号２３と比較して５以下の突然変異を含み、特に、（ａ）最も近いヒト生殖配列、又は（ｂ）配列番号２３から２６を有するコンセンサス配列の一つ、特に配列番号２３と比較して、５未満、４未満、３未満、特にただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない。
本発明の一の実施態様において、前記Ｖκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号２及び配列番号８から選択される配列、特に配列番号８の配列に存在するフレームワーク領域である。
本発明の一の実施態様において、前記ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、（ｉ）目的の抗原に対して特異性を有する親非ヒト抗体由来、特に親ウサギ抗体由来又は親げっ歯類抗体、特に親マウスもしくはラット抗体由来のＣＤＲドメイン ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉ）Ｖκドメインを含む親ヒト抗体又は親ヒト化抗体由来、特に、治療のために認可され、又はその他の商業化されている抗体由来のＣＤＲドメイン ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のＣＤＲドメイン、特に、（ｉ）又は（ｉｉ）の１以上のＣＤＲドメインの最適化により得られたＣＤＲドメインに由来するＣＤＲドメイン ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）の１以上のＣＤＲドメインにより置換されることになるＣＤＲドメイン、から独立して選択される。
本発明の一の実施態様において、フレームワーク領域ＩからＩＶは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択された配列にみられるフレームワーク領域の組み合わせである。
第２の態様において、本発明は、本発明に係る抗体ＶＬドメインを含む、単離された抗体又はその機能的フラグメントに関する。
特定の実施態様において、抗体ＶＬドメインは目的の標的に対する結合特異性を有する。
結合特異性は絶対的ではなく、相対的な性質であるので、本明細書で使用される、結合分子は、そのような結合分子が以下の標的分子と１以上の基準分子（複数）とを識別可能な時は、標的、例えばヒトＣＤ３「に対し／に特異的」、（標的）「を特異的に認識する」又は（標的）「に特異的に結合する」。その最も一般的な形式（及び定義されていない基準が述べられている場合）において、「特異的な結合」は、例えば、当該技術分野において知られる特異性アッセイ方法に従って測定される、目的の標的生体分子と関連のない生体分子とを識別する結合分子の能力を指している。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡテスト及びペプチドスキャンを含むが、それらに限られない。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイが行われ得る。スコアリングは標準発色展開によって行われるであろう（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを有する二次抗体及びテトラメチルベンジジンと過酸化水素）。あるウェルにおける反応は、例えば４５０ｎｍにおけるような、光学密度によりスコアされる。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は約０．１ＯＤであり、典型的な陽性反応は約１ＯＤであろう。これは、陽性スコアと陰性スコアとの比率が１０倍以上となり得ることを意味する。一般的に、結合特異性の測定は、単一の基準生体分子ではなく、粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリン等のような、約３から５の関連のない生体分子の一組を用いることにより行われる。
本発明の文脈において、用語「約」又は「おおよそ」は、所定の数値又は範囲の、９０％と１１０％の間を意味する。
しかしながら、「特異的な結合」は、標的生体分子と、基準点として用いられる１以上の密接に関連する生体分子（複数）とを識別する結合分子の能力をも言うこともある。さらに、「特異的な結合」は、例えば標的生体分子の異なるドメイン、領域又はエピトープのような、その標的抗原の異なる部分を識別し、もしくは、標的生体分子の１以上の重要なアミノ酸残基又は一続きのアミノ酸残基を識別する、結合分子の能力と関係することがある。
本発明の文脈において、用語「エピトープ」は標的生体分子と結合分子との間の特異的な結合に必要とされる、所定の標的生体分子の部分を言う。エピトープは連続、すなわち、標的生体分子に存在する隣接した構成要素によって構成されてよく、又は、不連続、すなわち、標的としてのタンパク質のアミノ酸配列内のような、標的生体分子の主要な配列内の異なる位置にあるが、体液内等の、標的生体分子がとる三次元構造において、非常に近接している、構成要素によって構成されてもよい。
本発明の一の実施態様において、単離された抗体又はその機能的フラグメントは、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ及びｓｃＦｖフラグメントから選択される。
本発明の他の特定の実施態様において、単離された抗体又はその機能的フラグメントは、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、鎖状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞誘導（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ；タンデム ジ−ｓｃＦｖ）、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ−ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合物、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ 融合物、例えば、ｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）、並びにノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ 技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）及びデュオボディ（デュオボディ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）からなる群から選ばれた抗体型である、二重特異性コンストラクトである。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂは、本明細書で使用するために特に好適である。
二重特異性ｓｃＤｂ、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂは、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢ又はＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢの順にリンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３によって結合された、二つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はそのフラグメント及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はそのフラグメントを特に含み、ここで、ＶＬＡ及びＶＨＡドメインは第一の抗原に対する抗原結合部位を共に形成し、ＶＬＢ及びＶＨＢは第二の抗原に対する抗原結合部位を共に形成する。
リンカーＬ１は特に２から１０アミノ酸のペプチドであり、さらに特には３から７アミノ酸、そして最も特には５アミノ酸のペプチドであり、Ｌ３リンカーは特に１から１０アミノ酸のペプチドであり、より特には２から７アミノ酸、そして最も特には５アミノ酸のペプチドである。中間のリンカーＬ２は特に１０から４０アミノ酸のペプチドであり、さらに特には１５から３０アミノ酸、最も特には２０から２５アミノ酸のペプチドである。
本発明の二重特異性コンストラクトは、当該技術分野において既知のいずれの簡便な抗体製造方法を用いることによって製造することができる（例えば、二重特異性コンストラクトの製造に関してはＦｉｓｃｈｅｒ， Ｎ． ＆ Ｌｅｇｅｒ， Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４ （２００７） ３−１４ ； 二重特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖｓに関してはＨｏｒｎｉｇ， Ｎ． ＆ Ｆａｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９０７ （２０１２）７１３−７２７、及びＷＯ ９９／５７１５０を参照）。本発明の二重特異性コンストラクトの調製のための好適な方法の具体例は、とりわけ、ゲンマブ（Ｇｅｎｍａｂ）（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０ （２０１３） ５１４５−５１５０参照）及びメラス（Ｍｅｒｕｓ）（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６ （２０１０） ７４１−７５０参照）の技術をさらに含む。機能的抗体Ｆｃ部を含む二重特異性抗体の製造方法もまた、当該技術分野において知られている（例えばＺｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ８６ （１９９４） １２７−１３４）；及びＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１ （１９８６） ２１０−２２８参照）。
それらの方法は、モノクローナル抗体の生成、例えば、ハイブリドーマ技術を用いて所望の抗原で免疫されているマウス由来の脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合する方法（例えばＹｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ｕｎｉｔ ２．５， ２００６参照）、又は、組換え抗体技術（レパートリークローニング又はファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えばＣｈａｍｅｓ ＆ Ｂａｔｙ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １８９ （２０００） １−８参照）、そして、既知の分子クローニング手法を用いて二重特異性コンストラクトを与えるための、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインもしくはフラグメント又はそれらの一部の組み合わせを典型的に含む。
本発明の一の実施態様において、単離された抗体又はその機能的フラグメントは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５及びＶＨ６から選択されるＶＨドメインサブファミリーに属するＶＨドメインを含み、特にＶＨドメインサブファミリーＶＨ３又はＶＨ４、特にはＶＨドメインサブファミリーＶＨ３に属するＶＨドメインを含む。
本発明の文脈において、ＶＨドメインサブファミリーは、配列番号２７から３３に示されるコンセンサス配列によって表される。所定の抗体可変重鎖ドメインは、段落［００３９］に記載の方法を用いた際に、前記ＶＨドメインサブファミリーと最も高度な配列相同性を示す場合、ＶＨドメインサブファミリーに属しているとみなされる。
特定の実施態様において、ＶＨドメインは（ａ）最も近いヒト生殖配列、又は（ｂ）配列番号２８から３４を有するコンセンサス配列の一つ、特に配列番号３０と比較して５以下の突然変異を含み、特に、（ａ）最も近いヒト生殖配列、又は（ｂ）配列番号２７から３３を有するコンセンサス配列の一つ、特に配列番号３０と比較して、５未満、４未満、３未満、特にただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない。
第３の態様において、本発明は、本発明の単離された抗体又はその機能的フラグメント、並びに、必要に応じて薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
第４の態様において、本発明は、本発明のいずれか一つの抗体ＶＬドメイン、又は、本発明の単離された抗体もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列もしくは核酸配列の集合物、及び／又は本発明の第９の態様に係る方法によって得られる、核酸配列もしくは核酸配列（複数）に関する。
第５の態様において、本発明は、本発明の核酸配列又は核酸配列の集合物を含む、ベクター又はベクターの集合物に関する。
第６の態様において、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合物、又は本発明のベクターもしくはベクターの集合物を含む、宿主細胞、特に、発現宿主細胞に関する。
第７の態様において、本発明は、本発明のいずれか一つの抗体ＶＬドメイン、又は本発明の単離された抗体もしくはその機能的フラグメントの製造方法であって、本発明の核酸配列もしくは核酸配列の集合物、又は本発明のベクターもしくはベクターの集合物、又は本発明の宿主細胞、特に、発現宿主細胞を発現するステップを含む、方法に関する。
第８の態様において、本発明は、ヒト化ウサギ抗体又はげっ歯類抗体、特にマウスもしくはラット抗体の作製方法であって、以下のステップ：
ａ）目的の抗原によるウサギ又はげっ歯類、特にマウスもしくはラットの免疫化；
ｂ）少なくとも一つの目的の抗体の単離；及び
ｃ）本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列に対する、前記少なくとも一つの目的の抗体のＶＬ ＣＤＲ領域のクローニング、
を含む、方法に関する。
ａ）目的の抗原によるウサギ又はげっ歯類、特にマウスもしくはラットの免疫化；
ｂ）少なくとも一つの目的の抗体の単離；及び
ｃ）本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列に対する、前記少なくとも一つの目的の抗体のＶＬ ＣＤＲ領域のクローニング、
を含む、方法に関する。
特定の実施態様において、ヒト化ウサギ抗体を作製する際に、前記抗体ＶＬドメインのフレームワーク領域ＩＶはＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）ではない。
特定の実施態様において、本発明の方法は、以下の１以上のステップ：
ａａ．特に、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いることにより、目的の抗原と相互作用する親和性成熟メモリーＢ細胞のクローン単離；
ａｂ．単一のＢ細胞クローンの不死化を必要としない共培養システムにおける、単一のＢ細胞の培養；
ａｃ．目的の抗原に結合する少なくとも１つの抗体を同定するための、細胞ベースのＥＬＩＳＡでのＢ細胞培養上清のスクリーニング；及び／又は
ａｄ．ヒト抗体ＶＨドメインをコードする核酸配列に対する、少なくとも１つの抗体のＶＨ ＣＤＲ領域のクローニング、
をさらに含む。
ａａ．特に、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いることにより、目的の抗原と相互作用する親和性成熟メモリーＢ細胞のクローン単離；
ａｂ．単一のＢ細胞クローンの不死化を必要としない共培養システムにおける、単一のＢ細胞の培養；
ａｃ．目的の抗原に結合する少なくとも１つの抗体を同定するための、細胞ベースのＥＬＩＳＡでのＢ細胞培養上清のスクリーニング；及び／又は
ａｄ．ヒト抗体ＶＨドメインをコードする核酸配列に対する、少なくとも１つの抗体のＶＨ ＣＤＲ領域のクローニング、
をさらに含む。
ウサギ抗体又はげっ歯類抗体のヒト化方法は、当業者によく知られている（例えば、２００２年１０月１８日にオンラインで発行されたＢｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｅｘｐｒｅｓｓ ａｒｔｉｃｌｅ １０．１０９６／ｆｊ．０２−０２８１ｆｊｅ； Ｙｕ ｅｔ ａｌ （２０１０） Ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ Ｒａｂｂｉｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（２）： ｅ９０７２． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００９０７２参照）。ウサギ又はげっ歯類の免疫化は、タンパク質のようなそれ自体が目的の抗原を用いて行われるか、もしくは、ペプチド又はタンパク抗原の場合、例えば目的のペプチド又はタンパク質をコードするプラスミドのような核酸によるウサギのＤＮＡ免疫によって行われることがある。
第９の態様において、本発明は、本発明に係る抗体ＶＬドメインをコードする核酸配列、又は、本発明に係る単離された抗体もしくはその機能的フラグメントをコードする１以上の核酸配列の作製方法であって、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶをコードする、１以上の核酸配列を組み合わせることを含み、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列；
から選択され、
特に、上記作製方法は、以下の方法：
ｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に、組換えベクターにおいて、Ｖκフレームワーク領域をフレームワーク領域ＩＶによって置換し、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉ．１以上のステップにおいて、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を含む核酸構造物、特に組換えベクターに、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；並びに（ｉｉ）ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする１以上の核酸配列を挿入し、ここで、
前記フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列において、フレームワーク領域ＩＶを産生するために、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を突然変異させ、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；あるいは
ｉｖ．１以上のステップにおいて、ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ、ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＩＶを含む、軽鎖ドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に組換えベクターにおいて、目的の抗体由来の対応するＣＤＲドメイン（複数）をコードする核酸配列（複数）によって前記ＣＤＲドメインをコードする１以上の核酸配列を置換すること、ここで、
前記フレームワーク領域は、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択される、
のうちの一つが用いられる、方法に関する。
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列；
から選択され、
特に、上記作製方法は、以下の方法：
ｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に、組換えベクターにおいて、Ｖκフレームワーク領域をフレームワーク領域ＩＶによって置換し、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉ．１以上のステップにおいて、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を含む核酸構造物、特に組換えベクターに、（ｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；並びに（ｉｉ）ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする１以上の核酸配列を挿入し、ここで、
前記フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；
ｉｉｉ．ヒト又はヒト化Ｖκドメインをコードする核酸配列において、フレームワーク領域ＩＶを産生するために、フレームワーク領域ＩＶをコードする核酸配列を突然変異させ、ここで、
該フレームワーク領域ＩＶは、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択され；あるいは
ｉｖ．１以上のステップにおいて、ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ、ＣＤＲ ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＩＶを含む、軽鎖ドメインをコードする核酸配列を含む核酸構築物、特に組換えベクターにおいて、目的の抗体由来の対応するＣＤＲドメイン（複数）をコードする核酸配列（複数）によって前記ＣＤＲドメインをコードする１以上の核酸配列を置換すること、ここで、
前記フレームワーク領域は、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特に配列番号１６から２２から選択されたＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλ系配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特に配列番号１６及び１７から選択されたＶλコンセンサス配列であるＶλ系配列；及び、
ｃ．Ｖλ系塩基配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλ系塩基配列
から選択される、
のうちの一つが用いられる、方法に関する。
本発明の方法の特定の実施態様において、（ｂ）又は（ｃ）の場合に、フレームワーク領域ＩＶは配列ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）を有し、
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない。
（ｗ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域とは異なり；
（ｘ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、クローンのリスト： ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）、３７５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５０９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５１１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５６７−ＦＷ１．４ｏｐｔ、５７８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１−ＦＷ１．４ｏｐｔ、８−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、１９−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３４−ＦＷ１．４ｏｐｔ、３５−ＦＷ１．４ｏｐｔ、４２−ＦＷ１．４ｏｐｔ、及び４３−ＦＷ１．４ｏｐｔにみられるフレームワーク領域の配列から置換によって得られる配列とは異なり；
（ｙ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列ＦＷ１．４ｇｅｎ（配列番号４）の位置１５、２２、４８、５７、７４、８７、８８、９０、９２、９５、９７及び９９（ＡＨｏ ナンバリング）の１以上における突然変異によって得られる配列とは異なり；又は、
（ｚ）前記ヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号８を有するヒトＶκ配列内の各領域と比較して、５以下の突然変異を含み、特に、配列番号８を有するヒトＶκ配列と比較して、５未満、４未満、３未満、特に、ただ一つの突然変異を含むか、又は突然変異を含まない。
特定の実施態様において、１以上の前記ＣＤＲドメイン（複数）がウサギ起源のものである場合は、前記フレームワーク領域ＩＶはＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１５）ではない。
以下の実施例はその範囲を限定することなく本発明を説明する。
実施例１： 代表的なウサギＣＤＲを有するｓｃＦｖコンストラクトの構築
変性及び凝集傾向に関して改善された安定性を示す可変ドメインを同定することは我々の目的であった。加えて、これらドメインは、ヒトにおける免疫応答を誘発するリスクを最小限にするために、ヒト生殖系レパートリーとできる限り近くあるべきである。驚いたことに、コンセンサスＶκ１由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及び異なるＶλドメイン由来のフレームワーク領域ＩＶ（図１参照）から構成されるキメラＶＬ ドメインを有するＶＨ３コンセンサスフレームワークの組み合わせは、結果として、優れた生物物理学的特性のｓｃＦｖコンストラクトとなることを我々は発見した。
変性及び凝集傾向に関して改善された安定性を示す可変ドメインを同定することは我々の目的であった。加えて、これらドメインは、ヒトにおける免疫応答を誘発するリスクを最小限にするために、ヒト生殖系レパートリーとできる限り近くあるべきである。驚いたことに、コンセンサスＶκ１由来のフレームワーク領域ＩからＩＩＩ及び異なるＶλドメイン由来のフレームワーク領域ＩＶ（図１参照）から構成されるキメラＶＬ ドメインを有するＶＨ３コンセンサスフレームワークの組み合わせは、結果として、優れた生物物理学的特性のｓｃＦｖコンストラクトとなることを我々は発見した。
我々の発明の出発点は、１９９２年にすでに公表されたようなヒトＶＨ３及びＶκ１コンセンサスフレームワークＨｕ−４Ｄ５であった（Ｃａｒｔｅｒ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）。我々は代表的なウサギ抗ＴＮＦα抗体のＣＤＲ（ＷＯ／２００９／１５５７２３）を記載（Ｒａｄｅｒ ２０００， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； ＷＯ ２００５／０１６９５０； ＷＯ ２００８／００４８３４）の通りｈｕ−４Ｄ５可変ドメインに移植した。ヒト化可変ドメインは、前記文献中、Ｂｏｒｒａｓによって記載の通りフレキシブルなペプチドリンカーによって結合され、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント（ｓｃＦｖ１）を生じた。
ｈｕ−４Ｄ５に加えて、別の公表されたフレームワークの解決方法が試験された、すなわち、広範な生物物理学的データが公表されている（Ｂｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）、フレームワークＦＷ１．４ｇｅｎ（ｓｃＦｖ２）である。ｈｕ−４Ｄ５と比較したときに、フレームワークＦＷ１．４ｇｅｎは、いくつかのアミノ酸置換を含み、それによってヒトコンセンサスから外れる（ｄｅｖｉａｔｉｎｇ）。ＶＨにおいて、そのような違いはおそらく親和性成熟に起因し、一方で、それは、生殖系配列よりもむしろ体細胞高頻度突然変異を経た成熟抗体の配列を含むヒトｃＤＮＡライブラリーに由来するためであり、他方では、いくつかの突然変異が、ウサギＣＤＲを順応させることを目的として、筆者らにより導入されているためである。ＶＬにおいては、突然変異は導入されていないか、又はほんのわずかな突然変異が計画的に導入されており、最大の相違点は、体細胞高頻度突然変異に用いられる生殖系配列によって生じるか、又は、おそらく、ライブラリークローニング方法により生じる人為的結果である、ということを示唆している。
ｈｕ−４Ｄ５又はＦＷ１．４ｇｅｎ（それぞれｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２）のいずれかにもとづく、２つのコンストラクトの熱変性の実験的測定は、そのフレームワークがヒトコンセンサス配列に高い相同性を有するｓｃＦｖ１の優れた性能を示した、したがって、文献と一致している。驚いたことに、この優れた安定性は、ストレス条件下における保存中の単分散性については、より高い安定性に変換されなかった（表４参照）。これに対して、ｓｃＦｖ２は本実施例では、より良い安定性を示した。
安定性において観察された違いを合理的に説明する試みの中で、フレームワーク内の配列変異は、より厳密に調べられた。フレームワークＩＶ領域の５アミノ酸領域は、ＦＷ１．４ｇｅｎにおけるＶκ１のコンセンサス配列に変換されたとき（ｓｃＦｖ３）、ストレス安定性試験において、単量体状態の安定性障害をもたらしたことが明らかにされた（図３参照）。
この発見は大いに予想外であった。なぜなら、それは、Ｖκ１の場合、コンセンサス配列は、各可変ドメインの安定性に関して最も支持された解決を提示したであろう、という共通の理解と矛盾するためである。この発見に基づいて、我々は、モデル系におけるドメイン安定性の決定因子をさらに調査することに着手した。ＦＷ１．４のフレームワーク領域ＩＶにおける５アミノ酸が、κタイプよりもむしろλタイプフレームワーク領域ＩＶ配列と似ている、連結セグメント（フレームワーク領域ＩＶ）を形成したので、我々は、λタイプ連結セグメントは、Ｖκ１−ＶＨ３可変ドメインの安定性について、κタイプ連結セグメントよりも有利であろうと仮定した。
実際、我々は、対応するＶλフレームワーク領域によるＶκ１フレームワーク領域ＩＶのすべての置換は（ｓｃＦｖ５、ｓｃＦｖ９）、熱変性の中点（表３）と、ストレス安定性試験中の単量体状態の安定性（表４）のいずれの点でも、ｓｃＦｖ１又はｓｃＦｖ２と比較して、有利な安定性プロフィールをもたらした、ということを発見した。さらに、Ｖκ１コンセンサスフレームワークのバックグラウンドへの、異なる切断Ｖλフレームワーク領域ＩＶ生殖系モチーフの導入は（ｓｃＦｖ７、ｓｃＦｖ１０）、いくらかの安定効果を示した。重要なことに、本手法ではすべての個々のフレームワーク領域は、生殖系又は生殖系コンセンサスと同一のままであるので、Ｖλ領域ＩＶによるＶκ１フレームワーク領域ＩＶのすべての置換は、免疫原性となる、より低い可能性を有する。
加えて、フレームワークＩＩＩにおける位置ＡＨｏ１０１は、フレームワーク領域ＩＶのパッキングに寄与することになるＶκ及びＶλ可変ドメインの構造モデルの比較によって同定された（図４）。該位置におけるＶλコンセンサス残基の導入は（ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ６、ｓｃＦｖ８）、熱変性（表３）及びストレス安定性（表４）におけるドメイン安定性のさらなる増大をもたらした。
要約すると、ｓｃＦｖ可変ドメインコンストラクトの文脈において、優れた安定性プロフィールは、異なるＶλ生殖系遺伝子由来のコンセンサスフレームワーク領域ＩＶと、Ｖκ配列のフレームワーク領域ＩからＩＩＩとを組み合わせることによって成し遂げられることが見出されている。これら人工及びキメラの可変ドメインの安定性は、可変軽（鎖）ドメインのフレームワーク領域ＩＩＩにおける、フレームワーク領域ＩＶと空間的に非常に近接している位置の、改変Ｆ１０１Ｅ（ＡＨｏナンバリング体系による）によってさらに改善される。
重要なことに、公表されている事例（Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２５ （２０１２） ４８５-５０５）に基づいて、可変ドメインの好ましい特性は、他の抗体型にも変換する（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）ことが予測される。
Ｂｏｒｒａｓらによって公表されているＣＤＲ定義を用いて（Ｂｏｒｒａｓ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．）、代表的なウサギバインダーは文献（ＷＯ ２００９／１５５７２３）から同定され、そのＣＤＲは、ヒトコンセンサスＶＨ３／Ｖκ１フレームワークの各可変ドメインに移植された（Ｒａｄｅｒ ２０００， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； ＷＯ／２００５／０１６９５０； ＷＯ ２００８／００４８３４； ＵＳ ８，２９３，２３５）。ウサギＣＤＲのループ移植のために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ によるナンバリング（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； 図２参照）による配列領域ＣＤＲ−Ｌ１（Ｌ２４−Ｌ４２）、ＣＤＲ−Ｌ２（Ｌ５８−Ｌ７２）、ＣＤＲ−Ｌ３（Ｌ１０７−Ｌ１３８）、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｈ２７−Ｈ４２）、ＣＤＲ−Ｈ２（Ｈ５７−Ｈ７６）、ＣＤＲ−Ｈ３（Ｈ１０９−Ｈ１３８）は、ヒトフレームワークに変換された。これらヒト化可変ドメインに基づき、ｓｃＦｖコンストラクトは、フレキシブルＧｌｙ４−ＳｅｒリンカーでＶＬとＶＨとを結合することによって作製され、それによってＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨの配置を生じる。
方法
コンストラクト設計及び製造
得られるアミノ酸配列はデノボ合成され、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ｂａｃｋｂｏｎｅ（ノバジェン）に基づくＥ．コリ（ｃｏｌｉ）発現に適合した発現ベクターにクローン化した。発現コンストラクトは、Ｅ．コリ株ＢＬ１２（ＤＥ３）（ノバジェン）に変換され、細胞は開始培養として２ＹＴ培地で培養された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。発現培養物は接種され、３７°Ｃかつ２００ ｒｐｍにおいてバッフルフラスコでインキュベートされた。一度、１のＯＤ６００ ｎｍに達したら、タンパク質発現は０．５ ｍＭの最終濃度において、ＩＰＴＧの追加によって誘導された。一晩の発現後、細胞は４０００ ｇにおける遠心分離によって回収された。封入体の調製のため、細胞ペレットはＩＢ再懸濁バッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ トリトン Ｘ−１００）中で再懸濁された。細胞スラリーは１ ｍＭ ＤＴＴ、０．１ ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、１０ ｍＭ ロイペプチン、１００ μＭ ＰＭＳＦ及び１ μＭ ペプスタチンを添加された。細胞は、氷上で冷やされながら、３サイクルの超音波ホモジナイゼーションによって溶解された。その後、０．０１ ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼが加えられ、ホモジネートは室温で２０分間インキュベートされた。封入体は、１０，０００ ｇかつ４°Ｃにおける遠心分離によって沈降させられた。ＩＢは、他の遠心分離の前に、ＩＢ再懸濁バッファー中で再懸濁され、超音波処理によってホモジナイズされた。全体として、ＩＢ再懸濁バッファーによる最低３回の洗浄ステップが行われ、その後、ＩＢ洗浄バッファーによる２回の洗浄が行われ、最終ＩＢを得た。
コンストラクト設計及び製造
得られるアミノ酸配列はデノボ合成され、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ｂａｃｋｂｏｎｅ（ノバジェン）に基づくＥ．コリ（ｃｏｌｉ）発現に適合した発現ベクターにクローン化した。発現コンストラクトは、Ｅ．コリ株ＢＬ１２（ＤＥ３）（ノバジェン）に変換され、細胞は開始培養として２ＹＴ培地で培養された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。発現培養物は接種され、３７°Ｃかつ２００ ｒｐｍにおいてバッフルフラスコでインキュベートされた。一度、１のＯＤ６００ ｎｍに達したら、タンパク質発現は０．５ ｍＭの最終濃度において、ＩＰＴＧの追加によって誘導された。一晩の発現後、細胞は４０００ ｇにおける遠心分離によって回収された。封入体の調製のため、細胞ペレットはＩＢ再懸濁バッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ トリトン Ｘ−１００）中で再懸濁された。細胞スラリーは１ ｍＭ ＤＴＴ、０．１ ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、１０ ｍＭ ロイペプチン、１００ μＭ ＰＭＳＦ及び１ μＭ ペプスタチンを添加された。細胞は、氷上で冷やされながら、３サイクルの超音波ホモジナイゼーションによって溶解された。その後、０．０１ ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼが加えられ、ホモジネートは室温で２０分間インキュベートされた。封入体は、１０，０００ ｇかつ４°Ｃにおける遠心分離によって沈降させられた。ＩＢは、他の遠心分離の前に、ＩＢ再懸濁バッファー中で再懸濁され、超音波処理によってホモジナイズされた。全体として、ＩＢ再懸濁バッファーによる最低３回の洗浄ステップが行われ、その後、ＩＢ洗浄バッファーによる２回の洗浄が行われ、最終ＩＢを得た。
タンパク質リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）のために、単離されたＩＢは、湿ＩＢｇあたり５ ｍＬの割合で、可溶化バッファー（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．０、６ Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ）中で再懸濁された。２０ ｍＭの最終濃度においてＤＴＴが追加されるまで、可溶化物は室温で３０分間インキュベートされ、さらに３０分間インキュベーションは続けられた。可溶化が完了した後、溶液は８５００ ｇかつ４°Ｃにおける１０分の遠心分離によって除かれる。リフォールディングは、リフォールディングバッファー（一般的に：１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、４．０ Ｍ 尿素、５ ｍＭ システイン、１ ｍＭ シスチン）中の可溶化タンパク質の０．５ ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度における急激な希釈によって行われる。リフォールディング反応は通常、最低１４時間インキュベートされる。得られるタンパク質溶液は濃縮され、バッファーは透析濾過によりネイティブバッファー（５０ ｍＭ クエン酸リン酸塩 ｐＨ ６．４、２００ ｍＭ ＮａＣｌ）とバッファー交換される。リフォールディングされたタンパク質は適当な樹脂材料（例えばスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ） ７５， ＧＥ ヘルスケア）によるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。単離された単量体フラクションは、サイズ排除ＨＰＬＣ、純度についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そしてタンパク質含量については紫外・可視分光法によって分析される。タンパク質濃度は必要な濃度に調整され、安定性解析が行われる。
構造モデルの比較
可変ドメインＶＬカッパ及びＶＬラムダの三次元構造はＰＤＢから得られる構造モデルの例を用いて比較された（それぞれＰＤＢ ＩＤ １ＦＶＣ及びＰＤＢ ＩＤ ２Ａ９Ｍ）。ＶＬフレームワーク領域ＩＶのパッキングの分析は、側鎖配向における位置１４７以降との違いを明らかにした。加えて、位置１０１におけるアミノ酸側鎖の配向はＶκ及びＶλ構造において異なった。図４に示されるように、主要なアミノ酸（位置１０１）の異なるパッキングは明らかである。Ｖκの場合、フェニルアラニン１０１はドメインのコアに向かい、しかしながら、ラムダ可変ドメインにおいては、位置１０１のグルタミン酸は溶媒曝露し、Ｖ１４７（矢印）疎水性コアに順番に配置される。この観察に基づいて、アミノ酸置換Ｆ１０１Ｅを含む可変ドメインは、ＶλフレームワークＩＶのＶλ特異的パッキングを順応させるために作製された（配列番号８、１１及び１３）。
可変ドメインＶＬカッパ及びＶＬラムダの三次元構造はＰＤＢから得られる構造モデルの例を用いて比較された（それぞれＰＤＢ ＩＤ １ＦＶＣ及びＰＤＢ ＩＤ ２Ａ９Ｍ）。ＶＬフレームワーク領域ＩＶのパッキングの分析は、側鎖配向における位置１４７以降との違いを明らかにした。加えて、位置１０１におけるアミノ酸側鎖の配向はＶκ及びＶλ構造において異なった。図４に示されるように、主要なアミノ酸（位置１０１）の異なるパッキングは明らかである。Ｖκの場合、フェニルアラニン１０１はドメインのコアに向かい、しかしながら、ラムダ可変ドメインにおいては、位置１０１のグルタミン酸は溶媒曝露し、Ｖ１４７（矢印）疎水性コアに順番に配置される。この観察に基づいて、アミノ酸置換Ｆ１０１Ｅを含む可変ドメインは、ＶλフレームワークＩＶのＶλ特異的パッキングを順応させるために作製された（配列番号８、１１及び１３）。
実施例２：ｓｃＦｖコンストラクトについての生物物理学的データの測定
熱変性
試験されたコンストラクトの熱変性による転移の中点は、Ｎｉｅｓｅｎによって基本的に記載された、示差走査蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ）（ＤＳＦ）によって測定された（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２ （２００７） ２２１２−２１）。ＤＳＦアッセイは、ｑＰＣＲ装置によって行われた（例えばＭＸ３００５ｐ， アジレント・テクノロジー）。試料は、全量２５ μＬにおいて５ｘ サイプロオレンジ（ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ）の最終濃度を含むバッファー（クエン酸リン酸塩 ｐＨ ６．４、０．２５ Ｍ ＮａＣｌ）で希釈された。バッファー探索実験において、変性温度のｐＨ依存性が測定され、匹敵できるｐＨ特性がすべてのコンストラクトについて観察された。試料は２５〜９６°Ｃにプログラムされた温度勾配で三重測定された。蛍光シグナルが得られ、生データはグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）で分析された（グラフパッドソフトウェアインク）。
熱変性
試験されたコンストラクトの熱変性による転移の中点は、Ｎｉｅｓｅｎによって基本的に記載された、示差走査蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ）（ＤＳＦ）によって測定された（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２ （２００７） ２２１２−２１）。ＤＳＦアッセイは、ｑＰＣＲ装置によって行われた（例えばＭＸ３００５ｐ， アジレント・テクノロジー）。試料は、全量２５ μＬにおいて５ｘ サイプロオレンジ（ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ）の最終濃度を含むバッファー（クエン酸リン酸塩 ｐＨ ６．４、０．２５ Ｍ ＮａＣｌ）で希釈された。バッファー探索実験において、変性温度のｐＨ依存性が測定され、匹敵できるｐＨ特性がすべてのコンストラクトについて観察された。試料は２５〜９６°Ｃにプログラムされた温度勾配で三重測定された。蛍光シグナルが得られ、生データはグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）で分析された（グラフパッドソフトウェアインク）。
ストレス安定性試験
タンパク質は、オリゴマー形成についてはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により、分解についてはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、二週間にわたって３７°Ｃの保存において分析された。本試験に先立って、試料は１、１０及び４０ ｇ／Ｌに濃縮され、ｔ０時点が測定された。単量体含量は、ショウデックスＫＷ−４０２．５−４Ｆ（昭和電工）による試料の分離、及び、得られるクロマトグラムの評価によって定量化された。タンパク質単量体の相対的な割合の計算のため、単量体のピークの面積は、試料マトリックスに起因し得ないであろうピークの全面積で割った。タンパク質分解は、Ａｎｙ ｋＤミニプロティアンＴＧＸゲル（バイオ・ラッド ラボラトリーズ）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価され、クマシーブリリアントブルーにより染色された。タンパク質濃度は、ナノクアントプレート（Ｎａｎｏｑｕａｎｔ ｐｌａｔｅ）を備えたインフィニティリーダーＭ２００ Ｐｒｏ（テカングループ エルティーディー）を用いた紫外・可視分光法によって異なる時点で観察された。
タンパク質は、オリゴマー形成についてはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により、分解についてはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、二週間にわたって３７°Ｃの保存において分析された。本試験に先立って、試料は１、１０及び４０ ｇ／Ｌに濃縮され、ｔ０時点が測定された。単量体含量は、ショウデックスＫＷ−４０２．５−４Ｆ（昭和電工）による試料の分離、及び、得られるクロマトグラムの評価によって定量化された。タンパク質単量体の相対的な割合の計算のため、単量体のピークの面積は、試料マトリックスに起因し得ないであろうピークの全面積で割った。タンパク質分解は、Ａｎｙ ｋＤミニプロティアンＴＧＸゲル（バイオ・ラッド ラボラトリーズ）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価され、クマシーブリリアントブルーにより染色された。タンパク質濃度は、ナノクアントプレート（Ｎａｎｏｑｕａｎｔ ｐｌａｔｅ）を備えたインフィニティリーダーＭ２００ Ｐｒｏ（テカングループ エルティーディー）を用いた紫外・可視分光法によって異なる時点で観察された。
実施例３：市販ヒト化マウスモノクローナル抗体からのｓｃＦｖコンストラクトの構築
抗体可変ドメインの安定化について提唱された概念の、幅広い適用性を確認するために、２つの単鎖Ｆｖコンストラクトは、Ｖカッパ軽鎖を含む市販ヒト化マウスモノクローナル抗体に基づいて作製された。第１コンストラクトについては、ＩｇＧのアミノ酸配列として公表された元の可変ドメイン配列が用いられたが、一方で、第２コンストラクトについては、可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域ＩＶがラムダ生殖系遺伝子由来の各配列によって置換された、改変された配列が用いられた。ｓｃＦｖコンストラクト内の可変ドメインは ２０アミノ酸フレキシブル（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーによって結合され（配列番号１）、それによって、モデルコンストラクトｓｃＦｖ１からｓｃＦｖ１０に用いられる、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨの配置を生じる（表２参照）。ｓｃＦｖ分子の発現及びリフォールディングは、前述のとおり行われ、リフォールディングされたタンパク質は、プロテインＬレジンのアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ＳＥ−ＨＰＬＣによる精製タンパク質の分析は、ＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含むコンストラクトの有意に改善された単量体含量において現れた、コンストラクトの製造効率の顕著な違いを明らかにした（図５参照）。加えて、元の配列を有するコンストラクト及びＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含む分子の熱変性分析は、それぞれ６９．９及び７１．２°Ｃの変性の中点をもたらした。本結果は段落［００８２］に記載の結果と合致する。
抗体可変ドメインの安定化について提唱された概念の、幅広い適用性を確認するために、２つの単鎖Ｆｖコンストラクトは、Ｖカッパ軽鎖を含む市販ヒト化マウスモノクローナル抗体に基づいて作製された。第１コンストラクトについては、ＩｇＧのアミノ酸配列として公表された元の可変ドメイン配列が用いられたが、一方で、第２コンストラクトについては、可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域ＩＶがラムダ生殖系遺伝子由来の各配列によって置換された、改変された配列が用いられた。ｓｃＦｖコンストラクト内の可変ドメインは ２０アミノ酸フレキシブル（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーによって結合され（配列番号１）、それによって、モデルコンストラクトｓｃＦｖ１からｓｃＦｖ１０に用いられる、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨの配置を生じる（表２参照）。ｓｃＦｖ分子の発現及びリフォールディングは、前述のとおり行われ、リフォールディングされたタンパク質は、プロテインＬレジンのアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ＳＥ−ＨＰＬＣによる精製タンパク質の分析は、ＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含むコンストラクトの有意に改善された単量体含量において現れた、コンストラクトの製造効率の顕著な違いを明らかにした（図５参照）。加えて、元の配列を有するコンストラクト及びＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含む分子の熱変性分析は、それぞれ６９．９及び７１．２°Ｃの変性の中点をもたらした。本結果は段落［００８２］に記載の結果と合致する。
実施例４：より短いリンカー配列を有するｓｃＦｖコンストラクトの構築
リンカー配列の影響を分析するために、より短い１５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ リンカーを用いて、実施例１に記載の方法と同様の方法で、代替コンストラクトが作製された（配列番号３４）。リンカーを除いて、ｓｃＦｖ１１及びｓｃＦｖ１２の２つのコンストラクトは、それぞれコンストラクトｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ５に相当する（表２参照）。ストレス安定性試験は実施例２に記載のとおり行われた。表４に示されるように、ＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含む、より短いリンカーを有するコンストラクトｓｃＦｖ１２は、コンセンサスカッパ軽鎖ｓｃＦｖ１１を有するコンストラクトと比較して、高い安定性を示した。分子の全体的な安定性は、より長いリンカーを有する対応するコンストラクトよりも低かった。ｓｃＦｖ安定性は、１５ｍｅｒリンカーの代わりに２０ｍｅｒ又は２５ｍｅｒリンカーを用いることによって増大する、ということは周知である（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０５ （２００１） ９８９−１０１０参照）。従って、これらの発見は、２０ｍｅｒリンカーの結果に合致し、かつ、可変ドメインの安定性がＶＬ内のラムダフレームワークＩＶの導入によって改善されることを確認させる。
リンカー配列の影響を分析するために、より短い１５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ リンカーを用いて、実施例１に記載の方法と同様の方法で、代替コンストラクトが作製された（配列番号３４）。リンカーを除いて、ｓｃＦｖ１１及びｓｃＦｖ１２の２つのコンストラクトは、それぞれコンストラクトｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ５に相当する（表２参照）。ストレス安定性試験は実施例２に記載のとおり行われた。表４に示されるように、ＶＬ内のラムダフレームワークＩＶを含む、より短いリンカーを有するコンストラクトｓｃＦｖ１２は、コンセンサスカッパ軽鎖ｓｃＦｖ１１を有するコンストラクトと比較して、高い安定性を示した。分子の全体的な安定性は、より長いリンカーを有する対応するコンストラクトよりも低かった。ｓｃＦｖ安定性は、１５ｍｅｒリンカーの代わりに２０ｍｅｒ又は２５ｍｅｒリンカーを用いることによって増大する、ということは周知である（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０５ （２００１） ９８９−１０１０参照）。従って、これらの発見は、２０ｍｅｒリンカーの結果に合致し、かつ、可変ドメインの安定性がＶＬ内のラムダフレームワークＩＶの導入によって改善されることを確認させる。
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様によって範囲が制限されることはない。実際に、本明細書に記載された改変に加えて、本発明の種々の改変は、先の説明から当業者にとって明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲に属する。
本明細書で引用されているすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献及びその他の資料は、各特許法の下で可能な程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (9)
- (a)ＶＨドメインサブファミリーＶＨ３に属するＶＨドメインであって、当該ＶＨドメインに含まれるＶＨフレームワーク部分と、当該フレームワークに連結されるＣＤＲを含むＶＨドメインと、
(b)ｉ）Ｖκ１ファミリー由来であるヒトＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩ；（ｉｉ）親ウサギ抗体由来のＣＤＲドメイン ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；及び（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶ、とを含むＶＬドメイン、とを含み、
抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該フレームワーク領域ＩＶは配列番号１６及び１７から選択されるフレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列である、
抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記Ｖκ１ファミリー由来であるＶκフレームワーク領域ＩからＩＩＩは、配列番号２及び配列番号８から選択される配列に存在するフレームワーク領域である、請求項１に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
- ＶＨ３のＶＨドメインサブファミリーに属するＶＨドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、以下：
ＩｇＧ抗体、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、鎖状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞誘導（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ； タンデム ジ−ｓｃＦｖ）、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ−ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合物、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ 融合物、並びにノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ 技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）及びデュオボディ（デュオボディ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、
からなる群から選ばれた、抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、必要に応じて薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
- 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、核酸もしくは核酸の集合物。
- 請求項６に記載の核酸もしくは核酸の集合物を含む、ベクター又はベクターの集合物。
- 請求項６に記載の核酸もしくは核酸の集合物、又は請求項７に記載のベクターもしくはベクターの集合物を含む、宿主細胞。
- 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体、又は請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原に対して特異的に結合する単離された抗体の製造方法であって、請求項６に記載の核酸もしくは核酸の集合物、又は請求項７に記載のベクターもしくはベクターの集合物、又は請求項８に記載の宿主細胞の核酸もしくは核酸の集合物、又はベクターもしくはベクターの集合物を発現するステップを含む、方法。
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